KR20080072580A

KR20080072580A - 피부의 산화적 스트레스의 평가 및 완화

Info

Publication number: KR20080072580A
Application number: KR1020080010779A
Authority: KR
Inventors: 미쉘 가레이; 크리스토퍼 마르스; 마이클 사우톨
Original assignee: 존슨 앤드 존슨 컨수머 캄파니즈, 인코포레이티드
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2008-08-06
Also published as: US20080187502A1; JP2008292452A; EP1953548A3; BRPI0800123A; EP1953548A2

Abstract

본 발명은 포유동물에서의 산화적 스트레스의 평가 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 a) 상기 포유동물의 피부 세포를 산화가능한 잔기에 노출시키고; b) 상기 피부 세포를 외부 자극에 노출시킨 후; 및 c) 상기 산화가능한 잔기의 반응 생성물을 평가하는 것을 포함하고, 이때, 상기 평가 단계 (c) 이전에, 제거된 피부 세포가 생존할 수 있도록 상기 피부 세포를 상기 포유동물로부터 비-침습적으로 제거한다. 개인 관리 조성물은 선스크린을 포함하고, 이때 당해 조성물은 약 40% 이상의 산화 보호 지수를 갖는다.

산화적 스트레스, 피부 세포, 활성 산소종, 항산화제, 산화 보호 지수

Description

피부의 산화적 스트레스의 평가 및 완화 {Assessment and mitigation of oxidative stress in skin}

본 발명은 피부의 산화적 스트레스의 평가 방법에 관한 것이고, 구체적으로, 외부 자극으로부터의 산화적 스트레스를 완화하기 위한 국소 조성물의 능력의 평가 방법에 관한 것이다.

생명체는 일반적으로 다양하고 중요한 생화학적 프로세스에 유용하고 이를 지탱하는 세포 내부의 화학적 환경을 유지하기 위해 노력한다. 외부 인자는 생화학적 교란을 일으킬 수 있고 지질 및 DNA와 같은 세포 성분을 손상시키는 과산화물 및 자유 라디칼 (radical)의 생산을 통해 독성 효과를 일으킬 수 있다. 특히, 외부 인자는 세포 내부의 정상적인 산화 환원 반응 상태의 교란, 소위 "산화적 스트레스"를 일으킬 수 있다. 구체적으로 산화적 스트레스의 치명적 양태는 자유 라이칼 및 과산화물을 포함하는 활성 산소종 ("ROS")의 생산이다. 덜 활성인 이들 종의 몇몇은 산화 환원 반응에 의해 전이 금속과 함께 광범위한 세포 손상을 일으킬 수 있는 더욱 공격적인 라디칼 종으로 전환될 수 있다. 대부분의 이들 산소-유래 종은 정상적인 호기성 대사에 의해 낮은 수준으로 생산되며 이들이 세포에 일으키는 손상은 지속적으로 회복된다. 그러나, 세포 괴사를 일으키는 중증도의 산화적 스트레스 하에서, 손상은 ATP 고갈을 일으켜서 조절된 아폽토시스 사멸을 억제하고 세포가 쉽게 분리되도록 한다.

산화적 스트레스는 다수의 연구의 주제였으며, 다양한 외부 인자가 세포의 산화적 스트레스의 수준에 영향을 주는 것으로 가정되었다. 예를 들어, UV 방사선에 대한 지속적인 노출은 치명적인 ROS의 형성을 유도하거나 촉진하는 것으로 생각되었다.

명백하게, 생체 내 산화적 스트레스의 수준을 검출하고 감소시키는 방법을 찾는 것이 바람직하다. 그러나, 피부에 대한 산화적 스트레스의 효과를 평가하는 통상의 방법은 피부 세포를 수득하기 위한 침습적 방법 (예를 들어, 피부 생체 검사를 통해), 고가의 임상 연구, 또는 생존 가능한 세포를 수거하기 위한 침습적 방법이 관여한다. 통상의 시험관내 방법은 다양한 방식으로 수득된 "배양된" 세포 상에 외부 자극의 효과를 시뮬레이팅함으로써 산화적 스트레스를 평가하기 위해 시도되었고, 완전한 생물학적 반응을 포착하지 못하는 효과를 측정했다.

또한, 통상의 방법은 일반적으로 제거된 세포에서 항산화제의 함량을 정량하거나 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 고가이며 복잡한 기구의 이용을 통해 측정을 시도하였다. 이들 기구는 다루기 어렵고, 쉽게 이동되지 않으며, 고가이고, 철저한 훈련이 요구되고, 검출의 민감도가 떨어진다.

그러므로, 발명자들은 당업계의 이전의 교시가 (a) 산화적 스트레스로부터 높은 수준의 보호를 제공하는 국소 조성물을 제공하는 것도 아니고 (b) 산화적 스트레스에 반응하는 생물계의 능력을 평가하는 간단하고, 저렴하고, 믿을만하고, 비침습적이고/이거나 더 완벽한 수단을 제공하는 것도 아님을 관찰했다. 따라서, 하나 이상의 상기한 단점을 극복하는 것이 바람직하다.

일 양태에서, 본 발명은 포유동물에서의 산화적 스트레스의 평가 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 a) 상기 포유동물의 피부 세포를 산화가능한 잔기에 노출시키는 것; b) 상기 피부 세포를 외부 자극에 노출시키는 것; 및 c) 상기 산화가능한 잔기의 반응 생성물을 평가하는 것을 포함하고, 이때, 상기 평가 단계 (c) 이전에, 상기 피부 세포는 상기 포유동물로부터 비-침습적으로 제거되어, 제거된 피부 세포가 생존할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 개인 관리 조성물은 선스크린을 포함하고, 당해 조성물은 약 40% 이상의 산화 보호 지수를 갖는다.

본 발명의 다른 특성 및 장점은 본 발명의 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.

당업자가, 본원의 설명을 기반으로 하여, 본 발명을 최대한의 범위로 이용할 수 있다고 생각된다. 다음의 구체적인 양태는 단지 설명일 뿐이고, 임의의 다른 개시에 의해 제한되지 않는다.

다른 언급이 없다면, 본원에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 이용된 바와 같이 "포유동물에서 산화적 스트레스의 평가"는 포유동물 세포에서 활성 산소종의 생산 및/또는 이의 생산 능력에 대한 정보를 수득하는 것을 포함한다. 활성 산소종 (ROS)은 생물계에서 높은 반응성이 있는 자유 라디칼을 의미한다. ROS의 예는 슈퍼 옥사이드 및 과산화수소와 같은 과산화물뿐만 아니라, 유리 산소기 (singlet oxygen) 및 퍼옥시니트라이트를 포함한다. 이러한 정보는, 예를 들어, 외상 또는 치료를 위한 피부의 반응에 관한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 피부의 현재 건강에 대한 통찰을 제공한다 (예, 특정 미용적 또는 약제학적 피부 치료가 필요한지 결정하기 위해).

본 발명에 따라, 포유동물 세포의 산화적 스트레스는 a) 상기 포유동물의 피부 세포를 산화가능한 잔기에 노출; b) 상기 피부 세포를 외부 자극에 노출; 및 c) 상기 산화가능한 잔기의 반응 생성물을 평가함으로써 평가된다. 이들 단계는 (a) (b) (c)의 순서로 실행된다. 또한, 상기 평가 단계 (c) 이전에, 즉, 단계 (a) 이전 또는 단계 (a) 및 (b) 사이, 또는 단계 (b) 및 단계 (c) 사이에서, 상기 피부 세포는 제거된 세포가 생존 가능한 방식으로 포유동물로부터 비침습적으로 제거된다. 이 방식에서, 상기 평가 단계 (c)는 제거된, 생존하는 피부 세포 상에서 수행 된다.

생존 가능한 피부 세포의 비침습적 제거

본원에서 이용된 바와 같이, "생존 가능한 피부 세포의 비침습적 제거"는 피험 포유동물의 피부로부터 피부 세포의 분리 및 수거를 의미하고, 진피가 아닌, 각질층 및 임의로 표피로부터의 제거이다. 바람직한 양태에서, 상기 제거는 표피가 아닌 단지 각질로부터의 피부 세포의 제거이다. 본원에서 이용된 바와 같이 "생존 가능한"은 피부 세포가 생존, 발달 또는 증식할 수 있을 뿐만 아니라, 선호되는 조건에서 대사 활성, 예를 들어, 효소 반응을 할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 침략적 용매에 노출되어 용해된 피부 세포는 생존할 수 없다.

본 발명의 일 양태에서, 비침습적 제거는 표면 박피, 즉, 생존 가능한 세포를 피험체의 피부의 외피로부터 벗겨내는 것을 포함한다. 특히 적합한 일 양태에서, 피부 세포의 비침습적 제거는 상기 포유동물의 피부 표면을 접착 물질과 접촉시키고, 이때, 상기 접착 물질은 기질에 부착되고, 피부 표면으로부터 접착 물질을 강제적으로 제거하여, 상기 피부 세포가 피부 표면으로부터 분리되어 접착 물질과 결합되는 것을 포함한다. 이러한 방법은 통상 "테이프 박피"로 지칭하고, 접착 물질과 결합되는 유연한 기질은 제거될 피부와 접촉한다. 피부로부터 테이프를 당겨서 각질로부터 피부 세포를 제거한다. 이후, 이들 피부 세포는 테이프로부터 분리될 수 있다.

이용될 수 있는 적합한 테이프의 예는 통상 제조원 [CuDerm Corporation of Dallas, Texas]에서 시판하는 D-SQUAME을 포함한다.

산화가능한 잔기에 피부 세포 노출

피부 상의 또는 피부로부터 제거된 피부 세포는 처음에 산화가능한 잔기에 노출된다. 본원에서 이용된 바와 같이, "잔기"는 화학적 화합물, 원소, 라디칼 또는 이온 또는 이의 일부를 의미한다. "산화가능한 잔기"는 활성 산소종과 반응을 진행할 수 있는 잔기를 의미한다. 산화가능한 잔기는 이용가능한 ROS와 함께 반응이 쉽게 일어나고 다른 세포 성분과 달리 ROS가 이와 우선적으로 반응하도록 선택되는 것이 바람직하다.

바람직한 일 양태에서, 산화가능한 잔기에 피부 세포의 노출은 산화가능한 잔기에 의한 피부 세포로의 침투를 일으킨다. 본원에서 이용된 바와 같이, "침투"는 산화가능한 잔기가 피부 세포의 외막을 통과하여 내부로 이동하는 것을 의미한다. 산화가능한 잔기의 피부 세포로의 이동은, 예를 들어, 수동 확산 또는 삼투에 의한 것일 수 있다.

다른 양태에서, 산화가능한 잔기에 피부 세포의 노출은 피부 세포에 투과할 수 있고 피부 세포 내부의 하나 이상의 화학종 (예, 효소)과 반응하여 산화가능한 잔기를 형성하는 화학종을 제공하는 것을 포함한다.

다른 양태에서, 산화가능한 잔기에 피부 세포의 노출은 산화가능한 잔기가 피부 세포로 침투할 필요는 없지만, 산화가능한 잔기가 피부 세포와 유체 소통 (fluid communication)될 수 있다. 예를 들어, 산화가능한 잔기는 피부 세포 외부 에 위치할 수 있어서, 피부 세포 내부에서 발생한 ROS가 세포 막을 통해 또는 세포막 상에서 확산하고 연이어 산화가능한 잔기와 반응한다.

산화가능한 잔기를 갖는 특히 적합한 화합물은 아래에 기술한다.

외부 자극에 대한 노출

다음에, 피부 상의 또는 피부로부터 제거된 피부 세포를 외부 자극에 노출시킨다. 피부 세포가 일련의 실질적인 생화학적 반응의 스펙트럼을 진행하도록 하기 위해, 이 단계에서 피부 세포가 생존 가능한 것 (상기한 바와 같이 살아있는 포유동물의 피부상의 또는 피부로부터 제거되었지만 생존 가능한)이 중요하다. 예를 들어, 생존 가능한 세포에서, 자연적으로 발생하는 항산화제, 예를 들면, 글루타티온을 생화학적으로 불활성화시키는데, 이는, 불활성화되지 않으면 ROS 및 산화가능한 잔기 사이에서 발생하는 반응의 정도에 영향을 줄 수 있다.

외부 자극의 예는 포유동물 피부 세포에서 ROS를 발생시킬 수 있는 것들, 예를 들어, 세제 (예, 계면 활성제를 함유한 피부 및 모발 세제) 및 화장품; 면도 및 커팅 (cutting); 및 UV 광선 (예, 태양 광선 또는 UV 램프 및 인공태양과 같은 인공적 공급원으로부터의), 오존, 연소, 오염, 염소 및 염소 및 담배 연기를 함유하는 화합물과 같은 배기가스와 같은 외부 인자를 포함한다. 특히 중요한 일 양태에서, 외부 자극은 자외선 방사이다.

산화가능한 잔기의 반응 생성물 평가

외부 자극에 대한 피부 세포의 노출 반응에서, 반응 (예, 화학 반응)은 피부 세포의 산화가능한 잔기 및 ROS 사이에서 발생한다. 그러므로 하나 이상의 반응 생성물이 발생한다.

산화가능한 잔기는 "호스트 (host) 화합물" 상의 부위 또는 반응 그룹이다. 호스트 화합물은 ROS 및 산화 가능한 잔기 사이의 반응에 의해 발생한 하나 이상의 반응 생성물이 검출될 수 있도록, 예를 들어, 반응 생성물과 결합한 전자기적 신호가 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 전자기 방사선은 이러한 반응 생성물과 상호작용하도록 할 수 있고 이로부터 수득된 전자기적 신호는 검출될 수 있고 정량될 수 있는 것이 바람직하다.

따라서, 일 양태에서, 산화가능한 잔기의 반응 생성물을 평가하는 것은 상기 반응 생성물과 결합한 전자기적 방출 신호를 측정하는 것을 포함한다. 적합한 전자기적 방출 신호의 예는 형광 신호 및 발광 신호, 예를 들어, 화학발광 신호를 포함한다. 그러므로 당해 반응 생성물은 형광 반응 생성물일 수 있다.

특히 적합한 호스트 화합물은 통상, 발광, 화학발광 또는 형광 "프로브" 또는 "분자 프로브"로 지칭되는 것들이다. 이들 프로브는 당업계에 공지된 매우 다양한 화합물로부터 선택될 수 있다. 프로브는 과산화물과 같이 높은 선택성 및 ROS에 대한 민감성을 제공하는 것으로 선택하는 것이 바람직하다. 적합한 프로브의 한 부류는 종종 "내부 프로브"로 지칭되고, 즉, 피부 세포 내로 확산하여 그 곳에서 ROS와 반응할 수 있는 것이다. 내부 프로브의 한 종류는 세포 내로 확산하면서 효소적으로 전환될 수 있고, 반드시 ROS와의 반응에서만 형광 신호와 같은 전자 기적 신호를 발생시킬 수 있는 프로브를 제공한다. 환원하면, 이러한 내부 프로브는 형광 반응 생성물을 발생시키지만, ROS와의 반응 전에는 형광이 아니다.

세포 투과성 또는 내부 프로브의 예는 2',7'-디클로로하이드록시플루오르세인 디아세테이트, 2',7'-디클로로플루오르세인, 카복시-2',7'-디플루오르세인 디아세테이트, 5-(및 6-)디클로로메틸-2',7'-디클로로디하이드로플루오르세인 디아세테이트, 아세틸 에스테르, 칼세인 아세톡시메틸 에스테르, 디하이드로칼세인 아세톡시메틸 에스테르, 디하이드로로다민 123, 디하이드로에티디움 2,3,4,5,6-펜타플루오로테트라메틸디하이드로로사민, 바이오틴화 글루타티온 에틸 에스테르, MTT 및 XTT와 같은 테트라졸륨염을 포함하는, 문헌 ["The Handbook- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techonologies, 10th edition" by Richard P.Hougland, and Michelle T.Z. Spene, Invitrogen Corp. Press 2005]에 기재된 것들이다. 특히 적합한 내부 프로브는 제조원 [Invitrogen of Carlsbad, California]에서 시판하는 5-(및-6) 클로로메틸-2',7'-디클로로하이드로플루오르세인 디아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H2DCFDA)이다.

다른 적합한 프로브는 소위 "외부 프로브"라 불리는, 즉, 피부 세포로 침투할 수 없지만, 피부 세포로부터 확산되는 ROS와 반응할 수 있는 프로브를 포함한다.

본 발명의 용도를 위해 적합한 외부 프로브는 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진, 3'-(ρ-아미노페닐) 플루오르센인, 디페닐-1-피레닐포스파인, R-피코에리트린, 알로피코시아닌, 플루오르세인-표지된 포스파티딜에탄올아민 및 헥사데카노 일이마노플루오르세인을 포함하여, 문헌 ["The Handbook- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techonologies, 10th edition" by Richard P.Hougland, and Michelle T.Z. Spene, Invitrogen Corp. Press 2005]에 기재된 것들이다.

일 양태에 따라, 1 내지 10μM 농도의 호스트 화합물을 갖는 용액이 비-침습적으로 제거된 생존 가능한 피부 세포에 노출된다.

상기 생존 가능한 피부 세포에 외부 조성물의 제공

일 양태에서, 외부 조성물이 생존 가능한 피부 세포에 제공된다. 당해 외부 조성물은 통상 세포 내부의 ROS의 발생 또는 ROS를 발생시키는 세포의 능력에 대한 당해 조성물 또는 이의 성분의 효과를 측정하기 위해 적용된다. 외부 조성물은, 예를 들어, 항산화제 또는 선스크린을 포함할 수 있다.

적합한 항산화제는, 예를 들어, 부틸화된 하이드록시톨루엔 (BHT), 부틸화된 하이드록시아니솔 (BHA), 베타 카로틴, 알파 하이드록시산 (예, 글리콜산, 시트르산, 락트산, 말산, 맨델산, 아스코르브산, 알파-하이드록시부티르산, 알파-하이드록시이소부티르산, 알파-하이드록시이소카프로산, 아트로락트산, 알파-하이드록시이소발러르산, 에틸 피루베이트, 갈락트우론산, 글루코헵톤산, 글루코헵토노 1,4-락톤, 글루톤산, 글루코노락톤, 글루쿠론산, 글루쿠로놀락톤, 글리콜산, 이소프로필 피루베이트, 메틸 피루베이트, 뮤스산, 피루브산, 사카르산, 삭카르산 (saccaric acid) 1,4-락톤, 타르타르산 및 타르트론산); 베타 하이드록시산 (예, 베타-하이드록시부티르산, 베타-페닐-락트산, 베타-페닐피루브산); 폴리페놀; 식물 추출물 (예, 녹차, 대두 생성물, 큰엉겅퀴, 조류, 알로에, 안젤리카, 광귤, 커피, 황련, 그레이프프루트, 호엘렌 (hoellen), 인동덩굴, 염주 (Job's tears), 리토스퍼뮴, 오디, 작약, 푸에라루아 (puerarua), 나이스 (nice), 홍화 및 이의 혼합물)을 포함한다.

적합한 선스크린은 자외선 필터, 예를 들어, 당업자에게 공지된 무기 또는 유기 (지용성 또는 수용성) 필터를 포함하고, 이는 통상 개인 관리 제품에서 자외선 방사선을 흡수 또는 분산시키기 위해 이용된다. 제한되지 않는 예는, 무기 선스크린, 예를 들어, 산화 아연 및 산화 티타늄; 당업계에 공지된 다른 유기 필터 중, 예를 들어, 벤질리덴 캄포르, 4-아미노벤조산 유도체, 특히 4-(디메틸아미노)벤조산-2-에틸헥실 에스테르, 4-(디메틸아미노)벤조산-2-옥틸 에스테르 및 4-(디메틸아미노)벤조산 아밀에스테르; 시나몬산의 에스테르, 살리실산의 에스테르, 벤조페논 및 벤조일메탄의 유도체, 벤잘말론산의 에스테르; 트리아진 유도체; 프로판-1,3-디온; 케토트리사이클로데칸 유도체; 2-페닐벤즈이미다졸-5-설폰산; 벤조페논의 설폰산 유도체; 3-벤질리덴 캄포르 설폰산 유도체, 벤조산 2-(4-디에틸아미노-2-하이드록시벤조일)-벤조산 헥실에스테르의 유도체와 같은 유기 자외선 필터를 포함한다.

본 발명의 특히 중요한 양태에서, 외부 조성물은 항산화제 및 선스크린을 포함한다.

외부 조성물은 물 및 개인 관리 제형에 적합한 다른 성분, 예를 들어, 계면활성제, 유화제, 연화제, 보습제, pH 조절제 및 방향제 등의 담체를 포함할 수 있 다. 그러나, 외부 조성물은 관심 반응 생성물의 평가 (예, 정량적으로) 능력을 실질적으로 방해하는 성분을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 당해 방법이 산화가능한 잔기 및 ROS 사이의 반응 생성물의 형광 신호를 정량하는 것을 포함한다면, 반응 생성물과 형광 파장이 동일한 성분을 배제하는 것이 바람직하다.

일 양태에서, 외부 조성물은 상기 생존 가능한 피부 세포의 비-침습적 제거 이전에 국소적으로 피험체의 피부에 적용된다. 다른 양태에서, 외부 조성물은 피부 세포가 피부로부터 제거된 후 피부 세포에 제공된다.

산화 보호 지수

일 양태에서, 외부 조성물은 외부 자극에 노출되기 전에 피부에 국소적으로 적용된다. 바람직하게, 외부 조성물은 외부 자극의 효과를 감소시킨다. 본 발명의 방법을 이용하여, 외부 조성물의 산화 보호 지수, OPF를 측정하고 평가할 수 있다.

예를 들어, 일 양태에서, 외부 자극은 UV 방사선이고, 반응 생성물은 형광 반응 생성물이고, 선스크린을 함유하는 외부 조성물은 UV 방사선에 피부가 노출되기 전에 피부에 국소적으로 적용될 수 있다. 외부 조성물, X의 OPF는 본 발명의 방법 및 다음의 방정식을 이용하여 측정된다:

상기식에서,

S_N _,UV는 외부 조성물을 피부 세포에 적용하지 않고 UV 방사선에 노출시켜 수 득된 형광 신호이고;

S_N _, _NUV는 외부 조성물을 피부 세포에 적용하지 않고 UV에 노출시키지도 않고 수득된 형광 신호이고;

S_x _,UV는 외부 조성물 X를 피부 세포에 적용한 후, UV 방사선에 노출시켜 수득된 형광 신호이다.

일 양태에서, 선스크린을 포함하는 개인 관리 조성물은 약 40% 이상, 바람직하게 45%, 보다 바람직하게 50% 이상의 OPF를 갖는 것으로 제공된다. 이러한 개인 관리 조성물은 상기한 담체 및/또는 다른 적합한 성분을 포함할 수 있다. 특히, 개인 관리 조성물은 또한 항산화제를 포함할 수 있다.

다음의 제한되지 않는 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다.

실시예 1

사람의 피부에서 다양한 항-여드름 조성물에 의한 산화적 스트레스 (외부 자극)의 일련의 평가를 다음과 같이 수행했다.

각 경우에서, 일정한 기준선의 피부 표면을 제공하기 위해, 표면적이 380mm²인 22mm 길이의 D-SQUAME 테이프를 기계적인 압력과 함께 사람 피험자의 안쪽 손바닥에 적용하고, 1분 동안 피부에 두었다. 테이프를 포셉으로 제거하고 버렸다. 그후, 2번째 테이프를 동일한 부위에 적용하고 상기 적용 및 제거 과정을 피부 세 포의 표면을 벗기기 위해 반복했다. 2번째 테이프를 염수 용액 (HBSS: Hanks Balanced Salt Solution)을 함유한 12-웰 조직 배양 플레이트의 바닥에 넣었다. 각 피험체에 대해 4회 반복했다. 참조 1A: "생성물 없음"으로 표지된 이들 테이프를 아래에서 표시한 바와 같이 평가했다.

상기 과정을 반복했다. 그러나, 2번째 테이프의 적용 전, 10 중량%의 벤조일 퍼옥사이드 (Clearasil Maximum Strength Acne Treatment Cream, 제조원 [ Reckitt Benckiser of Slough, UK)를 함유한 조성물을 피험자의 안쪽 손바닥의 다른 부위에 4mg/cm²의 표면 농도로 국소적으로 적용했다. 이들 테이프를 상기한 바와 같이 수거 웰에 넣었다. 유사한 과정을 벤조일 퍼옥사이드 (BPO)의 농도만 변화시키면서 반복했다. 참조 1B는 10%의 벤조일 퍼옥사이드에 상응하고, 참조 1C는 5%의 벤조일 퍼옥사이드 (Oxy Lotion: 제조원 [Mentholatum Co., Orchard Park, NY])에 상응하고, 참조 1D는 2.25%의 벤조일 퍼옥사이드 (Acne Response Step 3 Blemish Fighting Lotion 제조원 [L'Oreal of Paris, France])에 상응한다.

피부로부터 제거시, 테이프로 제거된 세포를 즉시 피부 세포 내에서 DCFH로 가수분해되고, ROS와 반응하여 형광 반응 생성물, DCF를 형성하는 호스트 화합물인 CM-H2DCFDA의 5μmol의 용액 중에서 30분 동안 항온처리했다.

조직 배양 플레이트를 과량의 CM-H2DCFDA를 제거하기 위해 세정했다. 이후, 당해 피부 테이프를 제조원 [Oriel Corp. of Stratford, CT]에서 시판하는 인공 태양에서 82KJ/m²에 노출시켰다. 그 후, DCF에 대해 다음과 같이 평가했다. 각 테이 프를 방사선을 처리한지 정확히 1시간 후에 형광 프로브를 이용하여 분석하고 제조원 [Molecular Devices of Sunnyvale, California]에서 시판하는 분광 형광계 플레이트 판독기 상에서 여기 (excitation) 파장을 485nm 및 방출 (검출) 파장을 530nm로 설정하고 판독했다. 제조원 [Molecular Devices of Sunnyvale, California]에서 또한 제공하는 프로그램 [SOFTMAX]을 이용하여 측정된 평균 형광 강도 (MFI)로 보고된 당해 결과는 아래의 표 1에서 나타냈다.

이들 결과는 놀랍게도, 본 발명에 방법에 따라 형광을 측정함으로써, 당업자가 상이한 외부 공격에 대한 노출에 의해 생성된 ROS의 수준들, 예를 들어, 피부에 국소적으로 적용된 산화 화합물의 수준들을 구분할 수 있음을 밝혔다.

실시예 2

선스크린을 함유한 2개의 국소 조성물의 산화 보호 지수, OPF를 다음과 같이 측정하고 비교했다. 실시예 1과 유사한 방식으로 측정했다. 2개의 대조군 (아래에 기술했다) 뿐만 아니라 측정될 11개의 피부 테이프가 각 샘플에 대해 제공되었다. 피부 테이프를 남성 및 여성 피험자 (피부 형태 II 내지 III, 연령 범위 25 내지 55세)로부터 수거하였다. 당해 피부 테이프를 인공 태양에서 110KJ/m²에 노출시켰다.

비교 참조 2A 및 2B에는 외부 조성물을 적용하지 않았다. 제조원 [Schering-Plough, Kenilworth, NJ]에서 시판하는 외부 조성물, 쿠퍼톤 물 베이비즈 스펙트라 3 SPF 50을 비교 참조 2D에 적용했다. 다음의 외부 조성물을 본 발명에 따라 참조 2C에 적용했다:

외부 조성물 2C

외부 조성물을 5cm²의 플레이트 당 50㎕의 표면 범위로 폴리메틸메타클리레이트 플레이트에 적용했다. 당해 외부 조성물을 가라앉게 하여 주위 조건 하에서 약 5 내지 10분 동안 건조시켰다. 플레이트를 피부 세포를 함유한 특정 조직 배양 플레이트 상에서 조성물 면을 밑으로 하여, 배양 세포가 완전히 덮이도록 두었다. 샘플 2B 내지 2D의 세포는, 그 위의 PMMA 플레이트와 함께, 15분 동안 UV 용량에 노출시켰다. 샘플 2A는 UV에 노출시키지 않았다. 참조 2C 및 2D에대한 OPF_X를 공식:

을 이용하여 계산했다.

상기식에서,

S_N _,UV는 외부 조성물이 없고 UV가 있는 상태의 형광 신호이고, 당해 경우, 84.55이고;

S_N _, _NUV는 외부 조성물이 없고 UV가 없는 상태의 형광 신호이고, 당해 경우, 27.99이고;

S_N _,UV는 외부 조성물 X가 있는 때 UV 노출시의 형광 신호이고, 당해 경우 55.02 또는 63.89이다.

당해 결과는 아래의 표 2에서 나타냈다.

당해 결과는 놀랍게도, 본 발명의 방법이 산화적 스트레스, 특히 UV-유도 ROS에 의해 발생된 산화적 스트레스를 저지/억제하는 국소 조성물의 능력을 평가하는데 이용될 수 있음을 나타낸다. 또한, 높은 OPF로 나타나는, 산화적 스트레스로부터의 높은 보호 수준을 갖는 조성물을 제공하는 것이 가능하다. 특히, 약 40% 이상, 바람직하게 약 45% 이상, 보다 바람직하게 약 50% 이상의 OPF를 갖는 개인 관리 조성물을 제공하는 것이 가능하다.

본 발명이 이의 자세한 설명과 함께 기술되지만, 상기 설명은 설명을 의도하고 첨부된 청구항의 범위로 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님이 이해된다. 다른 양태, 이점 및 변형은 본 청구항에 포함된다.

Claims

a) 포유동물의 피부 세포를 산화가능한 잔기에 노출시키고;

b) 외부 자극에 상기 피부 세포를 노출시킨 후;

c) 상기 산화가능한 잔기의 반응 생성물을 평가함을 포함하고, 이때, 평가 단계 (c) 이전에, 피부 세포가 생존될 수 있도록 당해 피부 세포를 포유동물로부터 비-침습적으로 제거하는, 포유동물에서의 산화적 스트레스의 평가 방법.
제1항에 있어서, 평가 단계 (c)가 반응 생성물과 결합한 전자기적 신호를 측정하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 반응 생성물이 형광 반응 생성물인 방법.
제1항에 있어서, 노출 단계 (a)가 산화가능한 잔기에 의해 피부 세포로의 침투를 야기하는 방법.
제1항에 있어서, 항산화제, 선스크린 또는 이의 배합물을 포함하는 외부 조성물을 피부 세포에 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 제공 단계가 노출 단계 (b) 이전에 외부 조성물을 피부 세 포에 국소적으로 적용하는 것을 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 제공 단계가 포유동물의 피부 세포를 비침습적으로 제거하기 전에 수행되는 방법.
제5항에 있어서, 제공 단계가 포유동물의 피부 세포를 비침습적으로 제거한 후에 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 비침습적 제거가 피부 세포의 표면 박피를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 비침습적인 제거가, 기질에 부착된 접착 물질을 포유동물의 피부 표면과 접촉시키고, 접착 물질을 피부 표면으로부터 강제적으로 제거하여, 상기 피부 세포가 피부 표면으로부터 분리되어 접착 물질과 결합되는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 외부 자극이 피부 세포에 의한 활성 산소종을 발생시키는 방법.
제1항에 있어서, 외부 자극이 자외선 방사, 연기, 온도, 압력, 화학물질, 습도 및 이의 배합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 외부 자극이 자외선 방사인 방법.
약 40% 이상의 산화 보호 지수를 갖는, 선스크린을 포함하는 개인 관리 조성물.
제14항에 있어서, 약 45% 이상의 산화 보호 지수를 갖는 개인 관리 조성물.
제14항에 있어서, 약 50% 이상의 산화 보호 지수를 갖는 개인 관리 조성물.
제14항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는 개인 관리 조성물.