KR102391645B1

KR102391645B1 - 무화과 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102391645B1
Application number: KR1020210154439A
Authority: KR
Inventors: 윤은정; 박시준; 김정수; 김현민; 조진성
Original assignee: 주식회사 에이바이오머티리얼즈
Priority date: 2021-11-11
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2022-04-28

Abstract

본 발명은 무화과 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초고압 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 무화과 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며, 모발 성장 촉진, 탈모 방지 효과가 우수한 모발 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

무화과 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물{Cosmetic composition for hair containing fig exosome}

본 발명은 무화과 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 초고압 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 무화과 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 모발 성장 촉진, 탈모 방지 효과가 우수한 모발 화장료 조성물에 관한 것이다.

현대사회에서는 모발 손상이나 탈모에 시달리는 사람들이 늘어나고 있으며 탈모증을 치료하기 위해 가발, 모이식 수술과 같은 외곽적인 시술이나 약물 치료와 같이 탈모증을 치료하기 위해 다양한 시도가 이루어지고 있다. 탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 일반적으로 두피의 성모(굵고 검은 머리털)가 빠지는 것을 의미한다. 탈모의 원인은 유전적 원인, 모발 세포 기능 저하, 남성호르몬의 과잉 분비, 피지의 과잉 분비 등이 있으며 주로 남성호르몬인 안드로겐(androgen)이 중요한 인자로 작용되고 있다. 안드로겐 중 테스토스테론(testosterone)은 모낭에 도달하면 5알파-환원효소에 의해 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone:DHT)으로 전환이 되고, 이 호르몬은 모낭을 위축시키고 모발을 서서히 가늘게 만드는 성질이 있어 탈모를 일으킨다.

이러한 탈모증의 치료에는 미녹시딜(minoxidil), 피나스트라이드(finasteride)를 함유한 제제가 대표적이지만 성기능장애, 기형아 출산 가능성, 저혈압, 빈맥, 심혈 관계 합병증과 같은 부작용이 발생함에 따라 사용에 많은 제약이 있다. 따라서 부작용이 없는 천연 소재를 이용한 발모제 및 헤어 관련 제품에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

"엑소좀(Exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.

최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.

이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나, 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 용해도 및 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.

본 발명자들은 수성 2상 시스템을 사용하여 다양한 식물 유래 엑소좀을 분리 정제하고 모발 관련 효능이 우수한 식물 유래 엑소좀을 모발 화장료로 이용하기 위한 연구를 하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제10-2125567호 (2020.06.16) (0002) 대한민국 등록특허 제10-2265811호 (2021.06.16.) (0003) 대한민국 공개특허 제10-2019-0037162호 (2019.04.05)

본 발명은 무화과 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며 모발 성장 촉진, 탈모 방지 효과가 우수한 모발 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 무화과 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물이 제공된다.

또한, 상기 무화과 엑소좀과 함께 하수오 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물이 제공된다.

바람직하게는 유효성분으로서의 상기 무화과 엑소좀, 하수오 엑소좀은,

(A) 무화과 또는 하수오를 초고압 처리하는 단계; (B) 초고압 처리한 무화과 또는 하수오를 착즙하는 단계; (C) 상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (D) 엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (E) 상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (F) 상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것이다.

상기 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 한다.

유효성분으로서의 상기 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0%(w/w) 함유된다.

상기 모발 화장료 조성물은 모발 성장 촉진용 또는 탈모 방지용임을 특징으로 한다.

또한 상기 모발 화장료 조성물은 헤어 토닉, 헤어 로션, 헤어 오일, 헤어 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 헤어 크림, 헤어 팩, 헤어 스프레이, 헤어 에센스, 헤어 무스 또는 헤어 겔의 제형을 가지는 것임을 특징으로 한다.

초고압 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 본 발명의 무화과 엑소좀은 안정성이 우수하며, 우수한 모발 성장 촉진 효능과 탈모 방지 효능을 나타낸다. 또한, 무화과 엑소좀은 하수오 엑소좀과의 혼합사용에 의하여 더욱 우수한 모발 성장촉진 및 탈모방지 효능을 나타내므로 모발용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 무화과 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 하수오 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 무화과 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 하수오 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 세포 독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 모발 성장 촉진 효과를 모유두세포 증식 효과로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의해 정제된 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 탈모 방지 효능을 5알파-환원효소 저해 활성시험으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 본 발명은 무화과, 하수오로부터 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 모발 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.

무화과(無花果, fig)는 무화과나무속 나무의 열매이다. 무화과는 가장 오래된 과일 중 하나로 그 이름은 꽃이 없이 열리는 열매라는 뜻이다. 무화과는 식이섬유가 매우 풍부하고 천연 당이 많이 들어있다. 또한 필수 미네랄을 다량 함유하고 항산화 성분이 풍부하여 탈모에도 도움이 된다고 알려져 있다. 미네랄은 결핍시 모발에 악영향을 미치며 이는 탈모로 이어질 수 있기 때문에 미네랄은 모발 건강에도 기여한다.

하수오(何首烏)는 여러해살이 덩굴식물로 뿌리는 옆으로 길게 뻗으며 둥근 덩이뿌리가 생긴다. 하수오는 종기, 불면증 등 간과 신장을 보호하고 머리를 검게한다. 하수오에는 각종 아미노산과 항산화물질인 레시틴(lecithin), 이모딘(emodin), 크리소파놀(chrysophanol), 레인(rhein), 피시온(physcion)과 같은 기능성 성분이 다량 함유되어 있어 모발을 튼튼하게 해주고 탈모를 예방하는 약재로 사용되고 있다.

본 발명에 따르면, 무화과 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 모발 화장료 조성물이 제공된다. 더욱 바람직하게는 유효성분으로서 하수오 엑소좀을 함께 함유하는 모발 화장료 조성물이 제공된다.

유효성분으로서의 상기 무화과 엑소좀과 하수오 엑소좀은 다음과 같은 방법으로 정제된다.

(A) 무화과 또는 하수오를 초고압 처리하는 단계;

(B) 초고압 처리한 무화과 또는 하수오를 착즙하는 단계;

(C) 상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

(D) 엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;

(E) 상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및

(F) 상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된다.

상기 (A) 단계에서 무화과, 하수오는 생물 또는 건조물을 모두 사용할 수 있으며, 상기 초고압 처리는 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로, 바람직하게는 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분 수행하는 것임을 특징으로 한다. 엑소좀은 생리활성물질로서 그 처리 온도를 15~25℃로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 초고압 처리는 무화과 또는 하수오 건조물을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 15~25℃의 온도에서 200Mpa 이상의 압력으로 20초~2분간 초고압 처리를 하여 수행한다. 무화과 또는 하수오 생물을 사용하는 경우에는 증류수 없이 비닐 팩에 넣어 수행할 수 있다.

상기 (B) 단계에서 무화과 또는 하수오를 착즙하는 공정에 사용되는 스크류는 교반 속도가 20~50 rpm인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 초고압처리에 의한 식물세포벽의 투과율 변화로 즙이 쉽게 빠져나오기 때문에 교반 속도가 일정 이하인 스크류를 사용하는 것이 좋다.

상기 (C) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 (D) 단계에서 사용되는 동결건조는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 물질을 얼린 다음 용기 내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. -50 ~ -80℃에서 15~24시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 72~120시간동안 건조한다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미한다.

엑소좀을 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueous two phase partition method)을 사용하였다.

수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 PEG/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.

상기 (E) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 3.3중량%: 1.7중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 엑소좀의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.

엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (F)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.

이와 같은 방법에 의하여 제조된 무화과 엑소좀은 우수한 모발성장 촉진 효과(시험예 7), 탈모방지 효과(시험예 9, 시험예 10)를 나타내었으며, 무화과 엑소좀과 함께 하수오 엑소좀을 함께 사용하는 경우에는 그 상승효과에 의하여 더욱 우수한 모발성장 촉진 및 탈모방지 효과를 나타내었다.

그러므로 상기 무화과, 하수오 유래 엑소좀은 모발 성장 촉진용, 탈모방지용 모발 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다. 이때 유효성분으로서의 상기 엑소좀은 모발 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0%(w/w) 함유될 수 있다. 무화과 엑소좀과 하수오 엑소좀이 함께 함유되는 경우 동일 중량비율로 함유될 수 있다.

상기의 모발 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 헤어 토닉, 헤어 로션, 헤어 오일, 헤어 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 헤어 크림, 헤어 팩, 헤어 스프레이, 헤어 에센스, 헤어 무스, 헤어 겔 등으로 제조될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

실시예 1: 무화과 유래 엑소좀의 제조

무화과 초고압 처리

무화과 건조물 100g을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압기를 이용하여 25℃의 온도에서 200Mpa의 압력으로 30초간 초고압 처리를 실행하였다.

무화과 착즙

초고압 처리한 무화과를 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 무화과 착즙을 수행하였으며 수득한 무화과 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 무화과 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

엑소좀 정제를 위한 상층액 회수

무화과 착즙액은 엑소좀 정제를 위해 큰 오염 물질 제거가 필요하기 때문에 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.

상층액 동결건조

엑소좀의 대량생산을 위해 상층액의 부피를 줄이는 목적으로 동결건조를 수행하였다. -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간동안 건조하였다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.

수성 2상계 형성

동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG (Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran (Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1.7 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.

무화과 엑소좀의 회수

상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다.

추가 세척 공정

순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.

실시예 2: 하수오 유래 엑소좀의 제조

상기 실시예와 동일하게 하여 하수오 유래 엑소좀을 정제하였다.

실시예 3: 무화과, 하수오 혼합 엑소좀의 제조

상기 실시예 1, 2에서 제조한 무화과 엑소좀과 하수오 엑소좀을 1:1 비율로 혼합하여 제조하였다.

비교예 1: 무화과 추출물 제조

무화과 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 무화과 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

비교예 2: 하수오 추출물 제조

하수오 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 하수오 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

시험예 1: 무화과 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 무화과 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 무화과 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 147.1nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 2: 하수오 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 하수오 유래 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 2는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 하수오 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 123.6nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 3: 무화과 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 무화과 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 도 3은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 무화과 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 147.1nm와 1 mL의 단위 부피당 3.10 x 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 4: 하수오 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 하수오 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 도 4는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 하수오 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 123.6nm와 1 mL의 단위 부피당 1.50 x 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 5: 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 온도별 안정성 분석

본 발명 실시예 1, 2에 따라 정제한 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 온도별 안정성을 확인하였다. 하기 표 1은 상기 실시예 1, 2에 따라서 정제된 무화과, 하수오 유래 엑소좀을 12주 간 4℃, 25℃, 45℃에서 보관 후 나노입자추적분석(NTA)을 통해 입자의 크기와 농도를 나타낸 표이다.

	무화과 엑소좀 (4℃보관)		무화과 엑소좀 (25℃보관)		무화과 엑소좀 (45℃보관)
	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
초기	3.10 x 10¹⁰	147.1	3.10 x 10¹⁰	147.1	3.10 x 10¹⁰	147.1
2주차	3.24 x 10¹⁰	148.1	3.35 x 10¹⁰	142.7	3.27 x 10¹⁰	142.1
4주차	3.21 x 10¹⁰	151.7	3.27 x 10¹⁰	145.1	3.38 x 10¹⁰	147.0
8주차	3.20 x 10¹⁰	145.8	3.18 x 10¹⁰	149.5	3.19 x 10¹⁰	152.6
12주차	3.18 x 10¹⁰	156.4	3.33 x 10¹⁰	150.4	3.32 x 10¹⁰	153.3
	하수오 엑소좀 (4℃보관)		하수오 엑소좀 (25℃보관)		하수오 엑소좀 (45℃보관)
	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
초기	1.50 x 10¹⁰	123.6	1.50 x 10¹⁰	123.6	1.50 x 10¹⁰	123.6
2주차	1.52 x 10¹⁰	124.2	1.61 x 10¹⁰	122.7	1.50 x 10¹⁰	123.1
4주차	1.47 x 10¹⁰	124.7	1.49 x 10¹⁰	121.4	1.67 x 10¹⁰	124.1
8주차	1.49 x 10¹⁰	131.8	1.54 x 10¹⁰	120.8	1.66 x 10¹⁰	126.7
12주차	1.57 x 10¹⁰	135.7	1.55 x 10¹⁰	131.5	1.62 x 10¹⁰	127.6

온도별 12주 안정성을 분석한 결과, 실시예 1, 2에 해당하는 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 크기 및 농도 변화가 4℃, 25℃, 45℃ 조건에서 모두 안정적임을 확인하였다.

시험예 6: 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 세포독성 평가

무화과 유래 엑소좀(실시예 1), 하수오 유래 엑소좀(실시예 2), 무화과 및 하수오 혼합 엑소좀(실시예 3), 무화과 추출물(비교예 1) 및 하수오 추출물(비교예 2)의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 평가를 진행하였다. 96well 플레이트에 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 1×10⁵ cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 18시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS buffer로 세척한 후 새로운 배지와 무화과 엑소좀, 하수오 엑소좀 및 무화과 추출물, 하수오 추출물을 농도 별로 투여하고 다시 48시간동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution (5mg/mL)을 첨가한 후 4시간 동안 형성된 formazan을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해하고 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 5는 상기 실시예 1, 2, 3에 따라서 정제된 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 무화과 엑소좀, 하수오 엑소좀, 무화과 추출물을 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았으며 하수오 추출물의 경우 1%를 처리하였을 때 세포 생존율이 약 95%로 확인되었다.

시험예 7: 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 모발 성장 촉진 효과(모유두세포 증식)

무화과, 하수오 유래 엑소좀의 모발 성장 촉진 효능을 확인하기 위해 농도 별 무화과, 하수오 추출물과 비교하여 모유두세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다. 모낭을 구성하는 모유두세포인 HGDPC 세포주(Human follicle dermal papilla cell)를 96 well plate에 1×10⁴ cells/mL로 분주하여 배양한 후 무화과, 하수오 엑소좀, 그 혼합 엑소좀과 무화과, 하수오 추출물 및 DHT (5α-dihydrotestosterone)를 10μM이 되도록 처리하여 48시간 배양하였다. 배양 후 10x BrdU solution을 처리하여 6시간 배양한 뒤 solution 을 제거하고 Anti-BrdU Antibody를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Secondary Antibody HRP Conjugate를 첨가하여 반응시킨 뒤 PBS 로 세척 후 substrate solution을 넣어 반응시키고 stop solution을 이용하여 반응을 종료 시킨 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 6은 상기 실시예에 따라서 정제된 엑소좀의 모발 성장 촉진 효능을 모유두세포 증식 효과로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 무화과, 하수오 유래 엑소좀과 무화과, 하수오 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포 증식이 증가하였으며 비교예의 추출물들에 비해 무화과, 하수오 유래 엑소좀을 처리하였을 때 증식이 더 증가됨을 확인하였다. 또한 무화과와 하수오 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 그 효과가 더 우수한 것을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 Minoxidil 10Μm을 처리하였을 때는 93.14% 증식율을 보였다.

시험예 8: 모발 강도 평가

상기 실시예 1, 2, 3에 따라서 정제된 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 모발 강도에 미치는 영향을 확인하기 위해 무화과, 하수오 추출물과 비교하여 모발의 인장강도를 측정하였다. 모발의 인장강도는 인장강도계(TA-XT-Plus, Stable micro systems LTD., England)를 이용하여 측정하였다. 무화과, 하수오 유래 엑소좀 및 무화과, 하수오 추출물을 농도별로 모발 트레스(Tress)에 고르게 도포한 후 건조하였다. 건조된 모발 트레스에서 균일한 머리카락을 한 가닥 골라 인장강도계에 정착한 후 20mm/min 속도로 잡아당기면서 모발이 끊어질 때의 힘의 크기를 측정하였다. 동일한 방법으로 5회 이상 반복한 후 평균값을 계산하여 모발의 강도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 정제수를 도포하여 비교하였다. 하기 표 2는 그 결과를 나타낸 표이다.

	처리농도(%)	인장강도(g)
정제수	1	100.4
무화과 엑소좀(실시예 1)	1	117.2
하수오 엑소좀(실시예 2)	1	115.8
무화과 + 하수오 엑소좀(실시예 3)	1	129.7
무화과 추출물(비교예 1)	1	109.1
하수오 추출물(비교예 2)	1	107.6

모발 강도 측정 결과, 실시예 1의 무화과 엑소좀을 처리하였을 때 높은 인장강도를 나타내었으며, 무화과 엑소좀과 하수오 엑소좀을 각각 처리하였을 때보다 혼합하여 처리하였을 때 효과가 더 높아진 것을 알 수 있었다.

시험예 9: 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 5알파-환원효소(5α-reductase)저해 활성 시험

무화과, 하수오 엑소좀의 탈모방지 효능을 확인하기 위해 농도 별 무화과, 하수오 추출물과 비교하여 5알파-환원효소(5α-reductase)저해 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 모낭을 구성하는 모유두세포인 HGDPC 세포주(Human follicle dermal papilla cell)를 24 well plate에 4×10⁵ cells/mL로 분주하여 24시간 배양한 후 무화과, 하수오 엑소좀과 무화과, 하수오 추출물을 처리하여 1시간 배양하였다. 배양 후 테스토스테론(testosterone)을 처리하였으며 상등액을 분리하여 세포 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛은 효소면역측정법을 이용하여 디하이드로테스토스테론(DHT, dihydrotestosterone)의 농도를 측정하였다. DHT ElISA Kit strip-well에 세포 펠렛을 100μl씩 분주하고 DHT 항혈청을 25μl씩 분주하여 4℃에서 약 18시간동안 반응시켰다. 반응 후 각 웰에 HRP-Streptavidin Conjugate를 100μl씩 분주하고 30분간 상온에서 반응시킨 후 세척하였다. 세척 후 TMB 기질을 90μl을 분주하고 20분 이내로 상온에서 반응시킨 후 50μl의 stop 용액을 처리하고 처리 직후 450nm에서 흡광도를 측정하여 DHT의 농도를 정량하였다. 도 7은 상기 실시예에 따라서 정제된 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 탈모방지 효능을 알파-환원효소(5α-reductase)저해 활성 시험으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시료를 처리하지 않은 음성 대조군을 기준으로 5알파-환원효소 억제율로 계산하였다. 시험 결과, 무화과, 하수오 유래 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 저해 활성이 증가하였으며 비교예의 무화과, 하수오 추출물을 처리하였을 때와 비교했을 때 더 우수한 저해 활성을 나타냄을 확인하였다. 특히 무화과, 하수오 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 그 효과가 훨씬 우수한 것으로 나타났다.

시험예 10: 무화과, 하수오 유래 엑소좀의 탈모방지 효과

무화과, 하수오 유래 엑소좀의 탈모 방지 효능을 확인하기 위해 농도 별 무화과, 하수오 추출물과 비교하여 초기 탈모가 진행되는 성인 30명을 대상으로 12주동안 실험을 진행하였다. 상기 실시예에 따라 정제된 무화과, 하수오 엑소좀을 1% 농도로 처방하여 1일 1회 도포하고 약 20분 후 머리를 감게 하였다. 12주 후 탈락모를 수거하여 개수를 세었으며 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다. 음성 대조군으로는 아무 것도 처리하지 않은 상태에서 탈락모를 수거하여 비교하였다.

시료	처리농도(%)	탈락모 평균 개수(개)
음성 대조군	-	81
무화과 엑소좀(실시예 1)	1	59
하수오 엑소좀(실시예 2)	1	62
무화과 + 하수오 엑소좀(실시예 3)	1	51
무화과 추출물(비교예 1)	1	74
하수오 추출물(비교예 2)	1	78

실험 결과, 무화과, 하수오 추출물에 비해 엑소좀을 처리하였을 때 탈락모의 개수가 현저히 감소하였으며, 무화과와 하수오 혼합 엑소좀, 무화과 엑소좀, 하수오 엑소좀의 순서도 탈모 방지 효과가 더욱 우수한 것을 확인하였다.

제형예 1: 헤어토닉의 제조

하기 표 4에 기재된 조성으로 헤어토닉을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 (중량 %)
1	피마자유	5.00
2	무화과 엑소좀	3.00
3	하수오 엑소좀	3.00
4	판테놀	0.20
5	레조시놀	0.10
6	살리실산	0.10
7	토코페릴아세테이트	0.10
8	피리독신에이치씨엘	0.10
9	멘톨	0.05
10	색소	적량
11	조합향료	적량
12	에탄올	적량
13	정제수	To 100

제형예 2: 헤어 샴푸의 제조

하기 표 5에 기재된 조성으로 헤어 샴푸를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 (중량 %)
1	암모늄라우릴설페이트	20.00
2	암모늄라우레스설페이트	20.00
3	코카마이드프로필베타인	6.00
4	무화과 엑소좀	3.00
5	하수오 엑소좀	3.00
6	디메치콘(50%)	2.00
7	디메치콘(70%)	2.00
8	디소듐이디티에이	0.03
9	메칠클로로이소치아졸리논ㆍ 메칠이소치아졸리논 혼합액	0.03
10	코카마이드미파	적량
11	카보머	적량
12	에탄올	적량
13	DL-판테놀	적량
14	토코페릴아세테이트	적량
15	트리에탄올아민	적량
16	조합향료	적량
17	멘톨	적량
18	정제수	To 100

제형예 3: 헤어 컨디셔너의 제조

하기 표 6에 기재된 조성으로 헤어 컨디셔너를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 (중량 %)
1	염화스테아릴메틸벤질 암모늄(25%)	5.00
2	세탄올	3.50
3	무화과 엑소좀	3.00
4	하수오 엑소좀	3.00
5	프로필렌글라이콜	2.50
6	자기유화형 모노스테아린산글리세린	1.50
7	파라옥시안식향산메틸	0.30
8	색소	적량
9	조합향료	적량
10	정제수	To 100

제형예 4: 헤어 로션의 제조

하기 표 7에 기재된 조성으로 헤어 로션을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 (중량 %)
1	무화과 엑소좀	3.00
2	하수오 엑소좀	3.00
3	레조시놀	2.00
4	멘톨	2.00
5	판테놀	0.50
6	피록톤올아민	0.10
7	색소	적량
8	조합향료	적량
9	정제수	To 100

Claims

삭제
무화과 엑소좀 및 하수오 엑소좀을 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유하는 모발 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 무화과 엑소좀과 하수오 엑소좀은,
(A) 무화과 또는 하수오를 15~25℃의 온도에서 200~500Mpa의 압력으로 20초~2분간 초고압 처리하는 단계;
(B) 초고압 처리한 무화과 또는 하수오를 착즙하는 단계;
(C) 상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
(D) 엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;
(E) 상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및
(F) 상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
삭제
삭제
제2항에 있어서, 상기 모발 화장료 조성물은 모발 성장 촉진용임을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 모발 화장료 조성물은 탈모 방지용임을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 모발 화장료 조성물은 헤어 토닉, 헤어 로션, 헤어 오일, 헤어 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 헤어 크림, 헤어 팩, 헤어 스프레이, 헤어 에센스, 헤어 무스 또는 헤어 겔의 제형을 가지는 것임을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.