JP6553790B1 - コラーゲン産生促進用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
近年、皮膚の弾力性や、シワの改善を目的としてコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を経口摂取することが行われており、「美容ドリンク」や「美肌飲料」などの名称でコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を含む飲料が市販されている。これらの飲料は、1回当たりコラーゲン換算で900〜10000mgを摂取することが効果的であるといわれている。
経口摂取したコラーゲンやコラーゲンペプチドがどのような作用機序で皮膚の弾力性やシワの改善に働くのか、詳細な機構は明らかになっていないが、一部のペプチドが、コラーゲンを経口摂取すると血液中に出現することが知られている。そしてそのペプチドが線維芽細胞のI型コラーゲンの産生を促進することも知られている。
特許文献2には、前記のコラーゲントリペプチドとフラボノイドの一種であるシリマリンとリンゴ抽出物が、コラーゲンと線維芽細胞からなるコラーゲンゲルを収縮させ、シワ改善に用いることができることが記載されている。
特許文献3には、Gly−Pro−Hyp、Gly−His−Lys、Lys−Thr−Thr−Lys−Ser、またはGly−Glu−Pro−Argの構造を有するコラーゲン由来のペプチドがシリビンと相乗的にI型コラーゲンの産生を促進することが記載されている。
特許文献4では、コラーゲンを経口摂取した直後に血液中に出現する複数のトリペプチド又はジペプチドを合成して、Ala−Hyp−Gly、Pro−Hyp−Gly、Pro−Hyp、Leu−Hyp、Ala−Hypのジペプチドまたはトリペプチドが培養マウス線維芽細胞に対してコラーゲン合成を促進することを確認して、その結果に基づき、皮膚コラーゲン産生促進剤として利用することを提案している。
特許文献5にはGly−Pro、Pro−Gly、Pro−Hyp、Hyp−Gly、Gly−Hypのいずれかの配列を有するジペプチドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤が記載されている。
このように、これまでの研究開発から、コラーゲンタンパク質の加水分解物やコラーゲンペプチド、アミノ酸など多くの物質がコラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなっており、引き続き有用な物質の探索が行われている。
特許文献7には、特許文献6と同様の抽出物であって、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも1種のバラ科植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られた抽出物が記載されている。そして、この抽出物に抗インフルエンザウィルス作用を見いだし、これを有効成分とする抗インフルエンザウィルス剤及びこれを配合した飲食品の発明が記載されている。
バラ科バラ属の植物の花弁及び/またはつぼみのエキスにコラーゲンペプチドの作用を増強するという知見は、従来技術には見いだせない新規な発見である。この結果に基づき本発明をなした。
すなわち、本発明は、コラーゲン産生促進作用を有する、バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する新規な組成物を提供することを課題とする。
(1)バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとトリペプチドを10〜20質量%含有するコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物であって、有効成分としてバラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキス1質量部に対し、トリペプチドを10〜20質量%含有するコラーゲンペプチドを40〜640質量部の比率で含有するコラーゲン産生促進組成物。
(2)バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる1種以上である(1)に記載の組成物。
(3)バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである(1)または(2)に記載の組成物。
(4)コラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素分解した酵素分解物である(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
本発明の組成物について説明する。
バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみは、どのような品種から採取したものでもかまわないが、園芸種として大量に栽培されているものが産業上好ましい。このようなものとして特にガリカローズ(Rosa gallica)、ドッグローズ(Rosa canina)、アポテカリーズローズ(Rosa gallicaofficinalis)、スイートブライヤー(Rosa rubiginosa)、ダマスクバラ(Rosa damascena trigintipetala)、セイヨウバラ(Rosa centifolia)及びハマナシ(Rosa rugosarubra)が好ましい。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、市販されているものを使用することができる。本発明に適した、バラのつぼみのエキスの噴霧乾燥品である丸善製薬株式会社製の「ローズバッツエキスパウダーMF」を例示できる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物エキスは、ポリフェノールを5質量%以上含有し、好ましくは10〜80質量%、特に好ましくは10〜20質量%含有するものである。
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、豚、ウシなどの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。
(1)試験試料(サンプル)
バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売しているローズバッツエキスパウダーMFを用いた。またコラーゲンペプチドとして、コラーゲントリペプチドが10〜20質量%含まれているゼライス株式会社製のコラーゲンペプチドHACP−01を用いた。
1)使用細胞
正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF:ロンザジャパン株式会社)
2)試験試料(サンプル)
コラーゲンペプチド(HACP−01:ゼライス株式会社:コラーゲントリペプチド10〜20質量%含有品)、バラつぼみエキス(ローズバッツエキスパウダーMF:丸善製薬株式会社:ポリフェノール10〜20質量%含有品)を試験試料(サンプル)とした。
細胞は37℃、5%二酸化炭素、95%空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清(FBS)(Hyclone laboratories)10%、penicilin−Streptmycin(Sigma Aldrich)1%を添加したダルベッコ改変イーグル培地(高グルコース含有、life technologies)を用いた。以降、この培地を基礎培地と表記する。通常培養には10cmまたは15cmディッシュを用い、継代時の細胞剥離には0.05%Trypsin−EDTA(Sigma Aldrich)を使用した。
各サンプルは培地で溶解した。UVA照射前は基礎培地を用い、UVA照射後はFBS不含基礎培地を用いた。
サンプルの最終濃度
バラつぼみエキス(ローズバッツエキスパウダーMF) 6.25、12.5、25、50(μg/mL)
コラーゲンペプチド(HACP−01) 2000、4000、8000(μg/mL)
併用 各濃度の組合せ
下記の表1に示す添加濃度で試験を実施した。
形態観察には倒立型システム顕微鏡(OLYMPUS IX70)を用いて行った。
24wellプレートに細胞を1×105 cells/500μL/wellで播種した。1日前培養した後、サンプル入り基礎培地500μLと交換して1日培養した。その後、ハンクス平衡塩溶液(HBSS、カルシウム・マグネシウム含有、フェノールレッド不含)500μLに置換し、蓋を取ったディッシュをUVA照射ランプの下に一列に置いて12J/cm2照射した(約132分)。照射後、HBSSを取り除き、サンプル入りのFBS不含基礎培地500μLと交換して2日間培養した。培地を回収し、−80℃中に保存した。培地回収後、ディッシュを500μLのリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.1Nの水酸化ナトリウム溶液200μLで懸濁し、細胞を回収した。
回収した培地は4℃、10,000×gで10分間遠心し、その上清中のI型コラーゲン量をCollagen Type I, Human, ELISA Kit(株式会社エーセル)を用いて測定した。細胞懸濁液は4℃、10,000×gで10分間遠心し、その上清中のタンパク量をPierce BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher SCIENTIFIC)を用いて測定した。培地中のI型コラーゲン量は細胞タンパク量で補正した。
コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスによるI型コラーゲン産生効果を図1に示す。
なお、コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスによるコラーゲン産生能の相乗効果については以下の基準で判定した。
相乗効果:理論値<実測値
理論値=(A/D−1)×100+(B/D−1)×100
実測値=(C/D−1)×100
A:バラつぼみエキス単独添加によるI型コラーゲン産生量
B:コラーゲンペプチド単独添加によるI型コラーゲン産生量
C:バラつぼみエキスとコラーゲンペプチドの併用によるI型コラーゲン産生量
D:コントロール群(無添加サンプル)のI型コラーゲン産生量
さらに、コラーゲンペプチドとバラつぼみエキスの併用効果の検定には、得られた測定結果について二元配置分散分析法(繰り返しあり)を用いた。以上の測定結果と併用効果の判定表を、下記の表2に示す。
以上の試験結果の解析から、バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する組成物は、細胞の生育に影響を及ぼさずにコラーゲン産生を促進することがわかった。またバラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの配合比は、バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキス1質量部に対してコラーゲンペプチドを40〜640質量部を含むように調製することが効果的であるものと考えられた。
本発明の効果を正しく理解するために、比較試験例としてコラーゲントリペプチド含有量が5質量%未満の低分子コラーゲンを用いた試験を同様にして実施した。
バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売
しているローズバッツエキスパウダーMFを用いた。
またコラーゲントリペプチドの含有量が5質量%未満の低分子コラーゲン(平均分子量5000)を用いた。
1)使用細胞
正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF:ロンザジャパン株式会社)
2)試験試料(サンプル)
低分子コラーゲン(ゼライス株式会社)、バラつぼみエキス(ローズバッツエキスパウダーMF:丸善製薬株式会社:ポリフェノール10〜20質量%含有品)を試験試料(サンプル)とした。
細胞は37℃、5%二酸化炭素、95%空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清(FBS)(Hyclone laboratories)10%、penicilin−Streptmycin(Sigma Aldrich)1%を添加したダルベッコ改変イーグル培地(高グルコース含有、life technologies)を用いた。通常培養には10cmまたは15cmディッシュを用い、継代時の細胞剥離には0.05%Trypsin−EDTA(Sigma Aldrich)を使用した。
各サンプルは培地で溶解した。UVA照射前は基礎培地を用い、UVA照射後はFBS不含基礎培地を用いた。
サンプルの最終濃度
バラつぼみエキス(ローズバッツエキスパウダーMF) 6.25、12.5、25(μg/mL)
低分子コラーゲン 2000、8000(μg/mL)
併用 各濃度の組合せ
下記の表3に示す添加濃度で試験を実施した。
形態観察には倒立型システム顕微鏡(OLYMPUS IX70)を用いて行った。
24wellプレートに細胞を1×105cells/500μL/wellで播種した。1日前培養した後、サンプル入り基礎培地500μLと交換して1日培養した。その後、ハンクス平衡塩溶液(HBSS、カルシウム・マグネシウム含有、フェノールレッド不含)500μLに置換し、蓋を取ったディッシュをUVA照射ランプの下に一列に置いて12J/cm2照射した(約132分)。照射後、HBSSを取り除き、サンプル入りのFBS不含基礎培地500μLと交換して2日間培養した。培地を回収し、−80℃中に保存した。培地回収後、ディッシュを500μLのリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.1Nの水酸化ナトリウム溶液200μLで懸濁し、細胞を回収した。
回収した培地は4℃、10,000×gで10分間遠心し、その上清中のI型コラーゲン量をCollagen Type I,Human,ELISA Kit(株式会社エーセル)を用いて測定した。細胞懸濁液は4℃、10,000×gで10分間遠心し、その上清中のタンパク量をPierce BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher SCIENTIFIC)を用いて測定した。培地中のI型コラーゲン量は細胞タンパク量で補正した。
バラつぼみエキスと低分子コラーゲンによるI型コラーゲン産生効果を、表4及び図2に示す。
相乗効果:相加効果の理論値<実測値
相加効果の理論値=(A/D−1)×100+(B/D−1)×100
実測値=(C/D−1)×100
A:バラつぼみエキス単独添加によるI型コラーゲン産生量
B:低分子コラーゲン単独添加によるI型コラーゲン産生量
C:バラつぼみエキスと低分子コラーゲンの併用によるI型コラーゲン産生量
D:コントロール群(無添加サンプル)のI型コラーゲン産生量
判定結果を表5に示す。
コラーゲンペプチド(ゼライス株式会社)6g、バラつぼみエキス(丸善製薬株式会社
)0.01g、ビタミンC300mg を用い、常法によりドリンク剤を製造した。
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ(Rosa gallicaofficinalis)300gに50重
量%エタノールを2000mL加え、還流冷却器を付けて、80℃にて1時間抽出した後
、濾紙で濾過して抽出液1を得た。また、抽出残渣に50重量%エタノール1500mL
を加え、同様に還流冷却器を付けて、80℃にて1時間抽出した後、濾紙で濾過して抽出
液2を得た。得られた抽出液1、2を合せて減圧下で濃縮、乾燥させて粉末エキス100
gを得た(収率33.3%)。
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ(Rosa centifolia)300gに水2000mLを加え、
90℃にて1時間抽出を行った後、濾紙にて濾過し、抽出液を得た。得られた抽出液を減
圧下で濃縮、乾燥させて、製造例2の粉末エキス100gを得た(収率33.3%)。
コラーゲンペプチドの製造例
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン30gを蒸留水300ml
に加温溶解し、0.45μmのフィルターで滅菌ろ過した。
このゼラチン30gを蒸留水300mlに加温溶解した。コラゲナーゼタイプI(Wo
rthington Biochemical Corp.)300mgを加え、アンモ
ニア水にてpHを7.5に調整した後37℃で1時間放置した。反応終了後、反応液を1
00℃で3分間加熱しコラゲナーゼを失活させ、次いで0.45μmのフィルターで滅菌
ろ過した。このろ液をCDP−0とした。このろ液CDP−0を蒸留水で平衡化したSe
phadex LH−20(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)によりゲルろ過し、2
つの画分(CDP−1,CDP−2)に分け、それぞれを凍結乾燥した。それぞれのピー
クをSuperdex Peptide HR10/30(GEヘルスケア・ジャパン株
式会社)に供し、0.3M NaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7
.2)を溶出液に用いて分子量を求めたところ、CDP−1が約12000〜500に分
布し、CDP−2が約350だった。CDP−2の約50%がGly−Pro−Hypで
あった。
Claims (4)
- バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとトリペプチドを10〜20質量%含有するコラーゲンペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物であって、有効成分としてバラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキス1質量部に対し、トリペプチドを10〜20質量%含有するコラーゲンペプチドを40〜640質量部の比率で含有するコラーゲン産生促進組成物。
- バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる1種以上である請求項1に記載の組成物。
- バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである請求項1または2に記載の組成物。
- コラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素分解した酵素分解物である請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
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