KR101365822B1 - 옥타플로레솔 에이를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈조류인 넓패(Ishige foliacea)로부터 추출한 신물질 옥타플로레솔 에이(octaphlorethol A)의 미백 활성 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 상기 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물, 이를 함유하는 피부 미백용 화장료, 피부 미백용 식품 조성물 및 피부 미백용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 옥타플로레솔 에이는 멜라닌 생성을 억제하며, 생체 내 독성을 나타내지 않으므로, 피부 미백용 화장품, 식품 또는 약학적 조성물 등의 유효성분으로 사용될 수 있다.

Description

옥타플로레솔 에이를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Skin whitening composition comprising octaphlorethol A compound}

본 발명은 옥타플로레솔 에이(octaphlorethol A)의 미백 활성 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 넓패 유래의 옥타플로레솔 에이 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

최근 여성뿐만 아니라 남성들까지도 미용에 대한 관심이 높아지면서 성별의 구분없이 피부 미백용 제품들이 지속적으로 개발되고 있다. 미용의 측면에서뿐만 아니라 기능적으로 피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하는 아주 중요한 역할을 하는 조직으로, 크게 표피, 진피 및 피하조직으로 구성되어 있다. 일반적으로, 거뭇한 피부, 기미, 주근깨, 다크서클은 자외선에 의한 자극이나 호르몬 밸런스 이상, 유전적 요소 등에 의해 멜라닌 색소가 피부에 침착하여 발생하는 것으로 알려져 있다.

멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 고분자 물질이며, 피부색을 결정하는 중요한 색소로서 피부의 표피층에 존재한다. 주로 흑색이나 갈색을 나타내는 유멜라닌(eumelanin)과 노란색이나 붉은색을 나타내는 페오멜라닌(pheomelanin)이 있다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)로부터 합성된다. 합성된 멜라닌은 인접한 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동하면서 케라티노사이트의 각화과정을 통해 제거된다. 멜라닌 합성 과정을 살펴보면, 멜라노사이트 내의 멜라노좀에서 먼저 티로시나제(tyrosinase)라는 효소에 의해 티로신이 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논으로 전환되고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬을 거쳐 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 멜라닌은 자외선 에너지를 흡수함으로써, 진피 아래의 피부 기관을 자외선으로부터 보호하는 역할을 하며, 피부 생체 내에 생겨난 유해산소 및 자유라디칼 등을 잡아주는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호해주는 역할을 수행한다. 또한, 사람의 피부색을 결정하기도 한다. 즉, 멜라닌 색소가 많은 사람은 갈색 또는 검은 색 피부를 갖는 반면, 멜라닌 색소가 적은 사람은 흰색의 피부를 갖게 된다. 그러나 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고, 반대로 일광, 호르몬 변화, 염증 또는 약제 등 여러 가지 환경적 요인에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되거나 각화작용이 원활히 이루어지지 않아 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 색소가 침착되면 기미, 주근깨를 형성하며, 이와 같은 병변으로부터 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다. 그러므로 이러한 색소 침착 현상을 방지하기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다.

피부가 검게 되는 데는 여러 요인이 있는 것으로 알려져 있지만, 그 중 가장 중요한 것은 티로시나제(tyrosinase) 효소이다. 티로시나제 효소는 조직중에 존재하는 티로신(tyrosine)이라고 하는 아미노산에 작용하여 도파퀴논을 생성시키며 도파퀴논으로부터 흑색 색소인 멜라닌이 생성되는 여러 단계의 과정은 자동적으로 이루어지는 것으로 알려져 있다. 따라서 피부의 흑화 및 기미, 주근깨 등의 피부 질환을 막아주기 위하여 종래 아스콜빈산, 코지산, 글루타치온, 히드로퀴논등의 티로시나제 저해활성을 가진 물질을 화장료에 배합하는 방법이 이용되었었는데, 피부에 대한 안전성이나 화장료 배합시의 안정성 측면에서 문제점을 안고 있어서 그 사용이 제한적이다. 또한, 비타민 C 및 그 유도체는 산화가 잘되는 불안정성 때문에 화장품 원료로서 사용이 어려우며, 알부틴은 하이드로퀴논에 글루코피라노사이드가 결합된 유도체로 하이드로퀴논 사용 시 나타나는 부작용이 적으면서 인체에 대한 독성은 없이 멜라닌 색소의 합성을 억제하는 작용이 있어, 멜라닌 색소 침착이 증가되는 피부 질환의 치료제로서의 이용 가능성이 제시되었으나, 피부 효소에 의해 일부 분해되는 단점이 있다. 그럼에도, 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민류 등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색효과가 아주 적은 것으로 알려져 있다. 따라서 티로시나제의 활성을 저해시킴으로써 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 안전한 저해제가 지속적으로 개발되고 있다.

특히 식물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구도 계속 이루어져 왔고, 그 중 상백피(대한민국 공개특허 제92-002109호 및 제97-021273호), 감초(대한민국 공개특허 제92-002109호 및 제97-025601호), 작약(대한민국 공개특허 제92-002111호), 계피(일본공개특허 소 63-30403호 및 평5-139954호), 고삼(대한민국 공개특허 제92-002110호), 알로에(일본공개특허 소52-44375호) 등의 다수의 식물 추출물 및 생약재 추출물 등이 티로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있으며, 아직 뛰어난 효과를 나타내지도 못하고 있는 실정이다. 따라서 천연에서 유래되는 효능이 뛰어난 미백제가 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 피부에 안전하고 미백 효과가 우수한 신물질을 찾기 위해 노력하던 중 해양 생물인 넓패로부터 그 추출물을 분리, 정제하게 되었고, 그로부터 우수한 멜라닌 형성 저해 효과를 확인하고 피부 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 넓패 추출물을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 넓패 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 넓패 추출물을 함유하는 피부 미백용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 넓패 추출물을 함유하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 넓패(Ishige foliacea) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

상기 넓패(Ishige foliacea) 추출물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 신물질 옥타플로레솔 에이(Octaphlorethol A)를 포함한다. '옥타플로레솔 에이'의 IUPAC 명명은 "2-(4-(4-(4-(4-(4-(4-(3,5-디히드록시페녹시)-3,5-디히드록시페녹시)-3,5-디히드록시페녹시)-3,5-디히드록시페녹시)-2,6-디히드록시페녹시)-2,6-디히드록시페녹시)-2,6-디히드록시페녹시)벤젠-1,3,5-트리올" (2-(4-(4-(4-(4-(4-(4-(3,5-dihydroxyphenoxy)-3,5-dihydroxyphenoxy)-3,5-dihydroxyphenoxy)-3,5-dihydroxyphenoxy)-2,6-dihydroxyphenoxy)-2,6-dihydroxyphenoxy)-2,6-dihydroxyphenoxy)benzene-1,3,5-triol)이다.

<화학식>

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피부 미백용 조성물은 세포의 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 피부 미백용 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 화장료는 연고제, 팅크제, 비누, 클린싱크림, 콜드크림, 화장수, 밀크로션, 영양크림, 에센스, 파운데이션 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 피부 미백용 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 식품 조성물은 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 피부 미백용 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물에 함유된 옥타플로레솔 에이(Octaphlorethol A) 성분은 시험관(in vitro) 및 생체(in vivo) 실험 모두에서 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 확인되었고, 생체 내 독성을 나타내지 않았다. 따라서 옥타플로레솔 에이를 함유한 본 발명의 피부 미백용 조성물은 피부 미백용 화장품, 식품 또는 약학적 조성물 등의 유효성분으로 사용될 수 있다.

도 1은 넓패로부터 신물질인 옥타플로레솔 에이(octaphlorethol A)를 추출 및 정제하는 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 넓패로부터 정제되어진 옥타플로레솔 에이의 ESI-mass 크로마토그램 결과이다.
도 3은 넓패로부터 정제되어진 옥타플로레솔 에이의 구조를 분석하기 위한 NMR 결과이다.
도 4는 넓패로부터 정제되어진 옥타플로레솔 에이의 구조이다.
도 5는 B16F10에서 OPA가 세포 생존에 미치는 영향을 나타낸다. 96-웰 플레이트의 웰 속의 세포들(1 × 10⁵ cells/well)을 다양한 농도의 OPA로 72시간 동안 배양시켰다. 세포 생존율은 MTT 어세이로 측정하였다. 처리 세포들에서 각각의 백분율은 대조군 세포에 대한 값이다.
도 6은 OPA가 버섯 티로시나아제 활성에 미치는 억제 효과를 나타낸다. 측정 용액은 다른 농도의 OPA, 2100 units/ml 버섯 티로시나아제 및 1.5 mM L-티로신을 포함한다. 측정 혼합물을 37℃ 에서 12분간 배양하였다. 배양 후에 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서 측정하였다.
도 7은 B16F10에서 OPA가 세포 멜라닌 합성에 미치는 영향을 나타낸다. 세포들을 12.5-50 uM 또는 100 uM 알부틴의 존재 하에서 50 nM α-MSH에 노출시켰다. 각각의 백분율은 대조군에 대한 값이다. 알부틴은 티로시나아제 억제에 대한 양성대조군이다.
도 8은 OPA가 세포 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 B16F10 세포에서 실험한 결과이다. 세포들을 12.5-50 uM 또는 100 uM 알부틴의 존재 하에서 50 nM α-MSH에 노출시켰다. 각각의 백분율은 대조군에 대한 값이다. 알부틴은 티로시나아제 억제에 대한 양성대조군이다.
도 9는 OPA가 멜라닌 합성 관련 단백질들의 발현에 미치는 영향을 B16F10 세포에서 실험한 결과이다. 세포들을 12.5-50 uM 또는 100 uM 알부틴의 존재 하에서 50 nM α-MSH에 72시간 동안 노출시켰다. MITF, 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1 및 TRP-2 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 동일한 양의 단백질 로딩(loading)을 액틴 발현으로 확인하였다.
도 10은 OPA가 ERK의 인산화에 미치는 영향을 B16F10 세포에서 실험한 결과이다. 세포들을 50 uM의 OPA에 일정한 시간 간격 동안 노출시켰다. phospho-ERK 및 ERK 단백질들의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질 로딩은 액틴 발현으로 확인하였다.
도 11은 OPA가 Akt의 인산화에 미치는 영향을 B16F10 세포에서 실험한 결과이다. 세포들을 50 uM의 OPA에 일정한 시간 간격 동안 노출시켰다. phospho-Akt 및 Akt 단백질들의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질 로딩은 액틴 발현으로 확인하였다.
도 12는 OPA가 p38의 인산화에 미치는 영향을 B16F10 세포에서 실험한 결과이다. 세포들을 50 uM의 OPA에 일정한 시간 간격 동안 노출시켰다. phospho-p38 및 p38 단백질들의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질 로딩은 액틴 발현으로 확인하였다.
도 13은 OPA가 JNK의 인산화에 미치는 영향을 B16F10 세포에서 실험한 결과이다. 세포들을 50 uM의 OPA에 일정한 시간 간격 동안 노출시켰다. phospho-JNK 및 JNK 단백질들의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질 로딩은 액틴 발현으로 확인하였다.
도 14는 MEK 또는 ERK의 선택적 억제제인 PD98059가 OPA의 멜라닌 생성 억제 활성에 미치는 영향을 측정한 것이다.
도 15는 제브라피쉬에서 OPA의 멜라닌 합성 억제 효과를 실험한 결과이다.
1-phenyl-2-thiourea (PTU) 및 알부틴을 양성 대조군으로 이용하였다. 실험은 3반복으로 수행하였다.
도 16은 OPA가 제브라피쉬의 색소침착에 미치는 멜라닌 억제 효과를 실험한 결과이다. 제브라피쉬의 색소침착을 35 hpf (hour post-fertilization)째 현미경으로 관찰하였다. (A) 대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 제브라피쉬 배아. (B, C) 양성대조군으로 1-phenyl-2-thiourea (PTU), 알비틴 처리. (D, E, F) 3.125-25 uM OPA 처리.
도 17은 OPA의 티로시나아제 억제 활성을 제브라피쉬에서 실험한 결과이다. 1-phenyl-2-thiourea (PTU) 및 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 18은 50 uM 1-phenyl-2-thiourea (PTU), 500 uM 알부틴 및 1-50 uM OPA를 처리한 후 생존율을 측정한 결과이다.
도 19는 OPA에 의한 제브라피쉬의 심박수 변화를 측정한 결과이다.
도 20은 OPA에 의한 제브라피쉬의 부종 크기 변화를 측정한 결과이다.

본 발명은 넓패(Ishige foliacea)로부터 추출한 신물질 옥타플로레솔 에이(octaphlorethol A)의 미백 활성 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 해조류 중 갈조류에 속하는 넓패를 추출하고 주성분을 분리, 정제하여, 그의 구조를 결정하기 위해 실리카겔 크로마토그래피 (silica gel chromatography), HPLC, ESI-mass, NMR을 실행하여 그 구조를 확인하였다. 확인 결과 옥타플로레솔 에이(Octaphlorethol A; OPA)로 명명한 신물질을 동정할 수 있었다.

OPA의 미백 활성을 알아보기 위하여, 먼저 OPA가 멜라닌 생성(melanogeneses) 및 티로시나아제(tyrosinase) 활성에 미치는 영향을 B16F10 흑색종(melanoma) 세포에서 실험하였다(실시예 2). 그 결과 대조군에 비하여 OPA가 투여량에 비례하게 α-MSH (alpha-melanocyte stimulating hormone)에 의하여 자극 받는 멜라닌 합성 및 티로시나아제 활성을 감소시켰으며, OPA에 의해 멜라닌 함량이 상당히 감소함을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 8). 또한 본 발명자들은 p38, MITF (microphthalmia-associated transcription factor) 감소와 관련된 멜라닌 형성 유도 및 그 조절과 관련된 다른 티로시나아제-관련 단백질 발현을 조사하였다(도 9-14). 또한 제크라피쉬(zebrafish)를 사용하여 생체 내(in vivo) 미백 활성 실험을 수행하였다(실시예 3). 지난 십년간 생물 의학 분야의 중요한 모델 생물체로 개발된 것 중 하나가 제브라피쉬이다. 전통적으로 제브라피쉬 연구의 주된 분야는 발생생물학 분야였으나, 본 연구에서는 미백 효과를 측정할 수 있는 동물모델로 사용하였다. 그 결과 OPA는 제브라피쉬에서 우수한 색소침착 저해 효과를 나타냈으며(도 15 및 도 16), 그것은 대부분 티로시나아제 억제 활성으로부터 기인하는 것으로 보인다(도 17).

상기 실험 결과들은 일관되게 OPA의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냈으며, 그것은 기존의 억제제들과 비교하여 동등한 수준 이상의 효과였다. 일반적으로 피부가 검게 되거나 기미, 주근깨 등이 생기는 원인은 자외선 등에 의해 멜라닌 색소가 생합성되어 피부에 침착하기 때문인 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 넓패 추출물을 함유한 조성물은 피부 미백 용도로 사용될 수 있다. 여기에서 미백 용도란, 자외선 노출이나 호르몬 변화 등에 의해 발생하는 기미, 주근깨, 다크서클, 검은 피부 등을 개선하거나 방지하는 효과뿐만 아니라 나아가 피부를 투명하게 하거나 윤기나 탄력성을 증가시키는 효과 등을 의도하고 사용하는 경우를 포함한다.

또한, 상기 OPA 물질은 본 발명의 미백용 조성물로서 하기와 같은 다양한 형태로 사용될 수 있으며, 이 경우 OPA 물질 자체뿐만 아니라 이의 유도체, 나아가 이의 약학적으로 허용가능한 염 또한 본 발명의 피부 미백용 조성물로 사용될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 제품화에 있어 적절한 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 사용은 OPA 물질 자체보다 수용성 또는 유용성을 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 여기에서, 유도체란 자연계에서 생화학적으로 또는 인위적으로 발생할 수 있는 모든 형태의 유도체를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 알콜에스테르기를 갖는 유도체, 지방산에스테르기를 갖는 유도체, 알콕시기를 갖는 유도체, 알콕시메틸기를 갖는 유도체, 또는 배당체 등을 들 수 있다. 또한, 상기 유도체를 다시 유도체화하여 그들의 염을 사용할 수도 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 통상적으로 음식물 또는 의약 조성물로 이용되고 있는 염이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속염, 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리토류 금속염, 암모니아, 메틸아민, 디메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 프로필아민, 부틸아민 등의 알킬아민염, 에탄올아민, 디에탄올아민, 프로판올아민, 디프로판올아민, 이소프로판올아민, 디이소프로판올아민 등의 알카놀아민염, 피페라딘, 피페리딘 등의 기타 유기아민염, 알기닌, 히스티딘, 트립토판 등의 염기성 아미노산염 등의 염을 들 수 있다.

먼저, 본 발명의 OPA를 함유한 미백용 조성물은 이를 유효성분으로 함유한 미백용 화장료의 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 OPA 물질을 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 90 중량부의 양으로 함유하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 OPA에 추가적으로 피부학적으로 허용된 담체를 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 피부학적으로 허용된 담체는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제, 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 방부제, 저급 알코올 등이 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 그 종류와 농도는 다양하고, 당업자가 본 발명의 범위 내에서 변경할 수 있는 부분을 포함한다. 또한, 필요에 따라 기능적 물질, 예컨대, 미백제, 보습제, 항염증제, 항박테리아제, 항진균제, 비타민, 자외선 차단제, 항생제, 여드름 방지제, 향수, 염료가 포함될 수도 있으며, 이들은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 본 발명에 따른 화장용 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 화장료는 그 미백 효과를 증대시키기 위하여 본 발명의 OPA에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 활성 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 피부 미백 활성 성분으로는 예를 들어, 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 하이드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸, 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물로부터 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 상기 화장품은 본 발명의 OPA 이외에도 피부학적으로 허용된 매질 또는 기제를 함유함으로써 당업계에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수도 있다. 적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종

크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트 또는 미용액 등이 있다. 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

또한, 본 발명의 OPA를 함유한 미백용 조성물은 이를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 식품 조성물로 이용될 수 있다. 본 발명의 OPA를 함유한 미백용 조성물을 경구투여가 가능한 형태로 만들어 원료로서 음식물에 배합하면 피부의 미백 효과를 나타내는 음식물을 제조할 수 있다. 식품으로서의 미백 효과는, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 사료를 동물에게 섭취시켜서 피부의 색소 침착의 개선도를 지표로서 평가할 수 있다.

여기에서, '유효성분으로서 함유'한다는 것은, 그 미백 효과를 나타낼 수 있을 정도로 함유한다는 의미로서, 구체적인 함량이 특별히 제한되는 것은 아니며, 섭취의 빈도나 섭취량, 음식물의 종류, 섭취하는 사람의 체중, 성별 등에 따라 적절히 조절할 수 있다. 예를 들어, 직접 경구 섭취하는 경우에는 비교적 저농도가 좋고, 음식물의 원료 등에 사용하는 경우는 고농도가 바람직할 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 OPA를 함유하기 때문에 피부의 미백 효과를 가지는 것을 특징으로 한다. 특히, 음식물이기 때문에 계속적인 섭취가 가능하므로 우수한 효과가 기대를 기대할 수 있다. 나아가, 상기 본 발명의 기능성(미백용) 식품 조성물은 미백 효과의 향상이나 흡수성의 향상 등을 위하여 다른 생리적 활성 성분 등을 배합할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 비타민 C, 이소후라보노이드, 프로-안토시아니딘류, 탄닌류와 같이 상승적인 효과를 기대할 수 있는 다른 경구 미백 성분; 비타민 C, 토코페롤, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니졸, 에틸렌디아민, 세사민 등과 같이 간접적으로 미백 효과에 기여할 수 있는 항산화 성분; 대두유, 채종유, 참기름, 올리브유 등의 식물 유지나 라드, 우지(beef tallow), 어유(fish oil) 등의 동물 유지 등과 같이 체내에서의 흡수성을 향상시켜 미백 효과의 효율을 올리기 위한 유성 성분, 영양 강화를 위한 각종 비타민류, 미네랄류, 아미노산류 등을 들 수 있다. 상기 각 성분은 사용 목적에 따라서 적절하게 설계, 배합될 수 있다. 예를 들어, 이소후라본류 및 그 유도체는 수용성이 우수하고, 본 발명의 OPA와 동시에 생체에 작용하여 티로시나아제 저해 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 이소후라보노이드를 동시에 배합한 본 발명의 미백용 식품 조성물은 이소후라보노이드의 항산화성이나 에스트로겐과 같은 생리활성이 동시에 상승적으로 활성화되는 것을 기대할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 그 형태에 있어서 특별히 제한은 없으며, 예를 들어 통상의 형태 이외에, 유동식품, 경장영양식품, 건강식품, 유소아 식품 등의 형태로 제조될 수 있다. 계속적 섭취의 측면에서는 쌀밥이나 각종 조미료, 조합 유지나 마가린, 쇼트닝, 마요네즈, 드레싱 등의 유지 가공품이 바람직하다. 또한, 형태는 고체 형상, 반고체 형상, 겔 형상, 액체 형상, 분말 형상 등 당업계에서 통상 사용되는 어떠한 형태도 이용가능하다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 과자, 가공식품, 조합 유지, 유제품, 음료 등의 형태로 상품화할 수 있다.

또한, 본 발명의 OPA를 함유한 미백용 조성물은 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 OPA, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물은 임상적으로 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화될 수 있다. 또한, 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용제, 주사제 등의 제형을 의미한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산 알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 본 발명의 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서 OPA의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인에게 1일에 10 ~ 500 ㎎, 바람직하게는 50 ~ 300 ㎎의 양이 투여되도록 하는 것이 바람직하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하게는 1회 내지는 6회 분할 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

옥타플로레솔 에이(Octaphlorethol A; OPA)의 추출 및 정제

<1-1> 재료의 준비

실험에 사용한 해조류인 넓패는 제주연안에서 직접 채취하여 물로 깨끗이 여러 번 씻어 이물질을 제거한 후 심온동결기 (-70℃)에 보관하였다. 동결된 시료는 동결건조시켜 분쇄하였고 50 메쉬 (Mesh) 이하의 크기로 분말화하여 준비하였다.

<1-2> 넓패로부터 유기 용매 추출물의 제조 공정

준비된 건조 넓패 분말 500g에 5L의 에탄올 혹은 메탄올을 첨가하여 혼합하였으며, 추출 조건은 20~40℃, 24시간 동안 수행하였다. 유기용매 추출 공정을 통하여 추출되지 않은 잔사를 제거하기 위해 10~20분간 원심분리시켰다. 최종적으로 넓패의 유기용매 추출물은 필터링을 거친 후에 얻어졌고, 잔사는 위의 방법을 2~3회에 걸쳐 재추출하였다.

<1-3> 유기용매 분획 공정을 통한 주요 성분 정제 공정

넓패 유기 용매 추출물을 감압 회전농축기를 이용하여 유기용매 성분을 제거하였으며, 이에 증류수를 첨가하여 현탁하였으며, 헥산 (hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 각각 첨가하여 용매 분획을 수행하였다. 각 분획물을 감압 회전농축기를 통하여 용매를 제거하여 분획물의 무게를 측정한 결과, 헥산 분획물은 7.5g, 클로로포름 분획물은 4.5g, 에틸아세테이트 분획물은 15.5g을 얻었으며, 이중 가장 많은 양을 얻은 에틸아세테이트 분획물을 가지고 정제과정을 수행하였다.

<1-4> 주요 성분의 실리카 정제 방법 및 구조 분석

에틸아세테이트 분획물을 실리카 컬럼에 주입하였다. 이를 상세하게 설명하면, 75-180μm 직경의 실리카에 지름 55mm, 길이 400mm의 유리관에 충진시킨 실리카 컬럼에 에틸아세테이트 분획물을 주입하여 클로로포름:메탄올을 10:1에서 0:1 비율로 용리시키는 실리카 분획 공정을 통하여 분획물을 얻었다.

이와 같이, 실리카 공정에서 얻은 분획물을 ESI-mass (유속 = 0.2 ml/min, 2.1×100mm C-18 컬럼; Thermo (USA), Thermo HPLC-mass system)로 분석하였다. 또한 구조 분석을 위하여 ¹H-NMR (400MHZ, DMSO-d ₆) 및 ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d ₆)을 통하여 측정하였다.

분리된 주 성분인 옥타플로레솔 에이(octaphlorethol A)의 ESI-mass 결과는 도 2에 나타내었다. ESI-mass 분석 결과 옥타플로레솔 에이의 분자량은 994 MW로 확인되었으며 분자식은 C₄₈H₃₄O₂₄ 로 확인하였다. 도 4는 옥타플로레솔 에이의 분자 구조를 나타낸 것으로, 분자식을 통하여 24개의 이중결합과 17개의 하이드록실기(hydroxyl group)를 확인하였으며, 그리고 8개의 링의 구조로 이루어져 있음을 확인하였다.

물질의 구조는 디엠에스오(DMSO)를 분석용매로 하여, ¹H과 ¹³C NMR 분석을 통하여 구조를 결정하였다 (도3).

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆)을 이용하여 분석한 결과, δ¹H (mult, J = Hz)는 5.57 (1H, d, J =2.8 Hz，H-4), 5.58 (1H, d, J =2.8 Hz，H-6), 5.59 (1H, d, J =2.8 Hz，H-9), 5.59 (1H, d, J =2.8 Hz, H-11), 5.68 (1H, d, J =1.8 Hz, H-15), 5.68 (1H, d, J =1.8 Hz, H-17), 5.71 (1H, d, J =1.8 Hz, H-21), 5.72 (1H, d, J =1.8 Hz, H-23), 5.85 (1H, d, J =1.6 Hz, H-26), 5.84 (1H, d, J =1.8 Hz, H-30), 5.94 (1H, d, J =1.8 Hz, H-32), 5.94 (1H, d, J =1.8 Hz, H-36), 6.15 (1H, d, J =1.8 Hz, H-38), 6.15 (1H, d, J =1.8 Hz, H-42), 6.16 (1H, d, J =1.6 Hz, H-44), 6.01 (1H, d, J =1.6 Hz, H-46), and 6.16 (1H, d, J =1.6 Hz, H-48), 9.02 (s, OH-1,3), 9.04 (s, OH-5, 27, 29, 33,35), 8.98 (s, OH-8,12), 8.93 (s, OH-14, 18), 8.92 (s, OH-20,24), 9.06 (s, OH-39,41), and 9.07 (s, OH-45, 47) 이며, ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d ₆)을 이용하여 분석한 결과, δ¹³C는 δ 153.0 (s, C-1), 153.0 (s, C-3), 156.1 (s, C-5), 152.9 (s, C-8), 151.1 (s, C-10), 152.9 (s, C-12), 151.1 (s, C-14), 154.5 (s, C-16), 151.1 (s, C-18), 151.1 (s, C-20), 151.1 (s, C-24), 154.1 (s, C-25), 154.1 (s, C-22), 151.1 (s, C-27), 151.1 (s, C-29), 154.0(s, C-31), 150.8 (s, C-33), 150.8 (s, C-35), 156.2 (s, C-37), 152.7 (s, C-39), 152.7 (s, C-41), 161.0 (s, C-43), 158.6 (s, C-45), 161.0 (s, C-47), 122.0 (s, C-2), 122.0 (s, C-7), 122.0 (s, C-9), 122.0 (s, C-13), 123.4 (s, C-19), 123.4 (s, C-28), 123.5 (s, C-34), 123.5 (s, C-40), 94.9 (d, C-6),94.9 (d, C-4), 94.7 (d, C-11), 94.7 (d, C-15), 94.7 (d, C-17), 94.7 (d, C-21), 94.7 (d, C-23), 94.7 (d, C-26), 94.7 (d, C-30), 94.1 (d, C-32), 94.2 (d, C-36), 94.1 (d, C-38), 94.1 (d, C-42), 94.7 (d, C-44), 94.0 (d, C-46), and 94.7 (d, C-47) 이었으며, 상기 분석결과로부터 상기물질의 구조가 하기 화학식 1임을 확인하였다.

<화학식 1>

< 실시예 2>

옥타플로레솔 에이(OPA)의 멜라닌 형성 억제 및 티로시나아제-관련 단백질 조절 억제 활성

<2-1> OPA 가 세포 생존에 미치는 영향

B16F10 흑색종(melanoma) 세포주에서 OPA의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였기 때문에, 실험에 사용될 B16F10 세포가 OPA와 함께 72시간 동안 배양된 뒤 생존할 수 있는지를 MTT 측정(assay)으로 조사하였다.

B16F10 마우스 흑색종 세포들은 한국세포주은행(KCLB)에서 입수하였고, 세포배양은 10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin) (100 X)을 함유한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서, 37 ℃, 5% CO₂ 대기조건으로 수행하였다. 세포들을 60mm 조직 배양 접시에 접종하고, 샘플 처리는 접종 72시간 후에 시작하였다.

배양된 세포들의 생존은 (37 ℃, 24시간 배양 후에) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltrazolium bromide) 의 포르마잔(formazan) 환원을 통해 측정하였다. 배양 후에, 50㎕의 MTT 용액(저장농도 DPBS에서 5 mg/mL)을 각각의 웰(well)에 첨가하고 세포들을 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 각각의 웰에서 포르마잔 결정들을 DMSO에 녹였다. 540 nm에서 흡광도를 측정하여 자색 포르마잔의 양을 측정하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, OPA는 6.25-50μM 농도에서 흑색종 세포에 세포독성을 나타내지 않았으며, 이는 72시간의 처리 후에 OPA가 세포 생존에 영향을 미치지 않았음을 의미한다.

본 발명의 실시예 또는 도면에 기재된 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다. 모든 결과들은 독립적인 3반복 실험의 측정값이다. 결과들은 ANOVA 테스트(SPSS 11.5 statistical software)로 분석하였다. 파라미터들의 평균 사이의 유의적 차이는 Duncan's test로 결정하였다(p< 0.05).

<2-2> OPA 가 버섯 티로시나아제 활성, 세포 멜라닌 함량 및 세포 티로시나아제 활성에 미치는 영향

본 발명자들은 버섯 티로시나아제 억제 활성을 조사하였다. 티로시나아제 억제 활성은 Vanni (Vanni, A., et al., 1990. Kinetic investigations on the double enzymatic activity of the tyrosinase mushroom. Annali di Chimica 80: 3560)의 방법에 따라 수행하였다. 96-웰 플레이트에서 각각의 추출물(10㎕)을 140㎕의 0.1 mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)로 희석시킨 후, 40㎕의 1.5 mM L-티로신 용액 및 10㎕의 버섯 티로시나아제 (2100 units/㎖)를 첨가하였다. 실험 혼합물(200㎕)을 잘 섞고 37℃에서 12분간 배양하였다. 배양 후에, 반응 혼합물에서 생성된 도파크롬(dopachrome)의 양을 멀티플레이트 리더(multiplate reader)로 490nm에서 측정하였다. 티로시나아제 활성의 억제 백분율은 다음의 식으로 계산하였다:

억제율 (%) = (1 - (B - A) / (D - C) × 100

(A : 배양 전 시험 샘플의 490 nm 흡광도, B : 배양 후 시험 샘플의 490 nm 흡광도, C : 배양 전 시험 샘플이 없는 490 nm 흡광도, D : 배양 후 시험 샘플이 없는 490 nm 흡광도).

OPA는 흑색종 세포에 대해 50%의 상당한 버섯 티로시나아제 억제를 나타냈다(도 6). OPA는 직접적인 티로시나아제 억제제인 알부틴(arbutin) (100μM) 보다 더 나은 티로시나아제 억제 활성을 나타냈다. 따라서, OPA가 멜라닌 생성을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, B16F10 세포들에 α-MSH를 처리하기 전에 본 발명의 추출물을 처리하였다. 그 후 OPA 또는 알부틴 (100μM) 존재 하에, 상기 세포들에 α-MSH (50 nM)를 72시간 동안 노출시키고, 세포 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성을 측정하였다.

세포 멜라닌 함량은 공지의 방법을 사용하여 수행하였다(Tsuboi, T., et al., 1998. Enhanced melanogenesis induced by tyrosinase gene-transfer increases boron-uptake and killing effect of boron neutron capture therapy for amelanotic Melanoma. Pigment Cell and Melanoma Research 11: 275-282). B16F10 세포들에 OPA를 3일간 처리한 후, PBS로 세척하고, 1 N NaOH가 함유된 10% DMSO 속에 80℃로 1시간 동안 두었다. 상대적인 멜라닌 함량은 ELISA 리더를 사용하여 475 nm 흡광도를 측정함으로써 측정하였다.

세포 티로시나아제 활성 역시 공지의 방법(Tomita et al., 1992)을 약간 변형한 방법으로 측정하였다. 간략하게, 60 mm 접시에서 자란 세포들에 72시간 동안 DMEM을 처리한 후, 얼음 냉각한 PBS (pH 7.4)로 세척하고, 1% 트리톤(Triton) X-100을 함유한 PBS를 처리하였다. 그 후, 세포들을 얼린 후 해동시키고, 용해물(lysates)을 원심분리하였다(13000

g, 10분). 단백질 측정 키트(Bio-RAD protein assay kit)로 단백질 함량을 측정한 뒤, 같은 양의 단백질(100㎍)을 함유하기 위해 용해물을 용해 버퍼(lysis buffer)로 조절하였다. L-DOPA (2mg/ml)를 동일한 용해 버퍼에서 준비하였다. 각각의 추출물 90㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 37℃에서 10㎕의 L-DOPA 용액을 첨가하면서 효소 어세이(enzymatic assay)를 시작하였다. 배양 후에, 37℃에서 적어도 1시간 동안 매 10분마다 ELISA 리더를 사용하여 405nm 흡광도를 측정함으로써 도파크롬(dopachrome) 형성을 측정하였다.

OPA-처리 흑색종의 멜라닌 함량을 도 7에 나타내었다. 대조군과 비교하여, OPA (12.5, 25 및 50μM)를 72시간 동안 처리한 그룹은 투여량에 비례하여 멜라닌 함량을 감소시켰다. 양성 대조군인 알부틴 역시 B16F10 세포들에서 멜라닌 생성을 억제시켰다. 또한, 티로시나아제는 멜라닌 생성에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있으므로, OPA가 세포에서 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 조사하였다. OPA-처리 세포들의 티로시나아제 활성은 알부틴-처리 세포들의 수준보다 더 낮았다(도 8).

<2-3> OPA 가 티로시나아제, TRP -1, TRP -2, 및 MITF 단백질 발현에 미치는 영향

OPA의 억제 효과가 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 및 MITF를 포함한 멜라닌 생성-관련 단백질들의 발현 수준과 관련이 있는지 알아보기 위하여, 세포들을 OPA 또는 알부틴 존재 하에 α-MSH에 72시간 동안 노출시켰다. 그 후 단백질 추출물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석하였다.

마우스 흑색종 세포주인 B16F10을 18시간 동안 전-배양(pre-incubated)시킨 후, OPA 존재 하에 α-MSH로 자극시켰다. 72시간의 배양 후에, 세포를 찬 PBS로 두 번 세척하였다. 상기 세포들을 NucBuster^TM 단백질 추출 키트(Novagen, San Diego, CA, USA)를 사용하여 녹이고, 얼음에 30분간 놓은 후에 원심분리시켰다(1600 rpm, 5분, 4℃). 세포 용해물을 원심분리로 세척하고 BCA 어세이 키트(Bio-RAD)를 사용하여 단백질 함량을 측정하였다. 동일한 양(50 ㎍)의 각각의 단백질 추출물을 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 이어서, PVDF 막(Bio-RAD, HC, USA)에서 글리신 이동 버퍼[192 mM glycine, 25 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20% MeOH (v/v)]로 단백질들을 전기-이동시켰다. 5% BSA (bovine serum albumin)를 함유한 TBS 버퍼에서 2시간 동안 블락킹한 뒤, 상기 막을 티로시나아제, TRP1, TRP2 및 MITF와 같은 특정 1차 항체와 함께 배양시켰다. 상기 막은 HRP-연결(conjugated) 항-토끼 이뮤노글로뷸린(Ig) G와 함께 오버나잇 배양하였다. 면역활성 단백질은 ECL (enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블랏팅 키트를 사용하여 검출하였다.

도 9는 α-MSH-자극 세포에서 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 및 MITF 의 단백질 수준이 OPA에 의해 감소되었음을 보여주며, 이는 OPA의 MITF 발현 감소(down-regulating)에 의한 티로시나아제 단백질 발현 억제 활성과 일치하는 결과이다. MITF는 티로시나아제 유전자의 중요한 전사인자이다.

<2-4> OPA 가 MAPK 경로의 인산화에 미치는 영향

MAPK 경로가 OPA의 항-멜라닌 생성 활성과 관련이 있는지 알아보기 위하여, ERK1/2, Akt, p38 및 JNK 인산화(phosphorylation)에서 OPA의 영향을 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다(도 10-13).

흑색종의 멜라닌 생성 과정 동안 p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 경로가 MITF를 활성화시키는 반면에, Akt 경로 및 세포외(extracellular) ERK 경로는 MITF를 억제하는 것으로 알려져 있다. 50 μM의 OPA를 처리하여 B16F10 세포에서 ERK 1/2, Akt, P38 및 JNK 의 활성을 측정하였다. 시간에 따른 분석 결과, ERK의 인산화는 OPA 처리 12시간 째 상당히 증가되었다.

<2-5> 특정 억제제가 OPA 의 억제 기작에 미치는 영향

OPA가 ERK 신호전달 경로를 활성화시켰으므로, 본 발명자들은 MEK 또는 ERK의 선택적 억제제인 PD98059가 OPA의 멜라닌 생성 억제 활성에 미치는 영향을 살펴보았다. 도 14에 나타낸 바와 같이, PD98059 처리에 의해 멜라닌 합성이 유도되었다. 티로시나아제 활성은 α-MSH만을 처리한 세포보다 α-MSH와 PD98059를 함께 처리한 세포에서 더 높거나 비슷하게 나타났다.

< 실시예 3>

제브라피쉬(zebrafish)를 이용한 OPA 의 미백효과 실험

<3-1> 제브라피쉬 배아( embryo )에서의 OPA 의 멜라닌 합성 억제 활성

OPA의 억제 활성을 측정하기 위하여, 제브라피쉬 총 추출물을 사용하여 멜라닌 합성을 측정하였다.

성장한 제브라피쉬를 구입하여 10마리를 3 l 아크릴 탱크에 넣고, 28.5℃, 14/10 시간 명/암 사이클 조건을 유지시켰고, 먹이는 하루에 세 번씩 주었다. 배아는 빛을 비춰주는 아침에 유도되는 자연산란으로부터 얻었다.

공지의 방법에 따라 배아를 수집하여 피펫으로, 475㎕의 배아 배지를 담은 24-웰 플레이트에 웰당 15-20개의 배아를 정렬하였다(Cha, S. H.,et al., 2011. Screening of marine algae for potential tyrosinase inhibitor: Those inhibitors reduced tyrosinase activity and melanin synthesis in zebrafish. The Journal of Dermatology 38: 354-363). 시험할 화합물들을 1% DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹이고, hpf (post-fertilization) 935 시간부터 배아 배지에 첨가하였다. 제브라피쉬의 색소형성에 미치는 영향을 현미경으로 관찰하였다. 모든 실험에서 발달 단계에 영향을 받지 않은 투명한 제브라피쉬를 만들기 위해, 0.5 mM PTU (1-phenyl-2-thiourea) 및 20 mM 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다. 35 dpf 째 형질(phenotype)에 기초하여 몸의 색소를 측정하였다. 관찰을 위하여, 2 mg/ml 프로나아제(pronase) (비특이적 효소; Sigma, St Louis, MO, USA)에서 배아의 염소를 제거하고, SZX9 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 사진을 찍었다.

멜라닌 함량 측정은 9 - 35 dpf 동안 약 30개의 제브라피쉬 배아들에 멜라닌 생성 억제제(OPA, PTU 또는 알부틴)를 처리하거나 처리하지 않고, 프로-프렙(Pro-Prep) 단백질 추출용액(Intron)에서 초음파 분해하여 측정하였다. 원심분리 후에, 펠렛(pellet)을 1 ml 의 1 N NaOH에서 100℃로 30분간 녹였다. 그 후 혼합물을 볼텍싱하여 멜라닌 색소를 용해시켰다. 상층액의 광학밀도(optical density)를 490 nm에서 측정하고, 그 결과를 대조군(100%)과 비교하였다. 멜라닌 함량은 단백질의 양으로 계량하였다.

예상대로 양성 대조군인 PTU 와 알부틴(arbutin)은 멜라닌 합성을 억제시켰다(44.5%, 15%). 또한 3.125-25 μM 의 OPA 역시 멜라닌 합성을 억제시켰다(도 15, 도 16). 흥미롭게도, 12.5 μM 미만의 OPA는 알부틴 보다 더 높은 멜라닌 합성 억제 활성을 나타냈고, 6.25 μM OPA는 알부틴과 유사한 활성을 나타냈다.

<3-2> 제브라피쉬 배아에서 OPA 의 티로시나아제 억제 활성

제브라피쉬 총 추출물을 이용하여 티로시나아제 활성을 측정하였다.

티로시나아제 억제 활성은 공지의 방법에 따라 분광학적 방법으로 측정하였다(Busca et al., 1996. Inhibition of the Phosphatidylinositol 3-Kinase/p70^S6-Kinase Pathway Induces B16 Melanoma Cell Differentiation. The Journal of Biological Chemistry 271: 31824-31830). 약 100개의 제브라피쉬 배아들에 9-35 dpf 동안 멜라닌 생성 억제제(OPA, PTU 또는 알부틴)를 처리하거나 처리하지 않고, 프로-프렙(Pro-Prep) 단백질 추출용액(Intron)에서 초음파 분해하여 측정하였다. 용해물을 10,000 g에서 5분간 원심분리하였다. 100μl의 용해버퍼 속에 있는 250㎍의 총 단백질을 96-웰 플레이트에 옮기고, 100μl의 1.5 mM L-티로신(tyrosine)을 첨가하였다. 대조군 웰에는 100μl의 용해버퍼 및 100μl의 1.5 mM L-티로신(tyrosine)을 넣었다. 28℃에서 60분간 배양한 후에, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. PTU 및 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다. 대조군의 광학밀도를 100%로 간주하였다.

예상대로, 양성대조군인 PTU 와 알부틴은 티로시나아제 활성을 억제시켰다(각각 40.2%, 17.3%). 3.125-25 μM OPA 역시 티로시나아제 활성을 감소시켰다(도 17). 12.5 μM 보다 높은 OPA는 알부틴 보다 더 높은 티로시나아제 억제 활성을 나타냈다. 특히, OPA는 투여량에 비례하게 티로시나아제 억제 활성을 나타냈다.

<3-3> 제브라피쉬 배아에서 멜라닌 생성 억제제의 독성 실험

멜라닌 생성 억제제의 독성을 측정하기 위해, 제브라피쉬의 성장 패턴을 관찰하였다. 화합물들의 독성을 측정하기 위해, 배아 치사율, 생존율, 심박수 및 부종 크기 억제를 실험하였다.

농도에 비례하는 생존율과 부화시간(hatching time)을 공지의 방법으로 측정하였다(Karlsson, J et al., 2001. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gent expression during embryonic development. Marine Biothechnology 3: 522-527). 수정 후 48시간(48 hpf)째, 부화하거나, 부화하고 죽거나, 부화하지 못하고 죽거나, 살아 있는 배아의 수를 세었다. 120 hpf에서 부화하지 못한 살아있는 배아는 살아 있으면서 배아하지 못한 것으로 간주하였다. 부화시간은 살아 있는 배아들에 대해서만 측정하였고, 부화시간을 측정할 때 초기(48 hpf 이전) 사망한 숫자는 배제시켰다.

한편, 독성 측정은 공지의 방법에 따라 35 dpf에서 심방(atrium)과 심실(ventricle) 모두의 심박수를 측정하였다(Choi et al,, 2007. Zebrafish as new model for phenotype-based screening of melanogenic regulatory compounds. Pigment Cell Res 20: 120-127). 심방과 심실 수축의 측정 및 기록은 현미경으로 3분간 수행하였고, 결과를 평균 b.p.m으로 나타냈다. 알부틴(50 mM) 및 PTU (0.5mM)를 양성대조군으로 사용하였다. 실험한 시료의 농도는 100 ㎍/ml 이었다.

본 실험에서, 멜라노 생성 억제제(PTU, 알부틴 및 OPA)는 치사율과는 무관했다. 반면에 심박수 테스트에서, 알부틴은 약간의 억제(disturbance)를 나타냈고, PTU는 심박수의 상당한 증가를 나타냈으나, OPA는 생존율, 심박수, 부종 크기 실험에서 대조군과 비교하여 거의 변화를 보이지 않았다(도 18-20).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (4)

1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 옥타플로레솔 에이(Octaphlorethol A)를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   .
2. 제1항에 있어서,
   상기 옥타플로레솔 에이는 넓패(Ishige foliacea)로부터 추출된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 옥타플로레솔 에이는 세포의 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 연고제, 팅크제, 비누, 클린싱크림, 콜드크림, 화장수, 밀크로션, 영양크림, 에센스, 파운데이션 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.

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