KR101549136B1 - 아비프린을 포함하는 미백 화장용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포독성이 적으며 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성 저해활성을 가지는 화합물로서 아비프린을 포함하는 화장료 조성물, 의약 조성물, 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 아비프린을 포함하는 조성물은 티로시나제 활성 억제, 멜라닌 생성 억제, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방, 개선 또는 치료, 미백효과를 위하여 사용될 수 있다.

Description

아비프린을 포함하는 미백 화장용 조성물{The cosmetic composition for skin whitening comprising aviprin}

본 발명은 미백 활성 효과가 있는 화장용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미백 활성을 갖는 아비프린을 함유하는 미백 화장용 조성물에 관한 것이다.

최근 사회가 발달하고 생명공학의 발전과 생활수준의 향상, 평균수명 연장으로 인한 고령화 사회에 진입함에 따라 피부노화지연 및 피부세포부활 등의 생리활성 기능과 효과가 함께 갖춰진 복합 기능성 화장품 개발이 대두되고 있는 실정이다. 현재 기능성 화장품의 개발에는 생리활성을 가지는 원료물질의 개발이 선결과제이며, 검토해야 할 기능성으로는 미백, 항염증, 주름개선, 항노화, 항산화효과 등이 있다. 이러한 효과를 보유한 물질을 한약재 등 다양한 천연물에서 찾으려는 연구가 시도되고 있으며, 최근에 피부 흑화의 생물학적 기전이 상세히 규명됨에 따라 피부에 멜라닌(melanin) 색소가 침착되는 것을 예방하고 완화시켜 기미나 주근깨 등의 생성을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 미백제 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다.

피부미백제가 직접적으로 예방하고 완화시키고자 하는 것은 멜라닌으로, 이는 동식물과 미생물계에 널리 존재하는 천연 고분자 색소이며, 페놀류의 효소적, 비효소적 산화 및 중합반응 등의 다단계 과정을 거쳐 피부표피의 기저층에 분포하고, 색소형성세포주(melanocyte) 내의 멜라닌 소체(melanosome)에서 주로 생성된다. 생성된 멜라닌은 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 자외선이 진피 내로 투과하면서 발생되는 피부기관의 손상을 방어하는 역할을 하며, 피부 내에 생겨난 유해산소 및 자유 라디칼을 소거시키는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호하는 유용한 역할을 수행한다. 또한, 피부세포 내의 멜라닌 생성량과 분포도에 따라 사람의 피부색이 결정되며, 멜라닌 색소가 적은 사람은 흰색의 피부를 갖게 된다. 하지만 외부의 자극으로 인해 다량의 멜라닌이 부분적인 과색소침착을 일으키면 기미, 주근깨, 염증 후 색소침착, 검버섯뿐만 아니라 피부염, 피부암과 같은 피부질환을 유발하게 된다. 이 같은 질환과 미관상의 문제점을 극복하기 위하여 미백물질의 개발이 활발하게 이루어지고 있는 실정이다.

현재까지 미백제의 개발이 주로 티로시나제(tyrosinase)를 저해하거나 멜라닌 생성량의 감소 등을 통하여 색소형성세포주에 직접적으로 작용하는 기전으로 이루어졌지만 멜라닌 생성에 관여하는 여러 인자들이 밝혀지면서, 생성경로와 이와 관련된 여러 인자들의 작용 억제에도 관심을 두게 되었다. 대표적인 미백제로는 코직산(kojic acid)과 알부틴(arbutin)이 존재하며, 이들은 많이 상용되었으나 세포독성, 돌연변이 유발 등의 부작용 등이 최근 보고되었다. 그러므로 이와 같은 부작용을 유발하지 않으며 안전성과 안정성을 갖춘 피부미백제의 개발이 필요한 실정이다.

본 연구팀은 기존 피부미백제들의 문제점을 해결하고, 피부세포주에 대한 안전성이 보장되는 효과적인 미백활성물질을 획득하여 피부에 대한 안전성 및 미백제로써의 활성과 기전을 규명하고자 피부미백제에 대해 연구하였다. 물질의 탐색을 시도한 결과 수질(Hirudinidae)추출물을 선별할 수 있었다. 수질추출물은 미백활성 및 항산화활성과 피부세포주에 대한 무독성을 나타내었다. 수질은 거머리과로 거머리를 석회에 무쳐 햇빛에 말리거나 구운 것으로서 뇌혈관 질환, 고지혈증, 호흡기 질환 등의 치료에 광범위하게 응용되고 있으며, 특히 항응고 작용이 다른 한약재 보다 우수하고, 일반적인 어혈 치료약물에 비해 월등한 효능이 이미 밝혀졌지만 미백과 관련된 연구는 보고되어 있지 않았다.

수질추출물로부터 분리한 화합물은 DPPH 라디칼 소거, 항진균, 혈소판 응집억제, 항결핵 활성 등이 보고되었지만 피부미백활성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구팀은 수질추출물로부터 분리한 화합물을 피부미백제로써의 활성과 미백활성 기전규명 및 피부세포주에 대한 안전성 확인을 통해 새로운 피부미백제로써의 가능성을 제시하였다.

본 발명의 목적은 세포독성이 적으며 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성 저해활성을 가지는 새로운 물질을 찾아 신규한 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 아비프린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 티로시나제 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 미백효과를 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방, 개선, 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일구현예로서 항산화활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 조성물에는 일구현예로서 화장료 조성물, 의약 조성물, 식품 조성물, 식품첨가제 조성물이 포함된다.

본 특허출원을 통하여 제공되는 아비프린을 포함하는 화장료 조성물은 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성 저해활성, 항산화활성을 가지며, B16-F10 멜라노마 세포주에 대한 세포독성이 없다. 수질추출물을 포함하는 조성물은 안전한 티로시나제 저해, 멜라닌 생성 저해, 미백효과를 가지는 화장료 조성물, 의약 조성물, 식품 또는 식품첨가제 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 아비프린의 분리 및 정제 단계를 나타낸 것이다.
도 2는 아비프린의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 3은 아비프린의 ESI-Mass 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 아비프린(CDCl₃)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 아비프린(CDCl₃)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 아비프린의 HMQC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 아비프린의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 아비프린의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 아비프린의 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 아비프린의 미백 효과를 나타낸 것이다. 도 10(a)는 아비프린의 티로시나제 저해활성을 나타낸 것이다. 저해활성을 측정하기 위하여 다양한 농도의 아비프린을 이용하였고, 1500 units/mL의 티로시나제와 1.5 mM의 티로신을 이용하였다. 측정 용액은 37 ℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 490 nm에서 마이크로플레이트 리더에 의해 측정되었다. 각각의 수치는 세번 실험한 값의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 도 10(b)는 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)로 자극된 B16-F10 멜라노마 세포에서 아비프린의 멜라닌 함량 감소 효과를 나타낸 것이다. 상기 세포는 24시간 동안 배양되었고, 이후 아비프린으로 처리되었다. 전 처리된 세포 72시간 동안 1 μM의 α-MSH로 멜라닌 생성이 촉진되었다. 그 결과를 대조군과 비교하여 퍼센트로 표시하였고 세번 실험한 값의 평균 ± S.D.로 기록되었다.
도 11은 아비프린의 항산화 효과를 나타낸 것이다. 도 11(a)는 다양한 농도의 아비프린의 DPPH 라디칼 소거능을 보여준다. 에탄올 내의 0.4 mM DPPH 80 ㎕ 용액을 아비프린 20 ㎕와 12시간 동안 천천히 혼합한 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 Vit-C 1 mg/mL이다. 상기 데이터는 세번 실험한 후의 평균값(±S.D.)을 나타낸 것이다. 도 11(b)는 다양한 농도의 아비프린의 ABTS 라디칼 소거능을 보여준다. 1.25 mM ABTS와 1 unit/mL 의 퍼옥시다제 및 다양한 농도의 아비프린으로 측정되었다. 상기 물질이 혼합된 혼합용액은 37 ℃에서 15분간 반응되었다. 그후, 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 Vit-C 100 ㎍/mL이다. 모든 실험은 3번 실시하였으며, 상기 데이터는 세번 실험 후의 평균값(±S.D.)을 나타낸 것이다.
도 12는 아비프린으로 24시간 동안 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주의 세포생존을 나타낸 것이다. 도 12(a)는 MTT 에세이 이후, MTT 환원비율(MTT reduction rate)을 대조군의 생존한 세포와 비교하여 산출하였다. 도 12(b)는 LDH 방출 에세이로부터 얻은 결과를 비히클 처리된 세포(vehicle-treated cells)(100%)로부터 방출된 LDH의 활성으로 정규화하였고, 대조군에 대한 퍼센트로 표현되었다. 도 12(c)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주의 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 형태학적 변화는 24시간 동안 모니터링 되었다(a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린). 위상차 현미경에서 100배율로 사진을 찍었다. 도 12(d)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포에서 세포사멸(apoptosis)을 관찰한 것이다. B16-F10 멜라노마 세포주를 아비프린에 노출시켰고, 헤케스트(hoechst) 33342 염색법(10 μM) 및 형광 현미경을 이용하여 아폽토시스 소체(apoptotic body)가 형성되지 않음을 보여주었다(배율 400배, a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린).
도 13은 48시간 동안 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포의 세포 생존성을 나타낸 것이다. 상기 세포는 다양한 농도의 아비프린의 존재 하에서 48시간 동안 배양되었다. 도 13(a)는 MTT 에세이 이후, MTT 환원율을 대조군의 생존한 세포와 비교하여 산출하였다. 도 13(b)는 LDH 방출 에세이로부터 얻은 결과를 비히클 처리된 세포(100%)로부터 방출된 LDH의 활성으로 정규화하였고, 대조군에 대한 퍼센트로 표현되었다. 도 13(c)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 형태학적 변화는 48시간 동안 모니터링 되었다(a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린). 위상차 현미경에서 100배율로 사진을 찍었다. 도 13(d)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 세포사멸을 관찰한 것이다. B16-F10 멜라노마 세포주를 아비프린에 노출시켰고, 헤케스트 33342 염색법(10 μM) 및 형광 현미경을 이용하여 아폽토시스 소체가 형성되지 않음을 보여주었다(배율 400배, a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린).
도 14는 72시간 동안 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주의 세포 생존성을 나타낸 것이다. 상기 세포는 다양한 농도의 아비프린 존재 하에서 72시간 동안 배양되었다. 도 14(a)는 MTT 에세이 이후, MTT 환원율을 대조군의 생존한 세포와 비교하여 산출하였다. 도 14(b)는 LDH 방출 에세이로부터 얻은 결과를 비히클 처리된 세포(100%)로부터 방출된 LDH의 활성으로 정규화하였고, 대조군에 대한 퍼센트로 표현되었다. 도 14(c)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 형태학적 변화는 72시간 동안 모니터링 되었고(a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린), 위상차 현미경에서 100배율로 사진을 찍었다. 도 14(d)는 아비프린으로 처리된 B16-F10 멜라노마 세포에서 세포자살을 관찰한 것이다. B16-F10 멜라노마 세포주를 아비프린에 노출시켰고, 헤케스트 33342 염색법(10 μM) 및 형광 현미경을 이용하여 아폽토시스 소체가 형성되지 않음을 보여주었다(배율400배, a: 대조군, b: 50 μM 아비프린, c: 100 μM 아비프린).
도 15는 α-MSH로 유도된 B16-F10 멜라노마 세포주에서 아비프린에 의해 티로시나제의 발현이 저해되는 효과를 나타낸 것이다. 아비프린은 α-MSH로 처리되어 유도된 티로시나제 발현을 저해한다. B16-F10 멜라노마 세포주의 총 세포 용해물(lysate)을 분비한 후 goat polyclonal 티로시나제 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 상기 세포를 소정의 농도의 아비프린으로 30분간 처리한 후에 α-MSH(1 μM)로 72시간 동안 처리하였다. 내부 대조군으로 β-actin을 측정하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 아비프린을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에 있어서, "미백"은 멜라닌의 생성이 저해됨에 따른 결과로서 이해되는데, 구체적으로는 멜라닌의 생성이 저해됨에 따라 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상이 예방 또는 억제됨에 따른 결과로서 이해된다. 그러한 증상으로서 전술한 바의 기미, 주근깨, 피부노화 등이 예시될 수 있지만, 본 발명의 하기 실시예 및 실험예가 보여주는 바와 같이 본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 화합물이 멜라닌의 생성을 저해하는 효과를 보여주는 것이 명백한 이상, 상기 증상은 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상 예방 또는 억제함으로써 피부미백의 결과로 이어지는 모든 증상으로 이해되어야 한다.

본 발명의 발명자는 티로시나제 저해활성, 멜라닌 생성 저해활성을 가지며 세포독성이 적은 물질을 찾기 위하여 물질들을 스크리닝한 결과, 하기 화학식 1의 아비프린이 그러한 활성을 가진다는 것을 알아내었다.

<화학식 1>

상기 아비프린은 수질에서 추출될 수 있다. 수질은 수질과(Hirudinidae)의 환형동물이라는 큰 분류 군에 속하며, 대표적으로 일본의질(Hirudo nipponica Whitman), 마황/관체금선질(Whitmania pigra Whitman) 및 유엽마황/다색질(Whitmania acranulata Whitman)의 건조체를 들 수 있다.

본 발명의 발명자들은 아비프린의 미백효과를 확인하기 위하여, 미백활성을 갖는 것으로 보고된 알부틴과 티로시나제의 저해활성을 비교하였다. 0.05, 0.01, 0.5, 및 1 mM의 농도로 활성을 측정해 본 결과, 아비프린은 17, 22, 38 및 51%의 저해활성을 보인 반면, 알부틴은 23, 35, 70, 81%의 저해활성을 나타냈었다. 이러한 결과에서 아비프린은 알부틴에 비하여 저해 효과는 약하지만 농도 의존적으로 미백활성을 가진다는 것을 확인하였다.

또한, 세포주에 대한 멜라닌 생성억제효과를 확인하기 위하여 멜라노사이트가 생성하는 멜라닌 생성량을 비교하였다. 그 결과, 뮤린 멜라노마 세포주인 B16-F10에서 100 μM로 아비프린을 처리후, 멜라닌 생합성 유도제인 α-MSH를 처리한 결과 34% 가량 멜라닌 생성이 저해되었다. 이러한 멜라닌 생성량 저해정도는 동일 농도로 알부틴을 처리한 대조군에 비하여 약 6% 가량 더 멜라닌 생성을 저해한 것이다(도 10 참조). 이러한, 실험 결과 아비프린은 현재 미백용 화장료 조성물로 사용되고 있는 알부틴에 비하여 우수한 미백활성을 갖음을 확인하였다.

아비프린의 B16-F10 멜라노마 세포주에 대한 세포독성을 측정하기 위해, 아비프린을 사용하여 MTT 환원 에세이, LDH 방출 에세이, 세포의 형태학적 변화 관찰, 헤케스트 33342 염색을 실시한 결과, 최고 100 μM의 농도에서도 무처리 대조군과 상응하는 생존율을 가짐으로써 세포독성이 없다는 것을 확인하였다.

이와 같은 결과들은 아비프린이 티로시나제 저해활성 및 멜라닌 생성 저해활성이 뛰어나며 항산화활성도 보유하고 있고 B16-F10 멜라노마 세포주에 대한 안전성이 우수하여, 독성으로 인한 유전자 변이, 불안정성 및 피부암 유발 등과 같은 부작용을 가지는 기존의 티로시나제 저해제에 대한 대체가 가능하다는 것을 시사한다.

따라서, 본 발명은 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 티로시나제 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서 미백효과를 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일구현예로서 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방, 개선, 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일구현예로서 항산화활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 조성물에는 일구현예로서 화장료 조성물, 의약 조성물, 식품 조성물, 식품첨가제 조성물이 포함된다.

또한, 아비프린은 아비프린 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 아비프린은 수질추출물에 포함된 형태일 수 있다. 또한, 상기 수질추출물은 수질에 수질 중량의 약 1 내지 30배, 필요할 경우 그 이상의 용매를 첨가하여, 약 10 ℃ 내지 100 ℃에서 약 1시간 내지 5일 동안 침지추출, 열탕추출, 환류순환, 압력추출 등의 방법으로 추출한 후, 여과(또는 원심분리 후 여과)하여 제조할 수 있으며, 감압농축, 동결건조 등의 방법을 추가로 사용할 수 있다. 상기 용매는 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올, 프로필렌글리콜, 초산에틸, 부틸렌글리콜, 에테르 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합 용매인 것일 수 있다.

아비프린은 액상, 분말, 또는 과립형태일 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 의약용, 식품용, 화장용 등으로 사용가능하며 용도에 맞도록 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 비경구 또는 경구 투여가 가능하며, 투여 방법에 따라 적절한 제형으로 제조된다. 본 발명에 따른 조성물은 제형에 따라 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.

아비프린은 멜라닌 생성 저해활성이 있으며, 항산화활성을 가지고 있고, 세포독성이 낮으므로 화장료 조성물에 포함되어 사용이 가능하다. 특히 미백용 화장료 조성물로서 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 총 중량에 대하여 아비프린을 0.001 내지 90중량%, 바람직하게는 0.01 내지 70중량%를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 화장료는 아비프린 외에 비타민, 펩티드, 다당, 지질 등을 더 포함할 수 있으며, 그 외 통상 화장료에 배합되는 유지성분, 보습제, 계면활성제, 안료, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 향료, 정제수 등을 포함할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 오일, 왁스, 파우더, 스프레이, 비누, 클렌징, 팩, 파운데이션, 메이컵베이스 및 모발화장료로 구성된 군으로부터 선택된 제형일 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 아비프린은 티로시나제 과다 활성, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 및 치료용 의약 조성물, 멜라닌 생성 저해용 의약 조성물 또는 항산화용 의약 조성물에 포함될 수 있다.

멜라닌 과다 생성으로 인한 질병으로는 홍반, 색소침착, 피부의 흑화 현상, 피부노화, 피부암 유발, 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포사멸 등을 들 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 아비프린은 이를 위하여 전신투여(예를 들어 경구 투여) 및 국소투여(예를 들어 피부도포) 방법을 각각 또는 동시에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 아비프린은 조성물 전량 중, 0.0005 내지 30중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10중량% 포함될 수 있으나, 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 본 발명의 조성물의 최적 투여량은 연령, 개인차, 증상 등에 따라 적절히 결정되지만, 사람에게 투여하는 경우의 투여량은 통상 0.01 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg이며, 이 양을 1일 1회 또는 수 회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀, 연고제 등의 형태로 사용될 수 있고, 경구 또는 비경구로 적용하기에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제가 함께 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 환제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리, 주사제 및 사용하기에 적합한 임의의 기타 형태에 대해 일반적으로 비독성인 제약상 허용되는 담체와 함께 혼합될 수 있다. 사용 가능한 담체에는 고체상, 반고체상 또는 액체상의 포도당, 유당, 아라비아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산 마그네슘염, 활석, 옥수수 전분, 각질 (角質), 콜로이드 성 실리카, 감자 전분, 우레아, 쇄 길이가 중간 정도인 트리글리세리드, 덱스트란 및 제제의 제조에 사용하기에 적합한 기타 담체가 포함된다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 착색제 및 향료제가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 아비프린을 유효성분으로 함유하는 티로시나제 활성 저해, 멜라닌 생성 저해, 항산화를 위한 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 및 개선용 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물을 제공한다. 본 발명의 아비프린을 포함하는 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물은 단독으로 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

일반적으로, 아비프린은 식품 또는 음료제조 시에 원료에 대하여 각각 0.0001 내지 30중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 첨가되는 양은 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없으며, 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디 류, 스낵 류, 과자 류, 피자, 라면, 기타 면 류, 껌 류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험재료 준비

1.1. 실험용 시료 준비

본 실험에서 사용된 수질수출물은 경남 산청군 지리산대한당영농조합법인으로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 멜라닌 생성 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin, streptomycin은 Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였으며 미백활성평가를 위해 사용된 티로시나제, 티로신(tyrosine), 알부틴(arbutin), α-MSH와 세포독성평가를 위해 사용된 3-[4,5-dime-thylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma chemical CO. (St. Louis, MO, USA)으로 부터, LDH (lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)으로부터 구입하였다. 그 외의 연구에 사용된 여러 가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

1.2. 세포주 배양 및 처리

아비프린의 미백제로써의 활성과 피부세포주에 대한 안전성을 평가하기 위해 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 마우스 유래 흑색종 세포주 B16-F10을 분양받아 본 실험에 사용하였다. 세포배양을 위해 DMEM에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 100 units/mL의 penicillin, 100 ㎍/mL의 streptomycin, 3.5 mg/mL의 NaHCO₃을 첨가하여 사용하였다. 95%의 습도가 유지되는 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터 (MCO-18-AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였으며, 멜라닌의 생성을 유도하기 위해 1 μM의 α-MSH(α-Melanocyte stimulating hormone, α-MSH)를 처리하였다.

1.3. 통계 처리 방법

모든 자료는 SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고, 각 농도별 DPPH, ABTS 라디칼 소거능의 차이와 티로시나제 저해활성, 세포생존율, 멜라닌 함량 비교는 one way ANOVA법으로 분산분석을 하였으며, 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 실시하였다.

실시예 2. 아비프린의 수득

2.1. 수질추출물로부터 아비프린의 분리 및 정제

수질 1.2 kg을 water 3 L를 가하여 열수 추출한 후, 이 추출액을 40℃에서 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 수질 물 추출물을 얻었으며, 이를 극성과 비극성 용매 조건에 따라 분리하기 위해 물 1 L을 부가한 후, 헥산(hexane)을 이용하여 헥산층과 물층으로 나누고, 물층은 다시 디에틸 에테르(diethyl ether)를 부가하여 분배 추출하였다. 디에틸 에테르 층에서 티로시나제 저해활성을 확인한 후, CHCl₃:MeOH (50:1 ~ 1:1) 전개용매를 이용하여 silica-gel flash column (Ø6.5X40 cm) 크로마토그래피를 실시하고 각 분획(fraction)을 silica-gel TLC를 수행하여 모니터링 하였으며, bioassay를 통해 티로시나제 저해활성을 평가하였다. 그 결과를 바탕으로 강력한 활성을 나타내는 CHCl₃:MeOH = 20:1 fraction을 high performance liquid chromatography (HPLC)를 실시하여 최종적으로 활성성분을 분리하였다(도 1 참조). 분리한 물질이 단일물질인지 확인하기 위해 HPLC를 실시하여 15% acetonitrile로 이동상을 ODS column (Ø4.6×150 mm)에 흘려주었을 때, 약 85분경에 활성물질의 피크(peak)를 확인하였고 분리된 물질이 단일물질임을 알 수 있었으며, 이를 아비프린(aviprin)이라 명명하였다(도 2 참조).

2.2. 아비프린의 물리, 화학적 특성

아비프린의 분자량과 분자식을 확인하기 위해 ESI-Mass spectrum을 positive mode에서 측정한 결과, 도 3과 같이 [M+Na]⁺가 m/z 327.1에서 관찰되어 분자량이 304임을 알 수 있었고, 분자식이 C₁₆H₁₆O₆로 결정되었다.

2.3. 아비프린의 구조결정

아비프린의 구조결정을 위해 ¹H-NMR spectrum을 측정한 결과, 도 4와 같이 8.43 ~ 6.28 ppm 사이에 4개의 methine proton, 7.78 ppm 부근에 oxymethine proton, 4.38 ~ 4.79 ppm 부근에 두 개의 oxygenated methylene proton, 1.23 ~ 1.29 ppm 사이에서 2개의 methyl proton이 관찰되었다. 또한 도 5과 같이 ¹³C-NMR 스펙트럼(spectrum)을 측정한 결과, 163.3 ppm에서 한 개의 carbonyl carbon, 141.7 ~ 94.6 ppm 사이에서 4개의 methine carbon, 146.8 ppm 부근에 oxymethine carbon, 150.8 ~ 159.8 ppm 사이에서 3개의 oxygenated carbon, 75.8 ppm에서 methylene carbon, 24.8 ~ 27.2 ppm 사이에 2개의 methyl carbon이 관찰되었으며, ¹H-NMR spectrum과 개연성이 있다는 것을 확인할 수 있었다. Quarternary carbon의 존재유무와 H와 C의 연결고리를 알기위해 HMQC spectrum (도 6)을 측정하여 해석한 결과, 모든 proton-bearing carbon (¹ J _C-H)을 규명할 수 있었고, 모든 assign을 통해 Table 1의 ¹H-¹³C NMR chart를 완성할 수 있었으며, 4개의 olefinic methine, 2개의 methyl, 2개의 methylene과 ester를 확인함으로써 본 구조는 furano-coumarin계 화합물로 예측할 수 있었다.

아비프린의 부분구조를 규명하기 위해 ¹H-¹H COSY spectrum (도 7 참조)을 통해 ¹H-¹H 간의 cross peak를 확인한 결과, H-2과 H-3, H-7과 H-8, H-12과 H-13 사이의 COSY 연결을 통해 furan과 coumarin, isoprenyl기를 포함하는 3개의 부분구조를 규명할 수 있었다. 또한 3개의 부분구조 간의 연결고리를 확인하기 위해 HMBC spectrum (도 8 참조)을 측정하여 해석한 결과, H-2 (δ_H 6.28)으로부터 C-1 (δ_C 163.3), C-4 (δ_C 108.3)에, H-3 (δ_H 8.43)으로부터 C-1 (δ_C 163.3)과 C-11 (δ_C 153.9)에, H-10 (δ_H 7.19)으로부터 C-4 (δ_C 108.3), C-6 (δ_C 115.4), C-9 (δ_C 159.8), C-11 (δ_C 153.9)에 대한 long-range coupling을 통해 coumarin moiety를 assign할 수 있었고, H-7 (δ_H 7.22)으로부터 C-6 (δ_C 115.4), C-9 (δ_C 159.8)에, H-8 (δ_H 7.78)으로부터 C-6 (δ_C 115.4), C-9 (δ_C 159.8)에 대한 long-range coupling을 통해 furan moiety를 assign함과 동시에 coumarin과 연결고리를 확인함에 따라 furano-coumarin moiety를 결정할 수 있었다. H-13 (δ_H 3.81)으로부터 C-15 (δ_C 27.2), C-16 (δ_C 24.8)에, H-15 (δ_H 27.2)으로부터 C-13 (δ_C 78.1), C-14 (δ_C 72.7), C-16 (δ_C 24.8)에, H-16 (δ_H 1.23)으로부터 C-13 (δ_C 78.1), C-14 (δ_C 72.7), C-15 (δ_C 27.2)에 대한 long-range coupling을 통해 isoprenyl 부분구조를 결정할 수 있었다. 또한, furano-coumarin과 isoprenyl기의 연결고리를 확인한 결과, H-3 (δ_H 8.43)과 H-12 (δ_H 4.38, 4.79)으로부터 C-5 (δ_C 150.8)에 대한 long-range coupling을 통해 isoprenyl기가 furano-coumarin moiety에 결합된 구조임을 확인할 수 있었다(표 1 참조).

따라서 ¹H-¹H COSY spectrum에 의하여 규명된 세 개의 부분구조를 HMBC spectrum을 통해 연결할 수 있었고, 여러 문헌조사를 통해 기존화합물인 furano-coumarin계 화합물인 아비프린이라는 것을 알 수 있었다(표 1 및 도 9 참조).

<표 1> 아비프린의 ¹ H 및 ¹³ C NMR의 이동

실시예 3. 아비프린의 세포독성 확인

3.1. MTT 법을 통한 세포독성 확인

아비프린이 B16-F10 세포주 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 환원 에세이로 세포생존율을 측정하였다. B16-F10 세포주를 96-well plate에 3×10⁴ cells/mL의 농도로 각 well에 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후, 아비프린을 각각 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 세포주에 처리하고 대조군의 경우 1% DMSO가 되도록 처리한 후 각각 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 그 후 PBS 완충액에 녹인 MTT (5 mg/mL) 용액을 10 μL씩 첨가하고 30분 동안 반응시켜 formazan 형성을 확인하고, 배지를 완전히 제거 후 100 μL의 DMSO를 첨가하여 ELISA reader (Model 680, Bio Rad, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아비프린을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포의 생존율을 100%로 하였을 때의 상대적인 세포생존율을 구하였다.

3.2. LDH 방출법을 통한 세포 독성 확인

B16-F10 세포주에 대한 아비프린의 세포독성을 확인하기 위해 LDH 방출 어세이를 실시하였다. B16-F10 세포주를 96-well plate에 3X10⁴ cells/mL의 농도로 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후, MTT 환원 에세이와 동일한 조건으로 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 배양액의 상층액 부분을 새로운 96-well plate에 50 μL씩 분주하고, LDH 반응액을 50 μL씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응을 시켰다. 색의 변화로 반응이 완료되는 것을 확인한 후 정지액(stop solution)을 100 μL씩 첨가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 LDH의 방출량을 측정하였다. 세포 내 LDH를 측정하기 위해서 배양액을 제거한 후, 0.5% Triton X-100용액을 50 μL씩 첨가하여 10분 동안 shaking하여 세포막을 제거하고 LDH 반응액을 50 μL씩 첨가하여 반응시킨 후 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 대한 세포독성의 백분율은 배양액과 세포 내에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값을 무처리 대조군 값에 대한 백분율로 계산하였다.

3.3. 형태 변화 측정을 통한 세포 독성 확인

아비프린에 의한 색소형성세포주의 수지상 돌기 변화와 세포사멸에 대한 영향을 확인하기 위하여 inverted microscope를 이용하여 B16-F10 세포주의 형태학적 변화를 관찰하였다. B16-F10 세포주를 6-well plate에 3X10⁴ cells/mL의 농도가 되도록 2 mL씩 첨가한 후 24시간 동안 배양하고, 아비프린을 각각 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리하고, 대조군의 경우 1% DMSO가 되도록 처리한 후 24, 48, 72시간 동안 배양하여 관찰하였다. 위상차 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 형태학적 특징을 100 배율로 사진 촬영하였다.

3.4. 헤케스트 염색을 통한 세포 독성 확인

아비프린의 B16-F10 세포주에 대한 아폽토시스 유무를 확인하기 위해 헤케스트 33342 염색을 실시하였다. 아폽토시스의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광염색제인 헤케스트 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. 세포를 6-well plate에 3X10⁴ cells/mL로 24시간 동안 배양하여 아비프린을 각각 50, 100 μM 농도로 처리하고 대조군의 경우 1% DMSO가 되도록 처리하여 24, 48, 72시간 동안 배양한 후, PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% 포르말린(formalin)으로 고정한 후, 헤케스트 33342 (10 μM)으로 염색하여 형광 현미경 하에서 400 배율로 핵을 관찰하였다.

3.5. 아비프린의 세포 독성 결과

피부에 직접 닿는 화장품 원료로서의 안전성을 확인하기 위해 아비프린의 세포독성 평가를 24, 48, 72시간의 time course로 배양을 실시하였다. 색소형성 세포주인 B16-F10의 세포생장에 대해 아비프린이 영향을 미치는지 알아보기 위하여 MTT 환원 에세이와 LDH 방출 에세이, 현미경 관찰, 헤케스트 염색을 실시하여 세포독성을 측정하였다. 아비프린을 각각 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리한 후 24시간 동안 배양하여 MTT 환원 에세이를 실시한 결과, 대조군을 100%로 하였을 때 아비프린 처리군과 무처리 대조군의 세포생존율의 차이가 없음을 알 수 있었고(도 12a 참조), 동일한 농도 하에서 세포막 손상에 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포질 성분인 LDH 방출량을 측정하였다. 그 결과, 무처리 대조군의 LDH 방출량이 20%일 때, 각 농도별로 21, 22, 22, 25%로 대조군과 차이가 없음을 확인할 수 있었다(도 12b 참조). 세포는 외부 환경에 민감하게 자극을 받으면 상해를 입는 것과 동시에 세포사가 유도되어 형태학적인 변화를 나타나게 된다. 따라서 아비프린이 세포의 형태학적인 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 위상차 현미경을 이용하여 B16-F10 세포주의 형태학적 변화를 관찰하였다. 세포가 사멸하게 되면 세포독성으로 인하여 전체적인 세포의 수가 줄어들 뿐만 아니라 돌기가 거의 소멸된 양상을 보이며 세포의 형태학적인 큰 변화가 유도되는데 무처리 대조군과 아비프린을 50, 100 μM로 최종처리 된 군에서 동일한 세포의 형태를 관찰할 수 있었다(도 12c 참조). 또한, B16-F10 세포주에서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광염색제인 헤케스트 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. 세포가 손상을 받게 되면 아폽토시스 소체가 핵 주변에 나타나 아폽토시스가 유도됨을 확인할 수 있는데 아비프린을 처리한 결과 아무런 영향을 미치지 않고 타원형의 온전한 핵 모양을 나타내었다(도 12d 참조).

48시간(도 13 참조)과 72시간(도 14 참조)동안 아비프린을 처리하여 배양한 결과에서도 동일한 결과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 아비프린은 색소형성세포주에 대한 독성을 나타내지 않는 안전한 물질임을 입증하였고, 세포사로 인해 나타나는 미백활성이 아님을 규명할 수 있었다.

실시예 4. 아비프린의 항산화 활성 측정

4.1. DPPH 라디칼 소거능 측정

아비프린의 DPPH 라디칼 소거능(RSA)을 알아보기 위해 Thitilerdecha 등의 방법을 실험에 맞게 변형하여 사용하였다. 시료(아비프린 0.05, 0.1, 0.5, 1 mM) 20 μL에 0.2 mM DPPH 용액 80 μL를 첨가하여 10초 동안 섞은 후 실온에서 12시간 방치한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 Vitamin-C (1 mg/mL)를 사용하였다.

4.2. ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼을 이용하여 아비프린의 항산화활성을 측정하였다. 96-well plate에 아비프린 (0.05, 0.1, 0.5, 1 mM) 100 μL를 첨가한 후 0.1 M의 phosphate buffer (pH 5.0) 100 μL와 10 mM의 H₂O₂ 20 μL을 가하여 37 ℃에서 5분간 예비반응 시켰다. 예비반응 된 혼합물에 1.25 mM의 ABTS 30 μL와 5 Unit/mL 페록시다제를 30 μL 첨가하여 37 ℃에서 10분간 반응 시킨 후, 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 Vitamin-C (100 μg/mL)를 사용하여 분석하였다.

4.3. 아비프린의 항산화 효과

H₂O₂를 비롯한 다양한 활성산소종은 세포 외 기작의 주요 조절인자로써, 특히 자외선 조사로 인해 피부 내 생성된 활성산소종은 색소형성세포주를 자극시켜 멜라닌 생성기작을 촉진시킨다. 이처럼 세포 외의 멜라닌 생합성의 자극요소인 활성산소종을 제거함으로써 효과적인 미백활성을 나타낼 수 있다. 그러므로 가장 안정한 라디칼인 DPPH 라디칼을 이용하여 in vitro에서 아비프린의 환원력을 측정하여 항산화활성을 확인하고자 하였다. 아비프린을 각각의 농도인 0.05, 0.01, 0.5, 1 mM로 활성을 측정한 결과, 6, 1, 53, 73%의 농도 의존적인 라디칼 소거능을 보였고(도 11a 참조), 이미 보고되어진 항산화 활성연구에서 아비프린의 DPPH 라디칼 소거활성과 일치하는 결과임을 확인할 수 있었다. 수용성, 지용성 항산화제 모두 적용이 가능하고, 실험법이 비교적 간단하며 감도가 좋은 장점을 가지는 ABTS 라디칼 소거능을 DPPH 에세이와 같은 농도 설정을 통해 항산화효과를 평가하였다. 그 결과(도 11b 참조), 1, 3, 8, 36%의 농도 의존적인 라디칼 소거능으로 아비프린은 항산화활성을 가짐으로서 활성산소를 소거하여 멜라닌 생성 촉진 저해와 피부노화 방지 가능성을 유추할 수 있었다. 이는 즉, 아비프린이 자외선에 의해 생성된 피부 속 자유 라디칼을 소거시켜 피부노화를 방지시킬 뿐만 아니라, 색소형성세포주에 대한 자극을 저해시킴으로써 1차적인 멜라닌 생성 유도를 억제시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.

실시예 5. 아비프린의 미백 활성 확인

5.1. 티로시나제 활성 측정

멜라닌 색소생성의 중요한 단계를 촉매하는 효소인 티로시나제 활성에 대한 아비프린의 저해효과를 조사하기 위해 기존의 피부미백제인 알부틴과 아비프린을 0.05, 0.1, 0.5, 1 mM 의 농도에 따른 활성을 비교하였다. 96-well plate의 각 well에 100 μL의 시료와 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 140 μL, 1500 units/mL mushroom 티로시나제 20 μL, 1.5 mM tyrosine 40 μL을 순서대로 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로는 아비프린과 동일한 농도의 알부틴을 사용하였다.

5.2. 멜라닌 생성량 측정

B16-F10 세포주에 대한 아비프린의 멜라닌 생성 억제효과를 평가하기 위하여 세포주를 6-well plate에 3X10⁴ cells/mL이 되도록 2 mL씩 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 다음, 아비프린을 각각 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리하고 대조군은 1% DMSO가 되도록 처리하고 30분 동안 배양한 후, 멜라닌 생성 유도제인 1 mM의 α-MSH를 처리하고 72시간 동안 배양하여, 세포 내 멜라닌의 생성량을 측정하였다. 배양한 세포를 0.25% Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확한 후 원심분리(5000 rpm, 4℃)를 5분간 실시한 뒤, cell pellet에 1 N NaOH (10% DMSO)를 넣고, 80℃에서 10분간 세포와 세포 내 멜라닌 색소를 녹여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5.3. 웨스턴 블랏을 통한 멜라닌 합성 확인

α-MSH가 유도하는 멜라닌 생합성에 대한 아비프린의 영향을 알아보고자 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. B16-F10 세포주를 DMEM 배지를 사용하여 6-well plate에 5X10⁴ cells/mL의 농도로 현탁하고 24시간 배양한 후, 아비프린 5, 10, 50, 100 μM의 농도로 처리하여 30분 동안 배양한 뒤, 무처리 대조군을 제외한 모든 군에 α-MSH (1 μM)를 처리하여 72시간 배양하였다. 배양된 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척 후, 0.25% trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 떼어내어 micro tube (Eppendorf AG, Hambufg, Germany)로 옮겨 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 5분)를 실시하였다. 원심분리 후 상층액은 제거하고 cell pellet은 브래드포드 에세이 (Hercules, CA, USA)로 단백질 정량하고, 동일량의 단백질을 10% SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)상에서 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane (Bio-Rad)으로 옮긴 후, 실온에서 1시간 동안 blocking buffer [5% skim milk in PBS (phosphate buffer saline)]에서 교반하여 blocking 시켰다. Blocking 시킨 membrane은 TPBS (0.05% Tween 20 in PBS)로 10분씩 2회 세척하고 1차 antibody: goat polyclonal 티로시나제 (1:500, Santa Cruze Biotechnology, INC); mouse monoclonal anti-β-액틴 (1:1000, Sigma)를 blocking buffer에 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 membrane은 PBS로 2회 세척하고 1:500으로 희석한 2차 antibody: anti-goat immunoglobulin antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan); anti-mouse immunoglobulin antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan)을 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 후, 반응된 단백질을 Amersham Pharmacia ECL system (Pierce, MI, USA)으로 확인하였다.

5.4. 아비프린의 미백효과 확인

본 연구에서는 아비프린의 멜라닌 생합성 촉매효소인 티로시나제 저해활성을 조사하기 위해 기존의 피부미백제인 알부틴과 각 농도에 따른 티로시나제의 저해활성을 비교하였다. 알부틴과 아비프린을 각각 0.05, 0.01, 0.5, 1 mM의 농도로 활성을 측정해본 결과, 아비프린은 17, 22, 38, 51%의 티로시나제 저해 효과를 나타내었으며, 알부틴은 23, 35, 70, 81%의 저해 효과를 나타내었다. 이 결과로부터 아비프린이 알부틴 보다는 약하지만 농도 의존적인 티로시나제 저해활성을 통해 미백활성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다(도 10a 참조). 또한, 세포주에 대한 멜라닌 생성억제효과를 확인하기 위해 색소형성세포주가 생성하는 멜라닌 생성량을 비교하였다. 뮤린 멜라노마 세포주인 B16-F10에 아비프린을 5, 10, 50, 100 μM의 최종농도가 되도록 처리한 후, 멜라닌 생합성 유도제인 α-MSH 1 μM을 처리하고 72시간 배양하여 멜라닌의 생성을 유도한 후, 세포 내 멜라닌 생성량을 측정하였다. 무처리 대조군의 세포 내 멜라닌 생성량을 100%로 보았을 때, α-MSH 1 mM 처리군의 멜라닌 생성량은 159%로 아비프린의 최고 농도인 100 μM의 농도에서 α-MSH 단독처리군보다 34%를 더 저해하였다. 이것은 아비프린이 양성 대조군인 알부틴의 동일 농도 처리군보다 약 6% 가량 멜라닌 생성을 더 저해한 것으로서(도 10b 참조), 세포주 내에서 arbutin 보다 조금 더 높은 미백활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 이것을 통해 아비프린은 세포 내 티로시나제의 활성을 저해시킬 뿐만 아니라 다른 기작에 영향을 미쳐 멜라닌 생합성을 저해하여 효과적인 색소생성의 감소를 유도했다는 것을 알 수 있었다.

5.5. 세포주에서의 아비프린의 미백활성기전

멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소에는 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2가 있으며, 그 중에서도 멜라닌 생합성의 초기단계에 작용하는 멜라닌 생성효소인 티로시나제의 단백질 발현이 아비프린에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

B16-F10 세포주에 아비프린을 처리한 후 세포 내 단백질 발현량을 측정한 결과, 아비프린을 5, 10, 50, 100 μM로 최종 처리하였을 때 α-MSH가 유도하는 티로시나제의 발현량을 농도 의존적으로 크게 감소시켜(도 15 참조), 미백활성효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다. 이는 아비프린이 티로시나제 단백질의 효소적 활성을 저해시킬 뿐만 아니라, 발현까지 억제한다는 것을 시사하는 결과이다. 즉, 아비프린이 티로시나제의 발현자체를 억제하거나 발현 된 티로시나제 분해의 촉진을 통해 티로시나제 단백질 생성을 감소시켰지만 티로시나제의 발현 자체를 억제하였는지의 여부는 mRNA 수준의 분석을 통해서 확인할 수 있는 것이므로, 본 실험을 통해서는 아비프린이 melanogenic enzyme (티로시나제)의 생성을 저해 혹은 생성된 효소를 빠르게 분해시킴으로서 효과적으로 멜라닌의 생성을 억제한다는 것을 규명하였다.

따라서, 분리된 아비프린은 피부의 노화와 색소형성 피부세포주에 대한 멜라닌의 생성을 자극시키는 활성산소종을 효과적으로 환원시켜 멜라닌 생성의 1차적인 억제를 도모하였고, 티로시나제의 발현을 저해시키거나 혹은 분해시킴과 동시에 이미 발현된 티로시나제의 효소적 활성을 저해시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 아비프린은 멜라닌 생성 전 단계와 멜라닌 생성 단계를 모두 제어하고, 자체세포독성을 나타내지 않는 피부세포주에 대한 안전성이 보장되는 매우 효과적인 미백물질이며, 미백 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.

본 발명에 의한 아비프린를 함유하는 미백 화장료 조성물은 티로시나제 활성 억제율이 우수하며, 멜라닌 합성을 효과적으로 억제한다. 그뿐 아니라 세포독성활성이 매우 낮아, 피부 미백 및 기미, 주근깨 제거 및 개선을 위한 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (15)

1. 아비프린(aviprin)을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화활성을 갖는 미백용 화장료 조성물.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 오일, 왁스, 파우더, 스프레이, 비누, 클렌징, 팩, 파운데이션, 메이컵베이스 및 모발화장료로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조되는 미백용 화장료 조성물.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 아비프린은 수질에서 수득된 것인 미백용 화장료 조성물.
6. 아비프린을 유효성분으로 포함하는 홍반, 색소침착, 또는 피부의 흑화 현상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
7. 삭제
8. 제6항에 있어서, 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 환제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리, 주사제로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조되는 의약 조성물.
9. 제6항에 있어서, 상기 아비프린은 수질에서 수득된 것인 의약 조성물.
10. 아비프린을 포함하는 멜라닌 생성 저해용 식품 조성물.
11. 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 아비프린은 수질에서 수득된 것인 식품 조성물.
13. 아비프린을 포함하는 멜라닌 생성 저해용 식품첨가제 조성물.
14. 아비프린을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 개선용 식품첨가제 조성물.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 아비프린은 수질에서 수득된 것인 식품첨가제 조성물.

Images