KR102140185B1 - 천연물 유래 발효추출물 발모제를 포함하는 하이드로젤 나노입자, 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연물 유래 발효추출물 발모제를 포집한 하이드로젤 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른, 천연물 유래 발효추출물 발모제를 포집하는 하이드로젤 나노입자는, 피부간극 근방 또는 이하의 크기를 가지는 바, 피부 침투율이 우수하고, 높은 발모제 로딩과 함께, 장시간 동안 안정적으로 발모제의 서방형 방출이 가능하여, 종래 기술 대비 현저히 개선된 탈모방지 효과 및 발모촉진 효과를 나타낼 수 있는 바, 탈모방지 및 발모촉진용 피부외용제, 두피 또는 모발 케어 제품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

천연물 유래 발효추출물 발모제를 포함하는 하이드로젤 나노입자, 이의 제조방법{Hydrogel nanoparticles comprising hair growth solution of fermentation extract with natural products, method for manufacturing the same}

본 발명은 천연물 유래 발효추출물 발모제를 포집한 하이드로젤 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 발모 및 양모 효능을 가진 천연물 기반 발효추출물을 수백 나노미터 수준 크기의 기능성 하이드로젤에 포집하여 두피 흡수율 및 지속성을 향상시키는 기술에 관한 것이다.

일반적으로, 모발의 숫자는 일반적으로 10만개 정도이고, 모발은 하루에 약 0.3~0.4㎜ 정도로 자란다. 모발은 하루에 약 50~70개 정도가 빠지는데 100개 이상이 빠지면 대머리의 가능성이 있다.

각각의 모발은 서로 다른 성장주기를 가진다. 모발의 성장주기는 3단계로 구성되는데, 모발이 가장 활발하게 성장하는 성장기(anagen stage), 모발의 퇴화가 시작되는 퇴화기(catagen stage) 및 모발의 성장이 멈추거나 휴식에 접어드는 휴지기(telogen stage)로 분류된다(Buhl AE. Lab. Invest. 62(1) : 104~107(1990)).

이러한 주기는 3~6년에 걸쳐 반복하는데 그 결과 하루 평균 50~200개의 모발이 탈락하게 된다. 일반적으로 탈모증이라 함은 이러한 주기 중에서 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발이 탈락하는 숫자가 많아지는 것을 일컫는다.

최근 식생활 패턴의 변화로 인한 영양 불균형, 환경오염 및 사회 환경에 의한 스트레스의 증가 등으로 인해 탈모로 고민하는 인구가 크게 늘어나고 있으며, 그 연령 또한 낮아지고 있다. 또한 기존의 남성 뿐만 아니라 여성의 탈모인구도 늘어나고 있는 추세이다. 탈모방지 및 발모를 위해 전세계적으로 여러 종류의 발모제가 개발되어 왔으나, 실제로 미국식품의약국 (FDA)이 지금까지 발모제로 공인한 약은 미녹시딜과 프로페시아 정도에 불과한 실정이다. 미녹시딜과 프로페시아는 발모효능은 입증되었으나, 장기간 사용해야 발모효능이 생기는 것으로 보고되었는데, 장기간 사용시 성욕감퇴, 발기 부전 등의 심각한 부작용이 높은 빈도로 발생하고 있기 때문에, 독성 및 부작용이 없으며, 탈모예방 및 발모효능이 우수한 발모제 개발이 시급하다.

인체에 상대적으로 안전한 천연물 유래 발모제의 경우, 아직까지 효능의 지속성 및 두피 흡수율이 낮은 단점이 있다. 따라서 탈모방지 및 발모효능이 우수한 새로운 천연물 유래 발모성분의 개발과, 그 효능을 극대화할 수 있는 소재와의 융합기술 개발이, 급증하고 있는 발모제 시장의 새로운 원천 기술로서 크게 활용될 수 있으며, 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명자 중 ㈜세포활성연구소에서 개발한 천연발효복합조성물 (특허 제 1405665)을, 독성이 없고 고도의 보습력을 갖고 있는 천연 아미노산 고분자 소재인 폴리감마글루탐산 (PGA)에 기반한 하이드로젤에 포집하여 수백 나노미터 수준의 입자 형태로 제작함으로써, 피부 간극으로의 침투율 향상 및 포집된 발모제의 지속적인 방출을 확인함으로써, 발모 제재로서 보다 효과적으로 작동할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은, 천연물 유래 발모제의 효능 지속성 및 두피 흡수율의 측면에서 개선된 효과를 달성할 수 있는, 새로운 소재를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 소재의 제조방법을 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적은, 천연물 유래 발모제를 로딩하는 상기 소재를 유효성분으로 함유하는 탈모방지 및 발모 촉진용용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 피부외용제를 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 두피 또는 모발케어 제품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은,

천연물 유래 발효추출물을 포함하는 발모제; 및

상기 발모제를 포집하는, PGA(Poly-γ-glutamic acid) 및 키토산을 포함하는 하이드로젤 매트릭스; 를 포함하는 하이드로젤 나노입자를 제공한다.

또한, 본 발명은,

PGA(Poly-γ-glutamic acid) 수용액과 천연물 유래 발효추출물을 포함하는 발모제 원액을 혼합하여, 혼합액을 제조하는 단계;

키토산 용액에 상기 혼합액을 첨가하여 젤화시키는 단계;를 포함하는,

하이드로젤 나노입자의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 하이드로젤 나노입자를 유효성분으로 함유하는, 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 피부외용제를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 두피 또는 모발케어 제품을 제공한다.

본 발명에 따른, 천연물 유래 발효추출물 발모제를 포집하는 하이드로젤 나노입자는, 피부간극 근방 또는 이하의 크기를 가지는 바, 피부 침투율이 우수하고, 높은 발모제 로딩과 함께, 장시간 동안 안정적으로 발모제의 서방형 방출이 가능하여, 종래 기술 대비 현저히 개선된 탈모방지 효과 및 발모촉진 효과를 나타낼 수 있는 바, 탈모방지 및 발모촉진용 피부외용제, 두피 또는 모발 케어 제품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명 하이드로젤 나노입자의 제조방법 및 활용 방안을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 제조예 1의 천연물 유래 발효추출물의 제조공정도를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 사용한 발효추출물 발모제의 농도를, 발효추출물 특이 흡광도(400nm)를 이용해 정량적으로 계산하여 나타낸, 표준 곡선(standard curve) 이다.
도 4a는 실시예 2의 발모제를 포집하고 있는 하이드로젤 나노입자의 원심분리를 이용한 수득전(좌)과 수득 후(우)의 이미지이며, 4b는 발모제 없이 만들어진 하이드로젤 나노입자의 원심분리를 이요한 수득 전(좌)과 수득 후(우)의 이미지이다.
도 5a는 실시예 1의 발모제를 포집하는 하이드로젤 나노입자의 TEM 사진이며, 5b는 발모제를 포집하지 않는 하이드로젤 나노입자의 TEM 사진이다.
도 6은 본 발명 하이드로젤 나노입자의 시간 경과에 따른 발모제 방출 양을, 발모제 특이 흡광도(400 nm)를 통하여 측정하여 나타낸 것으로, 구체적인 실험 조건은 1) PBS, shaking (200 rpm) & 37℃, 2) PBS, 정지상태 & 37℃, 3) DW, 정지상태 & 4℃, 4) DW, 정지상태 & 실온으로 진행하였다.
도 7은 Primary DPCs(모유두세포)을 각각 FBS를 포함하는 DMEM의 serum(+) 배지 조건과 FBS를 포함하지 않는 DMEM의 serum(-) 배지 조건에서, 무처리군, 본 발명 실시예 1-3 처리군, 을 사용하여 CCD 카메라를 이용한 실시간현미경 사진이다.
도 8은 Primary DPCs(모유두세포)에 각각 본 발명 실시예 1-3 또는 비교예 2 하이드로젤 나노입자를 처리한 후, 배양 45시간에 CCD 카메라로 관측한 사진을 도시한 것이다.
도 9는 Keratinocyte에 해당하는 피부각질형성세포의 일종인 HaCaT 세포를 대상으로 실시예 1-3 하이드로젤 나노입자, 또는 발모제 없이 실시예 1-3과 같은 구성의 하이드로젤 입자를 24h 동안 37℃, 5% CO₂에서 처리함에 따른 세포독성을 Ez-Cytox kit를 사용하여 측정한 결과를 그래프로 도시한 것이다.
도 10은 등의 털이 제모된 C57BL6/N 마우스 모델을 대상으로, 본 발명 실시예 2, 대조군(발모제 없는 PGA_키토산 하이드로젤 나노입자), 발모제 단독 처리군을 각각 1일 1회 200μl 처리한 후, 경과 11일 시점에 촬영한 사진이다.
도 11은 등의 털이 제모된 C57BL6/N 마우스 모델을 대상으로, 본 발명 실시예 2, 대조군(발모제 없는 PGA_키토산 하이드로젤 나노입자)을 각각 1일 1회 200μl 처리한 후, 경과 11일 시점에, 각 개체별 30 이상의 털을 핀셋으로 뽑아, 길이를 측정하여 평균 털 길이를 그래프로 도시한 것이다.
도 12는 C57BL6/N 마우스의 털 주기(hair cycle), 즉, 성장기(anagen phase), 휴지기(telogen phase), 퇴화기(catagen phase)의 모낭의 양태와 털의 성장 변화를 도면과 사진으로 나타낸 것이다.
도 13은 등의 털이 제모된 C57BL6/N 마우스 모델을 대상으로, 무처리군, 본 발명 실시예 2, 대조군(발모제 없는 PGA_키토산 하이드로젤 나노입자), 발모제 단독 처리군을 각각 1일 1회 200μl 처리한 후, 경과 11일 시점에 각 개체를 희생시킨 후, 등 조직 일부를 털 성장 방향으로 절단하여 회수하여, H&E 염색한 슬라이드를 40 배율의 디지털 현미경으로 촬영한 사진을 도시한 것이다.
도 14는 등의 털이 제모된 C57BL6/N 마우스 모델을 대상으로, 무처리군, 본 발명 실시예 2, 대조군(발모제 없는 PGA_키토산 하이드로젤 나노입자), 발모제 단독 처리군을 각각 1일 1회 200μl 처리한 후, 경과 11일 시점에 각 개체를 희생시킨 후, 관측된 각 처리군별 털 주기 분포 양태를 그래프로 도시한 것이다.
도 15는 등의 털이 제모된 C57BL6/N 마우스 모델을 대상으로, 무처리군, 본 발명 실시예 2, 대조군(발모제 없는 PGA_키토산 하이드로젤 나노입자), 발모제 단독 처리군을 각각 1일 1회 200μl 처리한 후, 경과 11일 시점에 각 개체를 희생시킨 후, 등 조직 일부를 털 성장 방향과 수직으로 절단, 회수하여, H&E 염색한 슬라이드를 40 배율의 디지털 현미경으로 촬영한 사진을 도시한 것이다.
도 16은 등의 털이 제모된 C57BL6/N 마우스 모델을 대상으로, 무처리군, 본 발명 실시예 2, 대조군(발모제 없는 PGA_키토산 하이드로젤 나노입자), 발모제 단독 처리군을 각각 1일 1회 200μl 처리한 후, 경과 11일 시점에 각 개체를 희생시킨 후, 등 조직 일부를 회수하여, 2DE lysis solution으로 등 조직 단백질을 추출하여 이차원전기영동(2D electrophoresis)을 진행한 후, 이차원 젤에 나타난 단백질 spot의 발현정도를 확인한 사진이다.
도 17은 단회투여 독성 실험으로, 식품의약품안전청에서 고시된 ‘새로운 식품원료의 안전성평가 가이드라인(OECD Guideline for the testing of Chemical-No.401)’ 지침사항에 따라 진행한, C56BL/6N 마우스 모델의 체중 변화 그래프와 희생 후 촬영된 사진이다.
도 18은 FITC가 수식된 본 발명 하이드로젤 나노입자를 돼지 피부에 1시간 동안 반응시킨 후, 공초점 현미경을 통해 FITC의 형광을 돼지피부의 깊이에 따라 측정하여 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

단, 이하 설명은 발명의 이해를 돕기 위해서 제시하는 것이며, 본 발명이 이하 설명의 내용으로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에서,

천연물 유래 발효추출물을 포함하는 발모제; 및

상기 발모제를 포집하는, PGA(Poly-γ-glutamic acid) 및 키토산을 포함하는 하이드로젤 매트릭스; 를 포함하는 하이드로젤 나노입자가 제공된다.

여기서, 본 발명이 제공하는 하이드로젤 나노입자는, 포집되는 발모제의 효능 지속성 및 두피 흡수율의 측면에서 개선된 효과를 달성할 수 있는, 새로운 소재로 이해될 수 있다.

일 구체예에서,

본 발명이 제공하는 하이드로젤 나노입자는, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 1 μm 이하, 바람직하게, 500 nm 이하, 또는 450 nm 이하, 400nm 이하, 350 nm 이하, 300 nm 이하, 250 nm 이하, 가장 바람직하게 200 nm 이하의 크기 또는 직경을 갖는 바, 피부 내로의 침투율이 우수하고, 특히 피부 간극의 대략적 크기, 약 200 nm 이하의 직경을 가질 수 있는 바, 피부 기저층으로 용이하게 침투할 수 있다.

또한, 본 발명이 제공하는 하이드로젤 나노입자는 입자에 로딩된 유효성분, 즉 발모제를 서방형으로 방출할 수 있고, 예를 들어 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 7시간 이상, 또는 10시간 이상으로 지속하여 방출할 수 있다.

나아가, 본 발명이 제공하는 하이드로젤 나노입자에 포집되는 발모제는, 전체 하이드로젤 나노입자의 중량 대비 5 내지 15 중량%, 6 내지 15 중량%, 8 내지 15 중량%, 9 내지 15 중량%, 9 내지 14 중량%, 9 내지 12 중량%, 또는 약 10 내지 11 중량%로 함유될 수 있다.

상술한 특징으로부터, 본 발명이 제공하는 하이드로젤 나노입자는, 피부 기저층, 바람직하게 발모 자극을 줄 수 있는 피부 기저층으로 용이침투하여, 발모제 성분의 효능과 그 지속성을 현저히 향상시킬 수 있는 바, 우수한 발모 촉진 및 탈모 방지 효과를 달성한다.

특히, 본 발명의 하이드로젤 나노입자는, 우수한 피부 침투율, 장시간의 서방형 방출 특성으로부터, 발모제 성분의 효능을 지속시킬 수 있어, 모발이 가장 활발하게 성장하는 성장기(anagen stage)를 상대적으로 긴 시간동안 유지시키는 효과를 나타낸다.

또한, 상술한 본 발명 하이드로젤 나노입자의 개선된 효과와 특성으로부터, 당 기술이 직면해 있는 기술적 문제, 즉, 종래 천연 발모제가 가지는 문제점인, 발모제 효능 지속의 어려움과 현저히 떨어지는 두피 흡수율의 문제가 해결될 수 있는 바, 본 발명 하이드로젤 나노입자는 탈모 방지와 발모 촉진 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 상기 본 발명 하이드로젤 나노입자에 있어서,

상기 발모제에 포함되는 천연물 유래 발효추출물은, 예를 들어 발모 또는 탈모 방지의 효과를 나타내는 것이라면, 본 발명에 제한없이 포함된다.

따라서, 본 출원 이전에 공지된 발모 또는 탈모 방지의 효과를 가지는 것으로 알려진 천연 유래의 발효추출물이라면 본 발명에 포함되는 것이다.

일예로, 바람직하게, 상기 천연물 유래 발효추출물은, 한국 등록특허 10-1405665에 개시된 발효추출물을 사용할 수 있다.

다른 예로, 상기 천연물 유래 발효추출물은, 혈류 촉진제로서 지실과 당약 발효추출물과 칼슘 판토텐산; 국소 자극제로서 대나무 목초액, 생강발효, 벤질 니코틴산; 항염증제로 목단피와 고삼발효추출물; 모발 부활제로서 발아대두 동충하초, 발아현미 상황버섯, 무화과, 야자유, 하수오; 등에서 각 그룹별로 1가지 혹은 2가지 이상 선발, 발효한 것일 수 있다.

또 다른 예를 들어, 상기 천연물 유래 발효추출물은 도 1에 개시된 제조공정도와 같이 수행하여 제조될 수 있다.

나아가, 상기 천연물 유래 발효추출물은, 추가적으로 첨가제를 더 포함할 수 있다.

여기서, 상기 첨가제는, 인체에 허용 가능한 것으로 공지된 것 또는 현재 시중에 시판 중인 것이라면 제한없이 사용될 수 있고, 비제한적인 예로, 일반적으로 식품, 의약외품, 의약품 등에 사용되는 첨가제일 수 있다.

이에 제한되지는 않으나, 상기 천연물 유래 발효추출물은 L-아르기닌 벤질 니코틴산, 호르몬 첨가제로서 에스트라디올, 청량제로서 멘톨, 에탄올 등을 더 하유할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서,

상기 천연물 유래 발효추출물은, 모근에 영양분을 공급하고 모근의 부활을 돕는 발아현미 상황버섯, 발아대두 동충하초, 하수오, 무화과 및 야자유를 균등량 혼합한 발효추출물 30~65 중량; 혈류촉진제인 당약 및 지실을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 15~35 중량%; 항염증제인 고삼 및 목단을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 10~30 중량%; 국소자극제인 대나무 목초액 및 생강을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 5~20 중량%를 혼합하여 제조될 수 있다.

일예로, 상기 천연물 유래 발효추출물 5~10 중량%를 분쇄한 다음, 당밀과 흑설탕 균등량을 20~40 중량%를 첨가하고, 여기에 5~10배의 정제수를 넣은 다음 황국균, 백국균, 락토바실러스인 복합미생물제제를 10~20 중량% 넣은 다음 28~30℃에서 1~3개월 발효시킨 다음, 여과 정제시켜 제조될 수 있다.

선택적으로, 첨가제로 칼슘, 판토텐산, 벤질 니코틴산, L-아르기닌, 호르몬제인 에스트리디올을 각각 0.0001~0.001 중량%를 넣고, 기타 청량제로 멘톨, 에탄올을 0.0001~0.005 중량%를 더 혼합시킬 수 있다.

보다 구체적인 예로서, 상기 천연물 유래 발효추출물은,

(1) 모근에 영양분을 공급하고 모근의 부활을 돕는 발아현미 상황버섯, 발아대두 동충하초, 하수오, 무화과 및 야자유를 균등량 혼합한 발효추출물 30~65 중량; 혈류촉진제인 당약 및 지실을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 15~35 중량%; 항염증제인 고삼 및 목단을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 10~30 중량%; 국소자극제인 대나무 목초액 및 생강을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 5~20 중량%로 이루어진 발효추출물; 또는

(2) 모근의 영양제 및 모근 부활제로서 발아현미 상황버섯 35, 하수오 22, 발아대두 동충하초 2, 무화과 2, 야자유 1, 여기에 혈액촉진제로 당약 15, 지실 5, 항염증제로 고삼 11, 목단피 3, 국소자극제로 대나무 목초액 3, 생강 1을 중량%로 혼합한 혼합추출물 5~10 중량%를 분쇄한 다음; 당밀 10~20 중량%와 흑설탕 10~20 중량%를 첨가하고, 혼합추출물의 5~10배에 해당하는 정제수 30~50 중량%를 넣은 다음; 황국균, 백국균, 락토바실러스를 1 : 1 : 0.1의 비율로 혼합한 복합미생물제제를 10~20 중량% 넣은 다음; 28~30℃에서 1~3개월 발효, 여과 정제시키고, 첨가제로 칼슘, 판토텐산, 벤질 니코틴산, L-아르기닌, 호르몬제인 에스트리디올을 각각 0.0001~0.001 중량%를 넣고; 청량제로 멘톨 및 에탄올을 각각 0.0001~0.005 중량% 혼합하여서 제조되는 발효 추출물;일 수 있다.

나아가, 본 발명의 다른 측면에서,

PGA(Poly-γ-glutamic acid) 수용액과 천연물 유래 발효추출물을 포함하는 발모제 원액을 혼합하여, 혼합액을 제조하는 단계;

키토산 용액에 상기 혼합액을 첨가하여 젤화시키는 단계;를 포함하는,

하이드로젤 나노입자의 제조방법이 제공된다.

이하, 본 발명에 따른 하이드로젤 나노입자의 제조방법을 설명한다.

먼저, PGA(Poly-γ-glutamic acid) 수용액과 천연물 유래 발효추출물을 포함하는 발모제 원액을 혼합하여, 혼합액을 제조하는 단계에 있어서, 바람직하게 상기 PGA 수용액과 상기 발모제 원액의 혼합은, 특별히 제한되지 않으나, 두 성분이 잘 혼합될 수 있도록, 공지된 방법, 또는 장치(예를 들어, 교반기, 유화분산기 등)를 사용하여 교반시킬수 있고, 일예로, 나노유화분산기(Homogenizer)를 사용하여 고압분사시킬 수 있다.

한편, 이 단계에서 각각의 PGA 수용액과 발모제 원액은, 예를 들어, 부피비로 1 : 0.5-2, 바람직하게, 1:1로 혼합될 수 있다.

또한, 상기 PGA 수용액의 농도는, 예를 들어, 0.05-2 mg/mL, 0.07-1.8 mg/mL, 또는 0.1-1 mg/mL일 수 있고, 또는 바람직하게, 약 1 mg/mL일 수 있다.

다른 예로, 상기 PGA 수용액의 농도는 하기 키토산 용액의 농도와 유사하거나, 같을 수 있다.

다른 한편, 상기 발모제 원액의 농도는, 제한 없이 본 발명의 범주에 포함되나, 예를 들어, 1 mg/mL 이상, 5 mg/mL 이상, 10 mg/mL 이상, 50 mg/mL 이상, 또는 약 0.1 g/mL일 수 있다.

또 다른 한편, 상기 PGA 수용액과 상기 발모제 원액의 용매에 있어서, 각각의 성분을 분산시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 특히 상기 혼합액에 PGA와 발모제 성분이 고루 분포시킬 수 있는 용액을 제조할 수 있는, 용매라면, 제한 없이 본 발명에 포한되는 것으로 이해될 수 있다.

또한, 이 단계가 수행하는 바가, 생성물인 PGA와 발모제 성분의 분산 혼합액을 얻기 위한 것임을 이해한다면, 상기 혼합액을 보다 용이하게 얻기 위한, 온도 변경, 압력 변화, 가용제 등의 첨가제, 등의 일반적으로 당 기술분야에 알려진 방법을 선택적으로 상기 단계를 수행함에 있어, 더 포함시킬 수 있고, 이 역시 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

한편, 키토산 용액에 상기 혼합액을 첨가하여 젤화시키는 단계에 있어서, 바람직하게 상기 젤화 단계는, 공지된 젤화 방법을 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들어 이온성 젤화(ionic gelation) 시키는 단계일 수 있다.

또한, 이 단계에서, 상기 키토산 용액에 상기 혼합액을 첨가하는 방법은, 하이드로젤 입자가 제조될 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 고압분사 방식을 사용할 수 있고, 나노유화분산기(Homogenizer)를 활용한 고압분사 방식으로 수행될 수 있고, 또는, 상기 혼합액을 주사기 및 시린지 펌프를 이용하여 한방울씩(dropwise) 넣어 줌으로써 수행될 수 있다.

한편, 상기 키토산 용액은 특정 부피비로 혼합될 수 있고, 예를 들어, 상기 PGA 수용액 : 키토산 용액 = 1 : 1-10 또는 1 : 2-8로 할 수 있다.

바람직하게, 상기 PGA 수용액 : 발모제 원액 : 키토산 용액의 부피비는, 1 : 1 : 2-8로 할 수 있고, 가장 바람직하게 1 : 1 : 4로 할 수 있다.

상기 부피비를 한정하는 것은, 특정 이론에 제한되는 것은 아니고, 일 측면에서, 본 발명이 달성하고자 하는 하이드로젤 나노입자의 바람직한 크기, 예를 들어 200 nm 부근 또는 이하의 입자 크기를 달성하기 위한 것으로 이해될 수 있고, 다르게는 발모제가 충분한 양으로 로딩하기 위한 것으로 이해될 수 있으며, 또 다르게는 하이드로젤 입자의 발모제 서방형 방출에 있어서, 장시간의 효율을 달성하기 위한 것으로 이해될 수 있다.

또한, 상기 키토산 용액의 농도는, 예를 들어, 0.05-2 mg/mL, 0.07-1.8 mg/mL, 또는 0.1-1 mg/mL일 수 있고, 또는 바람직하게, 약 1 mg/mL일 수 있다.

또 다른 한편, 상기 키토산 용액의 용매는, 키토산을 용해 또는 분산시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 특히 이 단계의 젤화를 수행할 수 있는 용매라면, 제한 없이 본 발명에 포한되는 것으로 이해될 수 있다.

상술된 본 발명의 하이드로젤 나노입자의 제조방법에 있어서, 이로부터 용이 변경/수정 또는 부가 가능한 방법, 특히 공지된 기술을 도입, 수정/변경, 부가하는 방법은, 당 분야 통상의 기술자라면 용이하게 실시 가능한 것인 바, 본 발명에 포한되는 것으로 이해되어야 한다.

나아가, 본 발명은 상기 하이드로젤 나노입자를 유효성분으로 함유하는, 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

여기서, 상기 유효성분인 하이드로젤 나노입자는, 본원에서 설명되는 바와 같이, 종래기술 대비 우수한 피부 침투율, 장시간의 서방형 방출, 등의 특성을 나타내는 바, 탈모방지 및 발모 촉진의 개선된 효과를 가져올 수 있다.

특히, 본 발명 하이드로젤 나노입자는, 모발이 가장 활발하게 성장하는 성장기(anagen stage)를 장기간동안 유지시키는 효과를 나타내는 바, 탈모방지 및 발모 촉진의 개선된 효과를 가져올 수 있다.

또한, 상술한 본 발명 하이드로젤 나노입자의 개선된 효과와 특성으로부터, 당 기술이 직면해 있는 기술적 문제, 즉, 종래 천연 발모제가 가지는 문제점인, 발모제 효능 지속의 어려움과 현저히 떨어지는 두피 흡수율의 문제가 해결될 수 있는 바, 본 발명은 개선된 효능의 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.

나아가, 본 발명의 또 다른 측면에서,

상기 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 피부외용제가 제공된다.

여기서, 상기 피부외용제는, 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태일 수 있다.

한편, 상기 피부외용제는 유효성분인 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물 외에, 추가적으로 첨가제를 더 포함할 수 있고, 예를 들어, 의약외품 또는 의약품에 공지된 첨가제, 또는 시판되는 피부외용제에 있어서, 일반적으로 첨가되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.

일 예로, 상기 첨가제는 물, 알코올, 유제, 계면활성제, 증점제, 분체, 킬레이트제, pH 조정제, 보습제, 미백제, 항염증제, 세포부활제 등의 각종 약효제, 동식물·미생물 유래의 추출물, 향료 등에서 하나 이상을 선택 사용할 수 있다.

다른 한편, 상기 피부외용제에 있어서, 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물의 함유량은 특별하게 한정되지 않지만, 제품중에 1.0-90 중량％로 하는 것이 바람직하고, 3.0-50 중량％로 하는 것이 바람직할 수 있다. 또한 상기 제품중의 pH나 전기 전도도의 범위는 본 발명 하이드로젤 나노입자의 범위 내이면, 경시안정성의 면에서 유리할 수 있다.

나아가, 본 발명의 다른 측면에서,

상기 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 두피 또는 모발케어 제품이 제공된다.

여기서, 상기 제품은 액상, 고형, 반고형, 과립, 분말 또는 크림, 연고, 페이스트, 거품, 젤, 로션, 파우더, 스트레이, 스틱 또는 에어로졸 형태로 제공되는 되는 것인 두피 또는 모발케어 제품일 수 있다.

다르게는, 상기 제품은 샴푸, 바, 트리트먼트, 토닉, 팩, 린스 또는 삼푸와 린스의 혼합형인, 두피 또는 모발케어 제품일 수 있다.

이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명하였다.

단, 하기 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 천연 유래 발효추출물의 제조

도 1과 같은 공정을 거쳐 발효추출물을 제조한다.

모근의 영양제 및 모근 부활제로서 발아현미 상황버섯 35, 하수오 22, 발아대두 동충하초 2, 무화과 2, 야자유 1, 여기에 혈액촉진제로 당약 15, 지실 5, 항염증제로 고삼 11, 목단피 3, 국소자극제로 대나무 목초액 3, 생강 1을 중량%로 혼합하여 분쇄한 혼합추출물 5 중량%에,

당밀 15 중량%, 흑설탕 35 중량%를 넣은 다음,

황국균, 백국균 및 락토바실러스를 1 : 1 : 0.1의 비율로 혼합한 복합미생물제제 10 중량%를 첨가하고,

상기 혼합추출물의 7배에 해당하는 정제수 35 중량%를 넣고 25℃에서 90일간 발효시킨 다음, 여과하여 발효 생성물, 즉 발효추출물을 얻는다.

얻어진 발효 생성물에 첨가제로 칼슘 판토텐산, 벤질니코틴산, L-아르기닌, 에스트라디올을 각각 0.0001 중량%의 멘톨을 넣고, 총 부피%로 주정 알코올 5를 넣어 완성시켰다.

<실시예 1> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조

상기 제조예 1에서 얻은 발효추출물 1 mL를 동결 건조했을 때, 약 0.1 g의 고형 성분이 남는 것으로 확인되었다. 이에, 사용되는 발모제 원액의 농도를 0.1 g/mL로 하였고, 멸균한 PGA(Poly-γ-glutamic acid) 수용액 (1 mg/mL)과 동일 부피의 발모제 원액(PGA : 발모제 = 1 : 1 부피비)을 섞고 충분히 교반한 후, 교반되고 있는 키토산 용액 (1 mg/mL, 1 % (w/v) 아세트산에 키토산 용해, PGA : 발모제 : 키토산 = 1 : 1 : 2 부피비)에 주사기 및 syringe pump를 이용하여 dropwise하게 넣어 줌으로써, 즉각적인 이온성 겔화에 의해 발모제가 PGA_키토산 젤에 포집됨을 도 3a와 같이 확인하였다.

<실시예 2> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조 2

상기 실시예 1과 같이 수행하되, PGA : 발모제 : 키토산 = 1 : 1 : 4의 부피비로 변경하여, 하이드로젤 나노입자를 제조하였다.

<실시예 3> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조 3

상기 실시예 1과 같이 수행하되, PGA : 발모제 : 키토산 = 1 : 1 : 8의 부피비로 변경하여, 하이드로젤 나노입자를 제조하였다.

<실시예 4> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조 4

상기 실시예 1과 같이 수행하되, PGA : 발모제 : 키토산 = 1 : 1 : 4의 부피비로 하고, PGA와 키토산의 농도를 0.1 mg/mL로 변경하여, 하이드로젤 나노입자를 제조하였다.

<실시예 5> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조 4

상기 실시예 1과 같이 수행하되, PGA : 발모제 : 키토산 = 1 : 1 : 4의 부피비로 하고, PGA와 키토산의 농도를 0.2 mg/mL로 변경하여, 하이드로젤 나노입자를 제조하였다.

<실시예 6> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조 4

상기 실시예 1과 같이 수행하되, PGA : 발모제 : 키토산 = 1 : 1 : 4의 부피비로 하고, PGA와 키토산의 농도를 0.5 mg/mL로 변경하여, 하이드로젤 나노입자를 제조하였다.

상기 실시예 1 내지 5의 발모제를 포집한 입자는 수용액 상에 잘 분산되며, 발모제의 색에 의해 갈색을 띄며 (도 3a), 발모제 없이 PGA 수용액에 키토산만 반응시킨 대조군(control) 입자의 경우, 분산은 여전히 잘 이루어지며 불투명한 흰색을 띄는 것 (도 3b)을 확인하였다.

<비교예 1> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조

멸균한 히알루론산 (hyaluronic acid (HA))수용액 (0.6 mg/mL)과 이온성 젤화의 가교 역할을 수행하는 소듐 트리폴리포스페이트 (TPP)를 20:1 (부피비)로 섞은 후, 히알루론산 부피와 동일 부피의 발모제 원액을 추가적으로 섞고 충분히 교반 후, 교반되고 있는 키토산 용액 (0.6 mg/mL, 1 % (w/v) 아세트산에 키토산)에 주사기 및 시린지 펌프를 이용하여 한방울씩 넣어줌으로써, 즉각적인 이온성 젤화에 의해 발모제가 히알루론산_키토산 젤에 포집됨을 확인하였다.

이때, HA : 발모제 : 키토산 : TPP의 부피비 = 1 : 1 : 2 : 0.05이다.

<비교예 2> 발효추출물을 포함하는 하이드로젤 나노입자의 제조 2

멸균한 소듐 알지네이트 수용액(2%, w/v)과 발모제를 각각 3:1 (sodim alginate solution : 발모제(발효추출물))의 부피비로 섞은 후, 교반되고 있는 CaCl₂ (100 mM) 수용액에 주사기 및 시린지 펌프를 이용하여 한방울씩 넣어줌으로써, 즉각적인 이온성 젤화에 의해 발모제가 포집됨을 확인하였다.

<실험예 1> 발모제 표준 곡선의 확립

하이드로젤에 발모제의 로딩 및 방출 패턴을 측정하기 위한, 표준 곡서(standard curve)을 확립하였다.

발효추출물 발모제의 경우, 발모제 원액 1mL를 동결 건조(freeze-drying)했을 때, 대략 0.1 g의 고형 성분이 확인되었다. 이에, 사용되는 발모제 원액의 농도는 0.1 g/mL로 하였고, 발모제의 특이적 흡광도 (400 nm)를 토대로 발모제 농도에 따른 변화를 관측하여 도 2에 나타내었다.

도 2를 살펴보면, 발모제 농도와 400nm 에서의 흡광도는 선형 상관관계(linear correlation)를 보이는 것으로 확인되었고, 하기 하이드로젤에 발모제의 로딩 및 방출 패턴 실험에서 도 2의 표준 곡선(standard curve)을 이용하여 로딩 및 방출 양을 계산하였다.

<실험예 2> 하이드로젤 나노입자의 크기 및 발모제 포집 효율 분석

본 발명 하이드로젤 나노입자의 입자 크기와 발모제 포집 효율을 분석하기 위하여, 다음과 같이 실험하여 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1-6과 비교예 1 및 2의 하이드로젤 나노입자를 광학 현미경으로 관측하여, 각각 10개 이상의 입자의 평균값을 산출하여 확인하였고,

발모제 포집 효율 = 초기 발모제 양 - 하이드로젤에 로딩 후 상등액에 남은 발모제 양 / 초기 발모제 양, 의 식으로 산출하여 확인하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	입자 크기	포집 효율	Zeta potential (mV)	PDI
실시예 1	387.8 ± 4.3 nm	49.5 %	16.99 ± 1.23	0.250 ± 0.01
실시예 2	381.8 ± 2.4 nm	51.4 %	19.48 ± 1.91	0.255 ± 0.02
실시예 3	400.2 ± 6.7 nm	40.2 %	22.18 ± 1.16	0.274 ± 0.01
실시예 4	153.2 ± 3.8 nm	2.1 %	-10.08 ± 1.78	0.250 ± 0.01
실시예 5	176.4 ± 10.8 nm	2.5 %	-2.74 ± 0.66	0.255 ± 0.02
실시예 6	222.4 ± 6.7 nm	4.7 %	3.46 ± 0.64	0.292 ± 0.01
비교예 1	597 ± 10 nm	19.5 %	-4.84 ± 3.3	0.248 ± 0.03
비교예 2	1593.093 ± 9.09 μm	85.6 %	-	-

표 1을 살펴보면, 본 발명 실시예 1-6의 하이드로젤 나노입자의 경우, 전하적으로 안정된 상태이며, 피부 침투에 효과적인 nm 단위의 입자 크기, 바람직하게 피부간극 근처 및 이하의 크기로로 입자가 형성됨을 확인되었고, 우수한 포집 효율을 확인할 수 있었다.

반면, 비교예 1과 2의 경우, 상대적으로 입자 크기가 큰 것으로 확인되며, 특히 비교예 2의 경우, 현저히 큰 μm 단위의 입자 크기를 갖는 것으로 확인되었다.

<실험예 3> 하이드로젤 나노입자의 발모제 로딩 양 측정 및 방출 특성 분석

발모효능과 직접적으로 관련되는, 하이드로젤 나노입자의 발모제 로딩 양 및 시간에 따른 발모제 방출 특성을 분석하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

먼저, 발모제 로딩 양(wt %)을 분석하기 위하여, 실시예 1-6과 비교예 1 및 2의 하이드로젤 나노입자를 60℃ 오븐에서 하루 동안 건조시킨 후, 이의 질량을 측정하여 로딩 양을 다음과 같은 식을 통하여 산출하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

발모제 로딩 양 = (포집된 발모제 질량 / 하이드로젤 질량 + 포집된 발모제 질량) X 100

한편, 하이드로젤 나노입자의 약물(발모제) 방출 특성은,

작동 온도인 37℃와 보관 온도인 4℃에 대해, 증류수 (Distilled water; DW), phosphate buffered saline (PBS) 및 염산 (HCl, 10 mM) 조건하에서, 시간 경과에 따른 발모제 방출 양을, 발모제 특이 흡광도(400 nm)를 통하여 측정하였다. 구체적인 실험 조건은 1) PBS, shaking (200 rpm) & 37℃, 2) PBS, 정지상태 & 37℃, 3) DW, 정지상태 & 4℃, 4) DW, 정지상태 & 실온으로 진행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

	약물 로딩 양 (중량 %)
실시예 1	6
실시예 2	11
실시예 3	13
비교예 2	19.0

표 2를 살펴보면, 본 발명 하이드로젤 나노입자는 목적하는 수준의 발모제 로딩 양을 나타내는 것으로 확인되었다.

도 6을 살펴보면, 본 발명 하이드로젤 나노입자는 PBS 상에서 발모제의 방출이 확인되며, 37℃에서 정지상태와 shaking condition (200 rpm) 모두 7시간까지 지속적으로 90%에 가까운 발모제 방출이 이루어지는 것을 확인할 수 있다.

한편, 보관 용액으로서 성능을 테스트한 DW(증류수)의 경우, 실온과 4℃ 정지상태에서 모두 10% 이하의 발모제 방출만이 이루어지기 때문에, 발모제의 방출을 효과적으로 제한할 수 있다고 판단되었다.

<실험예 4> 세포 모델에서의 발모효능 및 독성 평가

본 발명 하이드로젤 나노입자의 세포 모델에서의 발모효능 및 독성을 평가하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

<4-1> 세포 모델에서의 발모효능 평가 1

6주령 C57BL/6N mice 모델에서 분리한 Primary DPCs(모유두세포, 5 x 10³ cell/well)을 24 웰 플레이트에 시딩한 후, 본 발명 실시예 1-3 하이드로젤 나노입자를 처리하거나, 또는 발모제 없이 실시예 1-3과 같은 구성의 하이드로젤 입자를 처리하여, 96h 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 실험에 사용된 배지는 FBS를 포함하는 DMEM의 serum(+) 조건과 FBS를 포함하지 않는 DMEM의 serum(-)조건을 사용하여 두 가지 조건에서 진행하였고, CCD 카메라를 이용한 실시간현미경을 사용하여, Primary DPCs의 세포 수와 세포 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 살펴보면, Serum이 포함된 조건(serum(+))에서 실시예 1-3 처리군에서 응집성을 보이는 DPCs군이 가장 많이 나타나는 것으로 보아, DPCs의 성장을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, Serum이 포함되지 않은 조건 (serum(-))에서도 실시예 1-3 처리군이 발모제 없는 처리군 대비 세포의 분화된 상태를 더 오래 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명 실시예 1-3 모두 세포 독성은 없는 것으로 확인되었다.

<4-2> 세포 모델에서의 발모효능 평가 2

6주령 C57BL/6N mice 모델에서 분리한 Primary DPCs(모유두세포, 5 x 10³ cell/well)을 24 웰 플레이트에 시딩한 후, 본 발명 실시예 1-3 또는 비교예 2의 하이드로젤 나노입자를 처리하여, 45h 동안 FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 배양하였고, CCD 카메라를 이용한 실시간현미경을 사용하여, Primary DPCs의 세포 수와 세포 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 살펴보면, 본 발명 하이드로젤 나노입자는 DPCs의 세포 수를 증가시킬 뿐 아니라, DPCs의 분화가 뚜렷하게 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.

<4-3> 세포 모델에서의 독성 평가

구체적으로, Keratinocyte에 해당하는 피부각질형성세포의 일종인 HaCaT 세포를 사용하여 실시예 1-3 하이드로젤 나노입자, 또는 발모제 없이 실시예 1-3과 같은 구성의 하이드로젤 입자를 24h 동안 37℃, 5% CO₂에서 처리함에 따른 세포독성을 Ez-Cytox kit를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

한편, 실험 데이터의 통계는 SPSS 12.0KO for Windows프로그램을 사용하여 ANOVA/Dunnet’s 분석법으로 분석하였다(**p<0.05,***p<0.01 vs 각 농도별control).

도 9를 살펴보면, 발모제 2, 4, 8μL를 방출하는 조건에서 모두 HaCaT 세포의 생존률이 100%에 가깝게 나타나는 것으로 확인되었고, 이에, 본 발명 하이드로젤 나노입자는 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

<실험예 5> 동물 모델에서의 발모효능 및 독성 평가

본 발명 하이드로젤 나노입자의 동물 모델에서의 발모효능 및 독성을 평가하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

본 발명 하이드로젤 나노입자의 탈모 방지 및 양모 효능을 평가하기 위하여, 털의 hair cycle 중 휴지기상태(telogen phase)에서 성장기(anagen phase)로 진행되어 재성장된 털에 대한 생리 및 약리 효과를 평가하였다.

구체적으로, Telogenic C57BL6/N 마우스 모델을 사용하였고, 5~7일 순화기간을 거친 후 등 부분의 털을 12cm²의 넓이로 시중에서 판매되는 제모제(비키로크림 [티오글리콜산80%], 태극제약(주), 충청남도, 한국)를 1/2 희석하여 제모한 후, 하루 동안 관찰 후, 총 11일 동안 일정한 시간(1회/day)에 각 실시예 2, 또는 발모제 없이 실시예 2와 같은 구성의 대조군의 시료를 200μl씩 도포하였다.

한편 실험에 사용된, C57BL6/N 11주령의 마우스는 등 부분의 모낭 대부분이 휴지기(telogen phase)에 속하는 시기로 모낭에서 털이 생성되는 속도가 느리며 핑크색을 나타대고, 모낭과 털이 성장기(anagen phase)로 진행됨에 따라 멜라닌 색소의 합성에 의한 검정색 반점이 나타내는 특징을 가진다(Park 2014) (Muller-Rover, Handjiski et al. 2001).

<5-1> 발모 속도 및 피부 색 변화 관찰

약물 처리 동안의 발모 속도 및 피부의 색 변화를 비교 평가하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10을 살펴보면, 11일 동안 실시예 2를 처리한 결과 등 부분의 피부에서 성장기의 특징인 멜라닌 색소 생성으로 인한 검정색 반점과 털의 성장 변화를 눈으로 관찰할 수 있다. 특히, 대조군 대비 본 발명 실시예 2 처리군에서 멜라닌 색소의 생성 면적 및 속도와 털의 발모 속도가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다.

<5-2> 털 길이 측정

또한, 처리 11일 후의 각 개체별 30 이상의 털을 핀셋으로 뽑아, 길이를 측정하여 비교 평가하였고, 그 결과를 도 11 및 표 3에 나타내었다. 실험 데이터의 통계는 Standard t-test로 분석하였다(***p<0.001 vs 대조군).

	실시예 2	대조군
털 길이 (mm)	2.38 ± 0.53 ***	1.68 ± 0.61

표 3 및 도 11을 살펴보면, 발모제가 포집되지 않은 대조군의 경우, 1.68 ± 0.61mm의 털 길이를 나타내었고, 본 발명 실시예 2 처리군의 경우, 털의 길이가 2.38 ± 0.53mm을 나타내어, 대조군 대비 털의 길이가 약 41%가 증가한 것으로 확인되었다.

<5-3> 털 주기 관찰 평가

나아가, 처리 11일 후의 각 개체를 희생시킨 후, 등 조직 일부를 털 성장 방향으로 절단하여 회수하였고, Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색한 슬라이드를 40 배율의 디지털 현미경을 사용하여, 각 모낭의 털 주기(hair cycle)의 상태를 관측하여 비교 평가하였고, 그 결과, 도 13에 각 처리군별 슬라이드 사진을 나타내었고, 도 14 및 표 4에 각 처리군별 털 주기 분포 양태를 나타내었다.

한편, C57BL6/N 마우스의 털 주기는 도 12와 같이, 성장기(anagen phase), 휴지기(telogen phase), 퇴화기(catagen phase)의 순서로 주기를 이룬다(Mkuller-Rover, Foitzik et al. 2001). 실험 데이터의 통계는 SPSS 12.0KO for Windows프로그램을 사용하여 ANOVA/Dunnet's 분석법으로 분석하였다(*p<0.05,**p<0.01 vs 무처리군).

		무처리 군	실시예 2	대조군	발모제 단독 처리군
점수 (%)	Telogen	26.75 ± 8.05	34.05 ± 9.23	13.05 ± 11.46 *	26.96 ± 14.19
	Anagen Ⅲ	20.91 ± 9.08	20.99 ± 8.31	40.52 ± 10.03 **	26.17 ± 17.49
	Anagen Ⅴ	29.64 ± 11.29	29.97 ± 9.12	25.33 ± 9.24	23.43 ± 10.62
	Catagen	22.70 ± 12.87	14.99 ± 8.83	9.51 ± 8.33 *	10.75 ± 9.53

표 4, 도 13 및 도 14를 살펴보면, 본 발명 실시예 2 하이드로젤 나노입자에 의하여 털의 성장기가 유도되었음을 확인할 수 있고, 다른 실험군과 비교하여 성장기의 모낭이 대략 2배 많으며, 휴지기로 넘어가지 않고 성장기로 오래 유지됨을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명 하이드로젤 나노입자로부터 발모촉진효능와 성장기를 오래 유지하여 모발의 손실을 방지하는 탈모예방의 효과가 현저히 향상되었음이 확인되는 바, 종래 기술 대비 개선된 효과의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물, 피부외용제, 두피 또는 모발 케어 제품이 제공될 수 있음을 알 수 있다.

<5-4> 모낭 수 및 모낭 밀도 관찰 평가

처리 11일 후의 각 개체를 희생시킨 후, 등 조직 일부를 털 성장 방향과 수직으로 절단하여 회수하였고, Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색한 슬라이드를 40 배율의 디지털 현미경을 사용하여 관측하였고, 각 처리군별 현미경 사진을 도 15에 나타내었고, 0.16 mm² 면적당 모낭(Hair follicle)의 개수를 비교 평가하였고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

	무처리 군	실시예 2	대조군	발모제 단독 처리군
모낭 개수 (개 / 0.16 mm2)	22 ± 2.3	24 ± 1.9	19 ± 3.6	19 ± 3.4

표 5 및 도 15를 살펴보면, 본 발명 하이드로젤 나노입자 실시예 2 처리군의 경우, 24 ± 1.9 개/0.16mm²으로 확인되었고, 이는 대조군 대비 약 26% 높은 모낭 밀도이고, 그외 무처리군 및 발모제 단독 처리군 대비 높은 모낭 밀도를 나타내는 것으로 확인되었다.

<5-5> 케라틴 단백질 함량 분석

처리 11일 후의 각 개체를 희생시킨 후, 등 조직 일부를 회수하여, 2DE lysis solution으로 등 조직의 단백질을 추출하여 이차원전기영동(2D electrophoresis)을 진행하였고, 각 처리군 별 이차원 젤에 나타난 단백질 spot의 발현정도를 분석하여 비교 평가하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16을 살펴보면, 실시예 2 처리군 및 대조군(발모제 없이, PGA_키토산 하이드로젤 나노입자 처리군)을 단백질 spot 이미지를 분석한 결과, 평균적으로 대략 310여 개의 spot이 관찰되었다.

참조문헌에 따르면 케라틴 단백질은 Type1(40-56.5kDa, pI<7.0)과 Type2(53-67kDa, pI≥7.0) 로 나누어지며 그 중 마우스와 사람 헤어 샤프트와 관련이 있는 케라틴-6의 경우 Type2 케라틴에 속한다(Rothnagel, Seki et al. 1999) (Steinert, Parry et al. 1985).

이차원전기영동을 통해 처리군별 동일한 분자량과 pI값을 갖는 spot을 비교하여 번호를 설정한 후, 각 spot의 강도(intensity)값을 측정하여 값이 2배 이상 차이나는 spot을 선정하였다.

Type2인 케라틴-6(분자량 대략 67kDa, pI≥7.0)라고 추정되는 spot의 intensity값이 3.9배~16.7배로 증가하였음을 확인하였다.

<실험예 6> 하이드로젤 나노입자의 동물 모델에서의 안전성 평가

본 발명 하이드로젤 나노입자의 안정성을 평가하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

<6-1> 피부감작성 시험

구체적으로, 피부감작성시험의 경우, 식품의약품안전청에서 고시된 'OECD Guideline for the testing of Chemical-No.437 및 429)' 지침사항을 참고하여 진행하였고, C57BL6/N 마우스 모델의 등 부분의 털을 시중에서 판매되는 제모제(비키로크림 [티오글리콜산80%], 태극제약(주), 충청남도, 한국)를 1/2 희석하여 12 cm²의 넓이로 제모한 뒤, 11일 동안 본 발명 실시예 2, 발모제 없는 실시예 2 구성의 대조군, 무처리군, 발모제 단독 처리군을 각각 200μl씩 처리하여 등 부분의 변화를 유의 관찰하였고, 다음과 같은 점수 기준표에 따라 평가하였고, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

피부 감작성 평가 기준: 홍반이 나타나지 않음(0점), 매우 미세한 홍반(1점), 뚜렷한 홍반(2점), 중등도 이상의 홍반(3점), 가피를 형성하는 홍반(4점).

	점수
무처리 군	0
실시예 2	0
대조군	0
발모제 단독 처리군	0

표 6을 살펴보면, 모든 처리군에서, 홍반과 관련된 증상이 전혀 나타나지 않는 것으로 확인되었고, 이에 독성이 없는 것으로 판단하였다.

<6-2> 단회 투여 독성 평가

구체적으로, 단회투여 독성 실험의 경우, 식품의약품안전청에서 고시된 ‘OECD Guideline for the testing of Chemical-No.401 및 425’ 지침사항을 참고하여 진행하였고, C56BL/6N 마우스 모델을 사용하여, 시료 투여 전 24h 절식시킨 후, 각각의 처리군을 400μl/20g 체중의 농도로 경구투여(Oral administration)하였다. 이후, 14일 동안 각 개체의 경과를 관찰하여 기록하고, 14일에 희생시켜 체내 분석 및 관찰하였고, 14일 동안의 체중 변화 그래프와 희생 후 촬영된 사진을 도 17에 나타내었다.

도 17을 살펴보면, 무처리 군, 실시예 2, 대조군, 발모제 단독 처리군 모두 실험 중 사망한 개체는 없었고, 체중에도 유의한 변화가 없었다. 또한, 14일인 마지막 날 희생시켜 육안으로 관찰했을 때, 위, 소장, 대장, 간, 비장과 같은 장기들의 손상이 관찰되지 않았다. 이에, 모든 처리군 시료의 독성이 없다고 판단하였다.

<실험예 7> 하이드로젤 나노입자의 피부 침투 성능 평가

본 발명 하이드로젤 나노입자의 피투 침투 성능을 평가하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다.

기존 보고 (Carbohydrate Polymers 38, 99-107 (1999))처럼, 본 발명 실시예 2 하이드로젤 나노입자에 FITC를 수식한 후, 이를 돼지 피부에 1시간 반응시킨 뒤, 공초점 현미경을 통해 FITC 형광을 관찰하였고, 그 사진을 도 18에 나타내었다.

도 18을 살펴보면, 돼지 피부의 0.737 mm 깊이까지 FITC의 녹색 형광이 관찰되고, 0.921 mm 깊이에는 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다.

이로부터 본 발명 하이드로젤 나노입자는 그 크기가 200-400 나노미터 수준으로 조절되어 있기 때문에, 피부간극을 용이 침투할 수 있는 것을 알 수 있다.

따라서, 상술된 제조예, 실시예, 및 실험예를 통하여 확인되는 것처럼, 본 발명 하이드로젤 나노 입자는, 피부간극 근방 또는 이하의 크기를 가지는 바, 피부 침투율이 우수하고, 높은 발모제 로딩과 함께, 장시간 동안 안정적으로 발모제의 서방형 방출이 가능하여, 종래 기술 대비 현저히 개선된 탈모방지 효과 및 발모촉진 효과를 나타낼 수 있는 바, 탈모방지 및 발모촉진용 피부외용제, 두피 또는 모발 케어 제품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (11)

1. 천연물 유래 발효추출물을 포함하는 발모제; 및
   상기 발모제를 포집하는, PGA(Poly-γ-glutamic acid) 및 키토산을 포함하는 하이드로젤 매트릭스; 를 포함하는 500 nm 이하의 직경을 가지는 하이드로젤 나노입자를 유효성분으로 함유하는, 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물이되,
   상기 하이드로젤 나노입자는,
   1-2 mg/mL의 PGA 수용액 : 0.1 g/mL의 발모제 원액 : 1-2 mg/mL의 키토산 용액을 부피비 1 : 1 : 1-10으로 혼합하고 젤화시켜 제조되는 나노입자인 것을 특징으로 하는, 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 천연물 유래 발효추출물은,
   모근에 영양분을 공급하고 모근의 부활을 돕는 발아현미 상황버섯, 발아대두 동충하초, 하수오, 무화과 및 야자유를 균등량 혼합한 발효추출물 30~65 중량%;
   혈류촉진제인 당약 및 지실을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 15~35 중량%;
   항염증제인 고삼 및 목단을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 10~30 중량%;
   국소자극제인 대나무 목초액 및 생강을 1 : 1로 혼합한 발효추출물 5~20 중량%로 이루어진 발효추출물인 것을 특징으로 하는, 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 발모제의 하이드로젤 입자에 대한 로딩 양은, 5 내지 15 중량%인 것을 특징으로 하는, 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제1항의 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 피부외용제.
    
11. 제1항의 탈모방지 및 발모 촉진용 조성물을 포함하는, 두피 또는 모발케어 제품.
    

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