CN113648336A - 一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,包括蜂蜜和积雪草外泌体,还包括活性剂、pH调节剂、保湿剂、稳定剂或防腐剂中的一种或多种。本发明,用于对皮肤瘢痕(妊娠纹)预防、缓解和治疗,具有很好的耐寒性和耐热性,能够满足在温度极端变化条件下的使用要求,能够治疗妊娠纹和肥胖纹。

Description

一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域领域,尤其涉及一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法。
背景技术
动植物资源是人类最重要的资源之一,是食物、药物以及多种生活物资的重要来源。在药物应用方面,不同动植物产生不同的次级代谢产物,这些次级代谢产物大多数具有生物活性,广泛应用于皮肤抗衰(如积雪草苷)、抗炎舒缓 (如红没药醇)、美白祛斑(如花青素)等各个皮肤护理方向。然而,动植物对人体的功效远不止步于次级代谢产物,植物外泌体还有多种类似的人体调节作用,显示出其在皮肤护理中有重要的潜在应用价值。
随着人们对审美要求的不断提高,对皮肤损伤后瘢痕的防治要求也越来越高。皮肤的创口愈合是一个复杂的生理过程,其包括凝血、炎症、增生和组织重构4个阶段;其中包括基因的表达调控,各种生长因子的分泌调节等多个环节,任何一个环节的异常均会影响切口愈合而引起瘢痕的形成。在伤口修复中, TGF-β是纤维化过程的重要纤维细胞因子,因而拮抗TGF-β可以有效防治创口愈合过程中的过度纤维化,从而有效防止瘢痕的形成。
蜂蜜提取物,具有润肤、增白、除皱、生肌敛疮,止痛等作用。蜂蜜中含有多种维生素,尤其是B族维生素最多,每100g蜂蜜中含300-400μg B族维生素。蜂蜜中含有0.5%左右的蜂胶,蜂胶是一种天然的抗生素,普遍存在于天然蜂蜜当中,这也是蜂蜜为什么在自然环境下能长期保存的秘密。蜂蜜具有抗菌消炎、促进组织再生的作用,在处理伤口时,将蜂蜜涂于患处,可减少渗出、减轻疼痛,促进伤口愈合,防止感染,水嫩肌肤。
积雪草甙能激活上皮细胞,促进正常肉芽组织的形成,有助于创面的愈合。同时,通过抑制转化生长因子TGF-β1(transforming growth factor beta-1) 和TGF-β2及SMAD(Drosophila mothers against decapentaplegic protein) 相关蛋白来实现抑制成纤维细胞的增殖,对无秩序的瘢痕疙瘩增生具有抑制和缓解作用,可以预防手术和创伤后的组织粘连。因此,积雪草制剂是理想的治疗瘢痕疙瘩的良药。
然而,蜂蜜与积雪草提取物中的这些活性物是水溶性成分,皮肤吸收过程中要通过角质层的间隙,这个间隙是亲脂性(亲油性),所以亲水性成分很难通过角质层,其在护肤品应用方式上,仍然难以有效突破皮肤屏障,难以被皮肤有效吸收利用。
因此,上述问题,需要得到解决。
发明内容
(一)发明目的
为解决背景技术中存在的技术问题,本发明提出一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,用于对皮肤瘢痕(妊娠纹)预防,以及具有很好的瘢痕防御和缓解作用。
(二)技术方案
为解决上述问题,本发明提出了一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,包括蜂蜜和积雪草外泌体,还包括活性剂、pH调节剂、保湿剂、稳定剂或防腐剂中的一种或多种;
制备提取方法,包括以下步骤:
S1:将200-250mL灭菌处理后的PBS加入蜂蜜与积雪草中,蜂蜜与积雪草中为200-250g;
S2:使用破碎机破碎后,在4℃及3000×g条件下,离心30min;
S3:过滤去除较大的残渣,取中间层的紫色透明溶液;
S4:将紫色透明溶液在4℃及10000×g条件下,离心60min,取得上清液;
S5:将上清液在4℃及120000×g条件下,离心50min;
S6:使用1-2mL无菌PBS重悬沉淀,并于4℃及150000×g条件下,离心 60min;
S7:使用1-2mL无菌PBS重悬沉淀,得到蜂蜜与积雪草外泌体的成品。
优选的,活性剂为:植物提取物活性剂、动物提取物活性剂、生物发酵活性剂或化学合成活性剂中的一种或多种。
优选的,pH调节剂为:磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或多种。
优选的,保湿剂为:甘油、丙二醇、丁二醇、1,2-戊二醇、聚乙二醇、聚甘油、海藻糖、透明质酸钠、透明质酸、黄原胶、葡聚糖、鼠李糖、山梨糖醇或卡波姆中的一种或多种。
优选的,稳定剂为:螯合剂或维生素E中的一种或多种。
优选的,防腐剂为:甘油、丙二醇、丁二醇、1,2-戊二醇、辛甘醇、乙二醇、1,2-己二醇、山梨酸或苯甲酸中的一种或多种。
优选的,按照重量组份,蜂蜜为0.1-30份,积雪草外泌体为0.1-30份。
优选的,按照重量组份,包括:活性组分的重量份数在0.1-70份;pH调节组分的重量份数在0.01-5份;保湿组分的重量份数在0.1-40份;稳定组分的重量份数为0.1-10份;防腐组分的重量份数为0.1-30份。
本发明中,蜂蜜与积雪草外泌体的活性成分,内部包裹着有活性的次级代谢产物以及有调控作用的miRNA成分,磷脂双分子层结构一方面可以保护活性成分,另一方面可以通过皮肤角质层的间隙,这个间隙是亲脂性(亲油性),由于皮肤的屏障功能,亲水性成分很难通过角质层,蜂蜜与积雪草外泌体中包含的次级代谢产物和miRNA成分,可以降低瘢痕的发生和生长,而蜂蜜与积雪草外泌体的磷脂双分子层结构可以使其包含的活性成分更容易到达起作用的部位,发挥其生物活性,从而起到更好的瘢痕防御和缓解。
本发明中,将蜂蜜与积雪草外泌体应用于皮肤瘢痕预防的组合物或皮肤瘢痕预防的产品中,用于瘢痕皮肤的护理,该组合物或产品中蜂蜜与积雪草外泌体结构稳定,能有效保护内含活性成分,同时,因其外部结构是与皮肤细胞相同的磷脂双分子层结构,因而更易被细胞吸收和发挥瘢痕护理的作用,还能够治疗妊娠纹和肥胖纹。
同时,本发明具有很好的耐寒性和耐热性,能够满足在温度极端变化条件下的使用要求。
附图说明
图1为本发明提出的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法中蜂蜜粒径分布图。
该配方用于猪皮肤瘢痕的修复效果评估。
注:巴马猪臀部皮肤造模,直径1.5cm*1.5cm的圆形创面。经过自然对照和配方制剂对比观察,第10天,配方制剂组创面平整,HE染色提示该组瘢痕明显萎缩,较平坦,接近正常皮组织。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了,下面结合具体实施方式并参照附图,对本发明进一步详细说明。应该理解,这些描述只是示例性的,而并非要限制本发明的范围。此外,在以下说明中,省略了对公知结构和技术的描述,以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1
如图1所示,本发明提出的一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,包括蜂蜜和积雪草外泌体,还包括活性剂、pH调节剂、保湿剂、稳定剂或防腐剂中的一种或多种;
制备提取方法,包括以下步骤:
S1:将200-250mL灭菌处理后的PBS加入蜂蜜与积雪草中,蜂蜜与积雪草中为200-250g;
S2:使用破碎机破碎后,在4℃及3000×g条件下,离心30min;
S3:过滤去除较大的残渣,取中间层的紫色透明溶液;
S4:将紫色透明溶液在4℃及10000×g条件下,离心60min,取得上清液;
S5:将上清液在4℃及120000×g条件下,离心50min;
S6:使用1-2mL无菌PBS重悬沉淀,并于4℃及150000×g条件下,离心 60min;
S7:使用1-2mL无菌PBS重悬沉淀,得到蜂蜜与积雪草外泌体的成品。
在一个可选的实施例中,活性剂为:植物提取物活性剂、动物提取物活性剂、生物发酵活性剂或化学合成活性剂中的一种或多种。
在一个可选的实施例中,pH调节剂为:磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或多种。
在一个可选的实施例中,保湿剂为:甘油、丙二醇、丁二醇、1,2-戊二醇、聚乙二醇、聚甘油、海藻糖、透明质酸钠、透明质酸、黄原胶、葡聚糖、鼠李糖、山梨糖醇或卡波姆中的一种或多种。
在一个可选的实施例中,稳定剂为:螯合剂或维生素E中的一种或多种。
在一个可选的实施例中,防腐剂为:甘油、丙二醇、丁二醇、1,2-戊二醇、辛甘醇、乙二醇、1,2-己二醇、山梨酸或苯甲酸中的一种或多种。
在一个可选的实施例中,蜂蜜为0.1-30份;积雪草外泌体为0.1-30份;活性组分的重量份数在0.1-70份;pH调节组分的重量份数在0.01-5份;保湿组分的重量份数在0.1-40份;稳定组分的重量份数为0.1-10份;防腐组分的重量份数为0.1-30份。
需要说明的是,植物提取物活性剂主要为积雪草提取物;动动物提取物活性剂只要为:蜂蜜、蜂王浆、蜂蜜花粉中的一种或多种。化学合成活性剂为功能性小分子美容肽,主要为三肽-1、六肽-3、棕榈酰三肽-5、棕榈酰四肽-7和棕榈酰五肽-4的一种或几种。
本发明中,蜂蜜与积雪草外泌体的活性成分,内部包裹着有活性的次级代谢产物以及有调控作用的miRNA成分,磷脂双分子层结构一方面可以保护活性成分,另一方面可以通过皮肤角质层的间隙,这个间隙是亲脂性(亲油性),由于皮肤的屏障功能,亲水性成分很难通过角质层,蜂蜜与积雪草外泌体中包含的次级代谢产物和miRNA成分,可以降低瘢痕的发生和生长,而蜂蜜与积雪草外泌体的磷脂双分子层结构可以使其包含的活性成分更容易到达起作用的部位,发挥其生物活性,从而起到更好的瘢痕防御和缓解。
本发明中,将蜂蜜与积雪草外泌体应用于皮肤瘢痕预防的组合物或皮肤瘢痕预防的产品中,用于瘢痕皮肤的护理,该组合物或产品中蜂蜜与积雪草外泌体结构稳定,能有效保护内含活性成分,同时,因其外部结构是与皮肤细胞相同的磷脂双分子层结构,因而更易被细胞吸收和发挥瘢痕护理的作用,还能够治疗妊娠纹和肥胖纹。
需要说明的是,本发明提出的基于蜂蜜与积雪草外泌体能够应用于皮肤瘢痕预防及治疗。
实验1:
蜂蜜与积雪草外泌体,对于宠物猫伤口愈合能力,实验如下:
实验采用母猫结扎时腹部的长条伤口观察生理盐水和蜂蜜与积雪草外泌体对伤口愈合能力进行测试。
实验过程:实验对象选取6只同品系同年龄段的雌性宠物猫因结扎手术腹部留有手术长条伤口(所有动物实验操作均符合国际动物保护和伦理道德规范)。
2组实验分别为:蜂蜜与积雪草外泌体组以及自然恢复组。首先将6只同品系雌性宠物猫随机分为2组,每组3只,其中一组以1ml蜂蜜与积雪草外泌体进行创面喷洒处理,每天处理一次,期间对所有猫伤口进行评估分析。
实验结果如下:
蜂蜜与积雪草外泌体组:3天就完成伤口拆线,伤口愈合平整。
自然恢复组:7天完成伤口拆线,伤口愈合平整。
由上可知,蜂蜜与积雪草外泌体可加速伤口愈合,促进皮肤恢复平整。
实验2:
蜂蜜与积雪草外泌体,对猪皮肤瘢痕或疤痕的作用测评;
实验对象试验用巴马香猪,所有动物实验操作均符合国际动物保护和伦理道德规范。
巴马香猪应用氯胺酮静脉注射麻醉(15mg/kg),然后固定于操作台上,备皮,用标记笔于臀部开阔处(沿脊柱对称相距15cm,减少二者之间的药物干扰) 标记直径为1.5cm*1.5cm的圆形创面,创面深度为0.5cm。制备3组,2个重复对称点(共计6个创面,沿脊柱对称)。脊柱一侧创面自行修复,另一侧以配方制剂每3天进行创面的局部注射和创面喷洒(共计每次的使用量为1ml),观察 10天后的创面变化及愈合后的瘢痕变化。
苏木素-伊红染色(HE染色):第10天后,麻醉巴马香猪,切取创面皮肤组织,用体积分数4%的甲醛液固定48小时,水洗,脱水,石蜡包埋,连续切片,切片厚度为4微米。切片于60°烤片1小时后置入二甲苯脱蜡,梯度乙醇中脱水,蒸馏水水洗,苏木素染色8分钟,蒸馏水水洗,体积分数5%乙醇分化,伊红染色5秒,蒸馏水水洗,中性树胶封固。
实验2结果表面:使用蜂蜜与积雪草外泌体,能够很好的改善猪皮肤的瘢痕修复情况。自然修复组创面仍有渗血,色红,质硬,中心为肉芽组织,HE染色下可见白细胞与淋巴细胞浸润,胶原纤维与微血管大量增生,排列紊乱。而配方制剂组瘢痕萎缩,颜色变淡,平坦,质较软,HE染色下成纤维细胞与微血管密度接近于正常皮肤组织。该实验提示本发明能显著改善瘢痕情况。
实验3:
蜂蜜与积雪草外泌体的稳定性验证。
实验过程:将各受试样品分别在-18℃、室温、45℃和-18-45℃交替四个测试条件下测试15天、30天、40天,观察各受试样品有无明显变化,无变化为合格,有变化为不合格。
实验结果:
蜂蜜与积雪草外泌体分别在-18℃、室温、45℃和-18-45℃交替四个测试条件下测试15天、30天、40天后,其均无明显变化,测试结果均为合格。
因此,本发明中,蜂蜜与积雪草外泌体具有很好的耐寒性和耐热性,同时能够满足在温度极端变化条件下的使用要求。
应当理解的是,本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理,而不构成对本发明的限制。因此,在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。此外,本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (8)

1.一种基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,包括蜂蜜和积雪草外泌体,还包括活性剂、pH调节剂、保湿剂、稳定剂或防腐剂中的一种或多种;
制备提取方法,包括以下步骤:
S1:将200-250mL灭菌处理后的PBS加入蜂蜜与积雪草中,蜂蜜与积雪草中为200-250g;
S2:使用破碎机破碎后,在4℃及3000×g条件下,离心30min;
S3:过滤去除较大的残渣,取中间层的紫色透明溶液;
S4:将紫色透明溶液在4℃及10000×g条件下,离心60min,取得上清液;
S5:将上清液在4℃及120000×g条件下,离心50min;
S6:使用1-2mL无菌PBS重悬沉淀,并于4℃及150000×g条件下,离心60min;
S7:使用1-2mL无菌PBS重悬沉淀,得到蜂蜜与积雪草外泌体的成品。
2.根据权利要求1所述的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,活性剂为:植物提取物活性剂、动物提取物活性剂、生物发酵活性剂或化学合成活性剂中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,pH调节剂为:磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,保湿剂为:甘油、丙二醇、丁二醇、1,2-戊二醇、聚乙二醇、聚甘油、海藻糖、透明质酸钠、透明质酸、黄原胶、葡聚糖、鼠李糖、山梨糖醇或卡波姆中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,稳定剂为:螯合剂或维生素E中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,防腐剂为:甘油、丙二醇、丁二醇、1,2-戊二醇、辛甘醇、乙二醇、1,2-己二醇、山梨酸或苯甲酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,按照重量组份,蜂蜜为0.1-30份,积雪草外泌体为0.1-30份。
8.根据权利要求1-7任一项所述的基于蜂蜜与积雪草外泌体的制备提取方法,其特征在于,按照重量组份,包括:
活性组分的重量份数在0.1-70份;
pH调节组分的重量份数在0.01-5份;
保湿组分的重量份数在0.1-40份;
稳定组分的重量份数为0.1-10份;
防腐组分的重量份数为0.1-30份。
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