KR20240020034A - 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법 및 이에 따라 제조된 추출물을 포함하는 피부 항산화 조성물 - Google Patents
알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법 및 이에 따라 제조된 추출물을 포함하는 피부 항산화 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 탈분화 과정 없이 알로에 줄기의 형성층 유래 균일한 줄기세포를 단시간 내에 대량생산 후 배양액을 분리하여 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물을 제조하는 방법 및 이의 추출물을 포함하여 항산화 활성을 2배 이상 증진시킬 수 있는 피부 항산화 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법 및 이에 따라 제조된 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물을 포함하는 피부 항산화 조성물에 관한 것이다.
산화는 생물체의 생물학적 과정에서 연료를 공급하는 에너지 생성에 있어 필수적인 과정이나, 생체 내에서 끊임없이 생성되는 자유 라디칼 및 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 세포사멸과 조직의 손상을 가져온다.
산화적 스트레스는 활성산소종의 생성과 세포의 항산화 방어 시스템 사이의 불균형으로 나타난다. 과도한 활성 산소종 생성은 산화적 스트레스, 세포 기능의 손실, 최종적으로 세포자살(apoptosis)이나 괴사(necrosis)를 야기하며, 활성산소종에 의한 산화적 스트레스는 만성 질병과 피부 노화를 유발하므로 항산화 활성 또는 자유 라디칼 억제는 산화적 스트레스에 의해 야기되는 독성 물질로부터 세포를 보호하는데 있어 매우 중요하다.
특히, 피부노화와 산화작용과의 연관성은 많은 연구를 통하여 잘 알려진 사실이며, 피부노화로 유발되는 주름생성 및 국소적인 흑화 현상도 이런 산화현상과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다. 같은 연령이라 할지라도 나이보다 훨씬 젊어 보이는 사람이 있는가 하면, 또 어떤 사람은 실제보다 훨씬 나이가 들어 보이는 경우도 있다. 피부주름 생성 및 국소적인 흑화 현상과 같은 노화 현상의 원인으로는 나이의 증가 등의 내인성 요인, 골격과 근육의 모양, 근육의 지속적인 이완과 수축에 의한 유전적인 요인, 및 환경오염물질, 스트레스 등에 의한 환경적인 요인으로 분류할 수 있다. 상기의 다양한 요인에 의한 피부 노화 현상으로 각질 형성 세포 및 섬유아 세포의 분열감소, 콜라겐 합성의 감소, MMP 생성의 증가, 멜라닌 생성의 신호 전달 증가 등으로 인한 주름은 증가하게 되고 피부의 탄력은 감소하며, 기미, 주근깨 및 검버섯은 증가하게 된다.
최근 연구에 의하면 건강한 피부의 경우는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(Superoxide Dismutase), 카탈레이즈(Catalase)로 대표되는 생체 항산화 방어인자에 의해 자유라디칼(Free Radical)이 제거되고 있지만, 이러한 제거가 완전하지 않을 경우 활성산소(자유라디칼의 일종)에 의한 산화작용이 발생되어 피부세포 및 조직의 기능이 저하되며 이러한 원인으로 피부주름 생성 및 국소적인 흑화현상이 촉진되는 것으로 알려졌다. 이런 생체 산화반응성이 강한 활성산소는 외적요인(공해, 스트레스) 및 내적요인(생체내 에너지 대사과정)에서 생성이 촉진되며, 지방질과 결합하여 과산화 지질이라고 하는 해로운 물질을 만들기도 한다. 상기 과산화 지질은 혈관에 작용하여 동맥경화나 혈전증을 비롯해 각종 성인병을 유발시킨다. 또한, 건강한 피부와 밀접한 관련이 있는 콜라겐의 생성 능력 저하 및 이들 콜라겐 섬유들의 비정상적인 엉킴 현상이 증가하여 피부 탄력이 현저히 저하되며, 피부보습을 담당하는 히아루론산과 당단백질의 일종인 글리코스아미노글리칸의 생성량이 현저히 저하된다.
이와 같은 피부노화 현상을 개선하기 위해 다양한 방법이 응용되고 있다. 대표적인 방법으로는 AHA, 레티노익산, 레티놀, 비타민류 등을 도포하는 방법이 주로 이용되지만, 이들은 피부 자극과 임상적인 효능에 대해 많은 논란이 제기되고 있으며, 사용량에 제한과 피부노화의 주요 원인인 활성산소에 의한 산화작용에 대한 근본적인 대처는 되지 못한다. 또한, 항산화 성분을 함유한 식물추출물을 단독으로 사용된 예가 많이 있지만, 만족할 만한 효과를 얻기는 어려운 단점이 있다.
항산화제에 대한 연구는 1969년 McCord와 Fridovich가 수퍼옥사이드 라디칼을 소거하는 효소인 SOD를 발견한 것을 계기로 본격적으로 진행되었으며, 최근에는 노화나 성인병 등의 질환이 활성산소와도 관련된 것으로 밝혀져 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있고, 합성 항산화제의 잠재적인 부작용 위험으로 인해 식물유래 천연 항산화제의 연구가 많은 관심을 받고 있다.
알로에는 백합과(Liliaceae)에 속하는 열대 또는 아열대 다년생 식물로서 세계 전역에서 재배되고 있으며, 그 종류만도 300 ~ 360여 종에 달하고 있다. 국내에서 주로 지배되고 있는 품종은 알로에 베라(Aloe vera)와 알로에 아보레센스(Alloe avoresence)이다. 알로에 겔은 99 %가 수분이며, 영양성분은 만노오스(mannose), 글루코오즈(glucose)가 주성분인 다당류와 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine), 아스파라진(asparagine) 등의 아미노산 그리고 K, Na, Ca 등의 무기질 등을 함유하고 있다.
또한, 생리활성 물질로는 알로에 에모딘(aloe emodine), 바발로인(barbaloin), 알로에신(aloesin) 등의 페놀화합물과 스테롤(sterol) 및 터페노이드(terpenoid) 등이 있으며, 항산화 활성, 항균 작용, 항종양 작용, 살균 작용, 소염 작용, 조직 형성 작용 등이 있는 것으로 알려져 있어 예로부터 민간요법으로 화상, 피부 질환, 소화기계 질병 치료로 사용되고 있고 난치성 성인병의 예방 및 개선치료에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 이러한 효능 및 성분에 대한 연구는 2년 내지 3년 이상 성장한 성체 알로에 잎을 중심으로 연구된 결과이며, 생육기간에 따라 달라지는 알로에의 효능에 대한 연구와 세포 수준에서의 연구는 거의 없다. 알로에는 생육기간에 따라 외형적으로는 크기와 두께 등에서 차이를 보여 생육기간이 3개월 된 알로에는 평균 20 cm, 6개월 된 알로에는 평균 45 cm의 크기를 나타내며, 생리활성 측면에서 차이를 보이지만 생육기간 동안 세포 수준에서의 생리활성에 대한 연구는 전무한 실정이다.
특히, 알로에의 항산화 활성을 증진시키기 위해 추가적으로 처리하는 공정들이 제시되어 있을 뿐, 생육기간 동안에 세포 수준에서의 연구를 기초하여 알로에의 항산화 활성을 증진시키는 기술적 특징에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 탈분화 과정 없이 알로에 줄기의 형성층 유래 균일한 미분화된 알로에 줄기세포를 단시간 내에 대량생산 후 배양액을 분리하여 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물을 제조하는 방법 및 이의 추출물을 포함하여 항산화 활성을 2배 이상 증진시킬 수 있는 피부 항산화 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 일실시예에서, (a) 알로에 줄기를 무균처리한 후 형성층을 채취하는 단계; (b) 상기 형성층으로부터 알로에 캘러스(aloe callus)를 유도하는 단계; (c) 상기 유도된 알로에 캘러스의 현탁배양을 통해 알로에 줄기세포를 대량 배양하는 단계; 및, (d) 상기 대량 배양된 알로에 줄기세포만을 분리하는 단계;를 포함하는 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 알로에는 3 내지 6 개월 생육한 알로에인 것일 수 있다.
상기 (b)단계에서 알로에 캘러스를 유도하는 단계는, 상기 알로에 캘러스를 pH 5.0 내지 6.0의 고체배지에서 4 내지 7 주 동안 배양하는 것일 수 있다.
상기 (b)단계에서 알로에 캘러스를 유도하는 단계는, 탈분화가 일어나 미분화된 세포조직을 형성하는 것일 수 있다.
상기 (c)단계에서 대량 배양하는 단계는, 미분화된 알로에 줄기세포를 대량 배양하는 것일 수 있다.
상기 (c)단계에서 대량 배양하는 단계는, 상기 유도된 알로에 캘러스를 고체배지에서 계대배양한 후, 알로에 줄기세포를 분리하여 현탁배양 배지에서 계대배양하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 일실시예에서, 상기 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법에 따라 제조된 알로에 형성층 유래 줄기세포 추출물을 유효성분으로 포함하고, 항산화 활성을 증진시키는 효능을 가지는 피부 항산화 조성물을 제공한다.
상기 알로에 줄기세포 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.005 내지 50 중량%를 포함하는 것일 수 있다.
상기 피부 항산화 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭, 보조제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 피부 항산화 조성물은 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이, 컨실 스틱(conceal stick), 발포(foam) 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 형태인 것일 수 있다.
본 발명의 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법은 알로에 줄기의 형성층을 알로에 조직배양의 절편체로 사용하여 단기간 내에 세포의 대량생산이 가능하고, 알로에 형성층만을 이용하여 캘러스를 유도한 후 균질한 세포주를 분리함으로써 유용한 알로에 줄기세포가 안정적으로 증식할 수 있다.
또한, 다양한 조직 또는 세포로의 분화능 및 동시에 배양 시 변이가 없음을 확인함으로써, 탈분화에 의한 변이의 문제를 해결하고 안정적으로 증식이 가능한 유전적 안정성이 높은 알로에 줄기세포를 확보할 수 있다.
더불어, 상기 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물을 포함하는 피부 항산화 조성물은 항산화 활성을 2배 이상 증진시킬 수 있는 특성이 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 줄기세포(AloStem) 제조공정도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 유묘 줄기로부터 채취한 형성층을 배양한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 형성층 및 캘러스 분리 후 계대배양 한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 캘러스 계대배양 후 액체배지에서 현탁배양 한 결과와 배양된 줄기세포 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 추출물 대비 알로에 줄기세포 추출물의 HPLC 분석결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 추출물 대비 알로에 줄기세포 추출물의 DPPH 항산화 색도비교 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 추출물 대비 알로에 줄기세포 추출물의 DPPH 항산화 측정결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 줄기세포 추출물 함유 제형의 in vitro 실험에서 콜라겐, 엘리스틴 히알루론산 생성을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 줄기세포 추출물 함유 제형의 탄력 개선에 의한 리프팅 효과를 인체 임상 (in vivo) 실험으로 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 유묘 줄기로부터 채취한 형성층을 배양한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 형성층 및 캘러스 분리 후 계대배양 한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 캘러스 계대배양 후 액체배지에서 현탁배양 한 결과와 배양된 줄기세포 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 추출물 대비 알로에 줄기세포 추출물의 HPLC 분석결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 추출물 대비 알로에 줄기세포 추출물의 DPPH 항산화 색도비교 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 추출물 대비 알로에 줄기세포 추출물의 DPPH 항산화 측정결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 알로에 줄기세포 추출물 함유 제형의 in vitro 실험에서 콜라겐, 엘리스틴 히알루론산 생성을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 알로에 줄기세포 추출물 함유 제형의 탄력 개선에 의한 리프팅 효과를 인체 임상 (in vivo) 실험으로 확인한 결과이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "알로에 캘러스(aloe callus)"란 식물 캘러스 조직 중 미색의 조직으로서 평소에는 식물조직과 유사한 기능을 하나, 식물생장조절제(plant growth hormone) 등 물리적 스트레스에 의해 식물의 암조직과 유사한 형태로 증식하는 조직을 의미한다. 일반 식물조직과는 달리 세포나 조직분화가 빠르며 미토콘드리아, 액포, 소포체 등을 풍부하게 함유하고 있어 급격한 대사와 증식이 빠른 캘러스로 분화되고 있는 세포조직이다.
알로에 줄기의 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로서 알로에 조직배양의 절편체로 사용 시 단기간 내에 세포의 대량생산이 가능하고 알로에 형성층만을 이용하여 캘러스를 유도 후 균질한 세포주를 분리함으로써 유용한 알로에 줄기세포가 안정적으로 증식되고, 다양한 조직 또는 세포로의 분화능을 확인함과 동시에 배양 시 변이가 없음을 확인하고(미분화된 알로에 줄기세포 수득), 탈분화에 의한 변이의 문제를 해결하고 안정적으로 증식이 가능한 유전적 안정성이 높은 알로에 줄기세포를 확보할 수 있다.
기존에는 캘러스로부터 부정근과 유묘 등을 유도하여 배양을 하였으나, 본 발명은 알로에의 항산화 활성을 증가할 수 있는 방법을 연구하던 중, 알로에 형성층 유래 줄기세포 배양액 및 이의 추출물을 포함하는 피부개선용 항산화 조성물을 발명함으로써, 항산화 활성을 2배 이상 증진시킬 수 있는 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명은 (a) 알로에 줄기를 무균처리한 후 형성층을 채취하는 단계; (b) 상기 형성층으로부터 알로에 캘러스(aloe callus)를 유도하는 단계; (c) 상기 유도된 알로에 캘러스의 현탁배양을 통해 알로에 줄기세포를 대량 배양하는 단계; 및, (d) 상기 대량 배양된 알로에 줄기세포만을 분리하는 단계;를 포함하는 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 알로에 껍질 캘러스 유래 나노 엑소좀의 제조방법은, 우선, 상기 (a)단계에서 알로에 줄기를 무균처리한 후 형성층을 채취한다.
알로에는 생육기간에 따라 외형적으로는 크기와 두께 등에서 차이를 보여 생육기간이 3 개월인 알로에는 평균 20 cm, 6 개월인 알로에는 평균 45 cm의 크기를 나타내며, 생리활성 측면에서 2년 내지 3년 이상 성장한 성체 알로에와 차이가 있지만, 생육기간 동안 세포 수준에서의 생리활성에 대한 연구는 전무한 실정이다. 본 발명에서 사용한 알로에는 3 내지 6 개월 생육한 알로에인 것일 수 있다.
상기 (b)단계에서는, 상기 형성층으로부터 알로에 캘러스(aloe callus)를 유도한다.
본 발명에 따른 알로에 줄기세포 추출물은 알로에 줄기에서 채취한 형성층을 사용하여 캘러스 유도를 향상시킬 수 있다. 식물에 있어서 형성층은 식물이 부피 생장할 수 있도록 하는 조직인데, 이 조직은 줄기나 뿌리의 목질부와 체관부 사이에 존재하며 활발히 분열하여 줄기나 뿌리가 굵어지게 한다. 따라서 식물체의 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직의 특성을 이용하여 알로에 줄기세포를 단기간 내에 대량생산을 가능하게 할 수 있다.
또한, 상기 (b)단계에서 알로에 줄기에서 채취한 형성층을 사용하여 캘러스를 유도하면 탈분화가 일어나 미분화된 세포조직을 형성하는 것일 수 있다.
상기 (b)단계에서 알로에 캘러스를 유도하는 단계는, 상기 알로에 캘러스를 pH 5.0 내지 6.0의 고체배지에서 4 내지 7 주 동안 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 pH는 5.0 내지 5.5, 5.5 내지 6.0 또는 5.7 내지 5.7일 수 있다.
상기 (c)단계에서는, 상기 유도된 알로에 캘러스의 현탁배양을 통해 알로에 줄기세포를 대량 배양한다.
상기 (c)단계에서 대량 배양하는 단계는, 미분화된 알로에 줄기세포를 대량 배양하는 것일 수 있다.
상기 (c)단계에서 대량 배양하는 단계는, 상기 유도된 알로에 캘러스를 고체배지에서 계대배양한 후, 알로에 줄기세포를 분리하여 현탁배양 배지에서 계대배양하는 것일 수 있다.
상기 대량 배양하는 단계는, 상기 계대배양한 알로에 줄기세포를 현탁배양 배지에서 5 내지 8 주, 5 내지 7 주, 6 내지 8 주 또는 6 내지 7 주 동안 배양하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법에 따라 제조된 알로에 형성층 유래 줄기세포 추출물을 유효성분으로 포함하고, 항산화 활성을 증진시키는 효능을 가지는 피부 항산화 조성물을 제공한다.
상기 알로에 줄기세포 추출물은 피부 항산화 조성물 총 중량에 대하여 0.005 내지 50 중량%를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 알로에 줄기세포 추출물은 피부 항산화 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 50 중량%, 0.1 내지 50 중량%, 1 내지 50 중량%, 10 내지 50 중량%, 0.005 내지 40 중량%, 0.005 내지 20 중량%, 1 내지 30 중량%, 1 내지 15 중량% 또는 2 내지 10 중량%를 포함하는 것일 수 있다.
상기 피부 항산화 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 알로에 줄기세포 추출물은 항산화 활성 증진, 피부 미백 및 주름개선 효과가 있을 수 있다.
상기 피부 항산화 조성물은 항산화 활성이 증진된 알로에 줄기세포 추출물에 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
상기 피부 항산화 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭, 보조제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 피부 항산화 조성물은 유화 제형 및 가용화 제형의 형태일 수 있고, 예를 들어, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이, 컨실 스틱(conceal stick), 발포(foam) 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 형태인 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 피부 항산화 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형일 수 있다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 알로에 줄기로부터 무균처리 후 형성층 채취단계
대한민국 제주도 성산읍에 위치한 (주)김정문알로에 제주 농공장으로부터 3 내지 5개월 생육한 알로에 유묘를 20촉 정도 샘플로 수집하여 충남대학교 식물조직배양실에서 알로에 유묘의 줄기로부터 형성층을 채취하였다. 채취한 재료들은 NaOCl(30% 클로락스) + H2O2(10% 과산화수소수)에 1~3분간 표면살균을 수행 후 1% 하이포아염소산나트륨 용액에 48시간 침적시킨 후 멸균수로 3~4회 세척하여 알로에 줄기로부터 형성층만을 채취하여 실험재료로 사용하였다.
이때 알로에 유묘의 줄기는 0.05~0.1 cm 정도의 크기로 횡단하여 자른 후 디스크로 만들어 형성층의 횡단면이 배지의 표면에 닿도록 하였다(도 1 참조).
실시예 2: 캘러스 유도배지에서 상기 형성층으로부터 캘러스 유도단계
실시예 1에서 알로에의 유묘 줄기에서 채취한 형성층에서 캘러스를 유도하기 위하여 각각 다른 식물생장조절물질, 즉, 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), NAA(α-naphtalene acetic acid), IAA(Indole-3-acetic acid), IBA(3-Indolebutyric acid)와 고체배지 제조 시 2.5g/L 겔라이트(gelrite), 30g/L 수쿠로스(sucrose)가 첨가된 MSO(Murashige, T. and Skoog F., 1962) 배지를 기본배지로 하여 배지를 제조하였다.
고체배지는 겔라이트(gelrite) 첨가 전에 pH 5.7로 조정하여 121℃, 1.2기압에서 15분간 고압 멸균하여 사용하였다. 멸균된 배지는 약 25~30 mL씩 페트리디쉬(petridish)에 분주하여 표면살균 과정을 거친 알로에 형성층 절편을 치상하였다. 실험재료의 배양은 25±3℃의 암배양 조건하에서 수행하였다.
본 실시예에서 사용된 MSO 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.
실험결과는 도 2의 (a)에서와 같이, 알로에 유묘를 MSO 고체배지에 치상하여 도 2의 (b)과 같이 배양 10~20일째부터 형성층에서 탈분화에 의한 연갈색의 캘러스가 유도되기 시작하여 배양 30일째는 상당량의 캘러스가 형성되었다.
실시예 3: 세포 증식배지에서 캘러스의 현탁배양을 통한 세포증식 단계
배양 30일 경과 후 부터 배양된 형성층과 캘러스층으로 분리되기 시작했다(도 3의 (a)). 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다려 완벽한 분리가 이루어진 후, 각기 다른 페트리디쉬에 분리 배양하였고 분리 후, 생장률이 좋은 신생 캘러스 부분을 떼어내어 새로운 배지에서 7~10일 정도 계대배양 하였다(도 3의 (b)).
고체배지에서 계대배양 후 분리한 형성층 유래 줄기세포를 아래의 표 2의 현탁배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±3℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 45일 내외로 하여 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다(도 4의 (a)).
알로에 형성층 유래 줄기세포를 현탁배양 배지에서 계대배양 후 세포 응집도를 현미경(Microscope OTM75, Olympus, Japan)으로 검경한 결과, 알로에 줄기세포는 도 4의 (b)에 나타낸 바와 같이, 현탁배양 시 많은 수의 단세포를 포함하며, 일부는 매우 작은 사이즈(100~500㎛)의 세포 집합체로 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 (b)).
추가적으로 증식배양 완료 후 계대배양 되기 전에 본 발명에 따른 줄기세포와 캘러스 (PC10623)의 세포를 샘플링하여 2% Evan's blue staining (5min) method를 이용하여 세포 생존율(%)을 산출한 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 줄기세포는 98.27%가 살아있는 세포인 반면에 캘러스는 71.31%만 살아있는 세포로 확인되었다.
실시예 4: 증식된 알로에 줄기세포 추출물 및 원료화 샘플 제조
실시예 3과 같이 45일 내외로 현탁배양한 알로에 줄기세포를 수거하기 위해서 배양액을 80~90℃로 3~4시간 가온 추출 후 3,000g에서 10분간 원심 분리시켜 상층액을 취함으로써 추출물[화장품 성분명 표준화 등록 완료(접수번호: 22627-10-00001 / 상품명: 알로스템(Alostem) / 등록일자: 2022.08.01. / 알로에베라분열조직세포배양추출물)]을 회수하였다. 얻어진 줄기세포 추출물은 회전진공농축기를 이용하여 농축하여 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조 후 원료화 샘플을 제조하였고 제형실험을 위해서 보존제(예; 1,2 Hexanediol 2% + Ethylhexylglycerin 0.1%) 처리 후 사용하였다.
제조예 1: 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 크림 제형 조성물
본 실시예 4로부터 얻은 알로에 줄기세포 추출물을 사용하여 하기 표 4에 나타낸 조성물 및 중량부에 따라 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 크림 제형 조성물을 제조하였다.
제조예 2: 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 로션 제형 조성물
본 실시예 4로부터 얻은 알로에 줄기세포 추출물을 사용하여 하기 표 5에 나타낸 조성물 및 중량부에 따라 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 로션 제형 조성물을 제조하였다.
제조예 3: 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 스킨 제형 조성물
본 실시예 4로부터 얻은 알로에 줄기세포 추출물을 사용하여 하기 표 6에 나타낸 조성물 및 중량부에 따라 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 스킨 제형 조성물을 제조하였다.
제조예 4: 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 마스크팩 제형 조성물
본 실시예 4로부터 얻은 알로에 줄기세포 추출물을 사용하여 하기 표 7에 나타낸 조성물 및 중량부에 따라 알로에 줄기세포 추출물 함유 피부 마스크팩 제형 조성물을 제조하였다.
실험예 1: 알로에 줄기세포 추출물의 2차 대사산물 분석
Agilent HPLC(Agilent Technological, USA)를 사용하여 실시예 4로부터 얻은 추출물의 2차 대사 산물을 측정하였다. 컬럼은 YMC-Pack Pro C18(250×4.6 mml.D. S-5 ㎛, 12 nm)를 사용하였고, 이때 컬럼의 온도는 40℃로 조절하였다. 100% 물(A)과 100% 아세토나이트릴 용액(B)을 이동상으로 하여 HPLC를 수행하였다.
상기 이동상 조건은 표 8에 나타내었으며 120분간 0.2 ㎖/분의 유속으로 유지하였다. 컬럼에서 분리된 물질들의 LC-MS 분석은 사중극자 질량분석 검출기(quadrupole mass spectrometer detector; HP1100LC-MSD, Agilent Technologies, Canada)를 이용하였다. 2차 대사 산물은 220 ㎚에서 측정하였다.
대조군인 알로에 추출물과 실험군인 알로에 줄기세포 추출물의 2차 대사산물의 변화량은 3반복으로 주요 피크의 면적 값을 이용하였으며, 대조군을 100%로 하여 상대적인 값을 구하였다.
실험결과, 대조군인 알로에 추출물는 대표적으로 13.751분, 30.263분, 88.125와 91.517분 피크의 물질이 생성되는 것을 확인하였고(도 5의 (a) 참조), 실험군인 알로에 줄기세포 추출물은 대표적으로 13.751분, 30.263분, 88.125와 91.517분 이외에도 16.328분 피크에 신생물질이 13.751분 피크와 거의 동등한 수준으로 생성되는 것을 확인하였다(도 5의 (b) 참조).
실험예 2: 알로에 줄기세포 추출물의 DPPH 항산화 활성 측정
DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)는 황산화 물질로부터 전자나 수소를 받아 비가역적으로 안정한 분자를 형성하므로 전자공여능으로부터 항산화 활성을 측정할 수 있는데, 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 자유 라디칼이 소거되며 이때의 DPPH 고유의 청남색이 엷어지는 특성이 있고 이 색차를 비색 정량하여 전자공여능력을 측정하는 항산화 활성측정 방법이다. 알로에 추출물 대비 알로에 줄기세포 추출물의 DPPH 항산화 색도비교 결과, 양성대조군인 아스코르브산과 알파-토코페롤 대비 알로에 추출물(도 6의 (a))과 알로에 줄기세포 추출물(도 6의 (b))의 DPPH 항산화 색도차이가 확연히 차이가 있었다(도 6 참조).
또한, 1.0 ㎎/㎖의 알로에 추출물과 알로에 줄기세포 추출물 각각 500 ㎕에 0.2 mM DPPH 500 ㎕를 첨가하여 섞은 후 상온에서 30분간 반응시킨 후, 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였으며, 음성 대조군으로는 추출용매 30% 에탄올을 사용하였다. DPPH 저해활성은 아래의 수학식에 따라 샘플용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
저해율 (%) = (1-샘플 첨가군 흡광도 / 샘플 무첨가군 흡광도) × 100
실험결과, 양성대조군인 아스코르브산은 0.01 mg/ml의 농도에서 95.3% 활성을 나타냈으며, 알로에 추출물 (2.0 mg/ml)은 33.1%의 활성을 나타냈으며, 알로에 줄기세포 추출물(2.0 mg/ml)의 경우, 항산화 활성이 70.8%로 항산화 활성을 나타내서 2배 이상의 항산화 활성이 나타나는 것을 확인하였다(도 7 참조).
따라서, 알로에 줄기세포 추출물은 알로에 추출물보다 항산화 활성이 2배 이상 증진되므로 본 발명의 알로에 줄기세포 추출물은 다양한 화장품 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 3: 알로에 줄기세포 추출물 함유 제형에 대한 in vitro 및 in vivo 평가
한국피부과학연구원에서 2022.2.11부터 3.31까지 성인남녀 21명 대상 인간진피섬유아세포인 Normal Human Dermal Fibroblasts(NHDFs)를 24시간동안 처리 후 COL1A1 발현 조절 여부 확인(1), ELASTIN 발현율 확인(2), qRT-PCR assay를 통한 콜라겐, 엘리스틴 히알루론산 생성 관련 유전자 발현 확인(3)하였다(도 8 참조).
또한, 한국피부과학연구원에서 2022.2.11부터 3.31까지 성인남녀 21명 대상사용 전과 2주 사용 후 비교한 결과, VECTRA-XT Dermal Torque Meter, 안면부위에 탄력 개선에 의한 리프팅 효과에 있어서 개인차가 있음을 확인하였다(도 9 참조).
Claims (10)
- (a) 알로에 줄기를 무균처리한 후 형성층을 채취하는 단계;
(b) 상기 형성층으로부터 알로에 캘러스(aloe callus)를 유도하는 단계;
(c) 상기 유도된 알로에 캘러스의 현탁배양을 통해 알로에 줄기세포를 대량 배양하는 단계; 및,
(d) 상기 대량 배양된 알로에 줄기세포만을 분리하는 단계;를 포함하는 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 알로에는 3 내지 6 개월 생육한 알로에인 것인 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 (b)단계에서 알로에 캘러스를 유도하는 단계는,
상기 알로에 캘러스를 pH 5.0 내지 6.0의 고체배지에서 4 내지 7 주 동안 배양하는 것인 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 (b)단계에서 알로에 캘러스를 유도하는 단계는,
탈분화가 일어나 미분화된 세포조직을 형성하는 것인 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 (c)단계에서 대량 배양하는 단계는,
미분화된 알로에 줄기세포를 대량 배양하는 것인 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 (c)단계에서 대량 배양하는 단계는,
상기 유도된 알로에 캘러스를 고체배지에서 계대배양한 후, 알로에 줄기세포를 분리하여 현탁배양 배지에서 계대배양하는 것인 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 알로에 형성층 유래 줄기세포 추출물을 유효성분으로 포함하고,
항산화 활성을 증진시키는 효능을 가지는 피부 항산화 조성물.
- 제 7 항에 있어서,
상기 알로에 줄기세포 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.005 내지 50 중량%를 포함하는 것인 피부 항산화 조성물.
- 제 7 항에 있어서,
상기 피부 항산화 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭, 보조제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 피부 항산화 조성물.
- 제 7 항에 있어서,
상기 피부 항산화 조성물은 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이, 컨실 스틱(conceal stick), 발포(foam) 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 형태인 것인 피부 항산화 조성물.
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| KR1020220097987A KR20240020034A (ko) | 2022-08-05 | 2022-08-05 | 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법 및 이에 따라 제조된 추출물을 포함하는 피부 항산화 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020220097987A KR20240020034A (ko) | 2022-08-05 | 2022-08-05 | 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법 및 이에 따라 제조된 추출물을 포함하는 피부 항산화 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20240020034A true KR20240020034A (ko) | 2024-02-14 |
Family
ID=89896934
Family Applications (1)
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| KR1020220097987A KR20240020034A (ko) | 2022-08-05 | 2022-08-05 | 알로에 형성층 유래 알로에 줄기세포 추출물의 제조방법 및 이에 따라 제조된 추출물을 포함하는 피부 항산화 조성물 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR20240020034A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102373819B1 (ko) | 2020-10-29 | 2022-03-14 | 임지영 | 항산화 화장품 및 이의 제조 방법 |
-
2022
- 2022-08-05 KR KR1020220097987A patent/KR20240020034A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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