CN106456492B

CN106456492B - 蔷薇色素化合物的用途

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Publication number: CN106456492B
Application number: CN201580025832.1A
Authority: CN
Inventors: 福井祐子; 吉本祐子; 松冈龙雄; 北川小百合
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: JPWO2015178385A1; JP6594300B2; EP3146957A1; WO2015178385A1; MY187326A; KR20170007812A; JP6905021B2; CN106456492A; TWI667041B; KR102312133B1; CA2949465A1; US10105313B2; US20170079904A1; RU2016149387A; TW201625209A; SG11201609636SA; HK1231387A1; EP3146957A4; AU2015262386A1; SG10201808946TA

Abstract

本发明的课题在于提供将由蔷薇科植物提取所得到的色素化合物作为有效成分的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP‑1生成抑制剂及胶原蛋白合成促进剂、以及包含该色素化合物的皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。具体而言，本发明提供将玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物作为有效成分而含有的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP‑1生成抑制剂及胶原蛋白合成促进剂、皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。

Description

蔷薇色素化合物的用途

技术领域

本发明涉及将由蔷薇科植物，尤其是蓝色系或淡紫色系的蔷薇，或具有编码类黄酮3’，5’－羟化酶基因的基因的蔷薇科植物所得到的多酚化合物作为有效成分而含有的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MM P-1生成抑制剂、胶原蛋白合成促进剂、皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。具体而言，本发明尤其涉及将玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物作为有效成分而含有的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂、胶原蛋白合成促进剂、皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。

背景技术

由于加龄或压力等的影响，当皮肤的新陈代谢或皮脂腺功能衰退时，则皮肤变为易受到刺激的状态。其结果，例如，呈现出由干燥引起的易变痒的症状。此外，由于紫外线的影响而皮肤的纤维成分萎缩时，还呈现出出现皱纹等的症状。

作为形成皮肤的皱纹或皮肤的弹性降低等的老化的原因，可考虑胶原蛋白、弹性蛋白等的真皮基质的纤维减少、变性或退化等的种种原因。

皮肤的真皮·表皮由表皮细胞、纤维芽细胞及在它们的细胞外支持皮肤结构的包含弹性蛋白、胶原蛋白等的细胞外基质的皮肤组织所构成。年轻的皮肤通过保持这些皮肤组织的相互作用的恒常性，从而确保水分保持、柔软性、弹性等，肌肤的表面也被维持在紧致有光泽水润的状态。然而，由于紫外线、空气的显著干燥、过度的皮肤清洁、压力等的外因或加龄的影响，细胞外基质的主要构成成分的弹性蛋白引起分解·变质，此外胶原蛋白生成量减少，同时由交联引起弹性降低。其结果，皮肤保湿功能或弹性降低，角质开始异常剥离，因此肌肤失去紧致光泽，呈现出粗糙、皱纹、暗沉等的症状。

蔷薇科植物的种类非常多，其中被分类于蔷薇科蔷薇属的作为花卉被利用的蔷薇据说其品种数为3000种，其大多数为通过杂交等所造出的园艺品种。该杂交后的园艺品种作为大的分类被分类为Old Garden Rose和Modern Rose的2 个种类(专利文献1)。

蔷薇的色素已被详细地研究。例如，作为花青素类色素，已知有矢车菊素3， 5-二葡萄糖苷、天竺葵素3，5-二葡萄糖苷、矢车菊素3-葡萄糖苷、天竺葵素3- 葡萄糖苷、芍药素3，5-二葡萄糖苷、芍药素3-葡萄糖苷。此外，还已知呈现黄色的大量的类胡萝卜素化合物。这些色素同时蓄积在花瓣上，呈现出红色～黄色。

已知在淡紫色系蔷薇品种“Madame Violet”中含有蓝色色素化合物的玫瑰花青苷类(化合物Ⅰ～Ⅲ)(专利文献2)。此外，已知在蔷薇品种“APPLAUS E(注册商标)”(或“SUNTORY blue rose APPLAUSE(商标)”)中含有玫瑰飞燕草类(化合物Ⅳ～Ⅵ)(专利文献3)。该化合物的结构、色调及各种光谱数据已经明确，但关于生理活性、功能性仍未明确。

作为蔷薇科植物的成分的作用，已报道具有抗敏作用、美白作用(黑色素产生抑制作用、酪蛋白酶活性阻碍作用)、保湿作用、抗氧化作用等。在专利文献(专利文献4)中，记载了蔷薇及金樱子等的提取物作为粘多糖片段化抑制剂有效。在专利文献(专利文献5)中，记载了蔷薇科的精华作为敏感肌肤用的化妆料有效。在专利文献(专利文献6)中，记载了RosaCentifolia的提取物作为美白用皮肤外用剂有效。着眼于这样的来自蔷薇科植物的成分的效果，被称作R osa Centifolia、Rosa Damascena、Rosa Gallica等的Old Garden Rose(别称西洋蔷薇)的蔷薇的提取物或花瓣被利用于化妆品等的皮肤外用剂或洗浴用剂、饮食品的香料等。但是，用于这些花卉以外的用途的品种的蔷薇均不含前述的玫瑰花青苷类或玫瑰飞燕草类。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2011-236147

专利文献2：日本特开2002-201372

专利文献3：WO 2010/110382A1

专利文献4：日本专利第3532244号公报

专利文献5：日本专利第3487739号公报

专利文献6：日本专利第4233734号公报

发明内容

本发明所要解决的技术课题为提供将由蔷薇科植物提取所得到单宁等的多酚化合物作为有效成分的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂及胶原蛋白合成促进剂、以及包含该色素化合物的皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。

本发明者们为了解决上述课题作了深刻的研究，结果发现从淡紫色系蔷薇花瓣所发现的色素玫瑰花青苷类或具有类黄酮3’，5’－羟化酶基因(3’，5’－羟化酶)的蔷薇中所合成的色素玫瑰飞燕草类显示出强的透明质酸酶抑制活性、胶原蛋白酶抑制活性、弹性蛋白酶抑制活性、MMP-1生成抑制活性及胶原蛋白合成促进活性。进而，发现包含玫瑰花青苷类或玫瑰飞燕草类的蔷薇科植物的提取物与不含玫瑰花青苷类或玫瑰飞燕草类的以往的蔷薇科植物的提取物相比，显示出强的透明质酸酶抑制活性、胶原蛋白酶抑制活性及弹性蛋白酶抑制活性，从而达到完成本发明。

即，本发明涉及以下内容。

[1]一种透明质酸酶抑制剂，其特征在于，作为有效成分含有选自由下述通式Ⅰ所表示的玫瑰花青苷类化合物

及由下述通式Ⅱ所表示的玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物，

式Ⅰ中，R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团a：

但是基团a中的葡萄糖的1位的羟基的配位(波浪线)表示α体和β体的互变异构性，

或为下述的基团b：

而且R₂为-OH；

式Ⅱ中，R₁为下述的基团a：

但基团a中葡萄糖的1位的羟基的配位(波浪线)表示α体和β体的互变异构性，

且R₂为-OH，或R₁及R₂一起形成-O-，或R1为下述的基团b：

且R₂为-OH。

[2]一种胶原蛋白酶抑制剂，其特征在于，作为有效成分含有选自由下述通式Ⅰ所表示的玫瑰花青苷类化合物

式Ⅰ中，R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团a：

或下述的基团b：

而且R₂为-OH；

式Ⅱ中，R₁为下述的基团a：

且R₂为-OH，或R₁及R₂一起形成-O-，或R1为下述的基团b：

且R₂为-OH。

[3]一种弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，作为有效成分含有选自由下述通式Ⅰ所表示的玫瑰花青苷类化合物

式Ⅰ中，R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团a：

或下述的基团b：

而且R₂为-OH；

式Ⅱ中，R₁为下述的基团a：

且R₂为-OH，或R₁及R₂一起形成-O-、或R1为下述的基团b：

且R₂为-OH。

[4]根据[1]～[3]中的任意一项所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述玫瑰花青苷类化合物为选自以下：由下述式所表示的玫瑰花青苷A1、

但式中葡萄糖的1位的羟基的配位(波浪线)表示α体和β体的互变异构性，

由下述式所表示的玫瑰花青苷A2、

及由下述式所表示的玫瑰花青苷B

中的一种以上的化合物。

[5]根据[1]～[4]中的任意一项所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含含有所述玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物。

[6]根据[5]所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含所述玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物为选自Madame Violet、PurpleRain、Lavande、Manhattan Blue、Chantilly Lace、Blue Moon、 Tasogare、Charles deGaulle、Violet Dorry、Blue Ribbon、Aozora、Lady X、Blue Bajou及Sterling Silver中的一种以上的蔷薇科植物。

[7]根据[1]～[6]中的任意一项所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述玫瑰飞燕草类化合物为选自以下：由下述式所表示的玫瑰飞燕草A1、

但式中葡萄糖的1位的羟基的配位，即波浪线表示α体和β体的互变异构性，

由下述式所表示的玫瑰飞燕草A2、

及由下述式所表示的玫瑰飞燕草B

中的一种以上的化合物。

[8]根据[1]～[7]中的任意一项所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含含有所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物。

[9]根据[8]所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物为具有类黄酮3’， 5’－羟化酶基因的蔷薇科植物。

[10]根据[9]所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物为APPLAUSE (注册商标)。

[11]根据[9]所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物为SUNTORY blue rose APPLAUSE(商标)。

[12]一种皮肤外用剂，其特征在于，包含[1]～[11]中的任意一项所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂。

[13]一种皮肤化妆料，其特征在于，包含[1]～[11]中的任意一项所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂。

[14]一种医药部外品，其特征在于，包含[1]～[11]中的任意一项所述的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂。

[15]一种皮肤外用剂，其特征在于，作为有效成分，包含选自[1]～[4]及[7] 中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物，或[5]、[6]及[8]～[11]中的任意一项所定义的提取物。

[16]一种皮肤化妆料，其特征在于，作为有效成分，包含选自[1]～[4]及[7] 中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物，或[5]、[6]及[8]～[11]中的任意一项所定义的提取物。

[17]一种医药部外品，其特征在于，作为有效成分，包含选自[1]～[4]及[7] 中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物，或[5]、[6]及[8]～[11]中的任意一项所定义的提取物。

[18]一种MMP-1生成抑制剂，其特征在于，作为有效成分，包含选自[1]～ [4]及[7]中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物，或[5]、[6]及[8]～[11]中的任意一项所定义的提取物。

[19]一种胶原蛋白合成促进剂，其特征在于，作为有效成分，包含选自[1]～ [4]及[7]中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物，或[5]、[6]及[8]～[11]中的任意一项所定义的提取物。

本发明提供存在于淡紫色系或蓝色系的蔷薇科植物中的色素化合物玫瑰花青苷类(化合物Ⅰ～Ⅲ)及存在于具有类黄酮3’，5’－羟化酶基因(3’，5’－羟化酶)的蔷薇科植物中的色素化合物玫瑰飞燕草类(化合物Ⅳ～Ⅵ)的新型用途。由上述的蔷薇科植物所得到的提取物、该提取物的含色素馏分、及纯化后的玫瑰花青苷类(化合物Ⅰ～Ⅲ)以及玫瑰飞燕草类(化合物Ⅳ～Ⅵ)值得惊叹的是，与以往已知的蔷薇科植物的提取物及提取物所含的单宁类相比，显示出约4倍的透明质酸酶抑制活性，每聚酚量为约2倍的胶原蛋白酶抑制活性，弹性蛋白酶抑制活性中，玫瑰花青苷A1和玫瑰飞燕草A1显示出强的活性，但特里马素1(TG1)基本上没有显示出活性。即，本发明提供具有优异活性的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂及弹性蛋白酶抑制剂。此外，该提取物、馏分、玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物还能够发挥优异的MMP-1 生成抑制效果及胶原蛋白合成促进效果(尤其促进Ⅰ型胶原蛋白合成)，还可提供MMP-1生成抑制剂及胶原蛋白合成促进剂。

本发明还提供含有上述色素化合物的皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品通过含有上述色素化合物作为有效成分，从而有助于皮肤组织的水分保持以及柔软性及弹性的维持改善，因此为防止及改善皮肤的干燥、皱纹、及松弛而有效。化妆品等中可配合的原料的量由于稳定性的原因有所限制，但本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品中使用的色素化合物以皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品中可配合的用量就能得到高的有效性。

根据迄今为止的研究，关于玫瑰花青苷类及玫瑰飞燕草类的结构式已经明确，但这些色素的作为蔷薇植物以外的生理功能完全未知。根据本发明，通过对这些色素化合物群的功能性有了新的发现，从而能够用于防止及改善皮肤的干燥、皱纹及松弛，对人们的生活质量提升做出贡献。

附图说明

图1表示玫瑰飞燕草A1的纯化中Polymer C18色谱柱的纯化物的分析结果(A560nm)。

图2表示Ⅰ型胶原蛋白合成量。

具体实施方式

本发明涉及将玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物作为有效成分而含有的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂、胶原蛋白合成促进剂、皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。

(玫瑰花青苷类化合物)

玫瑰花青苷类化合物只要是具有上述结构的化合物均可以使用，但尤其可适宜使用选自玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2、及玫瑰花青苷B中一种以上的化合物。

玫瑰花青苷类化合物可通过例如日本特开2002-201372中所公开的方法，从呈现蓝色系或淡紫色系的色调的蔷薇科植物，例如Madame Violet、Purple Rain、 Lavande、Manhattan Blue、Chantilly Lace、Blue Moon、Tasogare、Charles de Gaulle、 VioletDorry、Blue Ribbon、Aozora、Lady X、Blue Bajou及Sterling Silver等品种的蔷薇进行提取。

(玫瑰飞燕草类化合物)

玫瑰飞燕草类化合物只要是具有上述结构的化合物均可以使用，但尤其可适宜使用选自玫瑰飞燕草A1、玫瑰飞燕草A2、及玫瑰飞燕草B中一种以上的化合物。

玫瑰飞燕草类化合物在野生种的蔷薇中不存在，其为通过基因重组等的方法引入类黄酮3’，5’－羟化酶基因的蔷薇，或以基因重组蔷薇作为亲代所得到的具有类黄酮3’，5’－羟化酶基因的蔷薇中蓝色色素花青素被合成，在其上键合没食子酸酯基或特里马素类而生成的化合物。

玫瑰飞燕草类化合物可通过例如日本WO2010/110382中所公开的方法从以基因重组等的方法引入类黄酮3’，5’－羟化酶基因的蔷薇或以基因重组蔷薇作为亲代所得到的具有类黄酮3’，5’－羟化酶基因的蔷薇进行提取。

(包含玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物)

作为一个形态，本发明涉及含有包含玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂、胶原蛋白合成促进剂、皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品。它们也可包含玫瑰花青苷类化合物、玫瑰飞燕草类化合物和该提取物。玫瑰花青苷类化合物为优选选自玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷 A2、及玫瑰花青苷B中一种以上的化合物。此外，玫瑰飞燕草类化合物为优选选自玫瑰飞燕草A1、玫瑰飞燕草A2、及玫瑰飞燕草B中一种以上的化合物。优选的方式中，该提取物包含玫瑰飞燕草A1、玫瑰飞燕草A2、及玫瑰飞燕草B 的全部。

本发明中使用的包含玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物可通过该领域技术人员周知的方法从呈现出蓝色系或淡紫色系的色调的蔷薇科植物，例如MadameViolet、Purple Rain、Lavande、Manhattan Blue、Chantilly Lace、Blue Moon、Tasogare、Charles de Gaulle、Violet Dorry、Blue Ribbon、Aozora、Lady X、 Blue Bajou及Sterling Silver等的品种的蔷薇科植物得到。

此外，本发明中使用的包含玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物可通过该领域技术人员周知的方法从通过基因重组等的方法将类黄酮3’，5’－羟化酶基因引入的蔷薇，或将基因重组蔷薇作为亲代所得到的具有类黄酮3’，5’－羟化酶基因的蔷薇，例如APPLAUSE(注册商标)等的品种的蔷薇科植物得到。此外，“APPLAUSE(注册商标)”是指与“SUNTORY blue rose APPLAUSE(商标)”相同的品种，其可通过SUNTORY FLOWERS株式会社(日本国东京都) 入手。

具体而言，含有玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物可通过实施例所示的方法得到，例如可通过以下的方法得到。

为了得到本发明中使用的提取物，优选使用上述的蔷薇的花瓣的部分，但包含花瓣以外的花萼或花粉也无妨。也可将上述的蔷薇花部分的提取物用于本发明。既可将从茎剪下的状态的花或花瓣直接用于提取，也可使用被冷冻状态的花或花瓣，或者也可使用被干燥状态的花或花瓣。为了提高提取效率，优选将花或花瓣适当粉碎，用于提取物制造。提取物的制造方法没有特别限定，可列举将上述的蔷薇的花或花瓣浸渍于提取溶剂中的方法、在花或花瓣中使提取溶剂加热回流的方法等。

将上述的花或花瓣浸渍于提取溶剂中制造提取物时，提取溶剂的使用量没有特别限定，例如，可使用相对于花或花瓣的湿重量1～30倍的重量的提取溶剂。浸渍时间没有特别限定，例如可进行0.25～72小时。浸渍温度没有特别限定，例如可为1～100℃。作为提取溶剂，优选水、低级醇、低级醇水溶液。作为低级醇，可使用碳原子数为1～5的一元醇、二元醇、三元醇等，具体而言，可使用甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、甘油、丙二醇、1，3-丁二醇、1，3- 丙二醇、戊二醇等公知的低级醇类。低级醇类的浓度没有特别限定，可使用相对于水溶液总量含有5～90重量％的低级醇的物质。尤其是作为优选的提取溶剂，可列举相对于总量含有5～90重量％的有机溶剂的乙醇水溶液，或乙腈水溶液或1，3-丁二醇水溶液。此外，为了防止色素化合物的分解，优选在酸性条件下进行提取。酸性条件没有特别限定，例如pH1～6，作为酸，优选使用化妆品制造中所认定的医药部外品原料规格中记载的柠檬酸、盐酸、磷酸、乳酸、酒石酸、抗坏血酸、食品添加剂的醋酸、硫酸等。

通过在上述蔷薇的花或花瓣中使提取溶剂加热回流的方法制造提取物时，也可使用与上述同样的提取溶剂。

提取后，通过过滤或离心分离等的任意的方法将花或花瓣的残渣与提取物分离。

所得到的提取物可直接、或作为适当除去提取溶剂的浓缩物、进而作为将它们稀释的稀释物用于本发明的用途。为了除去所得到的提取物的酸，使pH恢复到中性，最好使其吸附于DIAION(商标)HP-20(三菱化学株式会社)或DI AION(商标)HP2MG(三菱化学株式会社)那样的吸附树脂，通过水清洗洗去酸，用溶剂回收需要的组分。此外，按照规定方法将所得到的提取物纯化的粗纯化物或纯化物也可作为含有玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物而用于本发明的用途。本发明的提取物、其浓缩物、稀释物可使用液体状的形态，也可直接使用通过喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥等方法干燥后的物质或使用粉末化、颗粒化后的形态。

提取物中所含的玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物可通过实施例所示的方法进行确认。

(透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂及胶原蛋白合成促进剂)

本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MM P-1生成抑制剂或胶原蛋白合成促进剂包含玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物。此外，本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂或胶原蛋白合成促进剂也可为包含选自玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物的物质。并且，包含玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物，包含玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物，或它们的组合也可直接作为本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂及胶原蛋白合成促进剂使用。

在不损害玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物、以及包含玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物的效果的范围内，本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂或胶原蛋白合成促进剂也可为进一步包含药理学可允许的载体或添加剂而制剂化的物质。作为载体的例子，可列举水、生理盐水、乙醇、丙二醇、甘油、1，3-丁二醇等。作为添加剂，可列举葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、环糊精等。此外，也可适当配合制剂化中通常所使用的赋形剂、乳化剂、收缩剂(等张剂)、缓冲剂、助溶剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂等。

被制剂化的本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂或胶原蛋白合成促进剂可为液体状、糊状、凝胶状、粉末状、颗粒状等任意的剂型。

本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MM P-1生成抑制剂或胶原蛋白合成促进剂的有效成分的玫瑰飞燕草类化合物、玫瑰花青苷类化合物、包含玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物及包含玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物的含量可考虑效果方面任意地决定。

(皮肤外用剂、皮肤化妆料、医药部外品)

本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品通过包含玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物，能有效地防止或改善皮肤的干燥、皱纹及松弛。本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品可为含有选自玫瑰花青苷类化合物、玫瑰飞燕草类化合物以及玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物的组合中的一种以上的化合物的物质。并且，本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品也可为包含含有玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物、含有玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物、或它们的组合的物质。

本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料、及医药部外品中还可适当配合通常皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品所使用的成分，例如水性溶剂、乙醇、油脂类、蜡类等的载体或赋形剂、乳化剂、收缩剂(等张剂)、缓冲剂、稀释剂、助溶剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂等的添加剂。

本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品的剂型可为例如粉末状、液状、乳液状、糊状、霜状、凝胶状、摩丝状、软膏状、片状等任意的剂型。

作为本发明的皮肤外用剂，可列举例如粉末、爽肤水、乳液剂、霜剂、凝胶剂、软膏、面膜剂、固体肥皂、液状肥皂、洗发水、护发素、沐浴剂等形态的物质，但不局限于此。

作为本发明的皮肤化妆料，可列举例如爽肤水、化妆水、美容液、乳液、美容油、美容霜、美容凝胶、面膜剂、粉底粉、粉底液、粉底霜、粉底棒、BB 霜、美容肥皂、沐浴露、洗面奶、卸妆水、卸妆乳液、卸妆霜、卸妆油、洗发水、护发素、焗油膏、生发液、生发剂、沐浴剂、止汗剂等形态的物质，但不局限于此。

医药部外品是指，被认定具有特定的功能、效果的制品，对人体的作用缓和的制品。作为本发明的医药部外品，可列举药用化妆品、药用肥皂、药用洗发水、药用护发素、药用沐浴剂、药用婴儿粉、药用婴儿爽肤水、药用生发剂等形态的物质，但不局限于此。

本发明的皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品由于包含具有透明质酸酶抑制效果、胶原蛋白酶抑制效果、弹性蛋白酶抑制效果、MMP-1生成抑制效果、及胶原蛋白合成促进效果的玫瑰花青苷类化合物、玫瑰飞燕草类化合物或它们的组合作为有效成分，因此具有赋予皮肤水润、有效防止或改善皮肤的干燥、皱纹及松弛、粗糙、龟裂、皲裂的功能。因此，本发明的皮肤化妆料可期待以下效果，防止或改善干燥肌肤、敏感肌肤、油性肌肤等的肤质，防止或改善皱纹、松弛、法令纹等的加龄引起的肌肤老化。

本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MM P-1生成抑制剂、胶原蛋白合成促进剂、皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品的有效成分的玫瑰飞燕草类化合物、玫瑰花青苷类化合物、含有玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物、及含有玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物的含量可考虑效果方面任意地决定。例如在透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、MMP-1生成抑制剂、胶原蛋白合成促进剂、皮肤外用剂、或皮肤化妆料中，选自玫瑰飞燕草类化合物、玫瑰花青苷类化合物、含有玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物、及含有玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物中的一种以上的成分优选合计含有0.000001～99.9重量％，更优选含有0.00005～50重量％，进一步优选含有0.00001～10重量％。

通过以下的实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的范围不受这些限定。本领域技术人员可对本发明进行各种更改、修饰而使用，这些也包含于本发明的范围。

[实施例1]

(玫瑰花青苷类的离析)

依照日本特开2002-201372的方法，由蔷薇品种“Madame Violet”的花瓣得到以下：玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2、玫瑰花青苷B的玫瑰花青苷类。

[实施例2]

(由含有玫瑰飞燕草类的蔷薇科植物的花瓣制作提取物)

将110g在-80℃下冷冻的蔷薇品种“APPLAUSE”的花瓣在冻结的状态下于塑料袋中用木槌粉碎。添加1.5L70％乙醇，用超声波清洗机在20分钟超声下进行提取。提取处理后，使用12.5cm的布赫纳漏斗，并使用No.2滤纸(Tokyo R oshi Kaisha，Ltd)进行抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至约1/5的体积为止，馏去乙醇后，进行冷冻干燥。得到干燥重量8.33g(从鲜花瓣的收率：7.57％) 的粉末。

[实施例3]

(含有玫瑰飞燕草类的馏分及玫瑰飞燕草类化合物的纯化)

<材料与方法>

将1100g蔷薇品种“APPLAUSE”的花瓣使用Excel Aoto Homo Genizer 在液态氮中冷冻粉碎，以成为含有0.5％TFA的50％乙腈的方式添加于混合了5. 5L的乙腈、4.4L的miliQ水、55ml的TFA的溶液(包含花瓣的水分为11L)浸渍1晚。将用预涂50g Hyflo Super-Cel(硅藻土)的的布赫纳漏斗抽滤 (×3次)的滤液用旋转蒸发仪连续浓缩，浓缩至约1/2以下的体积为止。

将该浓缩液装填至2.2L用水平衡化后的吸附树脂HP-20(三菱化学株式会社)。2.2L的水洗后，放置一夜，再进行4.4L的水洗(合计3CV)后，用6.6L 的含0.1％TFA的20％乙腈进行溶出，分成500ml每个的13组分。由于1～4Fr a没有溶出物，所以与水洗液一同废弃。5～13Fra进行减压浓缩、冷冻干燥。另外，色谱柱中残留的蓝色色素类用6.6L的含0.1％TFA的60％乙腈进行溶出分成 9Fra，进行减压浓缩、冷冻干燥。合并7～9Fra。在60％-4组分前后溶出了含有蓝色色素(玫瑰飞燕草A1)的组分。

将60％-4组分及60％-5组分使用以下的制备HPLC进行纯化。色谱柱为Develosil-ODS-HG(野村化学公司制)，移动相使用A：0.5％TFA/ 水、0.5％TFA/B：50％乙腈，流速：30ml/分钟，如下进行梯度溶出。B30％(保持30分钟)、B30→B100％的线性梯度(50分钟)、B100％保持20分钟。检测在 A260nm下进行。收集含有67-82分钟溶出的蓝色色素的组分进行冷冻干燥。对 60％-4Fra.反复进行6次色谱，对60％-5Fra.反复进行2次。

将冷冻干燥品分5次装填至用50％乙腈平衡化的SephadexLH-20色谱柱(Pharmacia、200mL)。用50％乙腈进行溶出，收集目测含有蓝色色素的组分，冷冻干燥。

将所得到的冷冻干燥品以下述的HPLC再次进行制备。

色谱柱为YMC pack Polymer C18(YMC株式会社、)，移动相为A：0.5％TFA/水、B:0.5％TFA/乙腈，流速：6ml/分钟，进行以下的梯度溶出。 B32.5％(保持30分钟)、B32.5％→B45％的线性梯度(50分钟)、B45％保持30分钟，检测用PDA检测器收集250-650nm的数据，收集A260nm及A560nm的色谱图的峰。收集80-94分钟溶出的蓝色色素(玫瑰飞燕草A1)进行冷冻干燥。色谱进行共计5次反复操作。

成分的分析以下述的HPLC-TOF-MS进行。

<HPLC分析条件>

色谱柱：SHODEX ODP-40-2D(x.昭和电工株式会社)

移动相：A：1％HCOOH/H₂O、B：0.1％HCOOH/CH₃CN

溶出条件：B conc.10％→60％(15分钟)，B conc.60％iso(5分钟)→10％ (1分钟)，B conc.10％(15分钟)

柱温：40℃

流速：0.2ml/分钟

检测波长：PDA(250-600nm)，A270nm&A560nm

进样量：3μl

<MS条件>

MS使用以Q-TOF Premier(Micromass公司制)在离子源上附加Z喷雾离子源的ESI，以阳性、V模式进行测定。通过锁定喷雾进行质量校正，对于参照使用亮氨酸脑啡肽(m/z556.2771[M+H]⁺)。

TOF-detector电压：2000V，毛细管：2.7KV，Cone：50V，Source Temp： 150℃，Desolvation Temp：250℃

作为理论值，分别给予玫瑰飞燕草A1为m/z1221.1268[M]⁺、玫瑰飞燕草B 为m/z435.0352[M]⁺、玫瑰飞燕草A2为m/z1373.1378[M]⁺的分子离子，各自的分子式为C₅₆H₃₇O₃₂、C₂₂H₁₁O₁₀、C₆₃H₄₁O₃₆。以该分子离子的色谱图为基础一边确认玫瑰飞燕草类，一边纯化。

<结果>

(1)HP-20色谱柱的馏分

HP-20色谱柱的馏分如表1所示，集中进行冷冻干燥。

表1

表1：HP-20馏分60％乙腈溶出物的收量

60％乙腈溶出物以水解性单宁、蓝色色素类(花翠素与单宁的键合物)为主要成为，60％-3～5Fra含有玫瑰飞燕草A1及A2。

(2)5cm的ODS-HPLC的分馏结果

分5次进行制备HPLC，收集包含玫瑰飞燕草A1的组分与前后的色素组分进行冷冻干燥。装填11.27g，得到2.49g的色素组分(收率：22.1％)。包含玫瑰飞燕草A1的组分的收率为5.6％。

(3)LH-20色谱柱分馏结果

LH-20的组分通过目测，进行分组。样品为以ODS-HG色谱柱馏分以上述(2) 所得到的冷冻干燥粉末分5次装填。此外由于即使用50％乙腈之后用80％丙酮溶出，仍存在永久吸附的紫色成分，因此由色谱柱取出树脂，用1N-HCl(0.2ml) /EtOH(30ml)溶出色素并回收。该色素以玫瑰飞燕草B为主成分。

进行5次的色谱，得到纯度20-70％的含玫瑰飞燕草A1的组分。

(4)由2cm的PolymerC18色谱柱的分馏结果

用PolymerC18色谱柱纯化后的玫瑰飞燕草A1的色谱图(A560nm)示于图1。

(5)LC-MS分析结果

玫瑰飞燕草类为在分析时，一边用LC-TOF-MS以m/z 1221.14的色谱图确认玫瑰飞燕草A1一边推进分馏。

纯化的结果，可得到3.9mg纯度超过90％的玫瑰飞燕草A1。

[实施例4]

(透明质酸酶抑制试验)

<材料与方法>

由实施例2制作的提取物(以后，记载为“蓝蔷薇花瓣提取物”)、蓝蔷薇花瓣提取物的HP-20色谱柱馏分(60％乙腈组分)、及玫瑰飞燕草A1的透明质酸酶抑制试验改变了前田有美惠等刊登在食品卫生学杂志31(3)，233-237(1990) 上的方法，使用以下的方法实施。透明质酸由透明质酸酶被分解为N-乙酰己糖胺。通过用对二甲氨基苯甲醛(和光纯药工业株式会社制，以下省略为p-DAB) 标识还原末端的N-乙酰葡糖胺使其显色从而以吸光度进行定量，测定透明质酸酶抑制活性。

在溶解于10％DMSO的40μL试样溶液中，混合20μL溶解于0.1M醋酸缓冲液 (pH4.0)的1000U/mL透明质酸酶(Sigma公司制)，在37℃下预备加温20分钟。添加40μL溶解于同缓冲液的0.5mg/mL Compound 48/80(Sigma公司制)，在37℃下静置20分钟使透明质酸酶活化。在该溶液中添加100μL0.8mg/mL的透明质酸钾溶液，使最终浓度成为0.4mg/mL，在37℃下使其反应40分钟后，添加40μL0.4N 氢氧化钠溶液，用冰冷却使反应停止。在40μL反应液中添加以6NNaOH调节至 pH9.1的0.8M硼酸溶液，在100℃下煮沸3分钟。在冰中冷却至室温，在其中添加 1.2mL遮光的10mg/mL对二甲氨基苯甲醛(p-DAB)溶液，在37℃下使其反应20 分钟后，测定585nm的吸光度(A₅₈₅)。试样的透明质酸酶抑制活性由下式所求得的抑制率表示。

抑制率(％)＝{1-(a-b)/(c-d)}×100

a：添加酶的试样溶液的A₅₈₅

b：未添加酶的试样溶液的A₅₈₅

c：添加酶的对照溶液的A₅₈₅

d：未添加酶的对照溶液的A₅₈₅

此外，对于阳性对照，代替试样溶液，添加40μL800μg/ml(摩尔浓度1.56 mM)的色苷酸钠(Sigma公司制、以下省略为DSCG)，使用试验浓度160μg/ml 的DSCG。

<结果>

(1)60％乙腈组分的透明质酸酶抑制试验

关于将蓝蔷薇花瓣提取物进行HP-20色谱柱分馏所得到的60％乙腈组分，测定试验浓度10、20μg/ml的透明质酸酶抑制率(％)时，成为如表2所示的那样。 3-5Fra.含有蓝蔷薇特有的色素成分玫瑰飞燕草A1，通过TOF-MS分析确认了其中4Fra.和5Fra.的含有率多。

3-6Fra.为蓝蔷薇花瓣提取物的1/2的试验浓度时，显示出强于蓝蔷薇花瓣提取物的透明质酸酶抑制活性，玫瑰飞燕草A1的含有率最高的4Fra.显示出最强的活性。由该结果揭示了以下可能性：3-5Fra.含有活性成分，玫瑰飞燕草A1为蓝蔷薇花瓣提取物中表示透明质酸酶抑制活性的活性成分。

表2

表２：60％乙腈组分的透明质酸酶抑制率(％）

*160μg/ml DSCG的抑制率：33.3％

(3)玫瑰飞燕草A1及类似化合物的透明质酸酶抑制试验

关于由蓝蔷薇花瓣提取物纯化的蓝色色素成分玫瑰飞燕草A1，测定试验浓度20、40、80μg/ml的胶原蛋白酶抑制率(％)时，成为如表3所示的那样。明确了玫瑰飞燕草A1为蓝蔷薇花瓣提取物中的活性成分。由于显示出浓度依存性的强的活性，因此也确认了玫瑰飞燕草A1的用量反应性。

此外，同时测定玫瑰飞燕草A1的结构的构成成分的特里马素1和宿主株的蓝色色素成分的玫瑰花青苷A1的活性，进行活性的强度比较。玫瑰花青苷A1 表现出与玫瑰飞燕草A1同等的活性。“APPLAUSE”中也包含且蔷薇科植物中也存在的水解性单宁、特里马素1显示出比玫瑰飞燕草A1还低的活性。

作为市售的蔷薇花瓣提取素材的一种，有东洋发酵公司制的ROSE CRYSTA-70(商标)。该素材含有作为水解性单宁的一种的丁香脑，总酚量70％标准。由于蓝蔷薇花瓣提取物显示出比ROSE CRYSTA-70(商标)更强的透明质酸酶抑制活性(表4)，因此得到了证实含有玫瑰飞燕草A1的蓝色色素群比水解性单宁类活性更强的数据。

明确了各化合物的透明质酸酶抑制活性的强弱顺序为玫瑰花青苷A1、玫瑰飞燕草A1＞蓝蔷薇花瓣提取物＞特里马素1。此外，明确了玫瑰飞燕草A1与特里马素1相比具有更强的活性，认为具有胜过以往所使用的蔷薇提取素材的保湿作用的效果。

表3

表3；玫瑰飞燕草A1及类似化合物的透明质酸酶抑制率(％)

*160μg/ml DSCG的抑制率：22.3％

表4

表4：蓝蔷薇花瓣提取物与ROSE CRYSTA70(商标)的透明质酸酶抑制率(％)

*160μg/ml DSCG的抑制率：33.7％

**总酚量为通过佛锡二氏法以没食子酸换算算出。

像以上那样，明确了蓝蔷薇花瓣提取物、其中含有蓝色色素玫瑰飞燕草类的组分、玫瑰飞燕草A1及非基因重组体的蓝色色素玫瑰花青苷A1具有强的透明质酸酶抑制活性。

[实施例5]

(胶原蛋白酶抑制试验)

<材料与方法>

蓝蔷薇花瓣提取物、蓝蔷薇花瓣提取物的色谱柱处理物(60％乙腈组分)、玫瑰飞燕草A1、玫瑰花青苷A1及特里马素1的胶原蛋白抑制试验改变了文献 (Wunsch等、HoppeSeylers Z Physiol Chem.,333,149-51(1963))的方法，使用以下的方法实施。

为使酶溶液成为100μg/mL(55.1unit/mL)的浓度，将10mg胶原蛋白酶Type Ⅳ(Sigma公司制)溶解于1mL蒸馏水中，使用时进行50倍稀释使用。对于基质溶液，为使PZ-肽(4-phenylazo-benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH) (Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH、Sigma公司制)的浓度成为0.5μg/mL，溶解于含有20nmol/L的氯化钙的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH7.1)中使用。在20μL 溶解于10％DMSO的试样溶液中混合20μL酶溶液及160μL基质溶液，在37℃下使其反应30分钟。接着添加400μL25mM柠檬酸溶液使反应停止，用2mL乙酸乙酯提取反应液中的Pz-Pro-Leu。测定乙酸乙酯作为对照的所得到的乙酸乙酯层的波长320nm处的吸光度。此外，各试样的抑制活性由下面的式子所求得的抑制率算出。

胶原蛋白酶抑制率(％)＝{1-(a-b)/(c-d)}×100

a：添加试样时反应30分钟后的吸光度

b：添加试样时反应0分钟后的吸光度

c：未添加试样时反应30分钟后的吸光度

d：未添加试样时反应0分钟后的吸光度

上述式中，胶原蛋白酶的活性被完全抑制时，胶原蛋白酶抑制率(％)为 100％。显示出高“抑制率(％)”的化合物可以说作为抑制剂的活性更高。

胶原蛋白酶抑制试验中，对于阳性对照，替代试样溶液，使用添加20μL(反应时的浓度为80μg/mL)800μg/mL(摩尔浓度0.176mM)的Isoamylphosphonyl- Glycyl-L-Proly-L-Alaine，dipotassium salt；C₁₅H₂₆K₂N₃O₆P(Elastin Products Company,Inc.制、以下省略为IP304)。

<结果>

(1)60％乙腈组分的胶原蛋白酶抑制试验

关于将蓝蔷薇花瓣提取物进行HP-20色谱柱分馏所得到的60％乙腈组分，测定试验浓度40、80μg/ml的胶原蛋白酶抑制率(％)时，成为如表5所示的那样。 3-5Fra.含有具有类黄酮3’，5’－羟化酶基因的蔷薇特有的色素成分的玫瑰飞燕草 A1，通过TOF-MS分析确认了其中4Fra.和5Fra的含有率多。

3-5Fra.为蓝蔷薇花瓣提取物的1/2的试验浓度时，此外1，2，6Fra.为与蓝蔷薇花瓣提取物相同的试验浓度时显示出强于蓝蔷薇花瓣提取物的胶原蛋白酶抑制活性。由该结果揭示出3-5Fra.含有活性成分，玫瑰飞燕草A1为蓝蔷薇花瓣提取物中表示胶原蛋白酶抑制活性的活性成分。此外由于不限于含有玫瑰飞燕草 A1的3-5Fra.，60％乙腈组分的全部的Fra.均具有比较高的活性，因此明确了蓝色色素化合物群全部具有活性。

表5

表5：60％乙腈组分的胶原蛋白酶抑制率(％)

*80μg/mL IP304的抑制率：84.1％

(2)玫瑰飞燕草A1及其类似物的胶原蛋白酶抑制试验

关于由蓝蔷薇花瓣提取物纯化的蓝色色素成分玫瑰飞燕草A1，测定试验浓度40μg/ml的胶原蛋白酶抑制率(％)时，成为如表6所示的那样。明确了玫瑰飞燕草A1为蓝蔷薇花瓣提取物中的活性成分。

此外，同时测定玫瑰飞燕草A1的结构的构成成分的特里马素1和宿主株的蓝色色素成分的玫瑰花青苷A1的活性，进行活性强度的比较。

关于各化合物的40μg/mL的胶原蛋白抑制活性，玫瑰花青苷A1、特里马素 1、玫瑰飞燕草A1的任意的活性均超过蓝蔷薇花瓣提取物。

表6

表6：玫瑰飞燕草A1及类似化合物的胶原蛋白酶抑制率(％)

样品名	抑制率(％)*
		蓝蔷薇花瓣提取物	23.0
玫瑰飞燕草A1	42.3
		玫瑰花青苷A1	52.0
特里马素1	42.7

*各样品的试验浓度：40μg/mL

*40μg/mL IP304的抑制率：69.7％

[实施例6]

(弹性蛋白酶抑制试验)

<材料和方法>

蓝蔷薇花瓣提取物、蓝蔷薇花瓣提取物的色谱柱处理物(60％乙腈组分)、玫瑰飞燕草A1、玫瑰花青苷A1及特里马素1的弹性蛋白抑制试验使用以下的方法实施。

为使酶溶液成为0.05 unit/mL的浓度，对0.1ml弹性蛋白酶(Sigma公司制) 使用pH8.0的0.2M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(以下记载为三羟甲基氨基甲烷缓冲液)，使用时进行100倍稀释而使用。将基质溶液溶解于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中进行使用，以使N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide(Sigma公司制)的浓度成为4mM。在96孔培养板中添加50μL溶解于10％DMSO的各试样溶液及50μL 酶溶液，用培养板振动器进行混合，在25℃下预备加温10分钟。接着加入100μL 基质溶液，用培养板振动器进行混合，在25℃下使其反应30分钟后，迅速以波长405nm的吸光度(以下为A₄₀₅)测定p-nitroaniline的游离。空白的A₄₀₅为代替基质溶液而添加三羟甲基氨基甲烷缓冲液进行测定，对照溶液的A₄₀₅为代替试样溶液而添加10％DMSO进行测定。此外，各试样的抑制活性由下面的式子求得的抑制率算出。

弹性蛋白酶抑制率(％)＝[(f-e)-{(b-a)-(d-c)}]/(f-e)×100

a：试样溶液的基质反应用的A₄₀₅(0分钟)

b：试样溶液的基质反应用的A₄₀₅(30分钟)

c：试样溶液的空白的A₄₀₅(0分钟)

d：试样溶液的空白的A₄₀₅(30分钟)

e：对照溶液的A₄₀₅(0分钟)

d：对照溶液的A₄₀₅(30分钟)

上述式中，弹性蛋白酶的活性被完全抑制时，弹性蛋白酶抑制率(％)为 100％。可以说显示出高“抑制率(％)”的化合物作为抑制剂的活性高。

弹性蛋白酶抑制试验中，对于阳性对照，替代试样溶液，使用添加50μL(反应时的浓度为80μg/mL)320μg/mL(摩尔浓度1.84 mM)的Phenylmethanesulfonyl fluoride；C₇H₇FO₂S(Sigma公司制、以下省略为PMSF)。

<结果>

(1)60％乙腈组分的弹性蛋白酶抑制试验

关于将蓝蔷薇花瓣提取物进行HP-20色谱柱分馏所得到的60％乙腈组分，测定试验浓度40、80、160μg/ml的弹性蛋白酶抑制率(％)时，成为如表7所示的那样。3-5Fra.含有蓝蔷薇特有的色素成分玫瑰飞燕草A1，通过TOF-MS分析确认了其中4Fra.和5Fra的含有率多。

60％乙腈组分4-9Fra.显示出比HP-20色谱柱分馏前的蓝蔷薇花瓣提取物更强的活性。尤其是由于60％乙腈组分6-9Fra.具有强的活性，因此明确了不只是玫瑰飞燕草类，蓝色色素化合物群整体均具有强的活性。

表7

表7：60％乙腈组分的弹性蛋白酶抑制率(％)

*80μg/mL PMSF的抑制率：94.1％

(2)玫瑰飞燕草A1的弹性蛋白酶抑制试验

关于由蓝蔷薇花瓣提取物纯化的蓝色色素成分玫瑰飞燕草A1，测定试验浓度40、80、160μg/ml的弹性蛋白酶抑制率(％)时，成为如表8所示的那样。由于玫瑰飞燕草A1显示出依存浓度的强的活性，因此也确认了玫瑰飞燕草A1的用量反应性。

此外，同时测定玫瑰飞燕草A1的结构的构成成分的特里马素1、宿主株的蓝色色素成分的玫瑰花青苷A1的活性，进行活性的强度的比较。玫瑰飞燕草 A1显示出与玫瑰花青苷A1同等以上的活性。由于相对于显示出弱的活性的蔷薇科植物中所含的水解性单宁的一种的特里马素1，玫瑰飞燕草A1及玫瑰花青苷A1显示出强的活性，因此认为由于含有蓝色色素化合物群，蓝色系的蔷薇花瓣由来的提取物比市售的蔷薇提取物具有更强的活性。

表8

表8.玫瑰飞燕草A1及类似化合物的弹性蛋白酶抑制率(％)

*80μg/mL PMSF的抑制率：79.5％

[实施例7]

(胶原蛋白合成促进试验)

<材料与方法>

将正常人纤维芽细胞使用含有0.5％胎牛血清的达尔伯克改良法MEM(0.5％ FBS-DMEM)以2.0×10⁴cell/well的细胞密度在96孔培养板中播种。播种24小时后，将0.5％FBS-DMEM与含有蓝蔷薇花瓣提取物的0.5％FBS-DMEM交换。蓝蔷薇花瓣提取物的试验浓度以无细胞阻碍性的蓝蔷薇花瓣提取物浓度为最高浓度，将其稀释。且作为阳性对照使用25μM的抗坏血酸磷酸镁盐(VC-PMg)。用含有蓝蔷薇花瓣提取物的色谱柱处理物的培养基进行24小时培养后，回收培养上清供于ELISA。细胞溶解于0.5％TritonX-100溶液后，用BCA法定量蛋白量。

将培养基及校正曲线用的Ⅰ型胶原蛋白溶液放入高吸附型ELISA培养板中，在4℃下进行一整天固定后，使用1％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃下粘连1 小时。一次抗体反应添加用0.3％BSA溶液稀释Anti-Human Collagen Type I antibody(Rabbit)后的物质，在37℃下使其反应1.5小时。二次抗体反应添加用磷酸缓冲液稀释Histofine MAX-PO(R)(Rabbit)后的物质，在37℃下使其反应1.5 小时。

接着，添加含有0.3mg/mL的2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt(ABTS)及0.03％的过氧化氢的磷酸-柠檬酸缓冲液(0.1M， pH4.0)使其反应30分钟，使用吸光微盘分析仪测定405nm的吸光度。

培养基中的Ⅰ型胶原蛋白量由用相同的ELISA培养板测定的校正曲线算出。通过培养基中的Ⅰ型胶原蛋白量除以总细胞的蛋白量从而算出每单位蛋白量的Ⅰ型胶原蛋白合成量。各个Ⅰ型胶原蛋白合成量使用Student t检验进行有意差检验，与对照进行比较。

<结果>

蓝蔷薇花瓣提取物的Ⅰ型胶原蛋白合成量如图2所示。通过试验试样的添加，Ⅰ型胶原蛋白合成量的有意增加得到确认。

[实施例8]

(MMP-1生成抑制试验)

MMP-1(基质金属蛋白酶-1)(英：Matrix metalloproteinase、MMP)也被称作间质性胶原酶，为与胶原蛋白的分解相关的金属蛋白酶(在活性中心排布金属离子的蛋白质分解酶)的一种。通过抑制MMP-1的生成，从而抑制胶原蛋白的分解。

对MMP-1生成的抑制中蓝蔷薇花瓣提取物的效果进行了研究。将来自新生儿的正常人皮肤纤维芽细胞(NHDF-NB从Kurabo株式会社购入)作为真皮纤维芽细胞使用，将MMP-1的生成量作为指标进行了研究。

在24孔培养板中播种真皮纤维芽细胞，在37℃、二氧化碳浓度5vol％中直到变得融合为止进行培养。其后，将溶解于DMSO中的蓝蔷薇花瓣提取物以0、 5、10、20mg/mL的浓度进行添加。以成为DMSO最终浓度为0.1％进行添加。培养24小时后，将1L-1β以最终浓度100pg/mL添加于培养基中。对于只添加 DMSO溶液的孔的一部分不添加1L-1β，将其作为对照。培养48小时后，回收培养上清，定量培养基中所分泌的proMMP-1，作为MMP-1的生成量。Pro MMP-1 的定量使用定量ELISA Kit(R&D Systems公司制)，按照所附带的说明书进行。定量结果作为以对于对照的MMP-1的生成量为100％的相对值(％)来表示(表 9)。

表9

对真皮纤维芽细胞仅添加1L-1β时，MMP-1的生成量为对照的大约4倍。而且，在以蓝蔷薇花瓣提取物处理细胞的情况下，任一浓度下均显著抑制了 1L-1β引起的MMP-1的生成。

由这些结果显示出，蓝蔷薇花瓣提取物具有优异的MMP-1生成抑制效果。产业上的可利用性

本发明的透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂通过作为有效成分含有玫瑰花青苷类化合物或玫瑰飞燕草类化合物，从而对干燥、皱纹、及松弛的防止及改善显示出优异的效果，因此对用于保湿用及抗老化用的皮肤外用剂、皮肤化妆料及医药部外品的开发及制造有益。

Claims

1.选自由下述通式Ⅰ所表示的玫瑰花青苷类化合物及由下述通式Ⅱ所表示的玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物在制造透明质酸酶抑制剂中的用途，

式Ⅰ中，R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团a：

但是基团a中葡萄糖的1位的羟基的配位即波浪线表示α体和β体的互变异构性，

或为下述的基团b：

而且R₂为-OH；

式Ⅱ中，R₁为下述的基团a：

但基团a中葡萄糖的1位的羟基的配位即波浪线表示α体和β体的互变异构性，

且R₂为-OH，或R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团b：

且R₂为-OH。

2.选自由下述通式Ⅰ所表示的玫瑰花青苷类化合物及由下述通式Ⅱ所表示的玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物在制造胶原蛋白酶抑制剂中的用途，

式Ⅰ中，R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团a：

或为下述的基团b：

而且R₂为-OH；

式Ⅱ中，R₁为下述的基团a：

且R₂为-OH，或R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团b：

且R₂为-OH。

3.选自由下述通式Ⅰ所表示的玫瑰花青苷类化合物及由下述通式Ⅱ所表示的玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物在制造弹性蛋白酶抑制剂中的用途，

式Ⅰ中，R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团a：

或为下述的基团b：

而且R₂为-OH；

式Ⅱ中，R₁为下述的基团a：

且R₂为-OH，或R₁及R₂一起形成-O-，或R₁为下述的基团b：

且R₂为-OH。

4.根据权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于，所述玫瑰花青苷类化合物为选自以下：由下述式所表示的玫瑰花青苷A1、

但式中葡萄糖的1位的羟基的配位即波浪线表示α体和β体的互变异构性，由下述式所表示的玫瑰花青苷A2、

及由下述式所表示的玫瑰花青苷B

中的一种以上的化合物。

5.根据权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于，作为所述玫瑰花青苷类化合物，使用含有所述玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物的提取物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，包含所述玫瑰花青苷类化合物的蔷薇科植物为选自Madame Violet、Purple Rain、Lavande、Manhattan Blue、Chantilly Lace、BlueMoon、Tasogare、Charles de Gaulle、Violet Dorry、Blue Ribbon、Aozora、Lady X、BlueBajou及Sterling Silver中的一种以上的蔷薇科植物。

7.根据权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于，所述玫瑰飞燕草类化合物为选自以下：由下述式所表示的玫瑰飞燕草A1、

但式中葡萄糖的1位的羟基的配位即波浪线表示α体和β体的互变异构性，由下述式所表示的玫瑰飞燕草A2、

及由下述式所表示的玫瑰飞燕草B

中的一种以上的化合物。

8.根据权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于，包含含有所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物的提取物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，包含所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物为具有类黄酮3’，5’－羟化酶基因的蔷薇科植物。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，包含所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物为APPLAUSE，APPLAUSE为注册商标。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，包含所述玫瑰飞燕草类化合物的蔷薇科植物为SUNTORY blue rose APPLAUSE，SUNTORY blue rose APPLAUSE为商标。

12.根据权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于，所述透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂为皮肤外用剂。

13.根据权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于，所述透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂为皮肤化妆料。

14.根据权利要求1～3中的任意一项所述的用途，其特征在于，所述透明质酸酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂或弹性蛋白酶抑制剂为医药部外品。

15.选自权利要求1～4及7中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物或权利要求5、6及8～11中的任意一项所定义的提取物在制造用于防止或改善皮肤的干燥、皱纹及松弛的皮肤外用剂中的用途。

16.选自权利要求1～4及7中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物或权利要求5、6及8～11中的任意一项所定义的提取物在制造用于防止或改善皮肤的干燥、皱纹及松弛的皮肤化妆料中的用途。

17.选自权利要求1～4及7中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物或权利要求5、6及8～11中的任意一项所定义的提取物在制造用于防止或改善皮肤的干燥、皱纹及松弛的医药部外品中的用途。

18.选自权利要求1～4及7中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物或权利要求5、6及8～11中的任意一项所定义的提取物在制造MMP-1生成抑制剂中的用途。

19.选自权利要求1～4及7中的任意一项所定义的玫瑰花青苷类化合物及玫瑰飞燕草类化合物中的一种以上的化合物或权利要求5、6及8～11中的任意一项所定义的提取物在制造胶原蛋白合成促进剂中的用途。