JP2011522884A - 天然高麗人参または高麗人参を含む高麗人参類の形成層由来植物幹細胞株を有効成分として含有する老化防止または抗酸化用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)先天的未分化状態(Innately undifferentiated)であり;
(b)同質の細胞株(homogeneous cell line)であり;及び
(c)多数の液包(vacuole)を有する形態学的特徴を示す。
本願において「形成層(cambium)」とは、植物の幹と根を太くなるようにして、植物が、大きく生長できるようにする組織である。形成層は細胞分裂が最も活発に起きる分裂組織で、植物組織培養の切片体としての使用時において、細胞の高速及び大量生産が可能だと報告されている(韓国登録特許第0533120)。
(a)高麗人参類の形成層含有貯蔵根組織を取得する工程;
(b)前記取得された形成層含有貯蔵根組織に浸透ストレスを加えた後、IAA(Indole-3-acetic acid)またはIBA(Indole-3-butyric acid)を含む培地で培養して、形成層由来細胞株を誘導する工程;及び
(c)前記誘導された形成層由来細胞株を回収する工程。
[1−1]植物材料の用意
図1(a)のAは本発明において使用した天然高麗人参の典型的な特徴を示す。天然高麗人参を用意した後、天然高麗人参の主根部を使うために流水で表面に付いている土やその他の汚れを除去し、液体洗剤を利用して主根の表面を洗った後、流水に放置した。きれいに洗った組織は、クリーンベンチ内に準備された滅菌フラスコに入れて、70%エタノールで30秒乃至1分程度殺菌した。その後、滅菌水で濯いで1%乃至1.5%次亜鉛素酸ナトリウム(sodium hypochlorite, Junsei, Japan)を利用して、5分乃至15分程度で消毒液で処理した。この時、消毒液が効果的に組織内に侵入するようにするためにTWEEN20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate, Junsei, Japan)を数滴落として処理した。この過程が終わると滅菌水で3回乃至5回濯いだ。その後に殺菌処理した組織の褐変化を防止するために抗酸化剤が含まれたBIM(browning inhibition medium)に殺菌された主根を入れて30分乃至1時間程度十分培養し、滅菌されたろ紙に置いて水気を除去した。
前記処理された材料を、褐変されるのを防止するために抗酸化剤が含まれたCS溶液(cutting solution、表2)が入った滅菌皿に置いて、表皮を薄く剥がし半分に分けて、各部分において分裂能が旺盛な形成層の部分が含まれるようにして、横×縦×高さ=0.5〜0.7cm×0.5〜0.7cm×0.2〜0.5mmの大きさに切断した。図1(a)のBは天然高麗人参の主根部において形成層が含まれるように前記の大きさで切断して切片体を製造した様子を示す。
前記実施例1−1で製造された切片体は、分化した組織、即ち、篩部、木部、髄等を壊死させて分裂組織である形成層だけを生存させるために、浸透ストレス処理を行った。前記形成層含有切片体をろ紙が敷かれた前播種培地(培地1、表3)にブロティング(blotting)して、1Mスクロース(Duchefa, Netherland)溶液が入れられたフラスコに入れて、冷蔵状態で16〜24時間浸透ストレス処理した後、0.05Mスクロース溶液(sucrose solution)で5分間、0.1Mスクロース溶液で5分間処理して、高濃度のスクロースによるストレスを解除した。その後、前記浸透ストレスが解除された形成層含有切片体をろ紙が敷かれた前播種培地(培地1)に置いて水気を除去した。
形成層起源の分裂能を有する同質的細胞株を誘導するために、前記実施例1−2で浸透ストレス処理した切片体を細胞株誘導培地(培地2、表4)に播種した。播種に使用された培地は下記表4に示したとおりである。播種された切片体は、22±1℃暗条件で培養した。
前記実施例1−3で誘導された形成層起源の分裂能を有する同質性細胞株を利用して増殖に使用した。培地は下記表6に示した基本塩(salt)組成を元に表7に示したように形成層起源の分裂能を有する同質性細胞株の増殖最適培地を使用した。
前記天然高麗人参形成層由来同質性細胞株を下記表8の液状培地が含まれたフラスコに入れて、暗条件で25±1℃で100rpmの回転攪拌機(shaker)で培養した。継代培養周期は2週間に固定することによって培養細胞が常に対数生長期状態で高活力を維持できるようにした。一方、高麗人参の子葉由来カルス(callus)も<表8>の培地4で培養して、本発明に係る天然高麗人参形成層由来同質性細胞株と比較した。
前記実施例1−5のように14日間懸濁培養した細胞株を利用して、三つの処理区に分けて、実験を行った。
実施例1で製造された三つ処理区の細胞株から下記のとおり有効物質を抽出した。
(1)DMSO抽出物の製造
(i)培養液を除去した細胞株及び凍結乾燥細胞株500gに500mLのDMSOを加えて、50℃で6時間攪拌させながら、溶解させた。
(ii)前記溶解後、3,000gで10分間遠心分離させ上層液を取ることによってDMSO可溶性物質を得た。
(iii)前記で得たDMSO可溶性物質を、回転真空濃縮機を利用して濃縮した。
(iv)濃縮試料を、凍結乾燥器を利用して、乾燥させてDMSO抽出物を得た。
(2)蒸溜水抽出物、メタノール抽出物及びアセトン抽出物の製造
(i)培養液を除去した細胞株及び凍結乾燥細胞株500gに500mLの蒸溜水を加えて、50℃で6時間攪拌させながら溶解させた。
(ii)前記溶解後、3,000gで10分間遠心分離させて上層液を取ることによって蒸溜水可溶性物質を得た。
(iii)前記蒸溜水可溶性物質を得た後、残った蒸溜水不溶性物質に500mLのメタノール(methanol)を添加させて、室温で6時間攪拌して、溶解させた。
(iv)前記溶解後、3,000gで10分間遠心分離させて上層液を取ることによってメタノール可溶性物質を得た。
(v)前記メタノール可溶性物質を得た後、残ったメタノール不溶性物質に500mLのアセトン(acetone)を添加させて、室温で6時間攪拌して溶解させた。
(vi)前記溶解後、3,000gで10分間遠心分離させて、上層液を取ることによってアセトン可溶性物質を得た。
(vii)前記で得た蒸溜水、メタノール、アセトン可溶性物質を、回転真空濃縮機を利用して濃縮した。
(viii)濃縮試料を、凍結乾燥器を利用して、乾燥させて蒸留水、メタノール、アセトンに溶かして、蒸溜水抽出物、メタノール抽出物、アセトン抽出物を得た。
(3)対照群の製造
(i)凍結乾燥した天然高麗人参根500gに500mLのDMSOを加えて、50℃で6時間攪拌させながら、溶解させた。
(ii)前記溶解後、3,000gで10分間遠心分離させ上層液を取ることによってDMSO可溶性物質を得た。
(iii)前記で得たDMSO可溶性物質を、回転真空濃縮機を利用して濃縮した。
(iv)濃縮試料を、凍結乾燥器を利用して、乾燥させて天然高麗人参対照群のDMSO抽出物を得た。
試験に使用された試料の使用濃度範囲を決めるために、下記のとおり細胞毒性を確認した。
3.5%の牛胎児血清が含まれたDMEM(Doubecco’s Modified Eagle’s Media)培地で培養したヒト繊維芽細胞(NHF cell)を96ウェル平板培養器(96-well microtiter plate)に5,000細胞/ウェルになるべく分株し、24時間スターベーション(starvation)した後、実施例2で製造した天然高麗人参の形成層由来同質性細胞株DMSO抽出物及びその培養培地を濃度別(細胞株DMSO抽出物(Wet)及び乾燥細胞株抽出物(Dry)はppm、培養液(Media)は%)に48時間0.5%FBS最小栄養培地状態で処理した。
紫外線露出によってMMPが増加する場合、増加したMMPsは皮膚のコラーゲンを分解して、皮膚のシワを形成させるため、紫外線によって増加したMMP−1発現が天然高麗人参形成層由来同質性細胞株抽出物またはその培養液によって抑制される効果を確認するために以下の実験を行った。
NHF(p6)を12ウェルプレートに75,000細胞/ウェルになるべく分株し24時間スターベーション(starvation)した後、40mJのUVBを照射して、各試料を濃度別に48時間処理して、キット(Amersham, RPN 2610)を利用して、実験を行った。陽性対照群としては10uMのレチノイン酸(retinoic acid)を使用した。
紫外線によって増加した活性酸素が天然高麗人参形成層由来同質性細胞株抽出物またはその培養液によって抑制される効果を確認するために、96ウェル black plateにHaCaT cell(German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany)を30,000細胞/ウェルになるように分株し、各試料を濃度別に3時間処理した。3時間後、HBSSで1度洗浄してDCF50uMを各ウェルに処理して37度で20分間反応させた。HBSSで2度洗浄した後、Luminatorを利用して、初期吸光度を測定した。これにUVB30mJを照射した後、37度で2時間培養後、吸光度を測定した。Controlは試料及びUVBを添加しないものであり、UVBは試料の添加なしにUVBだけで処理したものを示す。
天然高麗人参抽出物のジンセノーサイド成分が皮膚老化防止及び抗酸化に効果があると知られているが、そこで本発明に係る細胞株抽出物及びその培養液の皮膚老化防止及び抗酸化効果がこのようなジンセノーサイド成分の効果によるものであるか否かを調べるためにジンセノーサイド含有量を測定した。即ち、実施例2で製造した工程別天然高麗人参の形成層由来同質性細胞株と天然高麗人参は凍結乾燥させた後、凍結乾燥された細胞株20mgをメタノール600uLに1時間抽出して遠心分離後、上層液を分離する。分離した抽出物のジンセノーサイド含有量はUPLCを利用して測定し、含有量は標準Re、Rb1、Rb2、Rdと比較して示した。また、培養液は、Elicitation1工程の培養液を0.2umシリンジフィルターを利用してろ過した後、HPLCを利用して測定し、含有量は標準Re、Rb1、Rb2、Rdと比較して示した。
本発明に係る天然高麗人参形成層由来細胞株の老化防止活性と露地天然高麗人参の老化防止活性を比較するために、韓国慶煕大学皮膚生命工学センターに依頼して、下記のとおり前記センター標準業務指針に従って実験を行った。
本発明に係る天然高麗人参形成層由来細胞株の抗酸化活性と露地天然高麗人参の抗酸化活性を比較するために、韓国慶煕大学皮膚生命工学センターに依頼して、下記のとおり前記センター標準業務指針に従って実験を行った。
[製剤例1]錠剤の製造
実施例2で製造された細胞株抽出物100mgをとうもろこし澱粉100mg、乳糖100mg及びステアリン酸マグネシウム2mgを混合して、通常の錠剤製造方法によって製造した。
実施例2で製造された細胞株抽出物500mgを軟質ゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造する。
実施例1で製造された細胞株1g、異性化糖10g、マンニトール5g、適量の精製水の含有量で通常の液製剤の製造方法によって100mLのシロップ剤を製造した。
実施例2で製造された細胞株抽出物200mgを、ポリオキシエチレン水素化カストロオイルを含有する生理食塩水200mgに加熱溶解させて、混合抽出物を0.1%の濃度で含有する注射剤を製造した。
[剤形例1]柔軟化粧水(スキンローション)の製造
[製造例1]
実施例1で製造した細胞株200mgを96mLの水に溶解させた後、補助剤としてビタミンC500mg、矯味剤としてクエン酸、オリゴ糖を各々1g加え、保存剤として安息香酸ナトリウム0.05gを加えた後、精製水を加えて、全量を100mLにして、機能性飲み物を製造した。
実施例2で製造した細胞株抽出物200mgを96mLの水に溶解させた後、補助剤としてビタミンC500mg、矯味剤としてクエン酸、オリゴ糖を各々1g加え、保存剤として安息香酸ナトリウム0.05gを加えた後、精製水を加えて、全量を100mLにして、機能性飲み物を製造した。
Claims (16)
- 高麗人参類の形成層から誘導され、以下の特性を有する細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養物のいずれか一つ以上を含有する老化防止または抗酸化用組成物:
(a)先天的未分化状態であり;
(b)同質の細胞株であり;及び
(c)多数の液包を有する形態学的特徴を示す。 - 前記細胞株は以下の特性を追加的に有することを特徴とする請求項1に記載の老化防止または抗酸化用組成物:
(a)懸濁培養時に単細胞状態で存在し;
(b)高麗人参類の形成層以外の組織由来細胞株と比べて、バイオリアクターにおいて剪断ストレスに対して低い感受性を有し;及び
(c)高麗人参類の形成層以外の組織由来細胞株に比べて、生長速度が速く、安定して培養される。 - 前記細胞株は以下の工程を含む分離方法によって取得されたことを特徴とする請求項1に記載の老化防止または抗酸化用組成物:
(a)高麗人参類の形成層含有貯蔵根組織を取得する工程;
(b)前記取得された形成層含有貯蔵根組織に浸透ストレスを加えた後、IAAまたはIBAを含む培地で培養して、形成層由来細胞株を誘導する工程;及び
(c)前記誘導された形成層由来細胞株を回収する工程。 - 前記培養物は前記細胞株を3〜5重量%の原糖または砂糖;またはジャスモン酸メチル、真菌類抽出物、細菌類抽出物、酵母抽出物、キトサン、グルコマンナン、グルカン、フェニルアラニン、安息香酸、サリチル酸、アラキドン酸、STS、モバロナロネイトN−ベンゾリグリシン、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、エテホン、馬尿酸、硝酸セリウムアンモニウム、AgNO3、硫酸バナジル、p−アミノ安息香酸、ブラシノステロイド、アルギン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される物質一つ以上を含む培地で、追加的に培養して取得したものであることを特徴とする請求項1に記載の老化防止または抗酸化用組成物。
- 高麗人参類は、天然高麗人参または高麗人参であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の老化防止または抗酸化用組成物。
- 前記抽出物は蒸溜水、アルコール、アセトン、DMSO及びこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒を利用して抽出されたことを特徴とする請求項1に記載の老化防止または抗酸化用組成物。
- 前記抽出物は、前記細胞株を蒸溜水、メタノール及びアセトンで順次溶媒分画して獲得されたことを特徴とする請求項1に記載の老化防止または抗酸化用組成物。
- 高麗人参類の形成層から誘導され、以下の特性を有する細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養物のいずれか一つ以上を含有する老化防止用化粧料組成物:
(a)先天的未分化状態であり;
(b)同質の細胞株であり;及び
(c)多数の液包を有する形態学的特徴を示す。 - 前記細胞株は以下の特性を追加的に有することを特徴とする請求項8に記載の老化防止用化粧料組成物:
(a)懸濁培養時に単細胞状態で存在し;
(b)高麗人参類の形成層以外の組織由来細胞株と比べて、バイオリアクターにおいて剪断ストレスに対して低い感受性を有し;及び
(c)高麗人参類の形成層以外の組織由来細胞株に比べて、生長速度が速く、安定して培養される。 - 前記細胞株は以下の工程を含む分離方法によって取得されたことを特徴とする請求項8に記載の老化防止用化粧料組成物:
(a)高麗人参類の形成層含有貯蔵根組織を取得する工程;
(b)前記取得された形成層含有貯蔵根組織に浸透ストレスを加えた後、IAAまたはIBAを含む培地で培養して、形成層由来細胞株を誘導する工程;及び
(c)前記誘導された形成層由来細胞株を回収する工程。 - 前記培養物は前記細胞株を3〜5重量%の原糖または砂糖;またはジャスモン酸メチル、真菌類抽出物、細菌類抽出物、酵母抽出物、キトサン、グルコマンナン、グルカン、フェニルアラニン、安息香酸、サリチル酸、アラキドン酸、STS、モバロナロネイトN−ベンゾリグリシン、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、エテホン、馬尿酸、硝酸セリウムアンモニウム、AgNO3、硫酸バナジル、p−アミノ安息香酸、ブラシノステロイド、アルギン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される物質一つ以上を含む培地で、追加的に培養して取得したものであることを特徴とする請求項8に記載の老化防止用化粧料組成物。
- 前記組成物はMMP−1生成を抑制することを特徴とする請求項8〜11のいずれか一項に記載の老化防止用化粧料組成物。
- 高麗人参類の形成層から誘導され、以下の特性を有する細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養物のいずれか一つ以上を含有する抗老化能または抗酸化能を有する機能性食品:
(a)先天的未分化状態であり;
(b)同質の細胞株であり;及び
(c)多数の液包を有する形態学的特徴を示す。 - 前記細胞株は以下の特性を追加的に有することを特徴とする請求項13に記載の抗老化能または抗酸化能を有する機能性食品:
(a)懸濁培養時に単細胞状態で存在し;
(b)高麗人参類の形成層以外の組織由来細胞株と比べて、バイオリアクターにおいて剪断ストレスに対して低い感受性を有し;及び
(c)高麗人参類の形成層以外の組織由来細胞株に比べて、生長速度が速く、安定して培養される。 - 前記細胞株は以下の工程を含む分離方法によって取得されたことを特徴とする請求項13に記載の抗老化能または抗酸化能を有する機能性食品:
(a)高麗人参類の形成層含有貯蔵根組織を取得する工程;
(b)前記取得された形成層含有貯蔵根組織に浸透ストレスを加えた後、IAAまたはIBAを含む培地で培養して、形成層由来細胞株を誘導する工程;及び
(c)前記誘導された形成層由来細胞株を回収する工程。 - 前記培養物は前記細胞株を3〜5重量%の原糖または砂糖;またはジャスモン酸メチル、真菌類抽出物、細菌類抽出物、酵母抽出物、キトサン、グルコマンナン、グルカン、フェニルアラニン、安息香酸、サリチル酸、アラキドン酸、STS、モバロナロネイトN−ベンゾリグリシン、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、エテホン、馬尿酸、硝酸セリウムアンモニウム、AgNO3、硫酸バナジル、p−アミノ安息香酸、ブラシノステロイド、アルギン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される物質一つ以上を含む培地で、追加的に培養して取得したものであることを特徴とする請求項13に記載の抗老化能または抗酸化能を有する機能性食品。
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