JP2006316073A - 抽出物、医薬組成物、化粧用組成物、及びこれら組成物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】休眠状態に入ることが可能な生物体に由来するプロデューサー細胞またはプロデューサー組織を準備する工程と、前記細胞または組織を休眠状態に誘導して休眠状態とする工程と、前記細胞または組織から、あるいは前記細胞または組織が培養されたメディアから、細胞の抗増殖作用を示す水溶性の画分を取得する工程とからなるプロセスで得られた抽出物であって、前記抗増殖作用の抗力は可逆的であり、休眠状態にない前記細胞または組織から同様にして画分を取得した場合は該作用を示さないか、あるいは示してもその程度が小さい、抽出物であり、かつ、前記プロデューサー細胞またはプロデューサー組織がナルシサス属の球根から取得した細胞または組織であるか、前記生物体がアルテミア属に属する生物体であることを特徴とする抽出物。
【選択図】なし
Description
に関する。
必須の増殖器官を含む各種の穀類および種子の発芽はある種の状況下で遅延されるが、それでもその穀類または種子は様々な時間後に発芽することができる。こうした種子の発芽が遅延され得る時間は変化し、またその種子の固有の特性ならびに環境条件の性質および過激度の両方に応じて決まる。種子は数日、1年、数年およびさらに数世紀以上も休眠することが示された(これはスイレン科(ニンフェアセアエ(nympheaceae))のあるものおよびマメ科(レギュミノサエ(Leguminosae))の木の種子の場合において最近発見された(セン−ミラー Shen-Miller,J.ら、American Journal of Botany,82:1367-1380,1995))。
セン−ミラー Shen-Miller,J.ら、American Journal of Botany,82:1367-1380,1995 サムソン Samson,F.E.,A Rev.Pharmac.Toxic 16:143(1976) フルザワ Furusawa,E.ら、Chemotherapy,26:36-45,(1980) フルザワ Furusawa,E.ら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,152:186-191,(1976) ピロフスキ Pirofsky,B.ら、Vox-Sang,42:295-303,(1982) ピロフスキ Pirofsky,B.ら、J.Biol.Response Mod.,2:175-185,(1983) セリオッティCeriotti,G.ら、Tumors 53:359-371(1967) ペティPettit,G.R.ら、J.Nat.Prod.,49:995-1002(1986) スタビーStaby,G.L.,Hort Science,399-400(1970) ヴァンスタデン Vanstaden,J.V.,Pflanzenphysiol.,86: 323-30(1978) フィナモア Finamoreおよびクレッグ Clegg:The Cell Cycle,Academic Press Ed.,249-278,1969 ラガル Le Gal,Y.:Biochimie Marine,(Ed.Masson)p.176,1988 ディトレ Ditre,C.M.ら、J.Am.Acad.Dermatol.,34:187-195,1996 アメス Ames,B.N.ら、Environ.Health Perspect 101:35-44(1993) ハイフリック Hayflick,L.、Clin.Geriatr.Med.,1:15-27,(1985)
医薬組成物に応用した場合、皮膚の加齢に関連する現象の処置に用い、皮膚の若年様外観を維持すること、日焼け状態の維持・延長を可能とすること、良性もしくは悪性の腫瘍があるか、または良性若しくは悪性腫瘍に進行する高リスク状態の個体に投与し、細胞の増殖を抑制することができる。
さらに細胞の増殖を抑制することができ、脱毛症の抑制用、多毛症の抑制用、爪の成長速度の低下用、髪の処置、瘢痕形成の抑制用、及び、皮膚疾患の治療用の医薬用途に用いることができる。
以下は下記の説明文において使用されるいくつかの用語の意味である。
休眠 −細胞または組織の代謝速度が著しく減少した結果、その細胞または組織の成長および増殖が抑制される状態。
本発明にしたがって、休眠組成物が使用される。この組成物は細胞、特にプロデューサー細胞または組織とは異種の細胞の増殖を抑制するために使用することができる。本発明の好ましい1実施形態によって、この組成物をヒトの医薬および美容剤に使用する。別の実施形態にしたがって、組成物を植物の成長の調節のために使用する。さらに別の実施形態によって、本発明の組成物を食品の保存に際して使用する。
(i) プロデューサー細胞またはプロデューサー組織から取得される抽出物であって、この細胞または組織が少なくともその一部において休眠状態に入ることが可能な生物体を起源とするものであり、このプロデューサー細胞または組織が由来する生物体中でこの休眠状態を誘発または維持する1以上の物質を含む抽出物、
(ii) 休眠を誘発する上記抽出物の画分、および
(iii) 上記抽出物または画分に由来する休眠誘発物質。
1実施形態によれば、組成物は上記定義のような、天然の未処理抽出物中に見られるよりも高い濃度の休眠物質を含む、富化休眠物質製剤(EDP )を含む。
抽出物が得られるプロデューサー細胞または組織はその標的細胞または組織と同一の起源のものでもよいが、好ましくは異なる起源のものがよい。本発明の1実施形態において、この標的細胞または組織はヒト細胞または組織であり、そしてこのプロデューサー細胞または組織は植物または非ヒト動物細胞または組織である。本発明の別の実施形態においては、この標的細胞または組織は植物細胞または組織である。
本発明の後者の態様によって、皮膚科用または美容剤に許容される担体と一緒に、約0.0001重量%から、好ましくは約0.001重量%から、典型的には約0.01重量%から、約5重量%まで、好ましくは約1重量%までの休眠抽出物または休眠物質類似体を含んでなる皮膚科用または美容用組成物が提供される。
本発明の休眠組成物のさらなる用途は、新鮮な産物、例えば野菜、新鮮な魚卵、貝などの保存である。
次に、幾つかの非限定的実施例により、図を時々参照して本発明を説明する。
ナルシサス圃場鱗茎を入手し、45℃の温度を有する熱水に2〜4時間漬けた。その後、鱗茎をすぐ水溶性抽出物の調製に使うか、もしくは代わりに、乾燥室で30℃の温度に最大8ヶ月の期間維持した後、植物抽出物の調製に使った。
活性もしくは(上に説明したように休眠を誘導した)休眠ナルシサス圃場鱗茎を1時間石鹸水中で消毒した。その後、鱗茎を切り、ウルトラ・ターボ・ツラックス(Ultra-Turbo-turax)ホモジナイザーを使って蒸留水中でホモジナイズした(30秒×3)。その後、ホモジナイズした鱗茎の調製物を第1の0.45μm無菌フィルターを通し、その後、第2の0.22μmフィルターを通して濾過し、その後、フィルター上に残らなかった調製物を回収した。濃度は、最終抽出物容積(ml)当たりの元の鱗茎の重量(g)として定義した。
(i) 実験アッセイ:
キュウリ種子品種「デリカ("Delica")」, 1994-1995, 95%発芽、99.9%純度を水道水(tap water)中で発芽させ、その後、根分化(root initiation)(1〜2mm)まで暗所で27℃にて約20時間インキュベートさせた。各実験グループは、上に説明したように取得した様々な濃度の休眠ナルシサス圃場鱗茎由来のDC(IBR-1)2mlで満たされたそれぞれのペトリ皿を含んでなった。
1層の濾紙を各ペトリ皿において、上に説明したように発芽した10個のキュウリ種子を濾紙上においた。ペトリ皿を24〜72時間、26℃〜28℃にて暗所でインキュベートした。
色々な濃度で試験した鱗茎抽出物の効果を、キュウリ種子の2つのパラメーターについて試験した:
1. 根伸長
2. 胚軸伸長
これらの2つのパラメーターを、試験した抽出物と種子とをインキュベートした後24時間ごとに、およびその後24時間ごとに試験した。
(ii) 結果:
以下の表8及び9に示すごとく、DC IBR-1とともにインキュベートした種子の根および胚軸の長さにより測定されたように、無菌水とともにインキュベートした同じ器官の長さと比較してDC IBR-1は実生の成長に対して十分な阻害活性を示した。
(i) 実験アッセイ
(a) 実験は、上のI(A)に記載したのと同じ方法で実施した。キュウリ種子の根および胚軸の成長にあたえるDCの効果を、インキュベーション後24および72時間に測定した。インキュベーション後72時間に、種子を無菌蒸留水で洗浄し、無菌蒸留水でさらに72時間27℃にて、暗所でインキュベートした。種子の根および胚軸の長さを、インキュベーション開始後144時間(DCを洗浄除去後72時間)に再び測定した。
(ii) 結果
下の表10に見られるように、キュウリ種子の根および胚軸の成長に阻害効果のあるナルシサス由来DCを洗浄除去した後、根と胚軸は再び成長を開始した。このように、DCの阻害効果は可逆性があり毒性はなかった。同じ効果は、低濃度のDCとともにインキュベートした種子でも明らかであった(結果は示してない)。
(a) ケラチノサイト培養物の調製
ヒト・ケラチノサイト培養物を、ベン バサート等による Ben Bassat H., et al., Plastic and Reconstructive Surgery, 89:511, (1992)に記載されたように調製した。全般に、ケラチノサイト培養物は、小さい中間層皮膚の小さい生検材料(約1cm2)から開始した。健康なドナーからの生検材料を、1%リドカインによる局所麻酔をかけて採取した。その生検片をトリプシン−EDTA中で4℃にて18〜20時間インキュベートした。その後、表皮を分離して上皮をトリプシン−EDTA中に統合(desegregate)して、単一細胞懸濁液を形成した。x10抗生物質、1000U/mlペニシリン、1000μg/mlストレプトマイシン、0.0025μg/mlアンホテリシンBおよび0.4mg/mlゲンタマイシンとともにトリプシン0.125%−EDTA0.025%を含むパックの生理的塩類溶液(Puck's saline)を、この方法に使用した。トリプシン溶液はトリプシン1:250強度から調製した。
支持細胞層として致死量照射した3T3マウス線維芽細胞2×105を含有する予め調製した25cm2ファルコンフラスコ中へ、上に記載のとおり調製した細胞懸濁液を、3〜6×106細胞の濃度で接種した。
(i) 実験アッセイ:
ナルシサス鱗茎抽出物を実施例I(b)に記載のとおり活性および休眠鱗茎から取得した。上記のとおりマイクロプレートに接種した2次ケラチノサイト細胞培養物を、さらにKmed中で3〜4日間増殖させた。その後、マイクロプレートを次の主なグループに分割した:
(1) Kmed中で連続増殖したケラチノサイト;
(2) 複数の濃度(0.5μg/ml〜10μg/ml、各濃度が別々の実験グループを形成する)の活性ナルシサス鱗茎から調製したAE IBR-3を含有するKmed中で増殖したケラチノサイトならびに
(3) 複数の濃度(0.5μg/ml〜10μg/ml、各濃度が別々の実験グループを形成する)の休眠ナルシサス鱗茎から得たDC IBR-1を含有するKmed中で増殖したケラチノサイト。
抽出物で処理した培養物および対照を、グルタルアルデヒド中で最終濃度0.05%、10分間、室温で固定した。洗浄後、マイクロプレートを、メチレンブルー1%を含む0.1Mホウ酸バッファーpH8.5で60分間、室温にて染色した。その後、プレートを広範囲に徹底的に洗浄して過剰の染料をとり除いて乾燥した。細胞により摂取された染料は0.1N HClに60分間、37℃で溶出して620nmで読み取った。
図1(a)に見られるとおり、ナルシサス鱗茎由来のDC IBR-1は、ケラチノサイトの増殖に著しい阻害効果を与えた。阻害は5日目の実験から明らかであり、用量に依存した。ケラチノサイト増殖の阻害は0.5μg/mlの低いDC濃度で明らかであったが、DCの10μg/ml濃度で最も著しかった。効果は用量に依存した(DCの1g/ml濃度で開始し、DCの10μg/mlで最も効果的であった)。
これに対して、図1(b)に見られるとおり、AE IBR-3は、ケラチノサイト増殖に対して有意な阻害効果を示さなかった。
(a) 線維芽細胞培養物の調製:
1次線維芽細胞培養物を小さなヒト皮膚検体から開始し、使用増殖培地がDMEM+20%胎児ウシ血清であることを除くとケラチノサイト培養調製に関する上記実施例IIに記載のとおり調製した。
(b) DCおよびAEの調製
DC IBR-1およびAE IBR-3を休眠および活性ナルシサス鱗茎から上記のとおり調製した。
(c) 線維芽細胞にあたえるDCおよびAEの効果:
(i) 実験アッセイ:
前記抽出物を様々な濃度(1g〜10g/ml)で線維芽細胞培養物に加え、培養物内の線維芽細胞の数を上記実施例II(a)に記載のとおり細胞に抽出物を添加後、2日目、5日目および8日目に測定した。
(ii) 結果:
図2(a)に見られるとおり、DC IBR-1が培養中の線維芽細胞の増殖に最も著しい阻害効果を有した。効果は実験の5日目から明らかであり、用量に依存するが、0.5μg/mlの低い用量でも効果が見られた。
図2(b)に見られるとおり、AE IBR-3は線維芽の増殖に対する阻害効果はなかった。
以下は、本発明により個体への投与用に使うことができる幾つかの具体的な美容用および皮膚科用組成物の例である。
・ オゾケライト 10 g
・ パルミチン酸イソプロピル 9 g
・ 白ワセリン 14 g
・ 保存剤 0.2 g
・ 酸化防止剤 0.3 g
・ 香料 1 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 0.00001 g
・ 液体パラフィン 総量 100 g
・ オゾケライト 19 g
・ 液状プルセリン(purcellin)オイル 10 g
・ 白ワセリン 15 g
・ 保存剤 0.2 g
・ 酸化防止剤 0.3 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 0.00002 g
・ 液体パラフィン 総量 100 g
・ Carbopol(登録商標)981(グッドリッチ(Goodrich)より市販) 0.6 g
・ 揮発性シリコーンオイル 3 g
・ プルセリンオイル 7 g
・ 保存剤 0.3 g
・ エチルアルコール 15 g
・ 香料 0.4 g
・ トリエタノールアミン 0.2 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 0.04 g
・ 脱塩水 総量 100 g
・ Carbopol(登録商標)981(グッドリッチより市販) 1 g
・ トリエタノールアミン 1 g
・ 95%エタノール 60 g
・ グリセロール 3 g
・ プロピレングリコール 2 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 5 g
・ 脱塩水 総量 100 g
・ 無水エタノール 61.1992 g
・ ヒドロキシエチルセルロース 0.8 g
・ プロピレングリコール 25 g
・ ポリエチレングリコール 12 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 0.0008 g
・ 揮発性シリコーンオイル 10 g
・ 液状パラフィン 6 g
・ 液状ラノリン 3 g
・ Arlacel(登録商標)165(アトラス(Atlas)より市販) 6 g
・ Tween(登録商標)60(アトラスより市販) 2 g
・ セチルアルコール 1.2 g
・ ステアリン酸 2.5 g
・ トリエタノールアミン 0.1 g
・ 保存剤 0.3 g
・ 酸化防止剤 0.3 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 0.5 g
・ 脱塩水 総量 100 g
・ プロピレングリコール 2 g
・ PEG 400 3 g
・ 保存剤 0.3 g
・ Carbopol(登録商標)981(グッドリッチより市販) 0.2 g
・ ミリスチン酸イソプロピル 1 g
・ セチルアルコール 3 g
・ ステアリン酸 3 g
・ グリセロール 3 g
・ コーン油 2 g
・ 香料 0.5 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 0.001 g
・ 脱塩水 総量 100 g
・ オキシエチレン化ノニルフェノール 5 g
・ Carbopol(登録商標)981(グッドリッチより市販) 1 g
・ エチルアルコール 30 g
・ トリエタノールアミン 0.3 g
・ グリセリン 3 g
・ 香料 0.3 g
・ 保存剤 0.3 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 1 g
・ 脱塩水 総量 100 g
・ セチルアルコール 4 g
・ B−シトステロール 4 g
・ ジセチルリン酸 0.5 g
・ 保存剤 0.3 g
・ ヒマワリ油 35 g
・ 香料 0.6 g
・ Carbopol(登録商標)981(グッドリッチより市販) 0.2 g
・ トリエタノールアミン 0.2 g
・ スフィンゴシン 0.05 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 0.2 g
・ 脱塩水 総量 100 g
・ タルク 5 mg
・ エーロジル(Aerosil)200 5 mg
・ ステアリン酸亜鉛 5 mg
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 3 mg
・ ラクトース 総量 400 mg
・ 安息香酸ナトリウム 2 mg
・ 保存剤 0.15 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 1 g
・ 水 総量 100 g
・ プロテギン(Protegin)(ゴールドシュミット(Goldschmidt)市販) 19 g
・ ワセリンオイル 8 g
・ グリセリン 3 g
・ 鱗茎抽出物から調製したDC 1 g
・ 硫酸マグネシウム 0.5 g
・ 香料 0.8 g
・ 保存剤 0.2 g
・ 水 総量 100 g
(a) ナルシサス鱗茎細胞培養物の調製
圃場からの花序柄開始点(inflorescence stalk initials)を有する活性ナルシサス鱗茎を使って、複製内部規模外植片(duplicate inner scale explant)を調製した。その後、外植片をNR31培地(NAA/10μM BA: 5:0.5μM)に接種してカルス培養を開始した。カルス培養開始後4〜5週に、培養物をNR8培地(6%スクロース)に移植して小鱗茎(bulblet)成長外植体を形成した。バイオマスのスケールアップのため、半量の小鱗茎を、
ムラシゲ・スクーグ(Murashige & Skoog)(Sigma M-5525) 4.33 g/l
ミオイノシトール 100 mg/l
硫酸アデニン 150 mg/l
NaH2PO4H2O 345 mg/l
NAA 5 μM 寒天A型 7g/l
BA 5 μM pH=5.7
ピリドキシン 1 mg/l
グリシン 2 mg/l
ニコチン酸 5 mg/l
塩酸チアミン 0.5 mg/l
スクロース 30 g/l
を含んでなる液体基本培地N4の入った小鱗茎カラムバイオリアクターに4週間移植した。
その後、上記(a)に記載したように調製した植物材料を7〜10日間、ジャイロ型回転振とう機により、約35℃で振とうした(培地1ml当たりカラム重量は0.1gであった)。半量の細胞培養物を、高温(約35℃)でインキュベートして休眠を誘導した。この培養物から調製したDCをIBR-11と名付けた。残りの細胞培養物は、正常条件で成長させて活性状態を保持し、それから調製したAEをIBR-10と名付けた。AE IBR-10またはDC IBR-11は、水で洗浄し重量を測定しウルトラ・ターボ・ツラックス(ultra-Turbo-turax)でホモジナイズした培地を含まないバイオマスから調製した。ホモジネートを無菌蒸留水中に懸濁し希釈した。
(d) 実験アッセイ
(i) キュウリ実生の根伸長および胚軸伸長にあたえるナルシサス小鱗茎から調製した上記のDCおよびAEの効果を、次のとおり測定した。それぞれ10個の種子を含有するペトリ皿からなる各実験グループを、
1. DC IBR-11(休眠)
2. AE IBR-10(活性)
とともにインキュベートした。
1. 根伸長
2. 胚軸伸長
抽出物とともに種子を72時間インキュベートした後、これら2つのパラメーターを試験した。
以下の表11に見られるように、インキュベーション後72時間に、実生成長にあたえるAEの効果と比較して、DC IBR-11は実生の根の長さおよび胚軸の長さの両方に対して著しく高い阻害活性を有した。
(a) ケラチノサイト培養物の調製
ヒトケラチノサイト培養物を上の実施例II(a)に記載のとおり調製した。
(b) ケラチノサイトの増殖に対するナルシサス小鱗茎由来のDCの効果
(i) 実験アッセイ
ナルシサス鱗茎由来細胞培養物を上に記載のとおり調製し、DC IBR-11を(上に記載したとおり)休眠に誘導した小鱗茎から調製した。
(2) 複数の濃度(0.5μg/ml〜10μg/ml、各濃度に対して別個の実験グループを形成する)のDC IBR-11を含有するKmedで増殖したケラチノサイト。
各実験グループは5つのウエルを含んでなった。DCを含有する増殖培地は5日間、24時間ごとに取り替え、その後、培地を全ウエルからとり除いて植物抽出物を含まない新鮮なKmed培地を加え、培養物をその中でさらに3日間増殖した。
ケラチノサイト増殖について試験したDCの効果を、DCなしのKmed培地で増殖したウエルで検出した細胞数と比較した、試験した処理ウエル中に検出した細胞数により定量した。
抽出物処理した培養物および対照は、グルタルアルデヒド中に、最終濃度0.05%、10分間、室温で固定した。洗浄後、マイクロプレートを、メチレンブルー1%を含む0.1Mホウ酸バッファーpH8.5中で、60分間、室温で染色した。その後、プレートを広範囲に徹底的に洗浄して過剰の染料をとり除いて乾燥させた。細胞により摂取された染料は0.1N HClに、60分間、37℃で溶出して620nmで読み取った。
予備滴定実験で、1×103〜4×104細胞/ウエルについて直線的な読み取りを得た。ケラチノサイトは島として増殖し均一な単層を形成しないので、増殖曲線実験の各点は5ウエルの読み取りの平均である。ウエルの平均細胞数は、試験したDCを含むケラチノサイトのインキュベーションの2日後および5日後、ならびに培養の8日後(試験抽出物なしに3日間の増殖を実施した後)に測定した。
図3に見られるように、DC IBR-11は培養のケラチノサイトの増殖に著しい阻害活性を示した。
(a) 線維芽細胞培養物の調製:
1次線維芽細胞培養物を小さいヒト皮膚標本から開始し、使用増殖培地がDMEM+20%胎児ウシ血清であること以外はケラチノサイト培養調製に関する上記実施例IIに記載のとおり調製した。
(b) 細胞培養したDCの調製
上の実施例V(b)に記載のとおり、IBR-11を休眠小鱗茎から調製した。
(c) 線維芽細胞増殖に対するDCの効果:
(i) 実験アッセイ:
前述抽出物を様々な濃度(1μg〜10μg/ml)で線維芽細胞培養物に加え、培養物内の線維芽細胞の数を上の実施例V(a)に記載のとおり細胞に抽出物を添加してから、2日後、5日後および8日後に測定した。
(ii) 結果:
図4に見られるとおり、細胞培養から誘導したDC IBR-11は線維芽細胞の増殖に阻害活性を示した。
(a) 果実ジュースの調製
グレープフルーツジュースを1個の新鮮なグレープフルーツから作り、作ったジュースを絞り、綿布を通して濾過し、その後、10,000rpmで10分間、室温で遠心分離した。その後、上清を以下に記載するようにキュウリ種子成長に対するその効果を試験するために使った。
(b) キュウリ実生の成長に対するグレープフルーツジュースの効果
(i) 実験アッセイ:
キュウリ種子を、上の実施例1(c)(i)に記載のとおり調製した。各実験グループは、以下のものを1.8ml満たした10枚のペトリ皿を含んでなった:
(1) dH2O
(2) 上の(a)で得た果実ジュース。
1層もしくは2層の濾紙をそれぞれのペトリ皿におき、上に説明したとおり発芽した10個のキュウリ種子を濾紙上においた。ペトリ皿を25℃で培養し、キュウリ種子のパラメーターをインキュベーション開始の24時間後および72時間後に測定した。
果実ジュースの効果をキュウリ種子の2つのパラメーターについて試験した:
1. 根伸長
2. 胚軸伸長。
(ii) 結果:
下の表12に見られるように、この実験は、果実ジュースがキュウリ種子の成長に対する阻害活性を有することを示した。
IBR-4と名付けた休眠抽出物をアルテミア・サリーナ(Artemia salina)から抽出物を調製することによって得た。アルテミア「卵」を、脱水または高塩濃度にかけ、殻を開けてから、グラウンディング(grounding)してもよい。あるいはまた、アルテミア「卵」を10mlの水に分注し、殻を軟化させることができる。殻のグラウンディングもしくは軟化の後、卵をそれ自体周知の溶媒(例えば水)のどれか1つに溶解してそれから抽出物を得る。抽出物は(本実施例のように)凍結乾燥するか、あるいはまた、得られたままの状態で使うことができる。アルテミア抽出物を得るさらなる方法として、プレノープリウス(prenauplius)幼生が殻から這い出すまでアルテミア「卵」を水中に溶解して、その後、幼生をグラウンディングし、それから抽出物を得てもよい。
(i) 実験アッセイ:
キュウリ種子を、上の実施例1に説明したように調製してペトリ皿中に播種した。各実験グループは、10個のキュウリ種子を含有するペトリ皿を含んでなり、以下に示した結果は10個の種子に対して測定したパラメーターの平均である。ペトリ皿は、28℃、暗所で成長させ、キュウリ種子の根長と胚軸長を、以下のうちの1つの1.8mlとのインキュベーション開始の24時間後および48時間後に測定した:
(1) dH2O
(2) 0.02g/mlの濃度のDC IBR-4。
以下の表13に見られるように、アルテミアの休眠抽出物IBR-4は、キュウリ種子成長に著しい阻害効果を有し、その阻害効果はDC IBR-4による種子の培養の既に24時間後に明らかであったが培養の48時間後に最も著しかった(根成長の66%阻害および胚軸成長の40%阻害)。
(a) 休眠抽出物の調製
ナルシサス由来の植物休眠抽出物であるIBR-1およびアルテミア由来の動物休眠抽出物IBR-4を上の実施例に説明したように調製した。
(b) マウス膀胱癌細胞の増殖に対するDC IBR-1およびDC IBR-4の効果
(i) 実験アッセイ
2つの実験を次のとおり実施した:
T24P細胞(マウス膀胱癌細胞)(図5)を4×104細胞/ウェルの濃度でミクロ培養ウェル中にまき、T50細胞(マウス膀胱癌細胞)(図6)を2×104細胞/ウェルの濃度でミクロ培養プレート中にまき、そして細胞培養培地で増殖した。
細胞を播いた24時間後および休眠抽出物での細胞インキュベーションの48時間後に、色々な濃度(0g/ml〜25g/ml)で、DC IBR-1およびDC IBR-4をT24P細胞培養に加え、IBR-1をT50細胞にも加えた。ウエル1つ当たりの細胞数を、抽出物を含む細胞インキュベーション開始の48時間後に、ミクロ培養メチレンブルーアッセイ(上の実施例2に記載した)を使い測定し、染色した培養プレートを620nmで読み取った。
(ii) 結果:
図5および6に見られるように、植物由来の休眠抽出物ならびに動物由来の休眠抽出物の両方共が、マウス膀胱癌細胞T24P(図5)およびT50(図6)の増殖にいくらかの阻害効果を有した。
(a) 果実ジュースの調製
グレープおよびキウィジュースは新鮮な果実から作った。果実をブレンダーカップ中で3分間高速でブレンドし、ブレンド物を寒冷紗を通して濾過し、そして6,500rpm、10分間、室温で遠心分離した。その後、上清液は、グレープジュース1.2g/mlおよびキウィジュース1.26g/mlの濃度で、実験に使用した。濃度は、最終容量(v)に対する果実重量(g)で測定した。各ジュースについて複数の希釈物を調製し、キュウリ種子成長についての試験に使った。
キュウリ種子の調製および実験アッセイは、上の実施例I(c)(i)に記載したとおり実施した。根および胚軸の長さは、各試験ジュースまたは対照と種子との28℃でのインキュベーションを開始した24および48時間後に測定した。以下の表14に見られるように、キウィジュースおよびグレープジュースは両方とも、キュウリ根ならびに胚軸の両方の成長に非常に高い百分率の阻害を示した。最も顕著な阻害は、インキュベーション開始の48時間後にみられ、両方のジュースがキュウリ種子の成長を阻害した。
(i) 実験アッセイ
健康なヒト成人から得たケラチノサイトの細胞培養物および健康なヒト皮膚調製物から得た線維芽細胞の細胞培養物を、様々な濃度のナルシサス由来DC(IBR-1)、ナルシサス由来AE(IBR-3)およびアルテミア由来DC(IBR-4)とともにインキュベートした。細胞のDNA含量は、エチジウムヨウ素をDNAと結合する蛍光染料として使ってFACSにより分析した(パークスParks D. R.およびヘルツェンベルグHerzenberg, L.A., In: Methods in Cell Biology, Vol.26, Academic Press, p.283, 1982)。分析は、様々な抽出物との細胞のインキュベーションの開始の2日後および5日後に実施し、FACS FPAR-Plus(Becton-Dickinson, Inc.)で実施した。
(a) ケラチノサイトの細胞周期に対するDCの効果
図7(a)および図7(b)、ならびに、図9(a)および(b)に見られるように、ナルシサス由来のDCおよびアルテミア由来のDCはケラチノサイトのDNA含量に対して効果を有し、G1期にある細胞百分率の減少ならびにSおよびG2+M期にある細胞の増加を示した(その効果はインキュベーションの2日目に既に明らかであり、インキュベーションの5日目に一層明白となった)。これに対して、図8(a)および(b)にみられるように、ナルシサス由来のAE(IBR-3)の効果は、インキュベーションの5日目にのみ僅かに判る程度で遥かに低くみられ、G1期の細胞百分率の減少がS期にある細胞百分率の増加およびG2+M期にある細胞百分率の有意でない増加とともにみられた。
さらに、ナルシサスおよびアルテミア由来のDC IBR-1およびEBR-4は、ナルシサス由来のAE IBR-3でインキュベートしたケラチノサイトではみられなかったアポトーシスの百分率の増加を示した。
図10(a)および(b)ならびに図12(a)および(b)に見られるように、水とインキュベートした同じ細胞培養物と比較して、ナルシサス由来のDC(IBR-1)およびアルテミア由来のDC(IBR-4)はSおよびG2+M期にある細胞百分率を増加した(主にインキュベーション開始の5日後にみられた)。これに対して、図11(a)および(b)にみられるように、ナルシサス由来のAE(IBR-3)との細胞のインキュベーションは効果がなかった。どの試験抽出物も線維芽細胞培養中のアポトーシスの百分率を増加しなかった。
ケラチノサイトおよび線維芽細胞培養物に対する様々なDCの効果は時間および用量に依存した。
(a) 様々な植物の鱗茎から上の実施例Iに記載されたように抽出物を調製した。抽出した鱗茎は成長チップがみとめられない休眠段階にあった。抽出物濃度は、最終抽出物容量(ml)当たりの元の鱗茎の重量(g)として定義する。
(b) キュウリ発芽種子の成長に対する抽出物の効果:
実験アッセイは、上の実施例Iに説明したように実施した。発芽キュウリ種子の成長に対する試験鱗茎抽出物の効果を、種子を伴なう抽出物の培養開始の24および48時間後に試験した。
試験抽出物の阻害効果を上の実施例で記載したとおり計算した。
下の表15に見られるように、殆どの抽出物は、発芽キュウリ種子の成長に対して(平均してほぼ60%までの)良好な阻害効果を示した。複数の植物(例えば、パンクラチウム・マリツマム(Pancratium maritumum))は、ほぼ90%阻害の非常に良好な阻害効果を示した。複数の抽出物は低い阻害効果を示し、これはある場合には鱗茎が完全な休眠でなかった事実によるのであろう。
パンクラチウム・マリツマム(Pancratium maritumum))およびヒアシンス・カーネギー(Hyancinth carnegie)由来の抽出物の効果を、キュウリ種子成長に対する効果について、様々な濃度の抽出物を種子に加えてさらに試験した。結果(示されてない)は、加えた抽出物の濃度と発芽キュウリ種子の成長に対する抽出物の阻害効果の相関を示した。
(a) 休眠ナルシサス鱗茎からの抽出物を上の実施例に説明されたとおり調製した。
(b) キュウリ種子を発芽させて、3日間、根および胚軸が約4cmになるまで成長させた。その後、植物を土壌に植えて水道水(tap water)中で23℃で成長させた。植物を、それぞれ18植物を含んでなる次の3グループに分割した:
1. 水道水で灌漑した植物;
2. 水道水で灌漑し、ナルシサス鱗茎抽出物(5mg/ml)を葉および成長分岐組織(growth meristem)に噴霧することによりナルシサス鱗茎抽出物で処理した植物;および
3. ナルシサス鱗茎抽出物(0.2g/ml)で直接灌漑した植物。
植物を毎日灌漑し、処理の1週後に、植物を土壌から取り出してそれぞれの処理の効果を各植物の根および幹の長さを測定して試験した。
結果:
下の表16にみられるように、抽出物を葉および成長分裂組織に噴霧することによる(グループ2)ならびに抽出物で植物を灌漑することによる(グループ3)、キュウリ植物への休眠ナルシサス鱗茎抽出物の施用は、両方とも水道水によるそれらの成長と比較してキュウリ植物の成長阻害をもたらした。
(a) 休眠ナルシサス鱗茎抽出物を上に説明したように調製した。
(b) 複数の種類の種子(トマト、キャベツ、メロン、スイカ、コムギ、イネ科草本(grass)、キュウリ、マメ、オオムギ、トウモロコシ(corn)およびエンドウマメ)を一夜、水洗し、その後、24時間、30℃、暗所にて、水に漬けた濾紙上で発芽させた。24時間後、発芽した種子(それぞれの実験セットにつき20個)を休眠抽出物に漬けたワットマン濾紙を置いたペトリ皿に施用した。
種子の各グループを次のグループに分けた:
1. 水中で成長した種子(対照);および
2. 休眠ナルシサス鱗茎抽出物で成長した種子。
様々なタイプの種子を、上の実施例1で説明した水または(複数の濃度の)抽出物で成長させ、インキュベーション後、各種子の根長および胚軸長を発芽および成長の速度に依って24時間ごと測定した。抽出物の阻害効果を、上に説明したように試験し計算した。
下の表17にみられるように、休眠ナルシサス鱗茎抽出物は効果的に上記種子の成長を阻害した。阻害の程度はいろいろであった。
活性および休眠ナルシサス鱗茎から調製した粉末の数グラムをアセトンメタノール(90:10)で抽出した。抽出物を薄層クロマトグラフィー(TLC)技術を使って分離した。分離はTLCプレート(メルク(Merck)社製のシリカゲル60 F254)上で実施した。処理条件は、水:n−ブタノール:酢酸(5:4:1)であった。検出法は、254nmおよび365nmの紫外光であった。分離で生じたバンドをプレートからシリカで掻きとり、メタノールで洗浄し、60℃で乾燥した。活性ナルシサス鱗茎由来の抽出物に現れるバンドを休眠ナルシサス鱗茎の抽出物のそれらと比較した。
結果:
上の抽出物に現れたバンドを比較すると、(「バンド4」および「バンド6」と名付けた)2つのバンドの発現に差異があり、休眠鱗茎の抽出物においてより高い濃度で現れることを示した。
2つのバンドの紫外吸収スペクトルおよび発芽キュウリ種子に対する阻害活性を上に説明したように試験した。
図14(a)及び図14(b)にみられるように、バンド4の紫外吸収ピークは288nm、バンド6のそれは252nmにあった。下の表12にみられるように、バンド4および6は発芽キュウリ種子の成長を著しく阻害した。
本発明のDCの毒性を以下の方法を使って試験した:
1. ラットにおける急性経口毒性(固定用量)試験
急性経口毒性学試験はインベレスク・リサーチ・インターナショナル(Inveresk Research International(IRI), Tranent, EH33 2NE, Scotland)により1996年1月刊行したプロトコル、コードP/ACU/005に基づいた。
2. エイムス試験(Ames Test)
ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)哺乳類ミクロソーム結合プレートアッセイは、エイムスら(Ames B.N., McCann, J.およびYamasaki E., Mutation Research, 31:347-364 (1975))に基づいた。
3. 細胞毒性(Cytotoxity)
アガロース拡散法により測定した美容クリーム中の0.2g/mlの抽出物(5%)の細胞毒性は、イーブイアイシー・シーイービーエイ(EVIC-CEBA, Bordeau, France)により試験された。
4. 刺激ポテンシャル(Irritaion Potential)
(0.2g/ml抽出物の(5%))クリーム中の生成物の刺激ポテンシャルは、HET-CAM(雌鳥の卵の絨毛尿膜)試験法を使い、イーブイアイシー・シーイービーエイ(EVIC-CEBA, Bordeau, France)により試験された。
5. 皮膚耐性(Cutaneous Tolerance)
皮膚への連続使用後の美容クリーム中の抽出物(0.2g/ml抽出物の(5%))の皮膚耐性は、イーブイアイシー・シーイービーエイ(EVIC-CEBA, Bordeau, France)により評価された。
上記方法を使った毒性試験結果は次のとおりであった:
1. ラット経口(LD 50>2000mg/kg体重)における急性経口毒性(固定量)試験では、若い雌および雄ラットに急性の有害な影響はなかった。
2. 5000μg/プレートの上限用量までのエイムス試験では、沈殿および毒性を示さず、エイムス試験における突然変異性効果を誘導しなかった。
3. クリーム(0.2g/ml抽出物の(5%))の刺激ポテンシャル。産物はこの種の産物として正常の刺激性であることが見出された。
4. アガロース拡散法によるクリーム(0.2g/ml抽出物の(5%))中の生成物の細胞毒性測定は低いようで、この種の生成物として低くかつ正常とみなされた。
5. 皮膚耐性−美容クリーム中の抽出物の皮膚耐性の臨床評価を試験した。皮膚はこの生成物に非常によく耐えうることが見出された。
(a) アッセイ:
5%ジヒドロキシアセトン(DHA)を含有するクリームを個人の前腕に塗布した。DHAは、自己日焼け製品に使われる皮膚上層を着色することが可能な化合物である。クリームを、日焼けが前腕に現れるまで3回塗布した。
その後、日焼け部を次の3部分に分け、それぞれ、異なるクリームを毎日2回、17日間塗布して処理した。
1. DC IBR-1の5%を含んでなるクリームによる処理;
2. 上の(1)に使われたものと同じであるが、IBR-1を含有しないクリーム;
3. αヒドロキシ酸(AHA)(皮膚処理用に市販されている)を含んでなるクリーム;そして
それぞれの皮膚領域の着色量を分光比色計を用いて測定した。
日焼け延長に対する%効果は、次式で計算した。
上の実験結果は図15にみることができ、この図は、IBR-1を含有しないクリームの効果と比較した場合のIBR-1 DCを含有する上記1で使ったクリームの日焼け期間に対する効果(図15中AおよびB)と、AHAを全く含有しないクリームと比較した上記(3)に使われた(AHAを含んでなる)クリームの相対的効果(図15中CおよびD)との間の関係を示す。図15中Aにみることができるように、クリーム塗布の5日後、日焼け期間の延長に対するIBR-1を含有するクリームの効果は、IBR-1を含有しないクリームより著しく高かった。その効果は、図15中Bで見られるように、クリーム塗布後17日によりさらに著しかった。
以上の結果は、本発明のDCを含有するクリームは、おそらく皮膚細胞の増殖の阻害により、日焼け期間を延長することを示す。これに対して、皮膚処理用に一般的に使われるAHAを含有するクリームは、おそらく細胞分裂の刺激により日焼け期間を短縮する。
Claims (18)
- (a)標的細胞とは異種であり、かつ休眠状態に入ることが可能な生物体に由来するプロデューサー細胞またはプロデューサー組織を準備する工程と、
(b)前記細胞または組織を休眠状態に誘導して休眠状態とする、また、休眠状態にある場合はその休眠状態を維持するための条件を設定する工程と、
(c)前記細胞または組織から、あるいは前記細胞または組織が培養されたメディアから、細胞の抗増殖作用を示す水溶性の画分を取得する工程とからなるプロセスで得られた抽出物であって、
前記抗増殖作用の抗力は可逆的であり、休眠状態にない前記細胞または組織から同様にして画分を取得した場合は該作用を示さないか、あるいは示してもその程度が小さい、抽出物であり、かつ、
前記プロデューサー細胞またはプロデューサー組織がナルシサス(Narcissus)属の球根から取得した細胞または組織であるか、前記生物体がアルテミア(Artemia)属に属する生物体であることを特徴とする標的細胞または標的組織に対して抗増殖作用を有する抽出物。 - 前記請求項1に記載の標的細胞または標的組織に対して抗増殖作用を有する抽出物を含有することを特徴とする医薬組成物。
- 個体の皮膚に局所適用のための請求項2の医薬組成物
- 皮膚の若年様外観を維持するための医薬組成物であるか、または皮膚の加齢に関連する現象の処置のための医薬組成物であることを特徴とする請求項2に記載の医薬組成物。
- 日焼けの延長用の医薬組成物であることを特徴とする請求項2に記載の医薬組成物。
- 良性もしくは悪性の腫瘍があるか、または良性若しくは悪性腫瘍に進行する高 リスク状態の個体に投与するための請求項2に記載の医薬組成物。
- 脱毛症の抑制用、多毛症の抑制用、爪の成長速度の低下用、髪の処置、瘢痕形成の抑制用、及び、皮膚疾患の治療用の群から選ばれたいずれかのためのものであることを特徴とする請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記請求項1に記載の抽出物を含有することを特徴とする化粧用組成物。
- 皮膚の若年様外観を維持する、または、皮膚の加齢に関連する現象の処置のためのものであることを特徴とする請求項8に記載の化粧用組成物。
- 日焼けの延長のためのものであることを特徴とする請求項8に記載の皮膚の化粧用組成物。
- 脱毛症(Alopecia)の抑制、多毛症の抑制、爪の成長速度の低下、瘢痕形成の抑制、及び、皮膚疾患の処置、の群から選ばれる適用のためのものであることを特徴とする請求項8に記載の皮膚の化粧用組成物。
- (a)標的細胞とは異種であり、かつ休眠状態に入ることが可能な生物体に由来するプロデューサー細胞またはプロデューサー組織を準備する工程と、
(b)前記細胞または組織を休眠状態に誘導して休眠状態とする、また、休眠状態にある場合はその休眠状態を維持するための条件を設定する工程と、
(c)前記細胞または組織から、あるいは前記細胞または組織が培養されたメディアから、細胞の抗増殖作用を示す水溶性の画分を取得する工程とからなり、
前記抗増殖作用の抗力は可逆的であり、休眠状態にない前記細胞または組織から同様にして画分を取得した場合は該作用を示さないか、あるいは示してもその程度が小さい抽出物の製造方法であり、かつ、
前記プロデューサー細胞またはプロデューサー組織がナルシサス(Narcissus)属の球根から取得した細胞または組織であるか、前記生物体がアルテミア(Artemia)属に属する生物体であることを特徴とする標的細胞または標的組織に対して抗増殖作用を有する抽出物の製造方法。 - 医薬的に受容できる担体(carrier)に医薬的に効果的な量の請求項1に係る抽出物を含有させる工程を有する医薬組成物の製造方法。
- 個体の皮膚の局所適用のために調整された医薬組成物のための、請求項13に記載の医薬組成物の製造方法。
- 経口投与のために調整された医薬組成物のための、請求項13に記載の医薬組成物の製造方法。
- 化粧用途に受容できる担体(carrier)に化粧用途的に効果的な量の請求項1に係る抽出物を含有させる工程を有する化粧用組成物の製造方法。
- 個体の皮膚の局所適用のために調整された化粧用組成物のための、請求項16に記載の化粧用組成物の製造方法。
- 経口投与のために調整された化粧用組成物のための、請求項16に記載の化粧用組成物の製造方法。
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