KR20090089973A - 털산박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 털산박하(Isodon inflexus var . canescens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항산화효능을 갖는 화장료조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 털산박하 추출물로부터 멜라닌생성 억제작용을 갖는 화학식 1로 표시되는 kamebakaurin 화합물을 분리 정제하는 방법을 제공한다.

털산박하추출물, 항산화, 미백, kamebakaurin

Description

털산박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 미백용 화장료 조성물 {Antioxidation and whitening cosmetic compositions containing extract of Isodon inflexus var. canescens}

본 발명은 털산박하(Isodon inflexus var . canescens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 털산박하 추출물로부터 멜라닌생성 억제작용을 갖는 화학식 1로 표시되는 kamebakaurin 화합물을 분리 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 털산박하 추출물은 항산화 및 미백효능이 우수하여 항산화 관련 제재 혹은 미백제로 그 사용이 용이하며, 특히 kamebakaurin은 멜라닌 생성 억제작용이 우수하여 과다한 색소 침착의 피부질환에 대한 천연 미백제로서의 그 이용이 기대된다.

털산박하(Isodon inflexus var . canescens)는 다년초로서 줄기는 높이 40~100cm이고 사각이 지고 능선에 백모가 있다.

잎은 대생하고 삼각상란형이며 길이 3~6cm, 폭 2~4cm이고 둔거치가 있으며 뒷면에 털이 많다. 산박하와 비슷하지만 잎 뒷면에 털이 많은 것이 다르다.

털산박하를 대상으로 항산화 및 미백에 관련한 활성을 갖는 활성물질의 규명 에 대한 연구는 보고된 바가 없어 본 발명자들은 천연물에서의 천연 항산화제 및 미백 관련 활성물질에 대해 조사한 결과 털산박하를 유기용매로 추출한 털산박하 추출물의 좋은 항산화 및 미백효과를 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성과 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성억제를 통해 확인할 수 있었다. 또한, 이로부터 미백 효과를 갖는 물질을 분리하여 그 화학적 특성을 조사한 결과 kamebakaurin 임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

다음은 털산박하 유기용매 추출물에서부터 분리한 유효성분 kamebakaurin의 구조이다.

인간은 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 노화가 일어난다. 그러나 이러한 자연적인 노화가 아닌 현대사회의 다양한 변화에 맞춰 환경유해물질과 같은 공해에 노출이 되면서 외적 자극에 의해 노화의 정도가 더욱 가속화되어지고 있다. 특히 자외선에 의한 노화는 장기간 태양광에 노출되는 얼굴, 손등, 목 등의 피부에서 관찰되어 지는데 피부 각질층이 두꺼워지고, 피부의 구성요소들인 세포외 기질들이 변성되어 피부의 탄력을 잃게 되고, 깊은 주름이 형성될 뿐만 아니라, 피부 색소에 이상 현상을 일으켜 멜라닌 과다 생성 등을 초래한다. 자외선에 의한 피부노화 현상에 중요한 영향을 미치는 인자는 비정상적으로 생성량이 증가되는 활성산소종(ROS)과 자유 라디칼(free radical)의 작용이다.

활성산소종에 의한 지질의 과산화를 막기 위해 항산화제를 오래전부터 이용하여 왔는데 주로 페놀계 합성 항산화제인 butylated hydroxytoluene (BHT)이나 butylated hydroxyanisole (BHA)를 이용하였다. 그러나 이들 제제는 과량 섭취 시 급성 독성과 만성 독성을 보인다는 것이 알려짐에 따라 (Stich, H. F. (1991) The beneficial an hazardous effects of simple phenolic compounds. Mutat. Res. 259:307-324) 그 사용량이 제한되고 있긴 하지만 화장품과 같이 지속적으로 사용을 하는 제품의 첨가물로는 안전성에 염려된다. 따라서 보다 효과가 좋으면서 인체에 안전한 천연물 유래의 항산화제에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.

인간의 피부 색깔은 여러 가지 요인에 의해 결정되지만 피부의 과색소 침착과 관련된 주요한 원인은 표피 내에서의 멜라닌 색소의 이상적 증가에 기인한다. 멜라닌은 멜라닌 생성세포(melanocyte) 내의 멜라노좀(melanosome)이라는 소기관에서 만들어지며, melanosome에는 멜라닌 생합성효소로 알려져 있는 타이로시네이즈(tyrosinase) 효소에 의해 타이로신(tyrosine)이 도파와 도파퀴논으로 전환된다. 이후 타이로시네이즈 관련 단백질인 TRP-1 (5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid oxidase)과 TRP-2 (dopachrome tautomerase)의 작용과 자동산화과정을 통해 멜라닌이 형성된다. 생성된 멜라닌은 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이되어 피부색이 표현된다. 멜라닌은 동식물계에 널리 존재하는 생채고분자물질로서 자외 선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 한다 (Y. Mishima, S. Hatta, and Y. Ohyama, Induction of melanogenesis su-ppression: cellular pharmacology and mode of differential action, Pigment Cell Res., 1, 367 1988). 반면 과도한 자외선에의 노출은 색소 침착 뿐만아니라 멜라닌 전구물질 등에 의한 독성으로 인한 세포 사멸 등 부정적인 기능도 가지고 있다 (B. W. Choi, B. H. Lee, K. J. Kang, E. S. Lee, and N. H. Lee, Screening of the tyrosinase inhibitors from marine algae and medicinal plants, Kor. J. Pharmacogn., 29, 3, 1998). 산업의 발달에 따른 환경오염의 영향으로 오존층 파괴가 일어나고 그로인한 자외선 증가는 피부에 화상, 기미, 주근깨와 같은 색소 침착, 피부 노화, 피부암까지도 유발할 수 있다(B. A. Gilcherst, S. Zhai, M. S. Eller, D. B. Yarosh, and R. M. Yaa, Treatment of human melanocytes and S91 melanoma cells with the DNA repair enzyme T4 endomuclease V enhances melanogenesis after ultraviolet irrdiation, J. Invest . Dermatol., 101, 166, 1993).

천연물로부터 의약, 식품 및 화장품에 사용되는 원료를 찾고자 하는 움직임은 웰빙의 붐과 함께 자연주의에 대한 관심이 증폭되는 현대 사회에서 더욱 증가되는 현상으로, 항산화제나 미백에 사용되는 천연원료의 개발이 산업적으로도 활성화되고 있는 추세이다.

본 발명의 목적은 인체에 무해하고 친환경적인 소재의 활용을 통해 좀 더 안전하고 효능이 우수한 천연물질의 개발을 통해 새로운 항산화 및 미백용 화장료를 개발하며 나아가 피부색소 변화에 대한 치유제를 제공함을 목적으로 한다. 또한 본 발명의 또 다른 목적은 털산박하에서는 처음으로 kamebakaurin을 분리하는 방법을 제공할 뿐만 아니라 미백 효능에 대하여서도 처음으로 그 기능을 밝힌다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 털산박하를 에탄올과 기타 유기용매들로 추출하여항산화 효능 및 멜라닌 생성 억제활성을 갖는 털산박하 추출물을 제공한다. 또한 본 발명은 털산박하의 지상부를 80% 에탄올로 추출한 다음 유기용매인 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매를 가하여 다시 추출한 항산화 및 미백 활성을 가지는 털산박하 추출물의 용매분획물을 제공한다. 본 발명의 추출용매로는 에탄올, 헥산, 에틸아세테이트, DMF(Dimethyl foramide), THF(Tetrahydrofuran), 클로로포름, 디에틸에테르 등이 사용가능하고 바람직하기로는 에탄올이 바람직하다.

또한, 본 발명은 털산박하 전초를 80% 에탄올로 침지시켜 반복 추출하고 농축하여 에탄올 추출물을 얻은 다음 이를 20% 에탄올로 현탁시키고 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올 등의 유기용매를 차례대로 가하여 그에 해당되는 용매 추출분획을 제조한다.

또한 본 발명은 털산박하 추출물로부터 실리카겔 크로마토그래피, prep-HPLC를 이용하여 kamebakaurin을 분리·정제하는 방법을 제공한다.

본 발명자는 상기 과정으로 분리·정제한 물질이 미백효과 등의 활성을 나타내는 활성물질임을 밝히고, 화학적 구조를 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 방법으로 조사하여 kamebakaurin임을 확인하였다.

본 발명의 털산박하 추출물 또는 털산박하 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 및 미백용 화장료 조성물은 일반화장수, 크림제, 에센스, 마스크팩 등의 제형으로 제공될 수 있으며, 본 발명의 털산박하 추출물 또는 털산박하 용매분획물은 화장료 조성물 전체 중량의 0.00001 내지 10 중량% 함유하는 것이 바람직하다. 0.00001 중량% 이하 함유시는 본 발명의 미백효과를 기대하기 어렵고, 10 중량% 이상 함유시는 제제화에 문제가 있다. kamebakaurin으로는 화장료 조성물 전체 중량의 0.000001 내지 1.0 중량% 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 털산박하 추출물은 항산화 및 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하고 특히 털산박하 추출물의 활성성분인 kamebakaurin 화합물은 탁월한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내므로 앞으로 천연식물에서 유래한 안전하고 효과적인 미백제로 널리 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 의거 얻어진 털산박하 추출물은 화장품은 물론 의약품 분야에도 널리 응용될 수 있다.

본 발명은 털산박하 지상부를 80% 에탄올에 침지시켜 반복 추출하여 항산화 및 미백 효능을 가지는 털산박하 에탄올 추출물을 얻는다. 또한 털산박하의 에탄올 추출물을 다시 유기용매인 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 등을 이용하여 추출한 후 항산화 및 미백 활성을 가지는 추출 분획을 제공한다.

본 발명은 털산박하의 지상부를 80% 에탄올로 추출하여 농축한 에탄올 추출물을 이용하여 유기용매로 분획함으로서 항산화 및 미백 활성 효과가 우수한 털산박하 에틸아세테이트 분획을 제공한다.

본 발명은 상기 털산박하 추출물을 유효성분으로 하는 미백활성이 있는 조성물을 제공한다. 구체적으로는 상기 추출물은 생체내의 멜라닌 생성을 억제하여 미백 향장품 및 의약품 등의 조성물로서 사용될 수 있다.

상기 털산박하 추출물의 항산화 효능은 DPPH 라디칼 소거 활성을 이용하여 활성산소 소거 효과를 측정한 결과, 유기 용매 분획 중 에틸아세테이트 분획층에서 가장 좋은 효과를 나타내었다. 또한 미백 유효 성분은 털산박하 에탄올 추출물을 이용하여 mouse의 melanocyte에서 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과, 털산박하 조추출물에서 유효성분이 확인 되었고, 유기 용매 분획층에서는 항산화 효과와 마찬가지로 에틸아세테이트 추출분획에서 특히 멜라닌 생성 억제 효과가 탁월하게 나타내었다.

본 발명은 상기의 유효한 항산화 효과와 우수한 미백 효능을 보이는 에틸아세테이트 분획추출에서 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 prep-HPLC를 이용하여 단일 물질을 얻어낼 수 있었다. 또한 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법으로 조사하여 이 화합물이 kamebakaurin임을 확인하였다.

본 발명은 상기 kamebakaurin을 포함하는 털산박하 추출물의 미백효능을 조 사하기 위하여 melanocyte인 melan-a 세포와 B16 세포를 이용하여 멜라닌 생성 억제 효과 및 생합성 과정에 관련한 유전자들의 발현을 조절하는 기능을 측정함으로써 효과를 확인하였다.

< 실시예 1 : 털산박하의 지상부로부터 용매분획물의 제조>

제주도에 자생하는 털산박하 전초를 채취하여 깨끗이 손질한 후 잘게 파쇄한 181g을 80% 에탄올 10L로 3회 교반 추출 후 감압 농축하여 20g의 에탄올 조추출물을 얻었다. 건조 조추출물 10g을 20% 메탄올 1L로 현탁 시킨 후 헥산 1L를 첨가하여 헥산층을 분리하고, 이것을 3회 반복하여 헥산 분획층을 얻었다. 남은 물층에 에틸아세테이트 1L를 가하여 에틸아세테이트층을 분리하고, 이것을 3회 반복하여 에틸아세테이트 분획층을 얻었다. 최종적으로 물층에 부탄올 1L를 3회 가하여 부탄올층과 물층으로 분획하였고, 나머지 메탄올 조추출물들도 이와 같은 과정을 반복하여 모두 용매분획 하여 사용하였다.

상기에서 얻은 각 분획물을 감압 농축한 결과 에틸아세테이트 분획 3g을 얻을 수 있었다. 나머지 추출분리 계통도는 도 1에 기재한 바와 같다.

털산박하 추출물의 항산화 및 미백 효과를 조사하기 위하여 상기 실시예 1에서 얻은 각 분획물의 멜라닌 생성 억제 및 항산화 효과를 mouse melanocyte와 DPPH 라디칼 소거 활성을 통해 각각 조사하였다.

< 실험예 1 : DPPH (1,1- Diphencyl -2- piocry2 - Hydrazyl ) radical 소거활성에 의한 항산화 효능실험>

DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 517nm에서 강한 흡수 band를 보이나 phenolic 화합물과 같이 수소에 전자를 제공해주는 전자 공여체와 반응을 하게 되면 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 된다. 따라서 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 또한 공여된 전자는 비가역적으로 결합하며 그 수에 비례하여 진보라색의 DPPH의 색깔은 점점 옅어지게 되고 흡광도도 감소하게 된다. DPPH 시약을 EtOH에 녹여 0.1 mM 농도가 되게 제조하여 DPPH용액 450 μL에 여러 농도의 시료용액 50 μL를 넣어 잘 섞은 후 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 시킨 시료는 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 517nm의 파장에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 시료의 환원력의 크기는 Inhibition Concentration at 50% of Activity (IC₅₀) 으로 표시한다.

Free radical 소거 활성 정도는 다음과 같이 계산하였다.

A는 시료가 포함되지 않은 DPPH 자체의 흡광도이고, B는 시료가 포함된 DPPH와 시료 용액의 혼합액이면 C는 에탄올과 시료의 혼합액이다.

< 실험예 2 : 멜라닌생성 억제 실험>

melan-a cell은 non-tumorigrinc mouse melanocyte cell line 으로서 정상 mouse melanocyte의 성질을 대부분 가지고 있으면서도 불멸화(immortalization) 되어 실험에 용이하게 사용할 수 있다. 따라서 시료 추출물의 멜라닌 생성 억제 정도를 melan-a cell을 이용하여 최종 생성되는 멜라닌 생성 억제 정도를 측정하였다. Melan-a cells을 RPMI 배지를 이용하여 24 well plate에 1×10⁵ cells/mL로 plating 한 후, 시료를 처리하여 37℃ 10% CO₂ 항온기에서 3일간 배양하였다. Plate의 배지 제거 후 세포를 수확하여 1mM의 1N NaOH를 첨가하여 세포를 완전히 녹인 후 450 nm에서 ELISA reader (multiwell microplate reader)로 측정하여 대조군과 비교하였다.

합성 멜라닌을 이용하여 standard solution을 만들고 sample과 standard solution을 96 well plate에 넣고 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌으로 작성된 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다.

세포의 Viability 측정( MTT assay )

MTT 정량을 위하여 멜라닌 양 측정 시 plate를 duplicate로 하여 똑같은 방법으로 시료를 처리하여 배양 후 MTT (50 ㎎/mL) 시약을 처리 (0.1㎎)하여 형성된 formazan을 DMSO롤 녹인 후 540 nm에서 ELISA reader로 측정하여 대조군과 비교하였다.

털산박하 조추출물 및 용매분획물들의 항산화 효과

구분	DPPH radical scavenging effect(%) 50 ㎍/mL	IC50 (㎍/mL)
Crude extract	71.8±1.0	34.4±0.9
Hexane	14.1±2.4	N.D
EtOAc	80.0±0.8	26.63±0.2
BuOH	54.9±0.4	44.44±0.3
H2O	46.7±3.1	55.21±5.6
Vit. C	90.2±0.5	5.5±0.7

상기 표 1에 나타난 바와 같이 털산박하 조추출물인 상태에서 유효한 항산화 효과를 보였고, 이를 용매분획하여 라디칼 소거 활성을 조사한 결과 에틸아세테이트층에서 좋은 항산화 효과를 확인할 수 있었다.(N.D.는 측정되지 않음을 뜻한다.)

털산박하 조추출물 및 용매분획물들의 멜라닌 생성 억제 효과 및 세포 증식 억제

구분	Melanin content (%) (50 ㎍/mL)	MTT (%) (50 ㎍/mL)
Crude extract	58.3±1.3	9.0±0.5
Hexane	42.4±2.0	2.5±0.1
EtOAc	84.5±1.7	94.8±1.0
BuOH	15.6±0.8	-12.7±1.2
H2O	11.3±0.7	1.3±0.6
Arbutin	53.3±1.2	-0.8±3.2

표 2에서 털산박하 조추출물인 상태에서 세포의 증식을 거의 억제하지 않는 수준의 농도에서 좋은 효과를 보였고, 분획층에서는 같은 농도에서는 헥산층이 효과가 좋게 나왔으며, 에틸아세테이트층은 효능은 우수하였으나 상기 처리 농도에서 세포 증식을 억제하여 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 것으로 보여 세포 증식에 영향을 주지 않는 농도로 희석하여 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였다.

에틸아세테이트층의 농도별 멜라닌 생성 억제 효과 및 세포 증식 억제

농도 구분	Melanin content (%)	MTT (%)
10 ㎍/mL	77.1±0.8	4.6±2.5
5 ㎍/mL	63.5±1.1	4.1±1.8
Arbutin (50 ㎍/mL)	48.3±2.1	-3.7±2.7

상기 표 3에서 나타난 바와 같이 세포에 처리 농도를 낮추었을 때 세포 증식에 영향을 주지 않으면서도 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다.

< 실시예 2 : 털산박하로부터 유효성분의 분리 및 구조 결정>

실시예 1의 털산박하 전초에서 얻은 용매 분획 중 항산화 및 미백 효과가 우수한 에틸아세테이트 분획을 대상으로 하기의 과정에 따라 활성물질을 분리하였다.

에틸아세테이트 분획 3g을 순상 실리카겔(Merck사)을 유리 컬럼 (4.5×29 cm)에 전개 용매(Hexane과 EtOAc를 1:2)로 서스펜션시켜 충진 후 10개의 분획을 얻었다. 그리고 그 중에서 멜라닌 억제 효과가 좋게 나타나는 Fr6의 0.2을 순상 실리카겔로 유리컬럼 (3×46 cm)에 전개 용매(MeOH:CHCl₃=1:7)로 서스펜션시켜 충진 한 후 5개의 분획을 얻었다. 그리고 그중에서 양이 가장 많은 B를 순상 실리카겔 유리컬럼(2×27cm)에 전개 용매(MeOH:CHCl₃=1:9)로 용출시켜 5개의 분획을 얻었다. 그리고 이 중 B-3을 prep-HPLC를 이용하여 kamebakaurin을 분리하였다.

Kamebakaurin 의 구조 확인

Prep-HPLC로 분리한 단일 물질인 Kamebakaurin의 구조를 확인하기 위하여 ¹H, ¹³C NMR 스펙트럼을 측정하여 표 4와 도 4, 도 5에 나타내었다. NMR스펙트럼을 분석한 결과 화합물 RIE-2은 kamebakaurin임을 확인하였으며, 문헌치(Takeda, Yoshio.; Ichhara, Teruyoshi.; Takaishi, Yoshihisa.; Fujita, Tetsuro. "Structural Elucidation of New Diterpernoids isolated from Rabdosia umbrosa var. leucantha f. Kameba", J. Chem . Soc . Perkin Trans . I, 1987, 11, pp 1972-1999.)와의 비교에서도 잘 일치하였다.

NMR spectroscopic data for kamebakaurin (in CD₃OD).

C No.	δH (multi, J Hz)	δC (ppm)	ref.88) δC (ppm)	Dept	HMBC (H→C#)
1	3.43 (dd, J = 4.64Hz, 10.24Hz)	82.2	81.3	CH	9, 20
2	2.75 (dd, J = 5.6, 15.5)	30.5	30.7	CH2	5, 10, 20
	2.58 (ddt, J = 5.6Hz, 13.1Hz)
3	1.47 (m)	39.5	39	CH2
4		33.5	32.9	C
5	0.95 (m)	52.9	52.2	CH	6, 8, 10, 11
6	1.89 (m), 1.87 (m)	30.1	30.3	CH2	5, 7, 8
7	4.21 (dd, J = 4.88Hz, 12.2Hz)	75.4	74.8	CH	8, 14
8		62.4	62.1	C
9	1.63 (m)	57.3	56.8	CH	1, 8, 11, 12, 14
10		49.4	47.9	C
11	1.30 (m)	21.7	21.5	CH2
12	1.52 (m)	31.7	31.5	CH
13	2.99 (brs)	49.6	48.1	CH
14	4.99 (s)	77.3	76.5	CH	13, 15
15		210.1	209.3	C
16		150.6	150.8	C
17	6.06 (s)	116.9	115.3	CH2	13, 15, 16
	5.36 (s)				13, 15, 16
18	0.91 (s)	33.8	33.3	CH3	4, 5, 19
19	0.85 (s)	22.5	22.3	CH3	3, 18
20	4.38 (d, J = 12.2Hz)	62.1	61.9	CH2	1, 9
	4.0 (d, J = 12.2Hz)				1, 9, 10

< 실험예 3 : 에틸아세테이트 분획들의 DPPH 라디칼 소거능을 통한 항산화 효과>

실시예 2에서 에틸아세테이트층을 처음 컬럼 통과하여 얻은 분획들을 농축하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 각 분획들의 항산화 효과를 측정하였다.

에틸아세테이트 분획들의 항산화 효과

Fractions	DPPH radical scavenging effect(%) 50 ㎍/mL
	100㎍/mL (%)		IC50 (㎍/mL)
fr1	N·D		N·D
fr2	N·D		N·D
fr3	98.5±1.2		2.7±0.8
fr4	96.0±0.7		2.8±0.2
fr5	N·D		N·D
fr6	84.9±0.4		4.1±0.4
fr7	92.7±1.0		4.0±0.8
fr8	71.8±0.7		6.6±0.3
fr9	80.1±0.6		2.8±0.2
fr10	N·D		N·D
Vit. C	82.5±1.5		4.5±0.9

N·D : not detection

상기 표 5에서 보는 바와 같이 측정한 분획들의 항산화 효과는 대체적으로 낮은 농도에서도 우수한 결과를 보였으며 특히, fr3, 4, 9는 대조군으로 사용된 비타민 C보다 더 우수한 항산화 효과를 나타내었고, fr6, 7 역시 대조군보다 더 좋은 라디칼 소거 활성을 나타내었다.

< 실험예 4 : 에틸아세테이트 분획들의 멜라닌 생성 억제 실험>

실시예 1에서 에틸아세테이트층을 처음 컬럼 통과하여 얻은 분획들을 농축하여 melan-a 세포를 이용하여 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다.

에틸아세테이트 분획들의 멜라닌 생성 억제 및 세포 증식 억제

Fractions	5 ㎍/mL		1 ㎍/mL
	Melanin content (%) (50 ㎍/mL)	MTT (%) (50 ㎍/mL)	Melanin content (%) (50 ㎍/mL)		MTT (%) (50 ㎍/mL)
fr1	N·D	N·D	N·D		N·D
fr2	N·D	N·D	N·D		N·D
fr3	24.1±1.3	4.8±0.8	14.1±5.8		1.9±4
fr4	85.7±2.7	22±1.2	50.9±4.3		5.4±2.2
fr5	90.6±1.8	28.4±0.5	71.3±2.3		8.3±1.6
fr6	89±0.8	20.5±0.3	81±0.9		7.2±0.3
fr7	87±3.0	26.3±5	64±4.2		7.2±1.4
fr8	86±1.0	24.1±0.4	73.1±1.9		8.4±0.1
fr9	22.3±0.6	4.5±0.2	18.3±0.8		4.2±3.4
fr10	N·D	N·D	N·D		N·D
arbutin	17.2±1.9	-2.3±0.2	10.3±4.1		-1.3±2.3

N·D : No detection

상기 표 6과 도 3A에서 fr6은 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서 세포 증식에 거의 영향을 미치지 않으면서도 멜라닌 생성 억제 효과가 탁월하게 나타났으며, fr5, 8도 같은 농도에서 세포 증식에 영향을 거의 미치지 않으면서 멜라닌 생성 억제능은 여전히 좋게 나타나고 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5 : UV B 조사에 대한 멜라닌 생성 억제 효과>

UV B 조사에 따른 멜라닌 생성 억제 효과 측정

Melan-a cells을 RPMI 배지를 이용하여 24 well plate에 1×10⁵ cells/mL로 plating 한 후, 시료를 처리하여 37℃ 10% CO₂ 항온기에서 하루 동안 배양하였다. 다음 날부터 이틀 동안 UV B 10mJ/cm²로 조사한 후 시료가 들어있는 새 배지로 교환하고 하루 동안 더 배양한 후 Plate의 배지 제거 후 세포를 수확하여 1mM의 1N NaOH를 첨가하여 세포를 완전히 녹인 후 450 nm에서 ELISA로 측정하여 대조군과 비교하였다.

합성 멜라닌을 이용하여 standard solution을 만들고 sample과 standard solution을 96 well plate에 넣고 흡광도를 측정한다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌으로 작성된 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다.

세포의 Viability 측정( MTT assay )

MTT 정량은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. 멜라닌 양 측정 시 plate를 duplicate로 하여 똑같은 방법으로 시료를 처리하여 배양 후 MTT (50 ㎎/mL) 시약을 처리 (0.1㎎)하여 형성된 formazan을 DMSO를 녹인 후 540 nm에서 ELISA롤 측정하여 대조군과 비교하였다.

RT - PCR

Melan-a cells을 RPMI 배지를 이용하여 60mm plate에 4.5×10⁵ cells/well로 plating 한 후, 시료를 처리하여 37℃ 10% CO₂ 항온기에서 하루 동안 배양하였다. 다음 날부터 이틀 동안 UV B 10mJ/cm²로 조사한 후 시료가 들어있는 새 배지로 교환하고 하루 동안 더 배양한 후 Plate의 배지를 제거하고 Tri-zol solution (Invitrogen, USA) 을 이용하여 RNA를 추출하였다. 1μL의 total RNA를 oligo (dT)₁₈ primer, dNTP (0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor, M-MuLV reverse transcriptase (2U)로 70℃ 5min, 4℃ 5min, 37℃ 60min, 그리고 70℃에서 10min heating시켜 cDNA를 합성하였다. Polymerase chain reaction (PCR)은 합성된 cDNA로부터 primer들을 증폭시키기 위하여 2μL cDNA, 10×buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 1unit Taq polymerase(Promega, USA)를 증류수로 전체를 25μL로 맞춘 후 94℃에서 45s간 denaturation, 55℃에서 45s간 annealing, 72℃에서 90s간 extension을 28 cycles 수행하여 amplification 하였다. 사용된 primer는 다음과 같다.

유전자들을 증폭시키기 위한 primer들의 염기서열

연번	유전자명	DNA 염기 서열(5′-3′)
1	Actin	R : TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C F : TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G
2	Tyrosinase	R : GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT F : TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC
3	TRP-1	R : GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC F : AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT
4	TRP-2	R : GTT GCT CTG CGG TTA GGA AG F : TGT GCA AGA TTG CCT GTC TC
5	Mitf	R : TGA TGA TCC GAT TCA CCA GA F : AGC GTG TAT TTT CCC CAC AG
6	SCF	R : TGG AAT CTT TCT CGG GAC CT F : GGT GGC AAA TCT TCC AAA TG
7	MC1-R	R : CCA GGA AGC AGA GAC TGG AC F : ACT CCA ATG CCA CCT CTC AC
R : reverse F : froward

상기 도 6에서 Kamebakaurin은 처리 농도 1 ㎍/mL에서 mitf, SCF, MCIr의 mRAN 발현을 억제 시켰으며, tyrosinase의 mRNA 발현은 미약하게 억제시키고 있음을 확인할 수 있었다.

분리한 Kamebakaurin의 UVB 조사전과 후의 멜라닌 생성 억제 및 세포증식 억제

구분	UVB 조사전		UVB 조사후
	Melanin content (%)	MTT (%)	Melanin content (%)	MTT (%)
Kamebakaurin 1 ㎍/mL	57.2±3.4	5.2±0.1	42.7±7.2	-1.4±0.9
Arbutin 100 ㎍/mL	29.4±0.3	-6.0±0.6	16.5±9.1	-5.7±2.6
Hydroquinone 0.5 ㎍/mL	74.1±3.4	-4.3±3.3	76.5±12.1	20.0±7.6

상기 표 8에서 분리한 Kamebakaurin의 멜라닌 생성 억제 효과는 처리 농도에서 세포 증식에 거의 영향을 주지 않는 범위에서 알부틴보다 우수한 효과를 보였으며, 이것은 UVB 조사 후에도 유효한 결과를 나타내었다.

< 실험예 6 : Western blot 를 통한 멜라닌 생성 억제 효과 실험>

전기영동 및 Western blot 분석

Melan-a cells을 RPMI 배지를 이용하여 60mm plate에 4.5×10⁵ cells/well로 plating 한 후, 다음 날부터 3일간 시료가 포함된 새 배지를 교환해주면서 처리하여 37℃ 10% CO₂ 항온기에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 2~3회 PBS로 세척 후 100 μl의 lysis buffer을 첨가하고, 30분 동안 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 단백질 농도는 BSA (Bovine serum albumin)을 표준화하여 Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 정량하였다. 30~50 μg의 단백질을 8~12% mini gel Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)로 변성 분리하고, 이를 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad, USA)에 15V로 1시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (TBS (Tris-buffered saline) + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2시간동안 실시하였다. 반응이 끝난 뒤에 1차 항체 (1: 500 - 1: 2000)가 들어있는 5% skim milk에서 1시간(25^oC) 또는 24시간(4^oC)동안 반응시킨 후, TTBS로 3회 세척하고 2차 항체 (1: 10000)와 상온에서 1시간 반응시킨 뒤에 TTBS로 5회 세척하여 enhanced chemiluminescence 방법으로 각 band의 영상을 얻었다.

도 7에서 Western blot analysis를 이용하여 분리한 에틸아세테이트층과 kamebakaurin의 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들의 억제 효과를 확인한 결과 mitf, tyrosinase, TPR-1을 현저하게 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.

도 1은 Kamebakaurin의 추출분리 계통도.

도 2는 Kamebakaurin의 HPLC 분석 결과.

도 3은 털산박하 에틸아세테이트 분획들의 멜라닌 생성저해도.

도 4는 ¹H and ¹³C-NMR spectrum of kamebakaurin. (in CD₃OD)

도 5는 COSY and HMBC spectrum of kamebakaurin. (in CD₃OD)

도 6은 kamebakaurin의 멜라닌 생합성 관련 유전자 발현조절 결과.

도 7은 털산박하 에틸아세테이트 분획층과 kamebakaurin의 melan-a cell에서의 western blotting 결과.

Claims (5)

1. 털산박하 추출물 또는 털산박하 추출물의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화방지 및 미백용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 털산박하추출물 또는 털산박하 추출물의 용매분획물은 조성물 전체중량의 0.00001 내지 10 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화방지 및 미백용 화장료 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 털산박하 추출물 또는 털산박하 추출물의 용매분획물의 활성성분은 하기 화학식 1로 표기되는 kamebakaurin임을 특징으로 하는 피부노화방지 및 미백용 화장료 조성물.

   [화학식 1]

   
4. 제3항에 있어서 kamebakaurin는 화장료조성물 전체 중량의 0.000001 내지 1.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화방지 및 미백용 화장료 조성물.
5. 털산박하 전초를 물과 에탄올 또는 메탄올 혼합용액에 침지시켜 1회 이상 반복 추출하고 농축하여 에탄올 또는 메탄올 추출물을 얻은 다음, 이를 20% 에탄올 또는 메탄올에 현탁시켜 헥산으로 3회 반복 추출하여 헥산분획층을 얻고, 남은 물층에 에틸아세테이트와 부탄올을 순차적으로 가하고 각각 3회 반복 추출하여 그에 해당하는 용매 분획물을 얻는 것을 특징으로 하는 피부노화방지 및 미백 효과를 갖는 털산박하 추출물의 용매분획물의 제조방법.

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