KR20210017187A

KR20210017187A - 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 바이오 나노 입자의 분리 방법

Info

Publication number: KR20210017187A
Application number: KR1020190096059A
Authority: KR
Inventors: 박재성; 부종욱; 신현우
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 주식회사 엑소좀플러스
Priority date: 2019-08-07
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2021-02-17
Also published as: EP4012043A4; EP4012043A1; US20220288506A1; KR102294264B9; KR102294264B1; WO2021025291A1

Abstract

본 발명은 생물학적 시료로부터 나노 크기를 갖는 바이오 나노 입자를 손실 및 손상 없이 불순물로부터 고순도로 분리할 수 있는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 바이오 나노 입자의 분리 방법을 개시한다.

Description

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 바이오 나노 입자의 분리 방법{Separation method of bio-nano particles by aqueous two-phase composition}

본 발명은 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 바이오 나노 입자의 분리 방법에 관한 것이다.

바이오 마커란 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 치료방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 지표이다. 과거에는 혈압이나 체온, 혈당 수치 같은 생리학적 지표가 바이오 마커로 주목받았으나, 최근에는 유전물질(DNA, RNA), 단백질, 세균, 바이러스 등이 바이오 마커로 주목받고 있다.

바이오 마커는 그 특성에 따라 질병선 별표지자, 질병표지자, 예후표지자, 유효성표지자, 독성감별표지자 등 다양하게 분류할 수 있으며, 그 목적에 따라 한 가지 바이오 마커를 여러 가지 용도로 사용할 수도 있다. 또한, 상기 바이오 마커는 질병관련 표지자로서의 역할 뿐만 아니라, 신약개발과 관련하여 치료약물 선택, 임상시험 기간 단축 및 치료 효과 판정 등에 다양하게 사용되고 있다.

대표적인 바이오 마커 중 하나인 엑소좀(exosomes)은 체내 세포에서 자연적으로 분비되는 나노미터 크기의 구형 소낭의 일종이다. 상기 엑소좀은 세포간 신호 전달 목적으로 특별히 분비되는 것으로 이해되고 있으며, 특정 세포가 함유하고 있는 단백질, 지질, RNA 등 기능적 활성물질을 그대로 포함하고 있다. 이에 혈액이나 소변을 통해 엑소좀을 분리하고, 이를 분석하여 각종 질환과 관련된 특성을 분석하여 질병을 쉽게 진단할 수 있다.

엑소좀의 분리 기술로는 초원심분리(ultra-centrifugation isolation), 크기별 제외법(size exclusion), 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation), 미세유체 기술(microfluidics chip) 및 폴리머를 이용한 방법(polymeric method) 등이 있다.

이 중에서, 초원심분리는 엑소좀을 분리하는데 가장 널리 쓰이는 방법이고, 원리가 간단하여 가장 신뢰성 있는 분리 방법이다. 그러나 이러한 방법은 회수되는 엑소좀의 수율이 낮고, 분리에서부터 단백질 및 RNA 발현량 검출에 이르기까지 복잡한 절차 및 시간이 소요된다는 한계점이 있다. 또한, 기기 자체가 고가라는 단점이 있다.

이에 미세한 기공을 갖는 크기별 제외법 등을 이용하여 분리하는 방법이 있으나, 엑소좀이 계면에 형성된 기공에 흡착되어 분리 후 수율이 낮다는 또 다른 문제가 발생하였다.

면역친화성 분리법은 항체를 세포밖 소포체에 붙여서 분리하는 방법으로 매우 높은 선별성(specificity)으로 분리가 가능하지만, 항체를 만드는 과정이 오래 걸리며 많은 비용이 들기 때문에 실용적인 진단에 적용하는 것은 적합하지 않다.

또한, 폴리머를 이용한 방법은 체액(body fluid)의 용해도를 낮춰 줌으로써 세포밖 소포체를 가라앉게 만들어 주는 기술로서, 긴 준비시간(incubation time)이 필요하며 단백질도 함께 가라앉기에 침전물의 순도가 좋지않아 진단을 위한 활용에 적합하지 않다.

최근에, 엑소좀 분리를 위한 방법으로 수용액의 상분리가 일어난 수용액 이상계를 이용한 나노 입자를 분리하는 방법이 제안되었다. 이 방식은 Aqueous biphasic systems(ABS), Aqueous two-phase systems(ATPS) 또는 Aqueous two-phase extraction (ATPE) 방식으로 알려져 있다(비특허문헌 1, 2).

대한민국 공개특허 제10-2016-0116802호(특허문헌 1) 및 Scientific Reports(비특허문헌 3)에서는 단백질과 세포밖 소포체(예, 엑소좀)를 포함하는 체액을 수용액 이상계를 통해 단백질과 세포밖 소포체를 분리하는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법은 분리 공정 중 교반(vortexing) 후 100 ~ 5,000 × g-force로 원심분리 공정을 수행하여 미세 액적(micro droplet) 상태로 상분리를 수행하고 있다. 이러한 방법은 단시간 내 세포밖 소포체를 분리할 수 있다는 이점이 있으나, 교반 과정에서 주어지는 외력에 의해 입자가 수용액 경계면을 랜덤(random)하게 통과할 수 있기 때문에 수용액 경계면을 통환 필터링 효과가 제대로 일어나지 않는다. 이와 같은 입자 분리의 손실에 의해 고순도 및 고수율로 세포밖 소포체를 회수하는데 한계가 있다. 또한 원심분리 공정 과정에서 구조가 약한 바이오 입자는 파괴될 가능성이 있으며 바이오 입자끼리의 aggregation이 유발된다는 문제가 있다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0116802호 (2016.10.10), 수용액 이상계를 이용한 세포밖 소포체의 분리방법

Hamta, Afshin et al., "Application of polyethylene glycol based aqueous two-phase systems for extraction of heavy metals". Journal of Molecular Liquids. (2017) 231: 20~24. Juan A.Asenjo et al., Aqueous two-phase systems for protein separation: A perspective Journal of Chromatography A, Volume 1218, Issue 49, 9 December 2011, Pages 8826-8835 Hyunwoo Shin et al., High-yield isolation of extracellular vesicles using aqueous two-phase system, Scientific Reports volume5, Article number: 13103 (2015)

본 발명에서는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하되 교반 없이 입자를 분리하며 상분리시 초원심분리와 같은 추가 공정 없이 밀도 차이에 의한 상분리를 유도하였고, 상기 상분리가 일어나는 각 상의 계면장력을 제어하여 생물학적 시료로부터 바이오 나노 입자의 손상 및 손실 없이 고순도 및 고효율로 분리할 수 있는 방법을 개발하였다.

이에 본 발명에서는 수용액 이상계 시스템이 구성되는 상분리 조성물에서 두 가지 상이 접촉하는 계면에서의 장력을 조절함으로써 바이오 나노 입자의 분리가 가능한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 수용액 이상계를 이루는 제1수용액, 및 제2수용액을 제조하고, 상기 조성물을 이용하여 생물학적 시료 내 불순물과 바이오 나노 입자를 분리하는 방법을 제시한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 (a) 상기 생물학적 시료 내 불순물을 제2수용액상 내로 이동시키고, 바이오 나노 입자를 제1수용액상 내 잔류시킴으로써, 생물학적 시료 내 불순물과 바이오 나노 입자를 분리한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여, (b) 상기 생물학적 시료 내 불순물을 제외한 바이오 나노 입자를 제2수용액상 내로 이동시킴으로써, 생물학적 시료 내 불순물과 바이오 나노 입자를 분리한다.

이때 상기 (a) 및 (b)의 공정은 교반 및 초원심분리 공정 없이 수행한다. 특히, 본 발명은 생물학적 시료 내 불순물과 바이오 나노 입자를 분리하기 위해 상기 제1수용액상과 제2수용액상의 계면에서의 장력(γ)이 하기 수학식 1을 만족하도록 수용액 이상계 상분리 조성물을 설계하는 것을 특징으로 한다.

[수학식 1]

2 X 10^-7 μJ/m² ≤ γ ≤ 50 X 10^-5 μJ/m²

상기 제1수용액상은 벌크 형태로 중력 또는 부력에 의해 연속상인 제2수용액상 내에서 유동하며, 확산에 의해 제1수용액상에서 제2수용액상으로 불순물 또는 바이오 나노 입자가 이동하여, 불순물과 바이오 나노 입자를 분리한다.

이때 상기 생물학적 시료는 세포배양액, 혈액, 혈장, 혈청, 복강액, 정액, 양수, 모유, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 눈물, 콧물 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종이 가능하다.

또한, 상기 생물학적 시료로부터 분리 가능한 바이오 나노 입자는 엑소좀, 엑토솜, 바이러스, 단백질, LDL, HDL, 외부소포 마이크로베지클, 마이크로파티클, 세포자멸체, 막 입자, 막 소포, 엑소좀 유사 소포, 및 엑토솜 유사 소포 등을 포함하는 세포밖 소포체; 지질, 효소, 효소 기질, 억제제, 리간드, 수용체, 항원, 항체, 합텐, 알부민, 인슐린, 콜라겐, 프로테인A, 프로테인G, 아비딘, 바이오틴, 스트렙타비딘, 펩타이드, 폴리펩타이드, 변형 펩타이드, 핵산, 렉틴(Lectin), 탄수화물, 아미노산, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), RNA, DNA, 박테리아, 바이러스 등을 포함하는 바이오 분자; 항체-항원, 프로테인A-항체, 프로테인G-항체, 핵산-핵산 하이브리드, 앱타머-바이오분자, 아비딘-비오틴(Avidin-biotin), 스트렙타비딘-비오틴(Streptavidin-biotin), 렉틴-탄수화물(Lectins-carbohydrate), 렉틴-글리코실단백질(Lectin-glycoprotein)을 포함하는 이종 바이오 분자;로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종이다.

본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물은 생물학적 시료로부터 바이오 나노 입자를 고순도로 회수할 수 있다.

또한, 분리 공정 도중 초원심분리 등의 공정이 불필요하여 바이오 나노 입자 손상이 거의 없고, 손실 또한 발생하지 않는다는 이점이 있다. 더욱이 약 20분 내외로 분리가 가능하여, 기존 2~4 시간 동안 수행하는 초원심분리 공정 대비 단시간 내로 분리가 가능하다는 이점이 있다.

종래, 단백질과 엑소좀의 분리를 위해 초원심분리 공정이 수행되는데, 이둘 간의 밀도 차이가 거의 없어 그 분리가 용이하지 않다. 이에 본 발명의 수용액 이상계 상분리 조성물은 임계 입경 크기에 따른 분리가 가능하여, 상기 단백질(<10 nm)과 엑소좀(50 nm ~ 500 nm)의 크기 차이에 따른 분리가 가능하여 고순도로 단백질과 엑소좀의 분리가 가능하다는 이점이 있다.

이렇게 고수율로 분리된 바이오 나노 입자는 고순도로 회수됨으로써, 각종 질병 진단을 비롯한 각종 바이오 또는 의료 분야에 별도의 처리없이 그대로 사용 가능하여, 바이오 마커로서의 역할을 효과적으로 수행할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물의 분리 메카니즘을 설명하기 위한 모식도이다.
도 2는 제1수용액상 및 제2수용액상의 에너지 배리어를 보여주는 모식도이다.
도 3은 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 시뮬레이션 결과이다.
도 4는 도 3은 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 모식도이다.
도 5는 제1수용액상과 제2수용액상의 계면장력과 입자의 크기에 따른 에너지 장벽를 보여주는 모식도이다.
도 6은 제1수용액상과 제2수용액상에 의한 계면장력에 따른 임계 입경의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 제시하는 바이오 나노 입자의 분리 방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 8은 입자 크기에 따른 계면에서의 탈출 속도 변화를 보여주는 그래프이다.
도 9는 온도 변화에 따른 임계 입경의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 실시예에서 제2수용액상에 제1수용액상을 형성 후 형광 비드의 이동을 보여주는 사진이다.
도 11은 시간에 따른 형광 비드의 이동 정도를 보여주는 이미지이고, 이의 하단에는 A, B, 및 C의 제1수용액상(DEX)과 제2수용액상(PEG)의 계면장력을 보여준다.
도 12는 온도에 따른 세포밖 소포체/단백질의 분리능을 보여주는 그래프로, (a)는 세포밖 소포체의 회수 효율, (b)는 단백질 제거율을 보여준다.
도 13은 시간에 따른 세포밖 소포체/단백질의 분리능을 보여주는 그래프로, (a)는 세포밖 소포체의 회수 효율, (b)는 단백질 제거율을 보여준다.
도 14a는 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 방법에 따른 세포밖 소포체의 회수 효율과 관련된 RNA양 또는 입자개수(NTA) 변화를 보여주는 그래프이고, 도 14b는 순도를 보여주는 그래프이다.
도 15a는 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 방법에 따른 단백질 제거율을 보여주는 그래프이고, 도 15b는 단백질 1 ug당 세포밖 소포체의 개수를 CD63 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 회수된 세포밖 소포체를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지로, (a)는 실시예 1에서 회수된 세포밖 소포체, (b)는 비교예 1에서 회수된 세포밖 소포체이다.
도 17은 회수된 세포밖 소포체를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지로, (a)는 실시예 1에서 회수된 세포밖 소포체, (b)는 비교예 3에서 회수된 세포밖 소포체이다.

본 발명은 불순물과 바이오 나노 입자를 포함하는 생물학적 시료로부터 상기 불순물과 바이오 나노 입자를 분리하는 방법을 제시한다.

본 명세서에서 언급하는 생물학적 시료란 생물로부터 유래한 물질로서, 동물, 식물, 미생물, 바이러스, 및 균류를 포함하여, 이 외에도 생물로 정의되는 모든 물질을 포함하는 의미로 해석될 수 있다. 바람직하기로, 생체내 또는 시험관내에서 얻어진 생물학적 조직 또는 유체 기원의 시료를 포함한, 생물학적 대상으로부터 얻어진 시료를 지칭한다. 그러한 시료는 사람을 포함한 포유류로부터 분리된 조직, 분획, 유체, 및 세포일 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 생물학적 시료는 질병을 진단하기 위해 시료(sample)가 될 수 있는 물질로서, 물에 용해될 수 있는 세포 배양액, 혈액, 혈장, 혈청, 복강액, 정액, 양수, 모유, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 눈물, 콧물 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종이 가능하다. 이러한 생물학적 시료는 단백질을 포함한다.

상기 생물학적 시료의 크기는 1 내지 500nm, 바람직하기로 3 내지 450nm, 좀더 바람직하기로 5 내지 400nm, 더욱 바람직하기로 5 내지 350nm, 더더욱 바람직하기로 10 내지 250nm, 가장 바람직하기로 30 내지 180nm의 범위를 갖는다.

본 명세서에서 언급하는 바이오 나노 입자는 상기 생물학적 시료에 포함된, 세포들, 세포소기관들, 미생물들, 내독소 및 응집체들과 같은 미생물들의 하부구조들과 같은 세포 하부기관 또는 세포밖 소포체일 수 있다.

바람직하기로, 상기 세포밖 소포체(extracellular vesicle, EV)"는 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 세포외 소낭을 의미하는 것으로서, 세포밖 소포체는 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 막 단백질, 유전 물질 및 세포질 성분을 가지고 있어 세포의 성질과 상태를 간접적으로 파악할 수 있게 해준다. 또한, 세포밖 소포체는 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs, 단백질(성장 호르몬, 사이토카인 등) 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포외 전달체로 작용한다.

구체적으로, 상기 세포밖 소포체는 엑소좀(exosome), 엑토솜(ectosome), 외부소포(exovesicle) 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle), 세포자멸체(apoptotic body), 막 입자, 막 소포, 엑소좀 유사 소포, 및 엑토솜 유사 소포로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종이다.

또한, 바이오 나노 입자는 세포밖 소포체 이외에 바이오 분자 또는 이종 바이오 분자일 수 있다.

상기 바이오 분자로는 지질, 효소, 효소 기질, 억제제, 리간드, 수용체, 항원, 항체, 합텐, 알부민, 인슐린, 콜라겐, 프로테인A, 프로테인G, 아비딘, 바이오틴, 스트렙타비딘, 펩타이드, 폴리펩타이드, 변형 펩타이드, 핵산, 렉틴(Lectin), 탄수화물, 아미노산, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), RNA, DNA, 박테리아, 바이러스 등을 포함한다.

또한 이종 바이오 분자는 바이오 분자, 항체-항원, 프로테인A-항체, 프로테인G-항체, 핵산-핵산 하이브리드, 앱타머-바이오분자, 아비딘-비오틴(Avidin-biotin), 스트렙타비딘-비오틴(Streptavidin-biotin), 렉틴-탄수화물(Lectins-carbohydrate), 렉틴-글리코실단백질(Lectin-glycoprotein)을 포함한다.

보다 바람직하기로, 상기 세포밖 소포체를 포함하는 바이오 나노 입자는 20 내지 500 nm, 구체적으로 25 내지 400nm, 바람직하기로 30 내지 350nm, 더욱 바람직하기로 30 내지 200nm, 더더욱 바람직하기로 50 내지 200m, 가장 바람직하기로 50 내지 150nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 언급하는 불순물은 생물학적 시료 내 바이오 나노 입자를 제외한 모든 물질을 의미한다.

생물학적 시료로부터 불순물/ 바이오 나노 입자의 분리는 다양한 방법이 사용되고 있다. 그러나 분리 공정 중 바이오 나노 입자의 손상이 일어나거나 손실(loss)되어 이의 분리 공정에 대한 새로운 설계가 필요하다. 일례로, 바이오 나노 입자 중 하나인 엑소좀은 바이오 마커로서 사용 가능하다. 혈액 등의 생물학적 시료 내에는 엑소좀을 비롯한 단백질, 콜레스테롤(LDL, HDL) 등의 불순물이 함께 존재한다. 상기 엑소좀은 상기 불순물 대비 수십 내지 수백 nm 정도 큰 크기를 갖는다. 이에, 특정 범위의 크기만을 통과시킬 수 있는 필터를 사용할 경우 엑소좀과 불순물을 효과적으로 분리할 수 있다.

이에 본 발명에서는 상기 언급한 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 바이오 나노 입자를 손실 및 손상 없이 고순도로 분리한다.

수용액 이상계 상분리 조성물

본 발명에서 언급하는 수용액 이상계란, 밀도가 서로 다른 수용액이 액체-액체 상태로 상분리되어 존재하는 것을 의미한다.

이에, 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물이란 두 종류의 수용액이 상분리된 형태로 존재하고, 상기 상분리된 상태의 계면(즉, 경계면)에서 불순물 또는 바이오 나노 입자의 탈출을 통해 이들 간의 분리가 가능한 것을 의미한다.

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 분리 메카니즘

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 불순물/바이오 나노 입자의 분리에 관한 메카니즘은 하기와 같이 설명된다. 이때 상기 불순물 및 바이오 나노 입자는 나노 수준의 크기를 갖는 입자이므로, 하기에서는 나노 입자의 표현으로서 이들을 기재한다.

도 1은 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물의 분리 메카니즘을 설명하기 위한 모식도이다.

먼저, 분리하고자 하는 3종류의 나노 입자를 준비한다. 상기 3종류의 나노 입자는 설명을 위한 것으로, 분리를 위해 입자 크기가 다른 2종 이상 혼합된 모든 나노 입자가 가능하다.

다음으로, 수용액 이상계를 형성하기 위한 두 개의 수용액을 준비한다. 이때 분리가 필요한 대상(혼합 나노 입자, 즉, 생물학적 시료)은 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2) 중 어느 하나의 상에 포함된다. 도 1에서는 설명의 편의를 위해, 제1수용액상(P1)에 혼합하였다.

수용액 이상계의 형성은 두 개의 수용액이 존재하고, 이들 수용액은 접촉에 의해 도 1(a)에 나타낸 바와 같이 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)으로 상분리된다.

제1수용액상(P1)은 중력(gravitational force) 또는 부력(buoyancy)에 의해 제2수용액상(P2) 내에서 유동하는 상태로 존재한다. 제1수용액상(P1)이 제2수용액상(P2) 보다 높은 밀도를 가질 경우 중력 방향으로 이동하되, 부력에 의해 바닥으로 가라앉지 않고 제2수용액상(P2)에 부유하는 상태로 존재한다.

특히, 상기 제1수용액상(P1)은 미세한 입자나 액적 상태로 존재하거나 상층부/하층부와 같이 상하층이 분리된 상태가 아니라, 벌크(bulk) 형태로 부유하여 존재한다. 종래 수용액 이상계를 이용한 입자 분리는 교반(vortexing) 등의 공정을 수행하여 제1수용액 상이 미세한 입자 상태로 쪼개어지며 나노 입자의 분리가 일어나는데 비해, 본 발명은 벌크 형태 내에서 나노 입자의 분리가 수행된다. 또한 종래의 수용액 이상계는 교반(vortexing) 과정에 주어지는 외력에 의해 수용액 경계면의 에너지 장벽(energy barrier)이 달라지게 되며 이러한 외력에 의해 입자가 경계면을 자유롭게 통과할 수 있기 때문에 상경계면에 의한 입자의 필터링 효과보다 입자 표면과 각 수용액상 사이의 친화력(affinity)에 의한 분리효과가 더 두드러지게 나타난다.

도 1(b)를 보면, 벌크 상태의 제1수용액상(P1)에 존재하는 혼합 나노 입자들은 수용액 상 내에서 불규칙하게 운동하는 브라운 운동(Brownian motion)이 활발하게 일어나고, 이 운동에 의해 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 이루는 경계면과 접촉한다.

이때 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 접촉하여 경계면에 트랩(trap)되는데, 이 트랩된 나노 입자의 확산 계수(diffusion coefficient)에 의해 제2수용액상(P2) 또는 제1수용액상(P1)으로 이동하거나 경계면에 잔류한다. 그 결과, 도 1(c)에 나타낸 바와 같이, 제1수용액상(P1)의 혼합 나노 입자들 중 일부가 상기 기공을 통해 제2수용액상(P2)으로 이동한다. 그 결과, 일정 시간 경과 후 혼합 나노 입자들 중 일부는 제2수용액상(P2)에, 나머지는 제1수용액상(P1) 또는 경계면에 잔류하고, 상기 제2수용액상(P2)을 경계면을 포함하여 분리하여 이에 존재하는 나노 입자의 회수를 통해 나노 입자의 분리를 수행할 수 있다.

특히, 제1수용액상(P1)이 제2수용액상(P2)에 주입된 후 중력에 의해 하부측으로 이동하는 과정에서 상기 제1수용액상(P1)이 새로운 제2수용액상(P2)과 계속적으로 만나 계면을 형성하기 때문에, 상기 두 상(P1, P2)의 경계면에서 나노 입자의 이동이 연속적으로 일어나면서 가속화될 수 있다. 상분리 형태 중 하나인 상층부/하층부로 상분리된 형태에서는 지속적인 새로운 경계면의 형성이 불가능하여, 나노 입자의 연속적인 이동이 일어날 수 없다. 또한, 미세한 액적 상태로 상분리된 형태에서는 교반 등에 의해 새로운 경계면이 형성될 수 있으나, 상기 교반 과정에서 주어지는 외력에 의해 경계면에서의 에너지 장벽이 달라져, 이 외력에 의해 입자가 경계면을 자유롭게 통과할 수 있어, 교반 과정에서 경계면을 통한 많은 입자의 손실이 발생하게 되어 적합하지 않다. 이 방법은 경계면에서의 필터링 효과보다는 입자 표면과 각 수용액상(P1, P2) 사이의 친화력(affinity)에 의한 분리 효과가 두드러지게 나타나, 본 발명과는 다른 메커니즘으로 분리가 일어난다.

본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물을 통한 바이오 나노 입자의 분리는 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)을 형성하는 수용액의 경계면에서의 장력에 의해 영향을 받는다.

계면장력(Interfacial tension)은 서로 다른 2종 이상의 물체가 혼합하지 않고 층을 이루고 접할 때, 이 경계면에 발생하는 장력을 의미한다. 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)은 서로 다른 용질을 포함하여 밀도에 차이가 있고, 서로 다른 용질의 크기차, 물성차로 인해 계면을 경계로 장력이 형성된다. 이러한 장력에 의해 표면에 입자가 넘어야 하는 에너지 장벽이 형성되며 이 에너지 장벽은 마치 기공과 같은 역할을 한다, 장력의 크기가 크면 에너지 장벽의 높이가 높아져 기공이 작아지는 경향이 있어, 상기 힘에 의해 계면에서의 기공의 크기, 즉 임계 직경(threshold diameter, 또는 한계 직경)을 갖는 기공이 형성된다. 이렇게 형성된 기공을 통해 혼합 나노 입자의 일부가 제1수용액상(P1)으로 이동한다.

임계 직경은 통상 nm 수준으로, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면장력이 어느 정도 범위를 가져야만 상기 nm 수준을 유지할 수 있다. 즉, 계면장력이 작다는 것은 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 서로 혼합(miscible)될 수 있다는 것을 의미하여 입자 분리가 일어날 수 없고, 반대로 계면장력이 클 경우 상분리를 일어나나 임계 직경이 매우 작아 바이오 나노 입자의 분리를 수행할 수 없게 된다. 이 계면장력과 임계 직경과의 관계는 수용액 이상계 시스템 연구 분야에서 아직까지 제시한 바가 없는 새로운 개념이다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)에 의해 설정되는 계면장력의 수치는 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 조성에 의해 설계될 수 있으며, 이러한 조성의 설계는 분리하고자 하는 생물학적 시료 내 불순물 및/또는 바이오 나노 입자가 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 접촉에 의해 형성되는 경계면에서의 에너지 배리어를 넘어 확산이 가능한지에 따라 달라진다.

도 2는 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)의 에너지 배리어를 보여주는 모식도이다.

도 2를 참조하면, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)은 서로 다른 용질을 포함하는 수용액으로, 각각 다른 높이를 갖는 에너지 배리어가 존재한다. 상기 제1수용액상(P1)에 존재하는 혼합 나노 입자는 입자 분리를 위해 경계면과 제2수용액상(P1) 사이의 에너지 배리어를 뛰어넘어 제2수용액상(P2)으로 탈출한다. 이때 도 1의 장치를 이용할 경우 제2수용액상(P2)으로 탈출한 일부 나노 입자는 다시 제1수용액상(P1)으로 넘어가지 못한다. 상기 계면에서의 에너지 배리어의 통과, 즉 제1수용액상(P1)에서의 탈출 에너지는 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면에서의 계면에서의 장력에 의해 영향을 받는다.

경계면의 표면 장력의 경우 높아질수록 경계면에 있는 입자가 다른 상으로 탈출하기 위해 넘어야 하는 에너지 장벽의 높이가 높아져서 경계면을 탈출할 수 있는 입자의 임계 크기를 감소시킨다. 이는 사용하는 제1 및 제2수용액의 상을 어떻게 선택하느냐에 따라 경계면의 계면장력을 변수로 활용할 수 있음을 의미한다.

또한, 경계면에서 제1수용액상(P1)에서 제2수용액상(P2)으로의 나노 입자의 이동 및 탈출은 픽스 확산 법칙(Fick's laws of diffusion)을 통해 설명된다. 상기 픽스 확산 법칙은 열역학에서 확산 과정을 나타내는 두 개의 법칙으로, 제1법칙과 제2법칙이 있으며, 본 발명에서는 연속적인 확산과 관련된 제2법칙(Fick's second law)으로 설명될 수 있다.

Fick's second law와 경계면에 트랩된 입자의 탈출 비율(escaping rate)을 이용하여 입자의 이동을 예측했다. 경계면에 트랩된 입자가 탈출하는 비율은 식 (1)을 만족한다.

------------------ 식 (1)

(상기 식(1)에서, Γ: 경계면에서 탈출하는 입자의 비율, J: 입자의 flux, n 은 경계면에 있는 입자의 농도, α: 비례 상수, ΔΕ: 경계면에 있는 입자와 경계면에서 탈출한 입자의 에너지 차이, κ: 볼츠만 상수, T: 온도이다.)

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 경계면에 있는 입자의 에너지 장벽(ΔΕ)는 하기 식(2)로 표현할 수 있다.

-식 (2)

(상기 식(2)에서, γ_Phase/Phase2: 제1수용액상과 제2수용액상의 경계면에서 작용하는 장력, R: 입자의 반경, γ_{particle/Phase1}: 제1수용액상 안에 있는 입자의 표면에 작용하는 장력, γ_{particle/Phase2}: 제2수용액상 안에 있는 입자의 표면에 작용하는 장력, κ: 볼츠만 상수, T: 절대 온도, K: 분리 계수이다)

상기 식에서, ΔΕ는 경계면에 있는 입자가 경계면을 벗어나기 위해 넘어야 하는 에너지 장벽(Energy barrier)을 의미하며, 그 값이 클수록 입자의 탈출 비율은 낮아짐을 의미한다.

또한, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 경계면 근처에서의 입자의 유동은 하기 식을 만족한다.

----------------- 식 (3)

--------------식 (4)

(상기 식(3), (4)에서, J_{Phase1-interface}: 제1수용액상과 경계면 사이의 입자의 유동, J_{Interface-Phase2}: 제2수용액상과 경계면 사이의 입자의 유동, C_Phase1: 경계면 근처 제1수용액상에 있는 입자의 농도, C_Phase2: 경계면 근처 제2수용액상에 있는 입자의 농도, C_Interface: 경계면에 있는 입자의 농도, κ1, κ2: 비례 상수 Γ_Phase1: 경계면에서 제1수용액상으로 탈출하는 입자의 비율, Γ_Phase2: 경계면에서 제2수용액상으로 탈출하는 입자의 비율이다)

상기 식을 보면, 제2수용액상(P2)과 경계면 사이 입자의 유동은 제2수용액상(P2)에서 경계면으로 이동하는 입자의 유동과 경계면에서 제2수용액상(P2)으로 탈출하는 입자의 유동의 합이다. 마찬가지로 제1수용액상(P1)과 경계면 사이 입자의 유동은 제1수용액상(P1)에서 경계면으로 이동하는 입자의 유동과 경계면에서 제1수용액상(P1)으로 탈출하는 입자의 유동의 합이다.

상기 식 (1, 2, 3, 4)를 Fick's second law에 적용하여 시뮬레이션을 수행하였다.

입자는 10nm, 50nm 및 100nm의 3가지 종류의 혼합 비드 입자를 적용하여 제2수용액상(P2)으로 탈출한 비드 입자의 양을 측정하여 지배 방정식과 경계 조건의 계수를 결정했다. 제1수용액상(P1)으로는 덱스트란 수용액(1% 농도)을 사용하였고, 제2수용액상(P2)으로는 폴리에틸렌글리콜(3% 농도)를 사용하였다. 또한, 상기 식에서 제1수용액상(P1)은 새로운 제2수용액상과(P2) 연속해서 접하기 때문에 경계면 근처 제2수용액상(P2)에 있는 입자의 농도는 0에 가깝다고 가정했다. (

). 이에, 제2수용액상(P2)으로 탈출한 비드 입자의 양을 측정하여 지배 방정식과 경계 조건의 계수를 결정했다. 결정된 계수를 바탕으로 입자의 크기, 여과 시간, 분리 계수(partition coefficient), 온도, 경계면의 표면 장력에 따른 입자의 분리를 시뮬레이션 했다.

도 3은 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 시뮬레이션 결과이다.

도 3(a) 및 도 3(b)를 보면, 시간에 따라 경계면을 통과하는 비드 입자의 임계 크기가 점점 증가했으며 이를 바탕으로 크기가 작은 비드 입자부터 제2수용액상(P2)으로 탈출한다는 것을 알 수 있다.

구체적으로, 도 3(a)를 보면, 시간에 따른 경계면을 통과할 수 있는 비드 입자의 임계 크기의 증가는 200초 내에 급격하게 일어나며 그 뒤에는 일정 크기로 수렴한다. 또한, 도 3(b)를 보면, 10nm 크기의 나노 입자의 경우 60분 경과 후 모두 통과되었음을 알 수 있고, 50nm 및 100nm는 계면에 잔류함을 알 수 있다. 이는 수용액 이상계 상분리 조성물이 특정 크기 이하의 입자만 통과시키는 필터의 역할을 한다는 것을 의미한다.

특히, 10nm입자의 경우 60분 이후 완전히 탈출함을 알 수 있어, 혼합 나노 입자로부터 나노 입자의 손실없이 고순도, 즉 100% 또는 이에 가까운 수율로 나노 입자를 분리할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 실제 불순물과 바이오 나노 입자를 포함하는 생물학적 시료를 분리 공정에 적용할 경우 종래 분리막 등의 분리 공정에서 발생하는 바이오 나노 입자의 손실과 같은 문제를 원천적으로 차단하여, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용해 생물학적 시료로부터 바이오 나노 입자를 고순도로 분리할 수 있다는 이점을 확보할 수 있음을 알 수 있다.

이는 도 4의 모식도를 통해 보다 자세하게 알 수 있다.

도 4는 도 3은 입자 크기가 다른 3종류의 비드 입자를 사용하여 입자 크기에 따른 이동을 보여주는 모식도이다.

도 4에서 나타낸 바와 같이, 입자는 제1수용액상(P1)으로부터 제2수용액상(P2)이 접촉하여 형성하는 계면으로 이동한다. 경계면과 접촉한 입자의 일부는 경계면에 트랩되며, 이때 입자의 크기에 따라 제1수용액상(P1)으로부터 제2수용액상(P2)으로 탈출한다.

도 4는 3가지 형태의 계면을 도시하였고, Interface A인 경우는 가장 작은 크기의 입자만 통과하고, Interface B는 중간 크기의 입자까지, Interface C의 경우에는 모두 통과가 가능하다. 이를 통해 입자 크기에 따라 선택적으로 혼합 나노 입자에서 나노 입자를 분리할 수 있다.

좀더 설명하면, 3개의 입자 중 가장 작은 크기의 입자를 분리하고자 할 경우 Interface A와 같이 설계하여 제2수용액상(P2)으로 작은 크기의 입자를 통과시킨 후, 이를 회수하여 분리가 가능하다. 또한, 가장 큰 크기의 입자를 분리하고자 할 경우 Interface B와 같이 설계하여, 제1수용액상(P1)에 잔류하는 큰 크기의 입자를 회수하여 분리가 가능하다. 또한, 중간 크기의 입자의 경우, Interface B와 같이 설계한 후, 제2수용액상(P2)을 회수하고, 이를 다시 Interface α(미도시)를 갖도록 설계한 후, 제2수용액상(P2) 내 작은 크기의 입자와 중간 크기의 입자를 다시 한번 더 분리하는 공정을 거쳐 중간 크기의 입자만을 선택적으로 회수할 수 있다.

이 Interface A, Interface B, Interface C에서 나노 입자의 통과 여부는 상기에서 언급한 바와 같이, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)을 이루는 각 조성에 따른 에너지 장벽과, 이들이 접촉하여 형성하는 계면에서의 장력(즉, 계면장력)에 따라 달라진다. 상기 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 갖는 에너지 장벽이 낮으면, 이들이 접촉하여 이루는 계면장력이 낮아지고, 상기 계면장력이 낮아질수록 계면을 통과하는 입자의 크기(즉, 임계 입경)가 증가할 수 있다.

도 5는 계면장력과 입자 크기에 따른 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 사이의 에너지 장벽을 보여주는 모식도이다.

도 5에서 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 이루는 계면장력이 클수록 에너지 장벽이 높아진다. 이때 10nm, 50nm, 및 100nm 각각의 나노 입자가 넘어야 하는 에너지 장벽에 차이가 있으며, 10nm에서 가장 낮은 에너지 장벽을 갖는다. 즉, 입자의 크기가 작을수록 경계면에서 다른 상으로 탈출할 때 넘어야 하는 에너지 장벽이 더 낮아지는데 입자가 특정 크기 이상이 되면 에너지 장벽이 너무 높아 입자가 넘지 못하게 된다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 접하여 계면을 형성할 경우 에너지 장벽이 낮은 10nm 크기의 나노 입자부터 제2수용액상(P2)으로의 탈출이 먼저 일어난다. 이에 100nm 크기의 나노 입자 통과를 위해선 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면장력을 낮춰야만 이와 비례적으로 에너지 장벽이 낮아져 제2수용액상(P2)으로의 탈출이 일어날 수 있음을 알 수 있다.

이러한 결과는 계면장력에 따라 나노 입자가 경계면을 통과할 수 있는 임계 입경이 주도적으로(dominant) 결정될 수 있음을 의미한다. 다시 말하면, 계면장력이 낮다는 것은 그 만큼 통과하는 나노 입자의 크기가 커질 수 있다는 것을 의미한다.

도 6은 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)에 의한 계면장력에 따른 임계 입경(D_T)의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 6을 참조하면, 계면장력에 따라 경계면을 통과하여 탈출하는 임계 입경이 달라짐을 알 수 있다.

구체적으로, 계면장력이 높을수록 계면을 탈출할 수 있는 임계 입경이 최종적으로 작아지는 경향을 나타냄을 알 수 있다. 그리고, 특정 시간에 도달하기 전까지 시간에 따라 임계 입경이 바뀌지만 최종적으로 도달하는 임계 입경은 동일하다는 것을 알 수 있다. 또한 시간에 따라 임계 입경이 증가하는 것을 알 수 있는데 이를 해석함으로써 원하는 크기를 제거하는데 걸리는 시간을 알 수 있다. 일례로, 계면장력이 5X10^-6 μJ/m²으로 설계된 수용액 이상계 상분리 조성물의 경우 임계 입경이 40nm인 나노 입자를 30분 이내에 분리할 수 있음을 알 수 있다.

이러한 결과를 통해, 본 발명에서는 불순물과 바이오 나노 입자를 포함하는 생물학적 시료로부터, 상기 바이오 나노 입자를 분리하기 위해, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)은 하기 수학식 1을 만족하는 계면장력(γ) 범위를 가져야 한다.

[수학식 1]

2 X 10^-7 μJ/m² ≤ γ ≤ 50 X 10^-5 μJ/m²

본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 통해 구현 가능한 기공의 크기는 1 내지 500nm, 바람직하기로 3 내지 450nm, 좀더 바람직하기로 5 내지 400nm, 더욱 바람직하기로 5 내지 350nm, 더더욱 바람직하기로 10 내지 250nm, 가장 바람직하기로 30 내지 180nm의 범위를 갖는다.

상기한 기공을 갖기 위해, 수용액 이상계 상분리 조성물은 경계면에서 이루는 계면장력이 2 X 10^-7 μJ/m² 내지 50 X 10^-5 μJ/m², 바람직하기로 2 X 10^-7 μJ/m² 내지 40 X 10^-6 μJ/m², 좀더 바람직하기로 3 X 10^-6 μJ/m² 내지 350 X 10^-6 μJ/m², 더욱 바람직하기로 4 X 10^-6 μJ/m² 내지 270 X 10^-6 μJ/m², 더더욱 바람직하기로 5 X 10^-6 μJ/m² 내지 150 X 10^-6 μJ/m², 가장 바람직하기로 10 X 10^-6 μJ/m² 내지 60 X 10^-6 μJ/m²의 범위를 갖는다.

이때 계면장력이 상기 수학식 1에서 제시한 범위가 아니라 그 수치가 감소하여 어느 정도 한계를 벗어나게 되면, 상분리가 발생하지 않고 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 혼합이 일어나 수용액 이상계 상분리 조성물이 구성되지 않고, 반대로 상기 계면장력이 어느 수치 이상일 경우에는 불순물 또는 바이오 나노 입자의 탈출이 발생하지 않게 됨을 알 수 있다. 이는 본 발명에서 제시하는 수학식 1의 계면장력 수치 범위를 가져야만 안정한 수용액 이상계 상분리 조성물의 구성이 가능하여 불순물 또는 바이오 나노 입자의 탈출을 통한 분리가 가능해짐을 입증할 수 있는 데이터이다.

또한, 분리 시간을 살펴보면, 불순물 또는 바이오 나노 입자의 크기가 작을수록 계면을 탈출하는 속도가 빨라짐을 알 수 있다.

이 도 6에서 나타내는 계면장력에 따른 임계 입경의 변화에 따라, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 조성물을 특정 계면장력을 갖도록 설계할 경우 바이오 나노 입자를 고순도로 쉽게 분리할 수 있음을 예측할 수 있다.

바람직하기로, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물은 조성물의 설계를 통해 계면장력을 조절하고, 상기 계면장력의 조절에 의해 임계 입경을 제어할 수 있음에 따라 임계 입경이 1 내지 500nm, 3 내지 450nm, 좀더 바람직하기로 5 내지 400nm, 더욱 바람직하기로 5 내지 350nm, 더더욱 바람직하기로 10 내지 250nm, 가장 바람직하기로 30 내지 180nm 의 범위를 갖는 필터를 구현할 수 있다. 이때 상기 수용액 이상계 상분리 조성물은 분리능이 불순물과 바이오 나노 입자 간의 크기 차이가 10nm 정도까지 분리가 가능하다. 이때 분리능이 10nm라는 의미는 나노 입자가 10nm 및 20nm와 같이 10nm의 차이를 갖는 것까지도 분리 가능함을 의미하며, 10nm 및 100nm와 같이 90nm의 차이를 보이는 경우의 분리는 자명하게 수행될 수 있음을 의미한다.

한편, 도 6은 제1수용액상(P1)이 정지상(stationary phase)인 경우와 유동상(moving phase)인 경우를 나뉘어 도식화되었다. 시간이 무한대인 경우에 제1수용액상(P1)이 정지상 및 유동상 모두에서는 동일한 결과를 나타내었으나, 정해진 시간 내에서는 제1수용액상(P1)이 유동상을 가질 경우 나노 입자의 분리에 유리함을 알 수 있다. 통상적으로 나노 입자 분리가 무한대의 시간이 아닌 정해진 시간 내에서 이루어짐을 고려한다면, 제1수용액상(P1)이 유동상인 형태를 가지는 경우 실제 분리 공정에 적용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

수용액 이상계 상분리 조성물의 설계

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 계면에서의 장력은 제1수용액상과 제2수용액상의 조성 설계를 통해 이루어질 수 있다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 사이에 계면장력을 갖기 위해선 이들 간의 상분리가 선행되어야 한다. 상기 상분리는 다른 여러 가지 방법이 가능하나, 본 발명에서는 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 사이의 two phase diagram을 통해 이루어질 수 있다. 또한, 불순물과 바이오 나노 입자의 분리는 이들 표면이 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2) 중 어느 하나의 상에 친화력(affinity)에 있느냐에 의해 분리 속도 및 분리능이 향상될 수 있다. 이러한 내용을 고려하여 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)을 이루는 특정 조성을 two phase diagram을 통해 선택하여 수용액 이상계 상분리 조성물 구성할 수 있다.

제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)은 기본적으로 용질이 물에 용해된 수용액이다.

상기 용질의 종류에 따라 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)은 고분자 및/또는 염이 존재하는 고분자 수용액 또는 염 수용액일 수 있다.

용질로서의 고분자는 친수성 고분자일 수 있다.

사용 가능한 친수성 고분자로는 폴리아르기닌, 폴리라이신, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 키토산, 프로타민(protamin), 폴리비닐아세테이트, 히알루론산, 콘드로이친황산, 헤파린, 알지네이트, 하이드록시옥시프로필 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 전분, 폴리(비닐 메틸 에테르 에테르), 폴리비닐피롤리돈, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성 고분자일 수 있다.

또한, 용질로서의 고분자는 고분자 다당류일 수 있다. 상기 고분자 다당류는 사이클로덱스트린, 글루코오스, 덱스트란, 만노오스, 수크로오스, 트레할로오스, 말토오스, 피콜(ficoll), 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스-만니톨, 글루코오스-만니톨, 트레할로오스-폴리에틸렌글리콜, 수크로오스-폴리에틸렌글리콜, 수크로오스-덱스트란, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성 고분자일 수 있다.

염 수용액에 사용하는 염은 (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, MgSO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl, KCl, NaBr, NaI, LiCl, n-Bu₄NBr, n-Pr₄NBr, Et₄NBr, Mg(OH)₂, Ca(OH)₂, Na₂CO₃, ZnCO₃, Ca₃(PO₄)₂, ZnCl₂, (C₂H₃)₂Zn, ZnCO₃, CdCl₂, HgCl₂, CoCl₂, (CaNO₃)₂, BaCl₂, MgCl₂, PbCl₂, AlCl₃, FeCl₂, FeCl₃, NiCl₂, AgCl, AuCl₃, CuCl₂, 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate), 테트라데실황산나트륨(sodium tetradecyl sulfate), 브롬화도데실트리메틸암모늄(dodecyltrimethylammonium bromide), 염화도데실트리메틸암모늄(dodecyltrmethylammonium chloride), 브롬화 테트라데실트리메틸암모늄(tetradecyltrimethylammonium bromide), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성 고분자일 수 있다.

또한, 상기 용질로 고분자염이 사용될 수 있으며, 일례로 전술한 바의 고분자와 염의 조합이 될 수 있다.

전술한 바의 고분자 및 염 중에서 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)으로의 선택은 분리하고자 하는 나노 입자의 특성(예, 표면 특성), 및 상분리가 가능하도록 하는 특성 및 농도에 따라 달라질 수 있다.

그중, 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)으로 사용 가능한 각각의 조합은 고분자인 경우 친수성-소수성의 특성일 수 있다. 상기 고분자는 기본적으로 수용액에 용해되므로 친수성을 나타내나, 두 가지 조성을 조합할 경우 상대적으로 친수성을 갖거나 상대적으로 소수성을 가질 수 있다. 일례로, 덱스트란과 폴리에틸렌글리콜의 경우, 덱스트란은 상대적으로 친수성을 가지며, 분자 구조가 보다 조밀하고(more denser), 폴리에틸렌글리콜은 상대적으로 소수성을 가지며, 분자 구조가 덜 조밀한(less dense) 특성이 있다. 이에 덱스트란/폴리에틸렌글리콜은 각각 제1수용액상/제2수용액상(P1/P2)으로 사용할 수 있다.

또한, 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)으로 사용 가능한 각각의 조합은 고분자의 경우 분자량 및 농도는 중요한 선정 이유가 될 수 있다.

고분자는 분자량이 커질수록, 농도가 높아질 수록 제1 수용액과 제 2수용액상이 안정적으로 형성되며 고분자의 분자량이 너무 작을 경우 제1 수용액과 제 2수용액이 쉽게 섞여버리게 된다.

고분자의 분자량은 최소 수용액 내 용해(또는 팽윤)된 상태로 존재하야야 하며, 이는 고분자의 종류에 따라 물에 대한 용해도의 차이가 있으므로, 그 범위의 한정이 용이하지 않다. 다만, 전술한 바의 친수성 고분자의 경우 중량평균분자량이 200 내지 2,000,000, 바람직하기로 500 내지 1,000,000, 더욱 바람직하기로 1000 내지 500,000을 갖는다. 일례로, 덱스트란과 조합하는 폴리에틸렌글리콜의 경우 200 내지 60000, 바람직하기로 500 내지 40000 범위의 중량평균분자량을 갖는 것을 사용한다. 또한, 덱스트란은 15 내지 1000,000, 바람직하기로 1000 내지 500,000 범위의 중량평균분자량을 갖는다.

이때 고분자 또는 고분자염 수용액의 농도는 물에 대한 용해도의 차이가 있으나 0.001 내지 20 중량%, 바람직하기로 0.01 내지 15 중량%일 수 있다. 만약 그 농도가 너무 낮을 경우 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)의 고분자 수용액이 물과 비슷한 유동성을 나타내 이 둘이 서로 혼합(miscible)되어 수용액 이상계의 형성이 어렵다. 반대로, 너무 높을 경우 고분자의 용해에 시간이 걸리고 수용액 이상계의 계면에서의 장력이 너무 높아 임계 입경이 작아져 나노 입자의 분리가 어려워지는 문제가 있다.

고분자 대신 염을 사용할 경우 수용액 이상계를 이루기 위해 고농도의 염이 필요하다. 앞서 설명한 바와 같이 고분자의 분자량이 커질수록 제1 수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)이 안정적으로 형성되는데 염의 경우 분자량이 고분자보다 작기 때문에 고농도에서만 수용액 이상계를 형성시킬 수 있다. 바람직하기로 고농도염은 1 내지 70 중량%, 더욱 바람직하기로 5 내지 50 %로 사용하는 것이 바람직하다.

이미 제1 수용액상과 제2 수용액 상을 이룰 수 있는 시스템에 저농도의 염을 추가할 경우 염이 수용액 내에서 이온 상태로 해리되어 나노 입자의 이동 속도를 변화시키는 역할을 한다. 이때 염은 평균 분자량이 10 내지 1000 중량부이 바람직 하다.

구체적으로, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물에서 제1수용액상/제2수용액상(P1/P2)의 조합은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 고분자-고분자, 및 고분자-고농도염의 조합으로 사용될 수 있다.

	제1수용액상(P1, 분산상)	제2수용액상(P2, 연속상)
고분자-고분자 조합	5% 덱스트란	5%폴리에틸렌글리콜(MW= 100,000)
	2% 덱스트란	5% 폴리비닐피롤리돈(MW=5000)
	2% 덱스트란	2% 폴리비닐알코올(MW=130000)
	5% 덱스트란	5% 피콜(MW=400)
	3% 리비닐메틸에테르에테르(MW=5000)	5% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
고분자-고농도 염 조합	10% (NH₄)₂SO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% Na₂SO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% MgSO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% K₂HPO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% KH₂PO₄	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)
	10% Na₂CO₃	20% 폴리에틸렌글리콜(MW=35000)

상기 표 1에 제시한 조합은 일 예이며, 이외에 전술한 바의 조성을 이용한 다양한 조합이 수학식 1에서 제시한 계면장력을 만족하는 범위면 그 어느 조합이라도 사용될 수 있다.

수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 바이오 나노 입자의 분리 방법

전술한 바의 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여, 본 발명에서는 불순물과 바이오 나노 입자를 포함하는 생물학적 시료로부터 불순물과 바이오 나노 입자를 분리한다.

생물학적 시료를 포함하는 제1수용액, 및 제2수용액을 혼합하여 상기 제1수용액이 제2수용액 내에 상분리된 수용액 이상계 상분리 조성물을 제조하고, 상기 불순물을 포함하는 생물학적 시료로부터 바이오 나노 입자를 분리한다.

도 7은 본 발명에서 제시하는 바이오 나노 입자의 분리 방법을 설명하기 위한 순서도이다.

도 7을 참조하면, 먼저, 바이오 나노 입자를 포함하는 생물학적 시료를 준비한다(S1).

다음으로, 수용액 이상계 상분리 조성물을 설계하기 위한 제1수용액과 제2수용액을 선정한다(S2).

제1수용액은 제1수용액상을 형성하고, 제2수용액은 제2수용액상을 형성한다. 이들 각 조성의 선정은 상기 언급한 바의 조성으로부터 선정하되, 상기 제1수용액과 제2수용액이 상분리되는 계면에서의 장력(γ)이 하기 수학식 1을 만족하도록 설계한다.

[수학식 1]

2 X 10^-7 μJ/m² ≤ γ ≤ 500 X 10^-5 μJ/m²

다음으로, 제1수용액과 생물학적 시료를 혼합한다(S3).

생물학적 시료는 상기 언급한 바에서 선정될 수 있다. 이때 제1수용액 1ml에 대해 생물학적 시료는 0.0001 내지 0.1g으로 사용한다. 그러나 이러한 함량은 생물학적 시료의 조성에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절히 선정될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 필요한 경우, 혼합 전에 공지된 바의 전처리를 수행하는 것이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 특별한 전처리 없이 수행하였다.

다음으로, 생물학적 시료를 포함하는 제1수용액과 제2수용액을 혼합하여 제1수용액상/제2수용액상으로 상분리된 수용액 이상계 상분리 조성물을 구성한다(S4).

수용액 이상계 상분리 조성물을 구성하기 위한 제1수용액과 제2수용액의 각각의 함량은 제1수용액 1ml에 대하여 제2수용액 0.5 내지 2ml 범위로 혼합한다. 제1수용액과 제2수용액의 혼합비는 상분리가 안정하게 일어날 수 있도록 상기 범위 내에서 적절히 혼합한다.

다음으로, 상기 (S4)를 통해 제조된 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 분리 공정을 수행한다(S5).

상기 수용액 이상계 상분리 조성물에서 제1수용액상과 제2수용액상의 계면에 입자가 통과할 수 있는 나노 수준의 기공이 형성되며, 이를 통해 생물학적 시료 내 바이오 나노 입자 또는 불순물이 이동한다.

본 분리 공정은 도 11에 나타낸 바와 같이 두 가지 공정으로 수행할 수 있다.

(a) 바이오 나노 입자의 크기 > 불순물 크기

바이오 나노 입자가 불순물보다 큰 입경을 갖는 경우, 입자 크기가 상대적으로 작은 불순물은 계면을 통과하여 제2수용액상으로 이동하고, 제1수용액상에는 바이오 나노 입자만 잔류하게 된다. 이어, 상기 제1수용액상을 피펫 또는 스포이드 등의 장비를 이용하여 수용액 이상계로부터 분리하여 바이오 나노 입자를 회수할 수 있다.

일예로, 혈액 등의 생물학적 시료에는 세포밖 소포체(예, 엑소좀), 단백질, 콜레스테롤(LDL, HDL) 등이 존재한다. 상기 세포밖 소포체 중 하나인 엑소좀은 100nm 전후의 크기를 가지고, 나머지 단백질이나 콜레스테롤 등의 불순물은 50nm 이하의 크기를 갖는다. 이에, 본 발명에서 제시하는 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여 계면에서의 임계 입경을 50nm 이상을 갖도록 계면장력을 갖는 조성으로 설계할 경우, 엑소좀은 제1수용액상에 잔류하고, 나머지 불순물(단백질, 콜레스테롤 등)은 제2수용액상으로 이동하여, 순수 엑소좀만을 선택적으로 분리할 수 있다.

특히, 본 발명의 수용액 이상계 상분리 조성물은 입자 크기가 10nm의 차이를 갖는 입자에서도 분리가 가능하여, 고순도로 세포밖 소포체의 분리가 가능하다.

(b) 바이오 나노 입자의 크기 < 불순물 크기

바이오 나노 입자가 불순물보다 작은 입경을 갖는 경우, 입자 크기가 상대적으로 작은 바이오 나노 입자는 계면을 통과하여 제2수용액상으로 이동하고, 제1수용액상에는 불순물이 잔류하게 된다. 이어, 상기 제2수용액상을 피펫 또는 스포이드 등의 장비를 이용하여 수용액 이상계로부터 분리하여 바이오 나노 입자를 회수할 수 있다.

본 분리 공정은 바이오 나노 입자를 충분히 회수할 수 있도록 수행하며, 2시간 이내, 바람직하기로 1분~1시간, 더욱 바람직하기로 5분~30분, 가장 바람직하기로 10~25분 동안 수행한다. 이러한 시간은 종래 최소 2시간 이상이 소요되는 초원심분리 공정과 비교하여 시간을 대폭 감축시키는 이점이 있다.

특히, 기존에 엑소좀을 분리하는 가장 대표적인 방법은 초원심분리를 이용한 방법이다. 하지만 엑소좀은 수백 nm로 크기가 작고 단백질과 밀도 차이가 크지 않아서 혈장에서 높은 순도 및 효율로 엑소좀을 분리하기 힘들다. 또한 초원심분리기를 사용하게 되면 실제 세포가 받는 중력가속도가 10만g까지 이르게 되어 세포에 손상을 줄 가능성이 커, 본 발명에 따른 방법은 이러한 기존의 분리 방법의 문제를 해결할 수 있다.

이렇게 회수된 제1수용액상 또는 제2수용액상 내 존재하는 생물학적 시료는 그대로 연구하거나 임상 진단 또는 치료 등의 다양한 분야에 적용할 수 있다.

추가로, 상기 분리 공정시 분리능 및 분리 속도를 높이기 위해, 온도를 인가하거나 초음파를 인가할 수 있다.

온도는 분리 속도와 관련된 파라미터로, 온도를 높일수록 바이오 나노 입자와 불순물의 분리 속도가 증가하는 효과를 가져온다.

도 8은 입자 크기에 따른 계면에서의 탈출 속도 변화를 보여주는 그래프이다. 도 8에서 Γ_P1: 경계면에서 제1수용액상으로 탈출하는 입자의 비율을, Γ_P2: 경계면에서 제2수용액상으로 탈출하는 입자의 비율을 의미한다.

도 8을 참조하면, 온도가 증가할수록 입자의 브라운 운동이 가속화되어 경계면에 있는 입자의 탈출 속도가 증가한다. 일례로, 생물학적 시료에서 불순물의 입자 크기가 바이오 나노 입자의 크기보다 작을 경우, 상기 불순물이 탈출하는 속도가 증가될 수 있음을 의미한다. 이러한 결과를 통해, 아주 정확한 사이즈로 단시간 내에 분리할 필요가 있을 경우 유용하게 사용할 수 있는 공정 조건의 변수로 온도를 이용할 수도 있음을 알 수 있다.

도 9는 온도 변화에 따른 임계 입경의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 9를 참조하면, 온도 증가에 따라 임계 입경이 선형적으로 증가하는 경향을 나타냄을 알 수 있다. 그러나, 임계 입경의 크기 차이가 10nm 이내로 나타나, 불순물과 바이오 나노 입자의 분리시 온도를 증가하더라도 분리 속도만을 증가시킬 뿐 필요 이상의 임계 입경을 증가시키지 않아 고순도로 불순물과 바이오 나노 입자를 분리시킬 수 있음을 알 수 있다.

또한, 제1수용액상(P1)이 정지상(stationary droplet) 및 유동상(moving droplet)인 경우 분리 속도만 달라질 분 임계 입경은 최종적으로 동일해 지는 것을 알 수 있다.

또한, 초음파 인가를 통해 외부로부터의 물리력이 경계면의 에너지 장벽을 낮춰서 임계 입경을 변화시키거나 입자의 확산을 도와줘서 불순물과 바이오 나노 입자의 분리 속도를 증가시킬 수 있다.

입자 크기가 다른 불순물과 바이오 나노 입자는 그 크기의 차이와 같은 역학적 물성의 차이가 발생한다. 상기 크기 외에 그 재질이나 조성이 다른 경우, 재질, 밀도 및 압축률 등의 역학적 물성은 크게 차이가 난다. 여기에 초음파가 혼합 나노 입자에 인가되면 입자 크기에 따라 서로 다른 음향 방사력(acoustic radiation force)을 가져 초음파의 음압마디 선(sound pressure node line)을 따라 나노 입자가 이동한다. 즉, 불순물과 바이오 나노 입자들이 혼재되어 있을 경우 이들을 분리할 수 있으며, 이들의 이동 속도를 높일 수 있다. 특히, 제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2)의 경계면에 트랩되어 있는 불순물과 바이오 나노 입자들 간의 분리 속도를 높일 수 있어 상기 트랩된 입자로 인한 분리 속도의 저하를 방지할 수 있다.

이러한 음향 방사력은 주파수의 제어에 의해 조절 가능하다. 바람직하기로, 본 발명에서는 0.01 내지 100 kHz의 200 W ~ 400 W의 강도에서 1분 ~ 240 분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 이때 인가하는 초음파의 강도가 너무 셀 경우 벌크 형태를 이루어져야 하는 제1수용액상(P1)에 영향을 줘, 상기 제1수용액상(P1)이 미세한 액적을 형성할 수 있으므로, 상기 범위 내에서 적절히 수행한다. 또한, 초음파 인가는 초음파 발생기를 통해 수행할 수 있다.

응용분야

전술한 바에 의해 분리된 바이오 나노 입자는 다양한 분야에 적용 가능하다.

일례로, 바이오 마커로서 생물학 및 의학에서 분석, 진단, 및 치료 용도 등의, 이들로 제한되지 않는 다양한 분야에서 용도를 찾을 수 있다.

특히, 환자로부터의 세포 또는 시료의 분석이 진단적으로 (예컨대, 상기 질병은 암, 패혈증, 동맥경화증 및 류마티스 관절염 등과 같이 특정 질병을 가진 환자, 특정 독소에 노출된 환자, 또는 특정 치료 또는 장기 이식에 잘 반응하는 환자를 식별하기 위해) 그리고 예측적으로 (예컨대, 특정 질병을 발현하기 쉬운 환자, 특정 치료에 잘 반응하는 환자, 또는 특정 장기 이식을 수용하는 환자를 식별하기 위해) 채용될 수 있다. 이러한 방법은 동일한 생물학적 시료로부터의 복수의 (예컨대, 잠재적으로 무한한 수의) 바이오 마커로서의 정확하고 신뢰할 수 있는 분석을 용이하게 할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.

실험예 1: 시뮬레이션 시험

상기한 계면장력과 에너지 장벽 및 임계 입경과 관련된 이론적 고찰과 더불어 시뮬레이션 결과를 통해, 본 발명에서 나노 입자의 분리가 실제 공정에서 적용이 가능한지 직접적인 실험을 수행하였다.

먼저, 혼합 나노 입자로서 30nm, 50nm 및 100nm의 3가지 종류의 형광 비드를 준비하였고, 제1수용액상(P1)으로는 덱스트란 수용액을 사용하였고, 제2수용액상(P2)으로는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하였다. 분리 계수 (K, partition coefficient)=100, 온도=20℃, 시간=300s, 경계 장력 = 0.013mJ/m ² 의 조건에서 수행하였다.

이때 제1수용액상(P1) 및 제2수용액상(P2)의 농도를 조절하여 하기와 같이 계면장력을 갖는 수용액 이상계 필터를 설계하였다.

구성	계면장력( X10^-6 μJ/m²)
A	5.36
B	3.57
C	1.65
D	30
E	55

총 9개의 관형의 시험관을 준비하고, 구성 A, B 및 C의 필터에 30nm, 50nm 및 100nm의 3가지 종류의 형광 비드를 각각 주입하여 형광 비드의 이동을 형광 현미경(fluorescence microscope)으로 확인하였다. 이때 D 및 E의 구성을 갖는 필터는 임계 입경이 30nm 이하로 나노 입자의 탈출이 없어 도 11에 나타내지 않았다.

측정을 위해 먼저, 관형의 시험관(내경 2 mm)에 제2수용액상(P2)을 이루는 폴리에틸렌글리콜 수용액 75 μL를 주입하였다. 제1수용액상의 덱스트란 수용액 3 μl에 형광 비드 5 ng을 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 얻어진 분산액 3 μl를 상기 제2수용액상(P2)이 담겨진 관형의 시험관 상부에 천천히 주입하였다. 도 10에서와 같이, 제1수용액상(P1)이 시험관의 하부 측으로 이송됨을 알 수 있다.

제1수용액상(P1)과 제2수용액상(P2) 혼합 즉시(T=0분), 30분 및 60분 경과 후 형광 비드의 이동을 형광분광기를 통해 측정하였고 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11은 시간에 따른 형광 비드의 이동 정도를 보여주는 이미지이고, 이의 하단에는 A, B, 및 C의 제1수용액상(DEX)과 제2수용액상(PEG)의 계면장력을 보여준다.

도 11의 A 조성인 경우를 보면, 계면장력이 5.36 X10^-6 μJ/m²인 경우 30nm, 50nm 및 100nm 각각의 나노 입자 중 30nm의 나노 입자만이 제2수용액상(P2)으로 이동하였음을 알 수 있다. 이와 유사하게, B 조성의 경우 계면장력이 3.57 X10^-6 μJ/m²)이고, 30nm 및 50nm의 나노 입자들이 제2수용액상(P2)으로 이동하고, 100nm인 나노 입자는 제1수용액상(P1)에 잔류함을 알 수 있다. 또한, C 조성의 경우 계면장력이 1.65 X10^-6 μJ/m²)이고, 30nm, 50nm 및 100nm 모두 제2수용액상(P2)으로 이동함을 알 수 있다. 이를 통해, 수학식 1에 나타낸 바와 같이, 계면장력이 최소 2 X10^-6 μJ/m² 이상이 되어야 함을 알 수 있다.

이러한 결과를 통해, 계면장력의 제어를 통해 나노 입자의 분리시 통과할 수 있는 임계 입경을 조절할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 2: 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 단백질/세포밖 소포체 분리

(1) 덱스트란/폴리에틸렌글리콜 수용액 이상계 상분리 조성물 제조

수용액 이상계를 만들기 위해 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란을 인산 완충 식염수(PBS, Phosphate buffered saline)에 녹여 각각 10.5 wt% 및 45 wt% 의 농도로 준비하였다. 이때 덱스트란 수용액/폴리에틸렌글리콜 수용액 간 계면장력은 5.36X10^-6 μJ/m²이었다. 상기 표면장력을 갖는 수용액 이상계 상분리 조성물은 세포밖 소포체와 단백질의 분리 계수 및 크기를 계산한 결과 임계 입경이 42nm(±5nm)로 계산되었으며, 이로 인해 입자 크기가 작은 단백질만 경계면을 탈출해서 제거되어 세포밖 소포체를 고순도로 회수할 수 있다.

구체적으로, 생물학적 시료로는 Pre-cleaning을 통해 혈장 내 Cell debris를 제거한 것을 사용하였고, 이때 시료 내 100 ㎍/㎖농도의 세포밖 소포체 및 2000 ㎍/㎖ 농도의 단백질을 포함한 것을 사용하였다.

(2) 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 세포밖 소포체의 분리

가로*세로의 시험관에 폴리에틸렌글리콜 수용액 5 ml을 첨가하였다. 이어, 생물학적 시료 500 ㎕를 덱스트란 수용액 0.5 ml과 혼합하여 1시간 동안 용해시킨 후, 얻어진 용액을 상기 시험관에 첨가하여 덱스트란/폴리에틸렌글리콜 상분리를 유도하였다.

이어, 세포밖 소포체를 추출한 후, 회수된 세포밖 소포체의 농도와 제거된 단백질의 농도를 측정하였다.

세포밖 소포체의 회수 효율을 비교하기 위해, 초기에 있던 전체 세포밖 소포체 또는 단백질의 양과 비교하여 분리된 양을 확인했다. 이를 위해 전체 양에 대하여 분리된 세포밖 소포체 또는 단백질 양의 백분율(%)을 회수 효율(recovery efficiency, E)이라고 정의했으며, 수용액 이상계의 회수 효율을 아래의 수학식 2에 따라 계산하였다. 이때 세포밖 소포체의 양은 RNA 양으로 측정하였고 단백질의 양은 브래드포드 어세이(bradford assay)를 이용하였다.

[수학식 2]

(3) 분석 결과: 온도 파라미터

온도 변화에 따른 단백질/세포밖 소포체의 분리능을 확인하기 위해, 4℃, 20℃, 및 37℃에서 분리를 수행하였고, 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12는 온도에 따른 세포밖 소포체 및 단백질의 분리 변화를 보여주는 그래프로, (a)는 세포밖 소포체의 회수 효율, (b)는 단백질 제거율을 보여준다.

도 12(a) 및 도 12(b)를 참조하면, 온도에 따라 세포밖 소포체의 회수 효율이 증가하는 경향을 보였으며, 이와 대응하도록 단백질 또한 온도에 따라 제거율이 증가하는 경향을 나타내었다. 구체적으로 도 12(a)를 보면, 세포밖 소포체는 손실 없이 회수될 수 있었으며, 20℃ 및 37℃의 결과를 보면 온도에 따라 큰 변화는 없었다. 그러나, 도 12(b)를 보면, 단백질의 제거율의 경우 온도에 따라 증가하는 경향을 보였다.

이러한 결과를 통해, 동일 시간 내에 분리 시 온도를 증가시키는 편이 단백질의 이동 속도를 증가시켜 고순도로 세포밖 소포체를 회수할 수 있음을 알 수 있다.

(4) 분석 결과: 시간 파라미터

시간에 따른 단백질/세포밖 소포체의 분리능을 확인하기 위해, 온도를 고정시킨 상태(20℃)에서 15분, 30분 및 60분 동안 분리 공정을 수행하였다.

도 13은 시간에 따른 세포밖 소포체 및 단백질의 분리 변화를 보여주는 그래프로, (a)는 세포밖 소포체의 회수 효율, (b)는 단백질 제거율을 보여준다.

도 13(a) 및 도 13(b)를 참조하면, 시간에 따라 세포밖 소포체의 회수 효율은 크게 변화하지 않았으나, 단백질의 제거율을 크게 증가함을 알 수 있다. 특히, 도 13(b)를 보면, 90% 이상의 대부분의 단백질이 15분 이내에 제거될 수 있음을 알 수 있다.

실험예 3: 분리 방식에 따른 세포밖 소포체 분리 성능 평가

단백질/세포밖 소포체의 분리 방식에 따른 세포밖 소포체의 회수 효율 및 단백질 제거율을 측정하였다.

이때 실시예 1로 덱스트란/폴리에틸렌글리콜 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용하여, 20℃에서 60분 동안 수행하였다. 또한, 비교예 1은 초원심분리는 1,000 Х g-force로 4℃에서 2시간 간 초원심분리 1회 수행한 것이고, 비교예 2는 초원심분리를 2회 4시간 동안 수행한 것이다.

도 14a는 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 방법에 따른 세포밖 소포체 회수 효율과 관련된 RNA양 또는 입자 개수(NTA) 변화를 보여주는 그래프이고, 도 13b는 순도를 보여주는 그래프이다.

도 14a 및 도 14b를 참조하면, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 방법은 초원심분리 방법 대비 높은 함량으로 고순도의 세포밖 소포체를 회수할 수 있다. 특히, 초원심분리와 같은 기계적 힘을 인가하지 않아 회수된 세포밖 소포체의 손상 및 손실 없이 단백질과 분리할 수 있음을 알 수 있다.

도 15a는 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 방법에 따른 단백질 제거율을 보여주는 그래프이고, 도 15b는 단백질 1 ug당 세포밖 소포체의 개수를 CD63 ELISA와 Bradford assay로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. CD63의 양은 세포 밖 소포체의 양을 나타내며 Bradford assay는 전체 단백질의 양을 나타낸다. 전체 단백질은 세포 밖 소포체의 막단백질과 나머지 free protein을 포함하는 것으로 단백질 당 CD63의 양이 높을수록 더 높은 순도의 세포 밖 소포체가 분리되었음을 의미한다.

도 15a 및 도 15b를 참조하면, 가장 높은 순도의 세포 밖 소포체를 얻을 수 있는 방법은 실시예 임을 알 수 있다.

또한, 도 16에서 (a)는 실시예 1에서 회수된 세포밖 소포체, (b)는 비교예 1에서 회수된 세포밖 소포체를 투과전자현미경으로 촬영한 이미지이다. 도 16을 통해 실시예에서 분리한 세포 밖 소포체의 형태를 확인할 수 있었다.

전술한 바의 도 14 내지 도 16의 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 세포밖 소포체의 분리는 종래 초원심분리 공정 대비 세포밖 소포체의 회수 효율과 순도 측면에서 뛰어나다는 것을 확인했다. 이에 더해 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 방법은 더 짧은 시간 안에 (실시예 1: 60분, 비교예 1: 2시간, 비교예 2: 4시간) 분리할 수 있으며 튜브에 분리하고자 하는 샘플을 떨어뜨리기만 하면 자동으로 분리되기 때문에 간편하다는 장점이 있다.

실험예 4: 수용액 이상계 조성물을 이용한 분리 성능 평가

본 발명에 따른 방법 및 교반/원심분리를 수행하는 방법을 이용하여 단백질/세포밖 소포체를 분리하고, 회수 효율 및 손상 여부를 확인하였다.

(1) 회수 효율

이때 비교예 3으로서, 대한민국 공개특허 제10-2016-0116802호에 의거한 방법을 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 세포 밖 소포체와 단백질이 섞여있는 샘플 500 ㎕를 덱스트란 수용액(4.5 중량%)에 상온에서 1시간 정도 녹인 후 폴리에틸렌글리콜 수용액(10.5 중량%)와 혼합하였다. 이어 1,000 × g-force로 상온에서 10분간 원심분리를 하여 상 분리를 유도하였다. 이때 상기 샘플의 세포 밖 소포체 농도는 100 ㎍/㎖, 단백질 농도는 2000 ㎍/㎖ 이었다.

	실시예 1	비교예 3
세포밖 소포체 회수 효율	100.67%	52.2%
단백질 제거율	99.74%	75.3%
순도(세포밖 소포체 회수 효율/단백질 회수 효율)	387.19	2.11

상기 표 3을 참조하면, 본 발명에 따른 방법은 비교예 3 대비 세포밖 소포체의 회수 효율이 약 2배 더 높았다. 또한, 단백질 제거율에서 약 20% 이상의 단백질이 더 제거되는 것을 확인할 수 있다. 이로 인해 실시예 1로 통해 최종 회수된 세포밖 소포체의 순도가 더 높음을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 본 발명은 도면에 도시된 실시예들을 참고로 하여 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 실시예의 변형이 가능하다는 점을 이해할 것이다 그러나, 이와 같은 변형은 본 발명의 기술적 보호범위 내에 있다고 보아야 한다 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해서 정해져야 할 것이다.

Claims

생물학적 시료를 포함하는 제1수용액, 및 제2수용액을 혼합하여 상기 제1수용액을 포함하는 제1수용액상과 제2수용액을 포함하는 제2수용액상 내에 상분리된 수용액 이상계 상분리 조성물을 제조하고,
(a) 상기 생물학적 시료 내 불순물을 제2수용액상 내로 이동시켜 바이오 나노 입자를 제1수용액상 내로 잔류시키거나,
(b) 상기 생물학적 시료 내 불순물을 제외한 바이오 나노 입자를 제2수용액상 내로 이동시켜,
생물학적 시료 내 불순물과 바이오 나노 입자를 분리하는 단계를 포함하되,
상기 제1수용액상과 제2수용액상이 상분리되는 계면에서의 장력(γ)이 하기 수학식 1을 만족하는 것인, 생물학적 시료로부터 바이오 나노 입자의 분리 방법:
[수학식 1]
2 X 10^-7 μJ/m² ≤ γ ≤ 50 X 10^-5 μJ/m²
제1항에 있어서,
상기 제1수용액상은 벌크 형태로 연속상인 제2수용액상 내에서 유동하는 것인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 수용액 이상계 상분리 조성물은 확산에 의해 생물학적 시료 내 불순물 또는 바이오 나노 입자를 제1수용액상에서 제2수용액상으로 이동시키는 것인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (b)는 교반 및 초원심분리 공정 없이 수행하는, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 세포배양액, 혈액, 혈장, 혈청, 복강액, 정액, 양수, 모유, 타액, 기관지 폐포액, 종양 유출액, 눈물, 콧물 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 바이오 나노 입자는 세포밖 소포체인, 분리 방법.
제6항에 있어서,
상기 세포밖 소포체는 엑소좀(exosome), 엑토솜(ectosome), 외부소포(exovesicle) 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle), 세포자멸체(apoptotic body), 막 입자, 막 소포, 엑소좀 유사 소포, 및 엑토솜 유사 소포로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 바이오 나노 입자는 바이오 분자, 및 이종 바이오 분자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 바이오 나노 입자는 직경이 1 내지 500nm인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1수용액상-제2수용액상은 고분자-고분자, 또는 고분자-고농도염의 조합인 것인, 분리 방법.
제10항에 있어서,
상기 고분자는 폴리아르기닌, 폴리라이신, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 키토산, 프로타민(protamin), 폴리비닐아세테이트, 히알루론산, 콘드로이친황산, 헤파린, 알지네이트, 하이드록시옥시프로필 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 전분, 폴리(비닐 메틸 에테르 에테르), 폴리비닐피롤리돈, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성 고분자;
사이클로덱스트린, 글루코오스, 덱스트란, 만노오스, 수크로오스, 트레할로오스, 말토오스, 피콜(ficoll), 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스-만니톨, 글루코오스-만니톨, 트레할로오스-폴리에틸렌글리콜, 수크로오스-폴리에틸렌글리콜, 수크로오스-덱스트란, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 고분자 다당류; 및
이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 분리 방법.
제10항에 있어서,
상기 염은 (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, MgSO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl, KCl, NaBr, NaI, LiCl, n-Bu₄NBr, n-Pr₄NBr, Et₄NBr, Mg(OH)₂, Ca(OH)₂, Na₂CO₃, ZnCO₃, Ca₃(PO₄)₂, ZnCl₂, (C₂H₃)₂Zn, ZnCO₃, CdCl₂, HgCl₂, CoCl₂, (CaNO₃)₂, BaCl₂, MgCl₂, PbCl₂, AlCl₃, FeCl₂, FeCl₃, NiCl₂, AgCl, AuCl₃, CuCl₂, 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate), 테트라데실황산나트륨(sodium tetradecyl sulfate), 브롬화도데실트리메틸암모늄(dodecyltrimethylammonium bromide), 염화도데실트리메틸암모늄(dodecyltrmethylammonium chloride), 브롬화 테트라데실트리메틸암모늄(tetradecyltrimethylammonium bromide), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1수용액 및 제2수용액은 농도가 0.001 내지 20 중량%인, 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 및 (b)는 추가로 온도 조절 또는 초음파 인가 중 어느 하나 이상의 공정을 함께 수행하는, 분리 방법.