KR20150058715A - 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 티로시나제 활성 및 멜라닌의 생성을 저해하는 효과가 있어, 미백 활성 용도의 화장료 조성물 또는 멜라닌 과다생성으로 인한 질병의 예방 및 치료용 의약 조성물로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 조성물{THE COMPOSITION FOR TYROSINASE INHIBITORY ACTIVITY AND MELANIN INHIBITORY}

본 발명은 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물과 약제학적 조성물에 관한 것이다.

조류(algae)는 육상식물을 제외한 모든 광합성 생물의 통칭으로 분류학적 용어는 아니며, 매우 다양한 분류군을 지칭하는 일반 용어이다. 이들 중 현미경으로 관찰할 수 있는 단세포성 조류를 미세조류(microalgae)라 하며, 대부분의 식물성 플랑크톤이 이에 속한다. 조류는 지구상에서 전체 광합성의 90%를 담당하는 것으로 추정되며, 지구 생태계의 1차 생산자로 매우 중요한 위치를 점하고 있다.

이러한 미세조류는 1차 대사산물인 지질, 단백질, 탄소화물 뿐만 아니라, 2차 대사산물인 생리활성물질도 매우 다양하게 함유하고 있다. 미세조류로부터 획득할 수 있는 가장 풍부한 물질은 단백질이나, 단백질은 주로 미세조류 자체를 이용한다는 측면에서 고려되어야 할 성분이고, 미세조류 생산 물질을 이용한다는 측면에서 본다면, 지질, 탄소화물, 색소, 비타민, 미네랄 및 특수 성분을 들 수 있다.

이에 최근 국내외적으로 미세조류 생명공학의 연구와 산업적 이용에 대한 기술개발이 활발해지면서 해양생물공학의 유망한 개척 분야로 인식되고 있다. 미세조류는 건강식품 및 대체에너지원으로 잘 알려져 있으며, 수산양식용 사료, 의약원료물질의 생산, 생화학물질의 생산 등으로 그 이용성이 확대되고 있다.

한편, 사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)라 불리는 피부 세포에서 만들어져 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 여기서 멜라닌은 핵주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다. 생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고, 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져나갈 때 같이 피부에서 떨어져나가는 것으로 제거된다.

멜라닌 합성 과정을 살펴보면, 멜라노사이트 내의 멜리노좀에서 먼저 티로신을 기질로 하여 티로시나아제라는 효소가 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논 (DOPAquinone)을 생성시키고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬 (DOPAchrome)을 거쳐 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀이라는 소포체를 통해 케라티노사이트로 옮겨지고 여기에서 약 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부 표면으로 나와 각질과 함께 소실된다. 그러나, 이 과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 요인에 의해 멜라닌이 과다 생성되고 각화 작용이 원활히 이루어지지 않아 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소 침착 현상이 일어나게 된다. 따라서 이러한 색소 침착 현상을 방지하기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다.

피부미용을 위한 미백제의 개발에 있어서, 종래의 피부 미백효과를 갖는 조성물의 특징은 착색의 주원인인 멜라닌을 타겟으로 하여, 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색하는 방법과 멜라닌 합성을 감소시키기 위한 티로시나제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있다. 멜라닌의 색소 침착을 감소시키기 위해서 사용된 피부 미백성분으로는, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 사용되어 왔다. 그러나 상기 피부 미백성분들은 처방계 중에서 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

또한 다수의 식물 추출물 및 생약재 추출물 등이 티로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 안정성, 변색 가능성 등의 측면에서 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점을 갖고 있으며, 아직 뛰어난 효과를 나타내지도 못하고 있는 실정이다. 따라서, 피부 미백의 효과가 뛰어나고 안전성이 확보된 천연물 개발의 필요성이 높아지고 있다.

KR 등록 제10-0523241호 KR 출원 제10-2012-0009404호

이에 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 멜라닌의 생성을 억제하는 천연물을 연구하던 중, 미세조류의 추출물의 멜라닌의 생성 저해 효과를 포함할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은, 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.

또한 본 발명은 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 다른 해결과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은,

일 양태로서, 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 다른 양태로서, 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 미세조류 추출물을 포함하는 조성물은, 티로시나제 활성 및 멜라닌의 생성을 저해하는 효과가 있어, 미백 활성 용도의 화장료 조성물 또는 멜라닌 과다생성으로 인한 질병의 예방 및 치료용 의약 조성물로서 활용될 수 있다.

더욱이 본 발명에 다른 조성물은 화학적 물질이 아닌 천연물에서 유래한 성분인 미세조류 추출물을 유효성분으로 포함함으로써 세포독성이나 부작용 등을 현저하게 감소시키면서 피부를 보호할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 미세조류 4종 추출물의 티로시나제 활성 저해율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 미세조류 4종 추출물의 DOPA 산화활성 저해율을 나타낸 그래프이다.
도 3는 미세조류 4종 추출물에 대한 멜라닌 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4은 니치아 속(Nizchia sp.) 추출물의 티로시나제 활성 저해율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 니치아속(Nizchia sp.)추출물의 티로시나제 유전자 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 6는 니치아속(Nizchia sp.) 추출물의 TRP-1 유전자 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 니치아속(Nizchia sp.) 추출물이 세포내의 TRP-2 유전자 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 니치아속(Nizchia sp.) 추출물의 티로시나제, TRP-1, TRP-2, β-actin유전자 발현 저해를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

일 양태로서 본 발명은, 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물을 제공한다.

니치아 속은 저서미세조류에 속하는 부유성의 식물 플랑크톤으로, 광합성을 하기 때문에 퇴적물 내에서 빛 투과 한계점인 표층 약 2∼4 mm 상층부에서 주로 서식하는 미세조류로, 본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 니치아 속 추출물은 알부틴과 거의 동등한 수준의 멜라닌 생성저해율 및 티로시나제 활성저해율을 나타냄을 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류의 추출은 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글리콜, 헥산 및 이의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추출용매를 사용하여 추출될 수 있다. 바람직하게는 물과 알코올의 혼합용매를 이용하며, 가장 바람직하게는 70% 에탄올 수용액을 사용하여 추출한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항산화활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류의 추출물은 특정의 범위에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 화장료 조성물의 총 중량에 대해 0.0001 내지 30 중량% 함유되는 것이 좋다. 상기 추출물의 함량이 0.0001중량% 미만인 경우에는 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해의 미백활성 효과가 나타나지 않으며, 30중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 미세조류 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 비타민, 펩티드, 다당, 지질 등을 더 포함할 수 있으며, 그 외 통상 화장료에 배합되는 유지성분, 보습제, 계면활성제, 안료, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 향료, 정제수 등을 포함할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 미세조류 추출물 이외에 미백 활성을 나타내는 다른 유효성분을 1 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유지, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 양태로서 본 발명은 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

멜라닌 과다 생성으로 인한 질병으로는 홍반, 색소침착, 피부의 흑화 현상, 피부노화, 피부암 유발, 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포사멸 등을 들 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 수질추출물은 이를 위하여 전신 투여(예를 들어 경구 투여) 및 국소투여(예를 들어 피부도포) 방법을 각각 또는 동시에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류의 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.0005~30중량%, 바람직하게는 0.01~10중량% 포함될 수 있으나, 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 본 발명의 조성물의 최적 투여량은 연령, 개인차, 증상 등에 따라 적절히 결정되지만, 사람에게 투여하는 경우의 투여량은 통상 0.01~100 mg/kg, 바람직하게는 0.1~10 mg/kg이며, 이 양을 1일 1회 또는 수 회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀, 연고제 등의 형태로 사용될 수 있고, 경구 또는 비경구로 적용하기에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제가 함께 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 환제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리, 주사제, 외용제 및 사용하기에 적합한 임의의 기타 형태에 대해 일반적으로 비독성인 제약상 허용되는 담체와 함께 혼합될 수 있다. 사용 가능한 담체에는 고체상, 반고체상 또는 액체상의 포도당, 유당, 아라비아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산 마그네슘염, 활석, 옥수수 전분, 각질 (角質), 콜로이드 성 실리카, 감자 전분, 우레아, 쇄 길이가 중간 정도인 트리글리세리드, 덱스트란 및 제제의 제조에 사용하기에 적합한 기타 담체가 포함된다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 착색제 및 향료제가 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하기로 하나 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 해양 미세조류 추출물 제조

동결건조된 해양 미세조류 4종 (N. oceanica, T. suecica, P. tricornutum 및 Nitzschia sp.)을 준비하고, 각각의 미세조류 300g에 70% 에탄올 1.2 L(미세조류 중량대비 4배)넣고 40℃에서 4 시간 동안 추출하였다. 교반이 완료되면 필터지(Whatman No. 5)를 이용하여 잔사와 조추출액을 분리하였다. 분리된 조추출액은 20000xg, 30 분간 고속원심분리하여 남아 있는 미세잔사를 제거하였다. 상등액을 증발기(R1110 Rotary Evaporator, Eyela, 일본)를 이용하여 농축하였다. 에탄올을 완전히 증발시키고 조추출액의 무게를 칭량하였다. 과정을 2 회 더 추가로 수행하여 조추출액의 최종 수율을 비교하여 계산하였고, 추출과정을 2회 더 추가로 수행하였다.

상기 해양 미세조류 4종을 70% 에탄올을 이용하여 추출한 결과, 조추출액 수율은 미세조류 4종 모두에서 1차>2차>4차 추출의 순으로 점차 낮아지는 뚜렷한 경향을 보였다. 특히 니치아 속(Nitzschia sp.)이 가장 높은 조추출액 수율을 보였으며, P. tricornutum > T. suecica > N. oceanica의 순으로 높았다. 측정결과는 하기 표 1에 나타내었다.

종명	1차 추출	2차 추출	3차 추출	총합
Tetraselmis suecica	75.22±15.855 (25.07±5.285%)	28.47±9.203 (9.49±3.067%)	15.14±5.003 (5.04±1.667%)	118.83
Nannochloropsis oceanica	59.10±2.845 (19.70±0.948%)	32.23±1.678 (10.74±0.968%)	19.72±2.689 (6.57±0.896%)	111.05
Phaeodactylum tricornutum	94.95±3.345 (31.65±1.114%)	32.86±1.909 (11.11±0.636%)	13.48±1.362 (4.49±0.453%)	141.29
Nitzschia sp .*	123.29 (41.09%)	43.72 (14.57%)	19.75 (6.58%)	186.76

또한, 조추출액의 수율이 모두 10% 이상으로 비교적 높게 나타났다. 이는 100% 에탄올과 같은 단일용매만 사용했을 때보다 물이 첨가된 70% 에탄올을 사용하였기 때문에 물에 용해되는 물질도 함께 추출되었기 때문인 것으로 판단된다.

시험예 1: 티로시나제 활성저해 시험

본 시험예에서는 상기 실시예 1에 따른 미세조류 추출물을 시험물질 시료로 하여, 멜라닌 색소 생성에 촉매제 역할을 하는 티로시나제의 활성 저해효과를 확인하였다.

구체적으로 음성대조, 양성대조(알부틴) 및 미세조류 추출물 시료를, 96-웰 플레이트의 각 웰에 20μL의 시료와 0.1M 인산완충액(pH 6.8)를 120 μL, 2 KU/mL 티로시나제 20 μL를 순서대로 첨가한 후 37℃, 5분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader(spectra Max M5, Molecular Devices)로 490nm에서 흡광도를 측정(반응 전)하였다.

이후, 1.5 mM농도의 L-Tyrosine 40 μL를 37℃에서 15분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정(반응 후)하였다.

상기 4종 미세조류 추출물의 티로시나제 활성저해율은 하기 표 2 및 도 1에 나타내었고, 티로시나제 활성저해율은 하기 식에 의하여 구하였다.

티로시나제 활성저해율(%)={100-(시료 흡광도/ 음성대조군 흡광도)x100

반응 흡광도= 반응후 흡광도 - 반응전 흡광도

종류	티로시나제 활성저해율	SD
0	0	0.00
Nanochloropsis Oceanica	7.68	2.02
Phaeodactylum Tricornuturm	13.57	0.56
Nizchia. sp.	70.87	0.81
Tetraselmis Suecica	31.42	1.53
알부틴	92.43	0.38

상기 표 2 및 도 1에 나타난 바와 같이, 4종의 미세조류 추출물을 가지고 최고농도 약 1mg/ml로 공비4로 한 티로시나제 활성저해 시험결과, 양성대조물질인 알부틴보다 높은 효과를 가진 물질은 없었으나, 니치아 속(Nizchia . SP) 추출물 500μg/ml에서 활성 저해율이 70%로 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다.

시험예 2: DOPA 산화활성저해 시험

본 시험예에서는 상기 실시예 1에 따른 미세조류 추출물을 시험물질 시료로 하여, DOPA 산화활성 저해효과를 확인하였다.

먼저, 96-웰 플레이트에 음성대조, 양성대조(알부틴) 및 시험물질을 각각 20 μL, 0.1M 인산완충액(pH 6.8)을 각각에 120 μL를 첨가하였다. 2 KU/mL 티로시나제 20 μL를 37℃에서 5분 동안 반응 후 ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정 (반응 전)하였다.

이후, 4mM의 L-DOPA 40μL를 37℃에서 15분 동안 반응 후 ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정 (반응 후)하였다.

상기 미세조류 추출물의 DOPA 산화 활성저해율은 하기 표 3 및 도 2에 나타내었고, DOPA 산화 활성저해율은 하기 식에 의하여 구하였다.

DOPA 산화 활성저해율(%)={100-(시료 흡광도/ 음성대조군 흡광도)}x100

반응 흡광도= 반응후 흡광도 - 반응전 흡광도

종류	티로시나제 활성저해율	SD
0	0	0.00
Nanochloropsis Oceanica	0.90	0.43
Phaeodactylum Tricornuturm	8.05	1.71
Tetraselmis Suecica	17.83	1.42
Nizchia. SP	39.47	1.23
알부틴	17.99	1.54

상기 표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 4종의 미세조류 추출물을 가지고 최고농도 약 1mg/ml 로 공비4로 하여 DOPA 산화 활성저해 시험결과, 니치아 속(Nizchia sp .)이 500μg/mL에서 양성대조물질인 알부틴보다 높은 효과를 보였다.

시험예 3: 세포독성 시험(MTT assay)

본 시험예에서는 상기 시험예 1 및 시험예 2의 결과를 토대로, 니치아 속 추출물을 시험물질 시료로 하여, MTT 분석 방법으로 세포독성을 시험하였다.

Melan-a를 1.5x10⁴cells/180㎕/96-웰 플레이트로 분주한 후, 24시간 배양하고, 상기 시험물질을 공비4로 5단계 희석하여 0, 34, 136, 543, 2173, 8690μg/ml의 농도로 제조하고, 세포에 20 μL/well 씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양상등액을 제거하여 PBS로 1회 세척 후, MTT시약을 200 μL/well씩 첨가하고 처리하여 4시간 추가 배양하였다. 배양액 170μL/well를 완전히 제거하고, 150μL의 DMSO를 첨가하여 현탁한 후, ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

니치아속(Nizchia sp.) 및 양성대조물질인 알부틴의 세포독성 시험결과는 하기 표 4에 나타내었다.

	처리농도 (μg/mL)	세포 생존도(%)	SD
Nizchia sp.	0	99.90	0.17
	34	92.35	0.13
	136	81.90	3.96
	543	70.81	2.27
	2,173	51.65	1.60
	8,690	20.69	1.59
알부틴	8	98.67	1.83
	31	97.10	3.42
	125	87.11	4.45
	500	56.99	4.85
	2,000	20.27	0.20

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 니치아 속(Nizchia sp .)의 농도가 0μg/mL처리군에서 99.90%, 543μg/mL처리군에서 70.81%, 8,690μg/mL 처리군에서 20.69%의 세포생존도(Cell viability)를 나타내었다. 즉, 니치아 속(Nizchia sp.)의 농도가 증가함에 따라 세포 독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 4: 세포내 멜라닌 생성저해 시험

본 시험예에서는 상기 시험예 1 및 시험예 2의 결과를 토대로, 니치아 속 추출물을 시험물질 시료로 하여, 세포내 멜라닌의 생성저해를 시험하였다.

먼저, 24-웰 플레이트에 Melan-a를 1x10⁴cells/900μL로 분주하고 200nM의 TPA를 첨가하여 37℃, 10% CO₂조건으로 24시간 배양하였다. 또한 음성대조물질, 양성대조물질(알부틴), 시험물질을 100 μL 처리하여 72 시간 배양하였다. 이후, 배지를 완전히 제거하고 시험물질을 재처리 하여 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 후, 10% DMSO가 첨가된 1 M NaOH 150 μL를 넣고 현탁하여 e-tube로 옮기도록 하였다. 100℃ 히팅블럭에서 30분 반응 후 15000 rpm으로 5분간 원심분리 후 상등액만 수득하였다. 수득한 상등액을 100 μL씩 96-웰 플레이트로 옮겨 ELISA reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상등액과 표준물 (BSA, 10% DMSO함유 1 M NaOH로 희석)을 25 μL씩 e-tube로 옮긴다음, 각 시료에 RC 시약 I을 125 μL 넣고 와류시키고, 1분 방치하였다. 여기에 RC 시약 II를 125 μL 넣고 와류시킨 다음, 15000 rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상등액은 버리고 튜브를 건조시킨 다음, 시약 A (DC 시약 S 5 μL + DC 시약 A 250 μL)를 127 μL씩 넣어 와류시켜 5분 동안 방치하고, 상기 DC 시약 B를 1 mL 넣어 즉시 와류시키고, 15분 방치 후 UV-분광광도계를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정(단백질 함량)하였다.

그 결과는 하기 표 5에 나타내었고, 세포내 멜라닌 함량은 하기 식에 의하여 구하였다.

세포 내 멜라닌함량(%) = (405 nm 멜라닌 흡광도)/(750 nm 단백질 흡광도)

	농도조건(μg/mL)	melanin/protein (%)
Nizchia. SP	0	100
	136	72.42
	272	61.97
	543	60.40
	1,087	57.84
	2,173	48.33
알부틴	125	42.51

상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알부틴 125 μg/mL 에서의 세포 내 멜라닌 생성율은 약 42.51%로, 음성대조군과 비교하였을 때 멜라닌 생성 저해를 나타내었다. 니치아 속 추출물의 농도가 높아짐에 따라 농도 의존적으로 멜라닌 생성율이 감소되는 경향을 나타내었고 2,173μg/mL 농도에서 알부틴과 비슷한 멜라닌 생성 저해율을 나타내는 것을 확인하였다.

시험예 5: 세포내 티로시나제 활성저해 시험

150mm 세포배양접시 (접착세포, 표면처리)에 Melan-a를 1.2x10⁶cells/27mL로 분주하고 200nM TPA를 37℃에서 10% CO₂조건으로 24시간 배양한 다음, 세포를 회수하고 DPBS로 1회 세척하였다. 다음으로, 12000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 버리고, 세포 펠렛에 100μL 의 단백질 추출용액을 넣고 10분 간격으로 와류(ice상태에서 진행)시켰고, 이를 4회 반복하여 시행하였다. 14000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 e-tube로 옮긴 후, 10000 rpm으로, 4℃에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다.

96-웰 플레이트에 0.1 M 인산완충액 (pH 6.8)을 140μL 첨가하고, 티로시나제 효소원(세포로부터 얻은 상층액)을 20 μL씩 첨가하였다. 이후, 37℃에서 5분간 반응한 후 ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정(반응 전)하였다.

또한 4 mM DOPA 40μL를 첨가하여 37℃에서 40분간 반응한 후 ELISA reader로 490 nm에서 흡광도 측정(반응 후)하였다.

시험결과는 하기 표 6 및 도 4에 나타내었다.

	처리농도 (μg/mL)	세포내 티로시나제 활성저해율	SD
Nizchia. SP	0	0	0.00
	136	0	1.44
	272	15.23	1.65
	543	45.00	4.79
	1,087	67.23	4.00
	2,173	85.24	2.79
알부틴	125	87.81	1.38

상기 표 6 및 도 4에 나타난 바와 같이, 니치아속 추출물의 농도가 높을수록 세포 내 티로시나제 활성 저해율이 점차적으로 증가하였고 2,173μg/mL 농도에서 양성대조군인 알부틴과 동등한 수준으로 85.24%의 활성저해율을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 6: Real time PCR

(1) 전배양: 섬유아세포(fibroblast)를 1.5x10⁵cells/9mL/100mmdish로 주입한 후, 24시간 배양하고, 음성대조물질, 양성대조물질 및 시험물질을 각각 1mL처리 후 72 시간동안 배양하여 전배양을 실시하였다. 시험물질은 실시예 1에 따른 니치아속 추출물이다.

(2) RNA 분리: 상기 전배양된 세포를 DPBS로 세척한 후 셀 스크래퍼를 이용해 회수하고, 회수한 세포를 1200 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 세포 펠렛에 1mL 트리졸, 0.2 mL 클로로포름(트리졸 1mL당)을 첨가하였다. 15초 동안 흔들어준 후, 실온에 2~3분간 방치하고, 4℃에서 12000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액은 새 튜브에 옮겨 0.5 mL 이소프로판올(트리졸 1mL당)을 첨가하였다. 10회 손으로 흔들어 주고 실온에 10분간 방치한 후, 4℃에서 12000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 이후, 상등액을 제거하고 펠렛에 70% 에탄올 1 mL(트리졸 1mL당)를 넣고 혼합하였다. 4℃에서 7500rpm으로 5분간 원심분리한 후 RNA 펠렛을 실온에서 10분 동안 건조하였다. 40μL DEPC 처리된 수용액을 넣어 RNA 펠렛을 녹이고, 분리된 RNA는 -70℃에 보관하였다. 녹여진 RNA 2 μL를 나노드롭을 이용하여 측정하였다.

(3) cDNA합성: 상기 RNA 1μg을 DEPC 처리수로 총 20μL를 맞춘 다음 Maxime™ RT premix 튜브에 넣었다. 열 순환기(T100™, Bio-Rad)를 이용하여 45℃에서 60분, 95℃에서 5분 반응시켰다. 반응이 끝난 cDNA합성 시료는 -20℃에 보관하였다.

(4) Real-time PCR:

cDNA 템플릿 2μL + Master mix 10 μL + 프라이머 1 μL + DEPC 처리수 7 μL로 96-웰에 총 20μL로 맞춰 넣은 다음, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 반응시켜 real-time PCR을 수행하였다.

상기 결과에 따른 티로시나제 유전자 발현율은 하기 표 7 및 도 5에, TRP-1 유전자 발현율은 표 8 및 도 6에, TRP-2 유전자 발현율은 표 9 및 도 7에 나타내었다.

	처리농도 (μg/mL)	Tyr expression (%)	SD
Nizchia. SP	0	100	3.44
	136	98.36	4.73
	272	80.70	2.49
	543	76.15	1.37
	1,087	51.35	3.19
	2,173	44.56	1.70
알부틴	125	44.97	2.39

	처리농도 (μg/mL)	TRP-1 expression (%)	SD
Nizchia . SP	0	100	2.75
	136	92.07	0.16
	272	83.96	2.31
	543	72.43	3.15
	1,087	56.67	1.34
	2,173	49.33	1.06
알부틴	125	28.54	3.20

	처리농도 (μg/mL)	TRP -2 expression (%)	SD
Nizchia . SP	0	100	2.93
	136	84.94	3.08
	272	84.68	0.51
	543	79.95	0.84
	1,087	50.88	3.09
	2,173	42.01	3.02
알부틴	125	46.24	2.14

상기 표 7 내지 표 9(도 5 내지 도 7)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 니치아 속 추출물은 2,173μg/mL의 농도에서 알부틴과 유사한 유전자 발현율을 나타내었고, 특히 티로시나제 유전자 및 TRP-2 유전자의 발현율은 알부틴과 거의 유사하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 7: 웨스턴 블롯

(1) 전배양: Melan-a를 1.2x10⁶cells/30ml/150mmcellculturedish로 분주하여 24시간동안 배양하고, 음성대조물질, 양성대조물질, 시험물질이 배지의 10%가 되도록 처리한 후 72시간 배양하여 전배양하였다. 시험물질은 실시예 1에 따른 니치아속 추출물이다.

(2) 시료의 제조:

시료의 제조를 위하여 상기 배양된 세포를 DPBS로 세척한 후 셀 스크래퍼를 이용하여 회수하고, 회수한 세포는 1200 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 세포 펠렛에 150 μL의 단백질 추출용액을 넣고 10분 간격으로 와류(ice상태에서 진행)시키고, 이를 4회 반복하였다. 다음으로, 14000rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 E-tube로 옮기고, 단백질을 정량하였다.

30μg의 단백질, 단밸질 추출 용액 및 5X 단백질 로딩 완충액 4 μL를 합하여 20μL가 되게 맞춘 후, 100℃에서 5분간 가열하고 와류시켜 스핀다운시켰다.

(3) 겔의 제조

사용된 세퍼레이팅 겔(Separating gel) 및 스태킹 겔(Stacking gel)은 하기 표 10 및 표 11에 나타낸 조성으로 제조하여 사용하였다.

10 % gel
D.W	4.1 mL
1.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.8)	2.5 mL
Acrylamide	3.33 mL
10% SDS	100 μL
10% APS	50 μL
TEMED	5 μL

(4) Running

세팅된 전기영동 장치에 전기영동 완충제를 채우고, 콤(Comb)에 maker 6 μL와 시료 20 μL 넣고 100 volt, 100분 조건으로 런닝(running) 시켰다.

- Transfer

Semi-dry transfer(semi-dry electrophoretic transfer cell, Bio-rad)에 스폰지-멤브레인-겔-스폰지 순으로 놓고 0.25 mA, 1시간 조건으로 트랜스퍼시키고, 멤브레인을 멸균증류수로 세척하여 선홍 염료(ponceau) 용액으로 확인한 후, TBS-T로 다시 세척하였다. 티로시나제(70~80 kDa), TRP-1(70~90 kDa), TRP-2(59 kDa), β-actin(42 kDa)이므로 타겟 부분이 잘려나가지 않도록 자르고 블록킹 용액(3%)에 1시간 동안 실온에서 흔들어 주어 1차 항체(in 블록킹 용액)에 비율에 맞게 넣고, 4℃에서 밤새도록 보관하였다. 표 12에는 각 유전자에 따른 희석배수를 나타내었다.

	희석배수
티로시나제	1:200
TRP-1	1:200
TRP-2	1:200
β-actin	1:10000

다음으로, TBS-T로 5분 간격으로 3회 세척하고, 2차 항체(in TBS-T)를 넣어주고 실온에서 5시간 흔들어 준 후, TBS-T로 5분 간격으로 3회 세척하였다. Super signal west pico chemiluminescent substrate(Super signal west pico chemiluminescent substrate NCI4080KR, Thermo)에 10초 반응시키고 Chemi doc(Gel DocXR, Bio-rad)을 이용하여 검출하였다. 표 13에는 각 유전자에 대한 희석 배수를 나타내었고, 웨스턴 블롯 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 니치아속 추출물은 2173㎍/ml 농도에서 티로시나제, TRP-1, TRP-2 유전자의 발현저해를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이 니치아 속을 포함하는 미세조류의 추출물은, 알부틴과 동등한 수준으로 티로시나제 활성을 저해하고 멜라닌의 생성을 저해하는 것으로 확인되었고, 웨스턴 블롯 결과 멜라닌 생성 유전자인 티로시나제 TRP-1, TRP-2의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.

따라서 본 발명의 니치아 속 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물 또는 약학적 조성물은 화학적 물질이 아닌 천연물에서 유래하여 부작용을 줄이면서 멜라닌 생성 억제 및 티로시나제 활성 저해로 인한 미백 및 피부보호 효과를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

이상에서 본 발명을 실시예를 중심으로 설명하였으나, 해당 분야의 통상의 기술자의 수준에서 다양한 변경을 가할 수 있음은 물론이며, 본 발명의 권리범위는 상기 실시 예에 한정하여 해석될 수 없고, 이하에서 기재하는 특허청구범위에 의하여 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 미세조류의 추출물은 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글리콜, 헥산 및 이의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추출용매를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 항산화활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 미세조류의 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30 % 포함되는 것을 특징으로 하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 제형을 갖는 것을 특징으로 하는, 티로시나제 활성저해 및 멜라닌 생성저해용 화장료 조성물.
6. 니치아 속(Nitzschia sp.)을 포함하는 미세조류의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 미세조류의 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 % 포함되는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
8. 제 6 항에 있어서,
   상기 조성물은 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 환제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리, 주사제 및 외용제로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

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