KR102169240B1 - 결명 새싹 유래 나프토파이론 유도체를 포함하는 신경세포 보호용 조성물 - Google Patents

결명 새싹 유래 나프토파이론 유도체를 포함하는 신경세포 보호용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나프토파이론 유도체 및 이를 포함하는 결명 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 항산화 효과, 및 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하거나 신경세포 사멸을 억제하는 효과가 있으며, 특히, 글루타메이트 독성에 의한 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸을 억제하는 효과가 있어, 시신경 손상에 따른 시력저하와 감퇴 및 안질환 치료 또는 예방, 뇌신경 손상에 따른 기억력 감퇴, 학습능력 감퇴, 우울장애 발생 및 악화와 퇴행성 뇌신경 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 또는 식품 조성물로서 사용될 수 있다.

Description

결명 새싹 유래 나프토파이론 유도체를 포함하는 신경세포 보호용 조성물 {Composition for protecting neuronal cells comprising naphthopyrone derivatives derived from the sprout of Cassia obtusifolia L.}
본 명세서는 나프토파이론 유도체 및 이를 포함하는 결명 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
뇌 해마(hippocampus)는 뇌 내측 측두엽의 한 구조체로써, 인간과 동물의 인지적 기능에 중요한 역할을 한다. 해마는 생리적/산화적 스트레스 자극에 취약하고 스트레스로 인한 인지기능의 손상을 일으키는데 중심 조직으로 알려져 있다. 스트레스는 해마의 구조와 뇌세포 생성, 시냅스 가소성 및 해마와 관련된 행동학적 변화를 일으킬 수 있다. (김은주, 한국심리학회지: 인지 및 생물, 2012, 24, 65-88). 신경세포에서의 산화적 스트레스가 해마, 뇌하수체, 선조체, 흑질, 전뇌피질 또는 시상하부에서 유발되면 신경세포사멸이 증가하고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 파킨슨병 또는 뇌허혈성 신경손상 등의 급성 또는 만성 신경질환을 초래하는 것으로 알려져 있다. (Rahman, T. et al. Adv. Biosci. Biotechnol. 2012, 3, 997-1019)
국민건강보험공단 건강보험 자료에 의하면 망막질환 환자는 2010년 약 83만명에서 2015년에 약 125만명으로 연평균 약 8% 증가해 왔다. 망막은 카메라의 필름에 비유되는 눈 내부의 얇은 신경막이다. 망막에는 일억개 이상의 광수용체 세포(빛감지 세포) 및 백만개 이상의 시신경 세포가 존재하여 빛을 전기적 신호로 바꾸고 신경을 통해 눈으로 보는 사물의 상을 뇌로 전달한다. 이러한 망막의 신경이 손상되거나 신경 기능에 이상이 생기면 시력과 시야에 문제가 생긴다. 대표적인 망막질환은 시력 저하, 시야 방해 및 실명을 포함하여 당뇨병성 망막병증, 연령 관련 황반변성, 망막색소변성, 망막박리 및 망막혈관폐쇄 등이 있다. 녹내장은 망막의 시신경 손상이 발생하는 대표적인 안질환으로, 안압상승, 허혈 및 산화스트레스 등의 이유로 시신경이 손상된다. (Kim, N. Y. et al. J. Korean Opthalmol. Soc. 2015, 56, 70-79; Kang, J. H. et al. J. Korean Ophthalmol. Soc. 2003, 44, 965-970; Lee, S. M. et al. J. Korean Ophthalmol. Soc. 2002, 43, 2577-2584)
글루타메이트는 척추동물의 중추신경계에서 중요한 역할을 하는 흥분성 신경전달물질이다. 글루타메이트는 뇌 조직 중에서 기억력과 학습능력에 관여한다고 알려진 소뇌편도와 해마에 집중적으로 분포되어 있는 quisqualate 수용체, NMDA (N-methyl-D-aspartate) 수용체 및 Kainite 수용체에 작용하여 다양한 생리작용 발현에 관여한다. 반면, 글루타메이트가 신경세포 내에서 밖으로 유리가 증가되어 세포 밖의 글루타메이트 농도가 급속히 증가하게 되면 산화적 신경독성 물질로 작용할 수 있다. (김현정 등, J. Life Sci. 2009, 19, 963-967) 과도한 글루타메이트(Glutamate)는 빈혈, 산소결핍, 저혈당, 트라우마, 여러 만성 퇴행성 신경질환을 포함한 다양한 급성 신경학적 장애와 관련되어 있다고 알려져 있다. 눈에서 글루타메이트는 망막 신경절세포의 급성적인 장애와 사멸에 관련되어 있다. (Otori, Y. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998, 39, 972-981) 글루타메이트가 다량 생성되어 시냅스전(presynaptic) 글루타메이트 수용체가 활성화되면서 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)의 과생성이 자극되는 것으로 알려져 있다. (Tarasenko A. et al. Neurochem. Int. 2012, 61, 1044-1051) 또한, 글루타메이트에 반응하여 발휘되는 산화작용은 NMDA 수용체의 활성화에 의해 매개되며, 칼슘이온 의존성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 과도한 NMDA 수용체 활성화와 칼슘이온의 미토콘드리아로의 흡수(uptake)는 ROS 생성으로 이어지는 것으로 보고되었다. (Reynolds I. J. et al. J. Neurosci. 1995, 15, 3318-3327) 활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 생물체 세포 내의 미토콘드리아에서 호흡과 면역 반응에 의한 산소의 산화·환원을 통해 지속적으로 생성된다. ROS는 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 생체내의 지질, 핵산, 단백질 등과 반응하여 DNA 손상, 세포내 유리 칼슘과 철 농도 증가, 생체막의 이온 수송계 손상 등을 일으킬 수 있다. (Kiselyov, K. et al. Cell Calcium. 2016, 60, 108-114) 또한, ROS는 빛에 의해 생성이 유도되기도 하여 시신경의 광산화 손상을 유도하는 것으로 알려져 있다. (Masuda, T. et al. Oxid. Med. Cell. Longevity. 2017; article ID 9208489, 14 pages)
결명자는 전통적으로 눈 건강을 위해 활용되어 왔으며 우수한 항산화 작용을 가진다고 알려졌다. 결명자는 콩과에 속하는 초본인 결명(Cassia obtusifolia L.) 또는 긴강남차 (Cassia tora L.)의 성숙한 종자로서 우리나라 각지에서 재배되며, 잎이 진 뒤에 약 10 cm 정도 되는 활모양의 꼬투리 속에 윤기가 나는 종자가 한 줄로 들어 있다. (Yen, G.-C. et al. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 820-824) 결명자 추출물은 당뇨병 개선, 이상지질혈증 개선, 간보호, 항균, 혈압저하 효능이 연구·보고되었다. (Dong, X. et al. Mol. Med. Rep. 2017, 16, 2331-2346)
그러나, 결명 새싹 추출물 또는 이로부터 유래한 나프로파이론 유도체인 7-하이드록시무시지닐-루브로푸사린-8'-O-글루코사이드 (7-hydroxymusizinyl-rubrofusarin-8'-O-glucopyranoside), 이소토라락톤 (isotoralactone), 토라락톤 (toralactone), 토로사크리손 (torosachrysone) 및 루브로푸사린 (rubrofusarin)의 글루타메이트 유도 신경독성에 대한 신경보호작용은 보고된 바 없으며, 결명 새싹 추출물을 활용한 항산화 및 신경보호용 조성물에 대한 기술은 알려진 바 없다.
또한, 결명 새싹 추출물을 활용한 건강 기능성 및 약효성분 연구개발 사례는 보고된 바 없는바, 본 발명자들은 결명 새싹 추출물이 결명자 추출물에 비해 새로운 항산화 성분이 생성되어 항산화 활성 성분이 증가되고 이를 통해 현저히 증가된 항산화 작용과 신경세포 보호 작용을 한다는 사실을 본 발명자들이 확인하였으며, 결명 새싹 추출물로부터 분리한 신규 화합물 7-하이드록시무시지닐-루브로푸사린-8'-O-글루코사이드를 포함한 나프토파이론 성분들이 글루타메이트 유도 산화적 스트레스로부터 망막신경세포 및 해마신경세포를 보호하는 효능을 나타낸다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-1503429 B1 KR 10-2010-0082054 A KR 10-0877371 B1 KR 10-1807367 B1 KR 10-2016-0058613 A
Jung, H. A. Journal of Ethnopharmacology, 2016, vol 191, 152-160; Inhibitory activities of major anthraquinones and other constituents from Cassia obtusifolia against β-secretase and cholinesterases. Shrestha, S. et al. Archives Pharmacal Research, 2018, online publication https://doi.org/10.1007/s12272-018-1044-0; Two new naphthalenic lactone glycosides from Cassia obtusifolia L. seeds.
본 명세서의 목적은 하기 화학식 1의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112020021274530-pat00001
본 명세서의 다른 목적은 산화적 스트레스로부터의 신경세포 손상을 보호하거나 신경세포 사멸을 억제하는 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서의 또 다른 목적은 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸에 의해 유발되는 신경 손상성 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서의 또 다른 목적은 항산화 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 일 측면에 있어서, 하기 화학식 1의나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020021274530-pat00002
다른 측면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020021274530-pat00003
[화학식 2]
Figure 112020021274530-pat00004
[화학식 3]
Figure 112020021274530-pat00005
[화학식 4]
Figure 112020021274530-pat00006
[화학식 5]
Figure 112020021274530-pat00007
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 그를 포함하는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹 추출물, 또는 그를 포함하는 결명 새싹 분획물을 유효성분으로 포함하는, 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 그를 포함하는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹 추출물, 또는 그를 포함하는 결명 새싹 분획물을 유효성분으로 포함하는, 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸에 의해 유발되는 신경 손상성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 그를 포함하는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹 추출물, 또는 그를 포함하는 결명 새싹 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 항산화 효과, 및 산화적 스트레스로부터 신경세포를 보호하거나 신경세포 사멸을 억제하는 효과가 있으며, 특히, 글루타메이트 신경독성에 의한 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸을 억제하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 망막신경세포를 보호하여 시신경 손상에 따른 시력저하와 감퇴 및 안질환 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 해마신경세포를 보호하여 뇌신경 손상에 따른 기억력 감퇴, 학습능력 감퇴, 우울장애 발생 및 악화와 퇴행성 뇌신경 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있고, 나아가 기억력과 학습능력 개선, 스트레스 완화 등의 정신건강과 시신경 보호와 시력 저하 개선 등의 눈 건강을 위해 사용될 수 있는바, 약학 또는 식품 조성물로서 사용될 수 있다.
도 1은 결명자 추출물(ST)과 결명 새싹 추출물(STS)의 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 자유라디컬 소거 활성을 나타낸 도이다.
도 2는 결명자 추출물(ST)와 결명 새싹 추출물(STS)의 ABTS 온라인 항산화 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이다. 윗쪽 방향으로 표기된 파란색 선의 크로마토그램은 자외선(UV) 254 nm 에서 검출되는 성분들을 나타낸 도이고, 아랫쪽 방향으로 표기된 붉은색 선의 크로마토그램은 ABTS 시약과 반응하여 UV/VIS(자외선/가시광선) 734 nm에서 검출되는 항산화 성분들을 나타낸 도이다.
도 3은 다양한 빛 조건 하에서 재배된 결명 새싹 추출물(STS-C, STS-385, STS-465, STS-645 및 STS-780)의 ABTS 온라인 항산화 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이다. (A) 내지 (F)의 각 크로마토그램에서 윗쪽 방향으로 표기된 크로마토그램은 자외선(UV) 254 nm 에서 검출되는 성분들을 나타낸 도이고, 아랫쪽 방향으로 표기된 크로마토그램은 ABTS 시약과 반응하여 UV/VIS(자외선/가시광선) 734 nm에서 검출되는 항산화 성분들을 나타낸 도이다. (A)의 시료는 차광 조건에서 2주 동안 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 1의 STS), (B)의 시료는 일반 빛 조건에서 2주 동안 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 2의 STS-C), (C)의 시료는 385 nm LED 조명하에서 2주 동안 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 2의 STS-385), (D)의 시료는 465 nm LED 조명하에서 2주 동안 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 2의 STS-465), (E)의 시료는 645 nm LED 조명하에서 2주 동안 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 2의 STS-645), (F)의 시료는 780 nm LED 조명하에서 2주 동안 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 2의 STS-780)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예인 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS)로부터 분리된 주요 성분들의 피크들을 표기한 HPLC 크로마토그램이다.
도 5는 본 발명의 비교예 1인 결명자 추출물(ST), 차광 조건에서 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 1의 STS) 및 다양한 빛 조건하에서 재배된 결명 새싹 추출물들(실시예 2의 STS, STS-C, STS-385, STS-465, STS-645 및 STS-780)이 글루타메이트(glutamate) 독성에 의해 유발된 망막전구세포(R28) 손상을 보호하는 효능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 결명 새싹 추출물(STS)로부터 분리한 각 화합물(실시예 4 및 5의 화합물 1 내지 화합물 5, 및 비교예 2의 화합물 A 내지 화합물 X)의 농도별 글루타메이트 독성에 의해 유발된 망막전구세포(R28) 손상을 보호하는 효능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 비교예 1인 결명자 추출물(ST), 차광 조건에서 재배한 결명 새싹 추출물(실시예 1의 STS) 및 다양한 빛 조건하에서 재배된 결명 새싹 추출물들(실시예 2의 STS, STS-C, STS-385, STS-465, STS-645 및 STS-780)이 글루타메이트(glutamate) 독성에 의해 유발된 해마신경세포(HT-22) 손상을 보호하는 효능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 결명 새싹 추출물(STS)로부터 분리한 각 화합물(실시예 4 및 5의 화합물 1 내지 화합물 5, 및 비교예 2의 화합물 A 내지 화합물 X)의 농도별 글루타메이트 독성에 의해 유발된 해마신경세포(HT-22) 손상을 보호하는 효능을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 하기 화학식 1의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물에 관한 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112020021274530-pat00008
상기 화학식 1의 나프토파이론 유도체는 7-하이드록시무시지닐-루브로푸사린-8'-O-글루코사이드(7-hydroxymusizinyl-rubrofusarin-8'-O-glucopyranoside)일 수 있다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기관의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전에 기재된 것으로 인지되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다.
본 명세서에서 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱더 바람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.
본 명세서에서 "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 하기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물의 제조방법으로서, 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹(sprout)으로부터 상기 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 분리하는 과정을 포함하는, 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물의 제조방법에 관한 것일 수 있다.
[화학식 1]
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[화학식 2]
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[화학식 3]
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[화학식 4]
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[화학식 5]
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상기 화학식 1의 화합물(나프토파이론 유도체)은 7-하이드록시무시지닐-루브로푸사린-8'-O-글루코사이드일 수 있고, 상기 화학식 2의 화합물(나프토파이론 유도체)은 이소토라락톤(isotoralactone)일 수 있고, 상기 화학식 3의 화합물(나프토파이론 유도체)은 토라락톤(toralactone)일 수 있고, 상기 화학식 4의 화합물(나프토파이론 유도체)은 토로사크리손(torosachrysone)일 수 있고, 상기 화학식 5의 화합물(나프토파이론 유도체)은 루브로푸사린(rubrofusarin)일 수 있다.
상기 새싹은 씨앗을 발아시켜 단기간에 재배한 것으로, 실내에서 종자를 발아시켜 재배한 것일 수 있고, 또는 일반적으로 판매되는 새싹인 것일 수 있다.
상기 제조방법의 결명 새싹(sprout)은 결명(Cassia obtusifolia L.) 또는 긴강남차(Cassia tora L. 또는 Senna tora)의 종자가 발아하여 2일 내지 31일 동안 자연 생장하였거나 재배한 새싹 또는 어린 식물체일 수 있으며, 구체적으로 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상, 16일 이상, 17일 이상, 18일 이상, 19일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 22일 이상, 23일 이상, 24일 이상, 25일 이상, 26일 이상, 27일 이상, 28일 이상, 29일 이상 또는 30일 이상 자연 생장하였거나 재배한 새싹 또는 어린 식물체일 수 있고, 31일 이하, 30일 이하, 29일 이하, 28일 이하, 27일 이하, 26일 이하, 25일 이하, 24일 이하, 23일 이하, 22일 이하, 21일 이하, 20일 이하, 19일 이하, 18일 이하, 17일 이하, 16일 이하, 15일 이하, 14일 이하, 13일 이하, 12일 이하, 11일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하, 7일 이하, 6일 이하, 5일 이하, 4일 이하 또는 3일 이하 자연 생장하였거나 재배한 새싹 또는 어린 식물체일 수 있고, 보다 구체적으로 2일 내지 21일까지의 기간 중 선택된 기간동안 자연 생장하였거나 재배한 새싹 또는 어린 식물체일 수 있다.
상기 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.)은 속씨식물문 쌍떡잎식물강 장미목 콩과의 초본을 의미하며, 결명자는 상기 결명(Cassia obtusifolia L.) 또는 긴강남차(Cassia tora L. 또는 Senna tora)의 성숙한 종자로서 일반적으로 상기 결명(Cassia obtusifolia L.)과 긴강남차(Cassia tora L. 또는 Senna tora)는 혼용되어 판매 및 사용되어 양자의 구별이 어렵다. 결명자 추출물은 당뇨병 개선, 이상지질혈증 개선, 간보호, 항균, 혈압저하 효능이 알려져 있으나(Dong, X. et al. Mol. Med. Rep. 2017, 16, 2331-2346), 산화적 스트레스 또는 약물 독성, 특히 글루타메이트로 인한 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상을 개선하거나 사멸을 억제하는 효능에 대하여는 알려진 바가 없다.
상기 결명 새싹 또는 어린 식물체는 결명 새싹 또는 어린 식물체의 전체 또는 부분일 수 있다. 상기 부분은 전초 또는 지상부 또는 지하부일 수 있다. 상기 지상부는 줄기, 잎, 꽃 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지하부는 뿌리일 수 있다. 상기 식물체는 자연적으로 생장하였거나 또는 인위적으로 재배된 것일 수 있다. 본 발명의 결명 새싹은 실내에서 용이하게 재배할 수 있으며 별도의 영양분 공급 없이 수 주 이내의 단기간에 재배하여 사용할 수 있으므로 산업적 활용성이 크다는 장점을 가진다.
상기 결명 새싹 추출물은 조추출물(crude extract) 또는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 구체적으로, 상기 결명 새싹 추출물은 결명 새싹의 조추출물, 분획물, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조추출물은 결명 새싹을 추출 용매와 접촉시켜 얻어지는 것을 말한다. 상기 분획물은 상기 조추출물에 대하여 특정 성분들을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 추출물, 또는 그의 분획물은 본 발명의 조성물 중에 결명 새싹 식물체의 추출물, 그의 분획물, 또는 소분획물이 각각 또는 그 혼합물로서 포함된 것일 수 있다. 상기 소분획물은 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 것일 수 있으며, 컬럼크로마토그래피 또는 용매분획을 통해 수득한 것일 수 있다. 상기 결명 새싹 추출물 또는 분획물은 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체를 함유하는 것일 수 있다.
상기 분리는 여과, 침지, 원심 분리, 용매분획, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 다양한 조건 즉, 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것으로서 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 고속유체 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 또는 그 조합일 수 있다.
상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에 일정 시간동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있고, 또는 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 가열은 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 또는 환류 온도까지 가열하는 것을 포함할 수 있다. 상기 가열은 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 70℃ 내지 환류 온도, 80℃ 내지 환류 온도, 또는 환류 온도까지 가열하는 것일 수 있다. 상기 추출 시간은 선택된 온도에 따라 달라질 수 있는데 1시간 내지 2개월, 예를 들면, 1시간 내지 1개월, 1시간 내지 15일, 1시간 내지 10일, 1시간 내지 5일, 1시간 내지 3일, 1시간 내지 2일, 1시간 내지 1일, 5시간 내지 1개월, 5시간 내지 15일, 5시간 내지 10일, 5시간 내지 5일, 5시간 내지 3일, 5시간 내지 2일, 5시간 내지 1일, 10시간 내지 1개월, 10시간 내지 15일, 10시간 내지 10일, 10시간 내지 5일, 10시간 내지 3일, 또는 10시간 내지 2일일 수 있다. 상기 추출은 상기 식물체를 용매 중에서 환류 추출하는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1배, 2배, 5배, 10배 또는 15배 이상의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 용매는 상기 식물체 중량에 대하여 1배 내지 15배, 2배 내지 15배, 5배 내지 15배, 10배 내지 15배 또는 약 15배의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 식물체는 음지 또는 차광설비 또는 온풍 또는 건조장치에 건조한 것일 수 있다.
상기 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 냉침법, 마이크로웨이브 추출, 환류냉각 추출, 가압추출, 아임계추출, 초임계추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 침지 추출 방법일 수 있다. 침지 추출은 온침 또는 상온에서 침지하는 것일 수 있고, 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있다. 상기 결명 새싹 식물체는 0.1배 내지 10배 또는 1배 내지 6배의 추출 용매에 접촉되는 것일 수 있다. 냉침 추출온도는 20℃ 내지 40℃인 것일 수 있다. 온침 또는 가열 추출온도는 40℃ 내지 100℃일 수 있다. 냉침 추출시간은 24시간 내지 120시간인 것일 수 있으며, 온침 또는 가열 추출온도는 0.5시간 내지 48시간인 것일 수 있다.
상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 증발 또는 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 감압농축은 진공 감압농축기 또는 진공 회전증발기를 이용하는 것일 수 있다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있다.
상기 제조방법은 상기 결명 새싹을 물, C1 내지 C6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 하여 추출하는 과정을 더 포함하는 일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C3의 알코올, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 알코올일 수 있다. 상기 알코올은 일차 알콜일 수 있다. 상기 C1 내지 C6의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 물, 에틸아세테이트, 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 분획하는 과정을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 제조방법은 상기 결명 새싹을 추출하는 과정을 통해 수득된 추출물의 총 중량을 기준으로 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물이 1 내지 20 중량%로 포함된 결명 새싹 분획물을 제조하는 과정을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상, 15 중량% 이상, 16 중량% 이상, 17 중량% 이상, 18 중량% 이상 또는 19 중량% 이상 포함된 결명 새싹 분획물을 제조하는 과정을 포함하는 것일 수 있고, 20 중량% 이하, 19 중량% 이하, 18 중량% 이하, 17 중량% 이하, 16 중량% 이하, 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 13 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하 또는 2 중량% 이하 포함된 결명 새싹 분획물을 제조하는 과정을 포함하는 것일 수 있다.
상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물은 결명 새싹 추출물 또는 분획물의 총 중량을 기준으로 1 내지 50 중량%로 포함될 수 있고, 구체적으로, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상, 15 중량% 이상, 16 중량% 이상, 17 중량% 이상, 18 중량% 이상, 19 중량% 이상, 20 중량% 이상, 21 중량% 이상, 22 중량% 이상, 23 중량% 이상, 24 중량% 이상, 25 중량% 이상, 26 중량% 이상, 27 중량% 이상, 28 중량% 이상, 29 중량% 이상, 30 중량% 이상, 31 중량% 이상, 32 중량% 이상, 33 중량% 이상, 34 중량% 이상, 35 중량% 이상, 36 중량% 이상, 37 중량% 이상, 38 중량% 이상, 39 중량% 이상, 40 중량% 이상, 41 중량% 이상, 42 중량% 이상, 43 중량% 이상, 44 중량% 이상, 45 중량% 이상, 46 중량% 이상, 47 중량% 이상, 48 중량% 이상 또는 49 중량% 이상 포함될 수 있고, 50 중량% 이하, 49 중량% 이하, 48 중량% 이하, 47 중량% 이하, 46 중량% 이하, 45 중량% 이하, 44 중량% 이하, 43 중량% 이하, 42 중량% 이하, 41 중량% 이하, 40 중량% 이하, 39 중량% 이하, 38 중량% 이하, 37 중량% 이하, 36 중량% 이하, 35 중량% 이하, 34 중량% 이하, 33 중량% 이하, 32 중량% 이하, 31 중량% 이하, 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 28 중량% 이하, 27 중량% 이하, 26 중량% 이하, 25 중량% 이하, 24 중량% 이하, 23 중량% 이하, 22 중량% 이하, 21 중량% 이하, 20 중량% 이하, 19 중량% 이하, 18 중량% 이하, 17 중량% 이하, 16 중량% 이하, 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 13 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하 또는 2 중량% 이하 포함될 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 그를 포함하는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹 추출물, 또는 그를 포함하는 결명 새싹 분획물을 유효성분으로 포함하는, 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 조성물에 관한 것일 수 있다. 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체는 상기 화학식 1의 나프토파이론 유도체, 및 상기 화학식 2 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체일 수 있다.상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체, 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 수화물, 용매화물, 결명 새싹, 결명 새싹 추출물 또는 분획물에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 조성물은 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 조성물일 수 있으며, 구체적으로 대사성 독성, 신경 독성, 화학적 원인 등으로 유도되는 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 조성물일 수 있다. 상기 산화적 스트레스는 글루타메이트(glutamate), 글루타메이트 독성 또는 글루타메이트 신경독성에 의해 유발된 것일 수 있으며, 또는 글루타메이트 신경독성에 의해 유발된 산화적 스트레스와 유사한 칼슘 항상성 조절 이상, 미토콘드리아 기능 이상, 흥분세포 독성, 영양 인자 고갈 등에 의한 산화적 스트레스일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 글루타메이트, 글루타메이트 독성 또는 글루타메이트 신경독성에 의해 유발된 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상을 감소, 억제, 개선, 또는 예방하거나, 사멸된 망막신경세포 또는 해마신경세포를 소생 또는 재생하는 것일 수 있으며, 글루타메이트 신경독성, 칼슘 항상성 조절 이상, 미토콘드리아 기능 이상, 흥분세포 독성, 영양 인자 고갈 등에 의해 유발된 산화적 스트레스에 대한 방어 기작인 항산화 활성화 또는 글루타메이트 대사 조절 등에 의해 신경세포를 보호하거나 신경세포 사멸을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 결명 새싹 추출물은 결명자 추출물에 비하여 DPPH 자유라디컬 소거 효능이 1.7배 이상 우수하였으며(시험예 1), 항산화 성분에 해당하는 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물(나프토파이론 유도체)의 함량이 높아, 보다 우수한 항산화 효과를 나타내어(시험예 2), 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스에 대한 방어 기작인 항산화 작용이 활성화되어 신경세포를 보호하거나 신경세포 사멸을 억제하는 효과가 우수함을 확인하였다.
상기 조성물은 신경세포 손상 또는 사멸 발생 전, 발생과 동시, 또는 발생 후에 처리하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 그를 포함하는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹 추출물, 또는 그를 포함하는 결명 새싹 분획물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량% 포함할 수 있고, 구체적으로 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 10 중량% 이상, 20 중량% 이상, 30 중량% 이상, 40 중량% 이상 또는 60 중량% 이상 포함할 수 있고, 80 중량% 이하, 60 중량% 이하, 40 중량% 이하, 30 중량% 이하, 20 중량% 이하, 10 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하 또는 1 중량% 이하 포함할 수 있다.
또한, 상기 결명 새싹 추출물 또는 분획물은 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 결명 새싹 추출물 또는 분획물의 총 중량을 기준으로 1 내지 50 중량%로 포함할 수 있고, 구체적으로, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상, 15 중량% 이상, 16 중량% 이상, 17 중량% 이상, 18 중량% 이상, 19 중량% 이상, 20 중량% 이상, 21 중량% 이상, 22 중량% 이상, 23 중량% 이상, 24 중량% 이상, 25 중량% 이상, 26 중량% 이상, 27 중량% 이상, 28 중량% 이상, 29 중량% 이상, 30 중량% 이상, 31 중량% 이상, 32 중량% 이상, 33 중량% 이상, 34 중량% 이상, 35 중량% 이상, 36 중량% 이상, 37 중량% 이상, 38 중량% 이상, 39 중량% 이상, 40 중량% 이상, 41 중량% 이상, 42 중량% 이상, 43 중량% 이상, 44 중량% 이상, 45 중량% 이상, 46 중량% 이상, 47 중량% 이상, 48 중량% 이상 또는 49 중량% 이상 포함할 수 있고, 50 중량% 이하, 49 중량% 이하, 48 중량% 이하, 47 중량% 이하, 46 중량% 이하, 45 중량% 이하, 44 중량% 이하, 43 중량% 이하, 42 중량% 이하, 41 중량% 이하, 40 중량% 이하, 39 중량% 이하, 38 중량% 이하, 37 중량% 이하, 36 중량% 이하, 35 중량% 이하, 34 중량% 이하, 33 중량% 이하, 32 중량% 이하, 31 중량% 이하, 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 28 중량% 이하, 27 중량% 이하, 26 중량% 이하, 25 중량% 이하, 24 중량% 이하, 23 중량% 이하, 22 중량% 이하, 21 중량% 이하, 20 중량% 이하, 19 중량% 이하, 18 중량% 이하, 17 중량% 이하, 16 중량% 이하, 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 13 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하 또는 2 중량% 이하 포함할 수 있다.
상기 신경세포는 뇌 해마 또는 눈 망막과 연관된 중추 신경, 말초 신경 또는 시신경일 수 있으며, 구체적으로 망막신경세포 또는 해마신경세포일 수 있다.
상기 망막신경세포는 막대세포(rod cell), 원뿔세포(cone cell), 쌍극세포(bipolar cell), 망막 아마크린 세포(retinal amacrine cell), 수평세포(horizontal cell) 및 망막 신경절세포(retinal ganglion cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포일 수 있다. 상기 막대세포 및 원뿔세포는 빛을 감지하여 사물을 인식하는 신경세포이고, 상기 쌍극세포, 망막 아마크린 세포 및 수평세포는 시각정보를 망막신경절세포로 보내는 신경세포이며, 상기 망막 신경절세포는 망막의 시각 정보를 뇌에까지 전달하는 신경세포이다. 본 발명의 일 실시예의 R28 망막전구세포 또는 R28 망막신경전구세포는 망막의 각종 구성세포의 형질을 발현하며 망막에 이식해도 생존하는 세포로, 저산소증이나 혈청의 결핍에 대해 세포사멸이 일어나고, 녹내장과도 관련된 글루타메이트나 GABA 수용체 발현과 연결되는 세포사멸과 세포독성 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, R28 세포는 배양조건에 따라 망막전구세포에서 망막신경절세포로도 분화할 수 있으며, 망막의 전반적인 세포학적 연구뿐만 아니라 망막 신경절세포의 기초연구에 활용될 수 있다(이정일, 김재우, 대한안과학회지, 2009, 50, 919-922).
상기 해마신경세포는 뇌 내측 측두엽의 한 구조체인 해마(hippocampus)의 신경세포로서, 해마는 생리적/산화적 스트레스 자극에 취약하고 스트레스로 인한 인지기능의 손상을 일으키는데 중심 조직으로 알려져 있으며, 상기 스트레스는 해마의 구조와 뇌세포 생성, 시냅스 가소성 및 해마와 관련된 행동학적 변화를 일으킬 수 있다(김은주, 한국심리학회지: 인지 및 생물, 2012, 24, 65-88). 본 발명의 일 실시예의 HT-22 해마신경세포는 글루타메이트(glutamate)에 민감하여 산화적 스트레스로 유발되는 신경독성을 연구하기 위한 in vitro 모델 시스템으로 사용될 수 있다(Liu, J. et al. Life Science, 2009, 84, 267-271; 김지현, 전순실, 한국식품영양과학회지, 2017, 46, 886-890).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 글루타메이트 처리에 의하여 산화적 스트레스가 유발된 R28 세포에 결명 새싹 추출물, 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체 각각을 처리 시, 글루타메이트에 의해 감소된 세포생존율이 대조군에 상응하는 정도로 상승하였으며, 이러한 망막세포 보호 효능은 비교예인 결명자 추출물보다 우수하였는바, 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스에 의한 망막신경세포의 손상을 보호하거나 망막신경세포 사멸을 억제하는 효과가 우수함을 확인하였다(시험예 3 및 4).
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 글루타메이트 처리에 의하여 산화적 스트레스가 유발된 HT-22 세포에 결명 새싹 추출물, 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체 각각을 처리 시, 글루타메이트에 의해 감소된 세포생존율이 대조군에 상응하는 정도로 상승하였으며, 이러한 해마신경세포 보호 효능은 비교예인 결명자 추출물보다 우수하였는바, 본 발명의 조성물은 산화적 스트레스에 의한 해마신경세포의 손상을 보호하거나 해마신경세포 사멸을 억제하는 효과가 우수함을 확인하였다(시험예 5 및 6).
본 발명은 일 측면에 있어서, 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 그를 포함하는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹 추출물, 또는 그를 포함하는 결명 새싹 분획물을 유효성분으로 포함하는, 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸에 의해 유발되는 신경 손상성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것일 수 있고, 또는 글루타메이트 신경독성에 의해 유발되는 신경 손상성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것일 수 있다. 상기 화학식 1 내지 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체는 상기 화학식 1의 나프토파이론 유도체, 및 상기 화학식 2 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체일 수 있다. 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체, 약학적으로 허용가능한 염, 입체이성질체, 수화물, 용매화물, 결명 새싹, 결명 새싹 추출물 또는 분획물, 함량에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸에 의해 유발되는 신경 손상성 질환은 글루타메이트 신경독성에 의한 것일 수 있고, 상기 망막신경세포 및 해마신경세포에 관한 설명은 상술한 바와 같다. 상기 신경 손상성 질환은 망막신경세포 손상 또는 사멸에 의한 당뇨병성 망막병증, 황반변성, 망막세포 손상에 의한 시력장애, 망막색소변성, 망막박리, 망막혈관폐쇄 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 해마신경세포 손상 또는 사멸에 의한 기억력 감퇴, 학습능력 감퇴, 우울장애, 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 파킨슨병 및 뇌허혈성 신경손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 글루타메이트 신경독성에 의해 유발되는 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸에 의한 질환이라면 제한되지 않는다.
상기 글루타메이트 신경독성은 신경세포 밖의 글루타메이트 농도가 급속히 증가하게 되어 글루타메이트가 산화적 신경독성 물질로 작용함으로써 나타나는 독성을 의미한다. 상기 글루타메이트 신경독성은 개체 외부에서 유입된 글루타메이트에 의해 유발된 것일 수 있고, 상기 글루타메이트의 유입은 글루타메이트가 함유된 식품, 글루타메이트가 함유된 치료제, 글루타메이트가 함유된 예방제, 글루타메이트가 함유된 항생제 등의 섭취 또는 투여에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹으로부터 분리 또는 정제된 것일 수 있고, 구체적으로 결명 새싹 에탄올 추출물로부터 분리 또는 정제된 것일 수 있으며, 결명 새싹 에탄올 추출물을 에틸아세테이트로 분획한 뒤, 상기 에틸아세테이트 분획물을 크로마토그래피로 분리하거나 또는 상기 에틸아세테이트 분획물을 다시 헥산, 염화메틸렌 및 메탄올의 혼합 용매로 분획하고 이를 크로마토그래피로 분리한 것일 수 있다.
상기 결명 새싹 추출물은 결명 새싹을 물, C1 내지 C6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 하여 추출한 것일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C3의 알코올, C1 내지 C4, C1 내지 C5 또는 C1 내지 C6의 알코올일 수 있다. 상기 알코올은 일차 알콜일 수 있다. 상기 C1 내지 C6의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.
상기 분획물은 물, 에틸아세테이트, 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 분획하는 과정을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체는 항산화 성분으로서 결명자 추출물에 비해 결명 새싹 추출물에 보다 높은 함량으로 포함되어 있으며(시험예 2), 상기 나프토파이론 유도체는 글루타메이트 처리에 의해 손상 내지 사멸된 망막신경세포(R28) 및 해마신경세포(HT-22)을 보호하는 효능이 우수한바(시험예 4 및 6), 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체가 글루타메이트 신경독성에 의해 유발되는 신경손상성 질환을 예방 또는 치료하는 효능을 가지는 결명 새싹의 유효성분임을 확인하였다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 그를 포함하는 결명(Cassia obtusifolia L. 또는 Cassia tora L.) 새싹 추출물, 또는 그를 포함하는 결명 새싹 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항산화용 조성물에 관한 것일 수 있다. 상기 화학식 1 내지 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체는 상기 화학식 1의 나프토파이론 유도체, 및 상기 화학식 2 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 나프토파이론 유도체일 수 있다. 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 나프토파이론 유도체, 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 수화물, 용매화물, 결명 새싹, 결명 새싹 추출물 또는 분획물, 함량에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 비경구 투여 제형은 피부적용 패치, 연고, 크림, 점안제, 분무제 또는 주사제일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 신경세포 보호하기 위한 방법일 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있으며, 상기 포유동물은 인간일 수 있으며, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.
상기 투여는 경구 투여 또는 정맥, 복강, 피내, 피하, 상피 또는 근육투여 등과 같은 비경구 투여를 위해 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 신경세포가 존재하거나 발생이 예상되는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 식품 조성물은 제형은 특별히 한정되지 않으나, 농축액 또는 분말을 직접 또는 희석하여 섭취하거나 경구로 섭취하는 형태로 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카리드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카리드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카리드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 상기 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.04 중량부, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 명세서의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.
상기 식품 조성물에 있어서, 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.
본 발명의 조성물은 의약외품 조성물일 수 있다.
상기 '의약외품'이란 약사법에 따라 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로서, 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품보다 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품을 의미한다. 따라서 인간 또는 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 또는 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 의약외품 조성물은 산화적 스트레스에 의한 신경세포의 손상 개선, 보호 또는 치료를 위한 것일 수 있고, 글루타메이트 신경독성에 의해 유발되는 신경 손상성 질환의 예방 또는 개선을 위한 것일 수 있다.
상기 의약외품 조성물은 의약외품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 의약외품 조성물은 피부도말제, 크림, 파스, 점안제, 분무제 형태로 제형화될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 결명 새싹 추출물의 제조
소독되지 않은 국내산 결명자(Cassia obtusifolia L. 및 Cassia tora L.)를 구입하여(㈜두손애약초, 2016년 1월) 표백분(CaOCl2) 20 mg/mL 농도로 15분간 소독한 후 물로 충분히 세척하고 정제수에 4시간 동안 침지한 후, 차광 조건에서 6일간 재배하였다. 상기 재배를 통해 수득한 결명 새싹을 32 ℃에서 22시간 동안 온풍(38 ℃) 건조하고 분쇄하여 698.4 g의 건조된 식물체를 얻었다. 그 후, 상기 건조된 식물체를 추출 용기에 넣은 다음, 에탄올 5.5 L를 가한 후 상온에서 흔들어서 교반하여 7일 동안 추출하고 상기 혼합물을 0.34 mm의 필름 두께를 가지는 와트만(whatman) 종이 여과지와 직경 30 cm 유리 깔대기를 사용하여 중력 여과하는 과정을 2회 반복(‘추출-여과' 2 회)하여, 여과된 추출액을 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 감압 하에 35 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축하여 결명 새싹 추출물 66.7 g(이하 ‘STS’라고 함)을 수득하였다(수율 9.55%).
[ 비교예 1] 결명자 추출물의 제조
소독되지 않은 국내산 결명자(Cassia obtusifolia L. 및 Cassia tora L.)를 구입하여(㈜두손애약초, 2016년 1월) 분쇄한 후 15 mL 추출 용기에 넣은 다음, 에탄올 11 mL을 가한 후 상온에 흔들어 교반하여 7일 추출하고 이 혼합물을 0.34 mm의 필름 두께를 가지는 와트만(whatman) 종이 여과지와 직경 10 cm 유리 깔대기를 사용하여 중력 여과하는 과정을 실시하여('추출-여과' 2 회), 여과된 추출액을 수득하였다(이하 ‘ST’라고 함). 상기 여과된 추출액을 감압 농축기에 넣고 감압 하에 35 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축하였다(수율 3.34%).
[ 실시예 2] 다양한 빛 조건 하에서 재배된 결명 새싹 추출물의 제조
상기 실시예 1의 차광 조건에서 재배한 결명 새싹 추출물(STS)의 성분과 특정 빛 조건에서 재배한 결명 새싹 추출물의 성분을 비교 분석하기 위하여 빛의 파장 조건을 다르게 하여 결명 새싹을 재배하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 결명 새싹을 재배하되, 결명 새싹 재배 시의 빛 조건을 차광 조건이 아닌, 형광등, LED 385 nm, 465 nm, 645 nm, 780 nm을 각각 다량 파장으로 하는 선택적 광질의 빛을 조사하여 각각 6일간 재배하였다. 상기 재배를 통해 수득한 5 종의 새싹들을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 각각 결명 새싹 추출물을 제조하였으며, 형광등 조건에서 재배하여 얻은 추출물을 'STS-C', LED 385 nm의 빛 조건에서 재배하여 얻은 추출물을 'STS-385', LED 465 nm의 빛 조건에서 재배하여 얻은 추출물을 'STS-465', LED 645 nm의 빛 조건에서 재배하여 얻은 추출물을 'STS-645', LED 780 nm의 빛 조건에서 재배하여 얻은 추출물을 'STS-780'이라 하였다.
[ 실시예 3] 결명 새싹 추출물( STS )의 분획물 제조
상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS) 66.7 g을 물 600 mL에 현탁시킨 후, 에틸아세테이트 1.8 L를 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 4회에 걸쳐 분획을 실시하여 에틸아세테이트 분획물(STS-EA) 23.5 g을 수득하였다. 상기 에틸아세테이트 분획물을 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) 단독 또는 n-헥산, 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트), 메탄올(또는 에탄올)의 혼합 용매(n-헥산 : 염화메틸렌의 혼합비율(부피비)이 1:1, 염화메틸렌 : 메탄올의 혼합비율(부피비)이 200:1, 50:1, 10:1, 5:1, 3:1 및 1:1) 2.4L씩을 분획용매로 사용하여 상기 STS-EA의 분획물, 즉 결명 새싹 추출물(STS)의 분획물을 제조하였다.
구체적으로, 상기 에틸아세테이트 분획물(STS-EA)을 상기 8종의 분획용매에 접촉시켜 셀라이트(celite)에 교반하여 용매를 증발시키고, 직경 10 cm 및 길이 20 cm의 컬럼에 충진된 실리카(silica) 수지에 전개하였다. 상기 각 용매로 용출하는 크로마토그래피를 수행하여 20종의 분획물(STS-EA-분획 1 내지 STS-EA-분획 20)을 수득하였다.
[ 실시예 4] 결명 새싹 추출물로부터 화합물 1의 분리
상기 실시예 3에서 제조한 STS-EA-분획 12(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올(또는 에탄올)의 혼합비율이 10:1인 분획 3개 중 2번째 분획)을 감압 농축한 후, 하기 분리 방법 1의 조건 하에서 분취용 컬럼크로마토그래피를 수행하여 머무름시간 약 221분에서 상기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물 1을 분리하였다. (14.0 mg, 건조 식물체 무게 대비 0.002%; 건조 추출물 무게 대비 0.021%)
분리 방법 1
사용장비: YMC LC-Forte R
컬럼: Waters Delta-Pak C-18 RP HPLC 컬럼 (30.0x300 ㎜, 15 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 40:60으로 용출 시작
0분에서 60분 (a)용매의 비율을 40%에서 100%로 증가
이동상 유속: 10.0 mL/min
검출기: 자외선 254 nm; ELSD
[ 실시예 5] 결명 새싹 추출물로부터 화합물 2 내지 5의 분리
(1) 화합물 3의 분리
상기 실시예 3에서 제조한 STS-EA-분획 12(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올 (또는 에탄올)의 혼합비율이 10:1인 분획 3개 중 2번째 분획)을 감압 농축한 후, 상기 실시예 4의 분리 방법 1의 조건 하에서 분취용 컬럼크로마토그래피를 수행하여 머무름시간 약 24분에서 상기 화학식 3의 구조를 가지는 1.2 mg의 화합물 3을 분리하였다.
(2) 화합물 2의 분리
상기 실시예 3의 STS-EA-분획 8(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올(또는 에탄올)의 혼합비율이 50:1인 분획 3개 중 1번째 분획)을 감압 농축한 후, 하기 분리 방법 2의 조건 하에서 분취용 컬럼크로마토그래피를 수행하여 머무름시간 약 36분에서 상기 화학식 2의 구조를 가지는 7.5 mg의 화합물 2를 분리하였다.
분리 방법 2
사용장비: YMC LC-Forte R
컬럼: Waters Delta-Pak C-18 RP HPLC 컬럼 (30.0x300 ㎜, 15 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 60:40으로 용출 시작
0분에서 60분 (a)용매의 비율을 60%에서 100%로 증가
이동상 유속: 10.0 mL/min
검출기: 자외선 254 nm; ELSD
(3) 화합물 4 및 5의 분리
상기 실시예 3에서 STS-EA-분획 13(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올(또는 에탄올)의 혼합비율이 10:1인 분획 3개 중 3번째 분획)을 감압 농축한 후, 하기 분리 방법 3의 조건 하에서 분취용 컬럼크로마토그래피를 수행하여 머무름시간 약 71분 사이에서 상기 화학식 4의 구조를 가지는 0.6 mg의 화합물 4를 분리하였고, 머무름시간 약 120분에서 상기 화학식 5의 구조를 가지는 2.6 mg의 화합물 5를 분리하였다.
분리 방법 3
사용장비: JASCO LC-2000PLUS
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 10:90으로 용출 시작
0분에서 60분 (a)용매의 비율을 10%에서 50%로 증가
60분에서 80분 (a)용매의 비율을 50%에서 51%로 증가
80분에서 140분 (a)용매 비율을 51%에서 58%로 증가
140분에서 180분 (a)용매 비율을 58%에서 100%로 증가
이동상 유속: 8 mL/min
검출기: 자외선 254 nm
[ 비교예 2] 결명 새싹 추출물로부터 화합물 A 내지 X의 분리
(1) 화합물 F, G 및 H의 분리
상기 실시예 3의 STS-EA-분획 12을 감압 농축한 후, 상기 실시예 4의 분리 방법 1의 조건 하에서 분취용 컬럼크로마토그래피를 수행하여 상기 분획물에 대한 성분 분리를 수행하였다. 그 결과, 도 4의 피크 F에 해당하는 화합물 F 0.8 mg, 도 4의 피크 G에 해당하는 화합물 G 0.9 mg, 도 4의 피크 H에 해당하는 화합물 H 0.5 mg을 분리하였다.
(2) 화합물 C, D 및 E의 분리
상기 실시예 3의 STS-EA-분획 8을 감압 농축한 후, 상기 실시예 4의 분리 방법 2의 조건 하에서 분취용 컬럼크로마토그래피를 수행하여 상기 분획물에 함유된 성분들을 분리하였다. 그 결과, 도 4의 피크 C에 해당하는 화합물 C 7.2 mg, 도 4의 피크 D에 해당하는 화합물 D 0.8 mg, 도 4의 피크 E에 해당하는 화합물 E 2.5 mg을 분리하였다.
(3) 화합물 I의 분리
상기 실시예 3에서 수득한 STS-EA-분획 15(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올(또는 에탄올)의 혼합비율이 5:1인 분획 3개 중 2번째 분획)를 감압 농축한 후, 하기 분리 방법 4의 조건 하에서 HPLC 분리법을 통하여 상기 분획물의 함유 성분을 분리하였다. 그 결과, 도 4의 피크 I에 해당하는 화합물 I 0.7 mg을 분리하였다.
분리 방법 4
사용장비: JASCO LC-2000PLUS
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 30:70으로 용출 시작
0분에서 240분 (a) 용매의 비율을 30%로 유지
이동상 유속: 8 mL/min
검출기: 자외선 254 nm
(4) 화합물 J, K, L, M, N, O, A 및 P의 분리
상기 실시예 3에서 수득한 STS-EA-분획 16(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올(또는 에탄올)의 혼합비율이 5:1인 분획 3개 중 3번째 분획)을 감압 농축한 후, 하기 분리 방법 5의 조건 하에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 14개의 소분획물로 분획하였다.
분리 방법 5
사용장비: 실리카 플래시 컬럼
컬럼: 유리 컬럼 (25.0x200 ㎜)
용매: (a) 메틸렌 클로라이드 (염화메틸렌)
(b) 메탄올
이동상 조성: (a)용매:(b)용매 부피비 20:1으로 용출 시작
(a)용매:(b)용매 부피비 10:1, 7:1, 4:1, 2:1, 1:1로 변화
단계별 용매량: 300 mL
상기 소분획물 3(상기 분리 방법 5에서의 용출 용매가 염화메틸렌:메탄올의 혼합비율이 10:1인 소분획 3개 중 두번째 분획)으로부터 하기 분리 방법 6의 조건 하에서 HPLC 분리법을 통하여 도 4의 피크 J에 해당하는 화합물 J 1.8 mg, 도 4의 피크 K에 해당하는 화합물 K 1.9 mg, 도 4의 피크 L에 해당하는 화합물 L 1.0 mg을 분리하였다.
분리 방법 6
사용장비: Gilson 321 HPLC
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 20:80으로 용출 시작
0분에서 80분 (a)용매의 비율을 20%에서 40%로 증가
80분에서 120분 (a)용매의 비율을 40%에서 100%로 증가
이동상 유속: 8 mL/min
검출기: 자외선 254 nm
또한, 상기 소분획물 4(상기 분리 방법 5에서의 용출 용매가 염화메틸렌:메탄올의 혼합비율이 10:1인 소분획 3개 중 세번째 분획)로부터 하기 분리 방법 7의 조건 하에서 HPLC 분리법을 통하여 도 4의 피크 M에 해당하는 화합물 M 2.5 mg, 도 4의 피크 N에 해당하는 화합물 N 2.1 mg, 도 4의 피크 O에 해당하는 화합물 O 0.5 mg을 분리하였다.
분리 방법 7
사용장비: Gilson 321 HPLC
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 20:80으로 용출 시작
0분에서 100분 (a)용매의 비율을 20%에서 80%로 증가
100분에서 160분 (a)용매의 비율을 80%에서 100%로 증가
이동상 유속: 8 mL/min
검출기: 자외선 254 nm
상기 소분획물 6(상기 분리 방법 5에서의 용출 용매가 염화메틸렌:메탄올의 혼합비율이 7:1인 소분획 3개 중 두번째 분획)으로부터 하기 분리 방법 8의 조건하에서 HPLC 분리법을 통하여 도 4의 피크 A에 해당하는 화합물 A 2.0 mg을 분리하였다.
또한, 상기 소분획물 7(상기 분리 방법 5에서의 용출 용매가 염화메틸렌:메탄올의 혼합비율이 7:1인 소분획 3개 중 세번째 분획)로부터 하기 분리 방법 8의 조건 하에서 HPLC 분리법을 통하여 도 4의 피크 P에 해당하는 화합물 P 4.1 mg을 분리하였다.
분리 방법 8
사용장비: Gilson 321 HPLC
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 17:83으로 용출 시작
0분에서 50분 (a)용매의 비율을 17%로 유지
50분에서 70분 (a)용매의 비율을 17%에서 25%로 증가
70분에서 150분 (a)용매의 비율을 25%에서 30%로 증가
150분에서 180분 (a)용매의 비율을 30%에서 100%로 증가
이동상 유속: 6.5 mL/min
검출기: 자외선 254 nm
(5) 화합물 Q의 분리
상기 실시예 3에서 수득한 STS-분획 17(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올(또는 에탄올)의 혼합비율이 3:1인 분획 3개 중 첫번째 분획)을 감압 농축한 후, 하기 분리 방법 9의 조건 하에서 HPLC 분리법을 통하여 상기 분획물의 함유 성분을 분리하였다. 그 결과, 도 4의 피크 Q에 해당하는 화합물 Q 1.7 mg을 분리하였다.
분리 방법 9
사용장비: JASCO LC-2000PLUS
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 10:90으로 용출 시작
0분에서 40분 (a)용매 비율을 10%로 유지
40분에서 70분 (a)용매 비율을 10%에서 18%로 증가
70분에서 180분 (a)용매의 비율을 18%에서 22%로 증가
180분에서 260분 (a)용매의 비율을 22%에서 100%로 증가
이동상 유속: 6.5 mL/min
검출기: 자외선 254 nm
(6) 화합물 B, R, S, T, U, V, W 및 X의 분리
상기 실시예 3에서 수득한 STS-EA-분획 18(실시예 3에서의 용출 용매가 염화메틸렌(또는 에틸아세테이트) : 메탄올(또는 에탄올)의 혼합비율이 3:1인 분획 3개 중 두번째 분획)을 감압 농축한 후, 하기 분리 방법 10의 조건 하에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 24개의 소분획물로 분획하였다.
분리 방법 10
사용장비: 실리카 플래시 컬럼
컬럼: 유리 컬럼 (25.0x200 ㎜)
용매: (a) 메틸렌 클로라이드 (염화메틸렌)
(b) 메탄올
이동상 조성: (a)용매:(b)용매 부피비 20:1으로 용출 시작
(a)용매:(b)용매 부피비 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1로 변화
단계별 용매량: 400 mL
10:1 (소분획물 3 내지 6), 7:1 (소분획물 7 내지 10), 5:1(소분획물 11 내지 14), 3:1(소분획물 15 내지 18), 2:1(소분획물 19 내지 22)
상기 소분획물 17 내지 21(상기 분리 방법 10에서의 용출 용매가 염화메틸렌:메탄올의 혼합비율이 3:1인 소분획 4개 중 세번째와 네번째 분획 및 용출 용매가 염화메틸렌:메탄올의 혼합비율이 2:1인 소분획 4개 중 첫번째 내지 세번째 분획)을 하기 분리 방법 11의 조건 하에서 HPLC 분리법을 통하여 상기 분획물의 함유 성분을 분리하였다. 그 결과, 도 4의 피크 B에 해당하는 화합물 B 1.6 mg, 도 4의 피크 R에 해당하는 화합물 R 24.8 mg, 도 4의 피크 S에 해당하는 화합물 S 5.5 mg, 도 4의 피크 T에 해당하는 화합물 T 2.3 mg, 도 4의 피크 U에 해당하는 화합물 U 9.3 mg, 도 4의 피크 V에 해당하는 화합물 V 6.4 mg, 도 4의 피크 W에 해당하는 화합물 W 4.1 mg, 도 4의 피크 X에 해당하는 화합물 X 0.6 mg을 분리하였다.
분리 방법 11
사용장비: JASCO LC-2000PLUS
컬럼: Phenomenex Luna C-18 RP HPLC 컬럼 (21.2x250 ㎜, 10 ㎛)
용매: (a) 0.02 % TFA를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02 % TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분에서 (a)용매:(b)용매 부피비 10:90으로 용출 시작
0분에서 40분 (a)용매 비율을 10%로 유지
40분에서 70분 (a)용매 비율을 10%에서 18%로 증가
70분에서 180분 (a)용매의 비율을 18%에서 22%로 증가
180분에서 260분 (a)용매의 비율을 22%에서 100%로 증가
이동상 유속: 6.5 mL/min
상기 실시예 4 및 5와 비교예 2에서 분리된 모든 물질(화합물 1 내지 5, 및 화합물 A 내지 X)에 대응하는 HPLC 피크는 도 4의 결명 새싹 추출물 HPLC 크로마토그램의 피크별로 표기된 바와 같다. 상기 화학식 1 내지 화학식 5의 구조를 가지는 나프토파이론 유도체들(화합물 1 내지 5)을 포함한 총 29종의 물질은 상기 실시예 1에서 수득한 양의 결명 새싹 추출물로부터 분리 가능한 성분들이다. 또한 HPLC 분석 크로마토그램에 따르면, 상기 29종의 물질은 결명 새싹 추출물의 주요 구성 성분에 해당한다.
[ 실시예 6] 결명 새싹 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 5의 구조 동정
상기 실시예 4 및 5에서 분리된 화합물 1 내지 5의 구조를 동정하기 위하여 각 화합물들에 대한 질량분석기(Mass Spectrometer, MS) 및 핵자기공명분광기 (NMR)을 이용한 분석을 수행하였다.
(1) 화합물 1의 동정
상기 실시예 4에서 분리된 화합물 1의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 664로 결정하였으며, 자외선(PerkinElmer 343 Polarimeter), 적외선(Thermo Scientific Nicolet iS50), 비선광도(PerkinElmer Lambda 35) 분광자료와 핵자기공명기(Bruker 400 MHz, 100 MHz NMR)를 이용한 1H 와 13C NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 1의 구조를 가지는 나프토파이론 유도체인 7-하이드록시무시지닐-루브루푸사린-8'-O-글루코사이드로 결정하였다. 상기 화합물 1은 현재까지 보고된 바 없는 신규한 화합물이며, 결명 새싹에서만 주성분 중 하나로 분리되었고, 이는 결명자 또는 완전히 생장한 결명자 식물체에는 함유되어 있지 않거나 매우 미량으로 함유되어 발견되지 않았다.
[화학식 1]
Figure 112020021274530-pat00014
분자식 C34H32O14; ESI-MS: m/z 665 [M+H]+; 적외선 흡수대 νmax 3384, 2936, 1631, 1373, 1204, 1059 cm-1; 자외선 흡수대(MeOH) λmax (log ε) 240 (4.3), 282(4.2); 비선광도 [α]22 D -20 (c 0.05, MeOH);
1H NMR (methanol-d 4, 400 MHz): δ 7.18 (1H, s, H-10), 6.97 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5), 6.92 (1H, s, H-9), 6.34 (1H, br s, H-5'), 6.12 (1H, s, H-3), 5.12 (1H, dd, J = 7.5, 3.5 Hz, H-1''), 3.98 (1H, dd, J =12.0, 2.0 Hz, H-6''a), 3.78(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6''b), 3.75 (3H, s, OMe-8), 3.58 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-2'), 3.55 (1H, dd, J =5.0, 2.0 Hz, H-5''), 3.51 (1H, overlapped, H-3''), 3.48 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-4''), 2.63 (3H, s, Me-10'), 2.41 (3H, s, Me-11), 1.98 (3H, s, Me-11'), 13C NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 208.1 (C-9'), 184.1 (C-4), 170.1 (C-2), 161.3 (C-8), 160.9 (C-5), 156.2 (C-6'), 156.1 (C-8'), 154.7 (C-6), 152.4 (C-10a), 150.9 (C-1'), 139.8 (C-9a), 137.1 (C-4'a), 132.4 (C-3'), 122.4 (C-2'), 120.6 (C-4'), 111.9 (C-7), 108.4 (C-8'a), 106.2 (C-5a), 105.8 (C-3), 103.1 (C-1''), 102.9 (C-5'), 102.8 (C-7'), 102.5 (C-4a), 101.4 (C-10), 97.0 (C-9), 77.4 (C-5''), 76.7 (C-3''), 73.5 (C-2''), 69.7 (C-4''), 61.0 (C-6''), 54.8 (OMe-8), 31.4 (C-10'), 19.4 (C-11), 16.1 (C-11')
(2) 화합물 2의 동정
상기 실시예 5에서 분리된 화합물 2의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 272로 결정하였으며, 핵자기공명기(Bruker 400 MHz NMR)를 이용한 1H NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 하기 화학식 2와 같은 구조의 나프토파이론 유도체인 이소토락톤(isotoralactone)으로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(Kitanaka, S. et al. Phytochemistry, 1981, 20, 1951-1953)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다.
[화학식 2]
Figure 112020021274530-pat00015
분자식 C15H12O5; ESI-MS: m/z 273 [M+H]+;
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 13.30 (1H, s, OH-10), 9.41 (1H, s, OH-9), 6.92 (1H, s, H-5), 6.59 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), 6.56 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 4.93 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-11), 4.62 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-11), 3.90 (3H, s, OMe-7), 3.80 (1H, s, H-4)
(3) 화합물 3의 동정
상기 실시예 5에서 분리된 화합물 3의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 272로 결정하였으며, 핵자기공명기(Bruker 400 MHz NMR)를 이용한 1H NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 3과 같은 구조의 나프토파이론 유도체인 토라락톤(toralactone)으로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(Newman, A. G. et al. J Am Chem Soc 2016, 138, 4219-4228)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다.
[화학식 3]
Figure 112020021274530-pat00016
분자식 C15H12O5; ESI-MS: m/z 273 [M+H]+;
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 13.56 (1H, s, OH-5), 9.44 (1H, s, OH-9), 7.00 (1H, s, H-5), 6.64 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), 6.55 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 6.25 (1H, s, H-4), 3.92 (3H, s, OMe-7), 2.28 (3H, s, Me-11)
(4) 화합물 4의 동정
상기 실시예 5에서 분리된 화합물 4의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 288로 결정하였으며, 핵자기공명기(Bruker 400 MHz NMR)를 이용한 1H NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 4와 같은 구조의 나프토파이론 유도체인 토로사크리손(torosachrysone)으로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(Gill, M. et al. Aust J Chem 2000, 53, 213-220)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다.
[화학식 4]
Figure 112020021274530-pat00017
분자식 C16H16O5; ESI-MS: m/z 289 [M+H]+;
1H NMR (methanol-d4, 400 MHz): δ 9.80 (1H, s, OH-9), 6.90 (1H, s, H-5), 6.57 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.51 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 3.91 (3H, s, OMe-7), 3.08 (2H, br s, H-4), 2.86 (2H, br s, H-2), 1.44 (3H, s, Me-11)
(5) 화합물 5의 동정
상기 실시예 5에서 분리된 화합물 5의 분자량은 Agilent 1100 고속유체크로마토그래피-질량 분광계(HPLC-ESI-MS)를 이용한 MS 측정을 통하여 288로 결정하였으며, 핵자기공명기(Bruker 400 MHz NMR)를 이용한 1H NMR 스펙트럼 분석을 통하여 그 구조를 하기 화학식 5와 같은 구조의 나프토파이론 유도체인 루브로푸사린(rubrofusarin)으로 추정하였다. 또한 NMR 자료를 기존문헌(Alemayehu, G. et al. Phytochemistry, 1993, 32, 1273-1277)의 자료와 비교하여 그 구조를 동정하였다.
[화학식 5]
Figure 112020021274530-pat00018
분자식 C15H12O5; ESI-MS: m/z 273 [M+H]+;
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 9.68(1H, s, OH-9), 7.00 (1H, s, H-10), 6.59 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-9), 6.48 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-7), 6.04 (1H, s, H-3), 3.91 (3H, s, OMe-7), 2.41 (3H, s, Me-11)
[ 시험예 1] 결명 새싹 추출물의 항산화 효능 평가
(1) 결명자 추출물과 결명 새싹 추출물의 DPPH 자유라디컬 소거 효능 비교
상기 비교예 1에서 제조한 결명자 추출물(ST)과 상기 실시예 1에서 제조한 결명 새싹 추출물(STS)을 메탄올에 각각 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm의 농도별로 용해시킨 후, 상기 비교예 1의 결명자 추출 용액 100 μL 및 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물 100 μL 각각을 DPPH 100 μL와 암조건에서 40분 동안 반응시켜 517nm에서 흡광도를 측정하였고 양성 대조군으로는 아스코르브산(L-ascorbic acid)을 사용하였다. 상기 흡광도 측정을 통해 하기 식으로 도출한 DPPH 자유라디컬 소거 효능을 도 1에 나타내었다.
Figure 112020021274530-pat00019
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS)의 DPPH 자유라디컬 소거 효과가 상기 비교예 1`의 결명자 추출물(ST)에 비해 각 농도에서 1.7배 이상 높은 것을 알 수 있었다.
(2) 결명자 추출물과 결명 새싹 추출믈의 ABTS 온라인 항산화 크로마토그래피 측정 결과 비교
상기 비교예 1에서 제조한 결명자 추출물(ST)과 상기 실시예 1에서 제조한 결명 새싹 추출물(STS)을 동일한 농도로 알코올 수용액에 용해시켜, 하기 분석 조건에 따라 ABTS 온라인 항산화 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)를 수행하였다.
ABTS 온라인 항산화 HPLC 분석 조건
사용장비: Agilent 1200 system
컬럼: RP C-18 HPLC 컬럼 (4.6x150 mm, 5μm)
용매: (a) 0.02% TFA (Trifluoroacetic acid)를 함유한 아세토니트릴
(b) 0.02% TFA를 함유한 물
이동상 조성: 0분 (a)용매:(b)용매 부피비 10:90으로 용출 시작
0분에서 30분 (a)용매 비율을 10%에서 100%로 증가
30분에서 37분 (a)용매 100%로 용출
이동상 유속: 0.7 mL/min
ABTS 조성: 0.08mM ABTS와 0.12 mM 과황화칼륨 (potassium persulfate)를 함유한 물
ABTS 유속: 0.35 mL/min
검출기 검출 파장: 자외선 254 nm; 734 nm
그 결과, 결명자 추출물(ST)과 결명 새싹 추출물(STS)은 매우 상이한 항산화 성분 양상을 나타내었다. 결명자 추출물(ST)과 결명 새싹 추출물(STS) 모두 머무름 시간 15분 이전에 황산화 활성을 가진 플라보노이드, 나프탈렌 유도체들로 구성된 성분들이 관찰되었으나, 결명 새싹 추출물(STS)에서는 결명자 추출물(ST)에 비해 상기의 성분들의 함량이 증가하는 동시에 15분 이후에 항산화 활성을 가진 나프탈렌, 안트라퀴논 유도체들이 추가적으로 관찰되었다. 도 2의 (A)와 (B)는 결명자와 결명 새싹 추출물의 ABTS 온라인항산화 HPLC를 수행한 결과이며, 자외선(UV) 검출기 254 nm (위 방향으로 표기된 파란색 선의 크로마토그램), 734 nm (아래 방향으로 표기된 붉은색 선의 크로마토그램) 파장을 각각 검출하여 얻어진 크로마토그램이다.
[ 시험예 2] 결명자 추출물(ST)과 다양한 빛 조건 하에서 재배된 결명 새싹 추출물의 ABTS 온라인 항산화 크로마토그래피 측정 결과 비교
상기 실시예 1에서 제조한 결명 새싹 추출물(STS)과 상기 실시예 2에서 제조한 7종의 다양한 빛 조건 하에서 재배된 결명 새싹 추출물(STS-C, STS-385, STS-465, STS-645 및 STS-780)을 알코올 수용액에 용해시켜, 상기 시험예 1과 동일한 분석 조건에 따라 ABTS 온라인 항산화 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하였다.
그 결과, 상기 실시예 2의 5종의 다양한 빛 조건 하에서 재배된 결명 새싹 추출물에서 항산화 활성을 지닌 구성 성분들이 공통적으로 관찰되었으나 빛 조건에 따라 성분들의 함량 변화가 나타났다. 도 3의 A, B, C, D, E, F는 각각 상기 6종의 결명 새싹 추출물인 STS, STS-C, STS-385, STS-465, STS-645, STS-780 추출물의 ABTS 온라인 항산화 HPLC를 수행한 결과이며, 자외선(UV) 검출기 254 nm (UV 254nm를 흡수하는 성분들의 피크를 나타냄) 및 734 nm 파장 (ABTS에 대한 항산화 작용을 나타내는 성분의 피크들과 피크들의 면적으로 항산화도를 나타냄)을 각각 검출하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 3의 크로마토그램들을 바탕으로 차광 조건과 형광등 및 각 특정 파장의 빛 조건 하에서 재배한 결명 새싹 추출물의 항산화 성분 프로파일을 살펴본 결과, 재배 과정 중에 조사된 빛 파장별로 항산화 성분들의 함량과 조성은 차이가 있었으나 특정 조건에서 사라지거나 새롭게 나타나는 성분은 발견되지 않았다. 도 3의 (A) 내지 (F)의 모든 크로마토그램에서 본 발명의 상기 화학식 1의 구조를 가지는 신규 나프토파이론 성분(실시예 4에서 분리된 화합물 1)이 가장 주목할 만한 항산화 피크 또는 주요 항산화 피크로 검출되었으며, 상기 화학식 2 내지 화학식 5의 구조를 가지는 4종의 나프토파이론 성분들(실시예 5에서 분리된 화합물 2 내지 5) 또한 도 3의 (A) 내지 (F)의 크로마토그램에서 항산화 성분으로 검출되었다. 일반 빛 조건에서 재배한 결명 새싹 추출물(STS-C)의 크로마토그램 (B)와 465 nm LED 조명 하에서 재배한 결명 새싹 추출물(STS-465)의 크로마토그램 (D)를 제외하고, (A), (C), (E) 및 (F)의 크로마토그램에서 상기 실시예 4 및 5에서 분리된 화합물 1 내지 5의 유효성분들이 상대적으로 높은 함량으로 검출되었다.
[ 시험예 3] 실시예 1 및 2의 7종의 결명 새싹 추출물의 망막전구세포 (R28) 보호 효능
상기 비교예 1 및 실시예 1에서 각각 수득된 결명자 추출물(ST)과 결명 새싹 추출물(STS), 및 상기 실시예 2에서 수득된 다양한 빛 조건 하에서 재배된 결명 새싹 추출물(STS-C, STS-385, STS-465, STS-645, STS-780) 의 망막전구세포(R28) 보호 효능을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, R28 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/mL 페니실린(penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)/low glucose 배지에서 37 ℃ 인큐베이터에서 5% CO2 조건하에서 배양하고, 2일마다 0.05% 트립신(Trypsin)을 사용하여 계대배양한 후, 96 플레이트에 1*?*104의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 배양된 R28 세포에 상기 7종의 추출물들을 도 5의 (A) 내지 (C)의 농도로 처리하고 2시간 후, 10 mM 글루타메이트(glutamate)와 0.5 mM BSO(buthionine sulphoximine)를 첨가하여 22시간 배양하였다. 그런 다음, 세포 생존률을 측정하기 위해 10 μL EZ-cytox를 처리하여 2시간 유지하였으며, UV 흡광도 450 nm에서 측정하였다.
도 5에서 (A)는 글루타메이트에 의해서 유발되는 산화적 스트레스로부터 3가지 농도에서 상기 비교예 1의 결명자 추출물(ST), 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS), 상기 실시예 2의 빛 조건을 다르게 하여 재배된 5종의 결명 새싹 추출물(STS-C, STS-385, STS-465, STS-645, STS-780)의 R28 세포 보호 효능을 세포 생존률로 나타낸 결과이다. 도 5에서 (B) 및 (C)는 각각 5가지 농도에서 글루타메이트에 의해서 유발되는 산화적 스트레스로부터 상기 비교예 1의 결명자 추출물(ST) 및 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS)의 R28 세포 보호 효능을 세포 생존률로 나타낸 결과이다.
도 5의 (A)에 나타난 바와 같이, 모든 추출물 처리군에서 글루타메이트에 의해서 유발되는 산화적 스트레스로부터 HT-22 세포를 보호하는 효과를 보였으나, 결명자 추출물에 비해 결명 새싹 추출물(STS, STS-C, STS-385, STS-465, STS-645 및 STS-780)이 거의 대부분의 농도에서 글루타메이트에 의해서 유발되는 산화적 스트레스로부터 R28 세포를 보호하는 효과가 보다 우수함을 보였으며, 특히 도 5의 (B) 및 (C)에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS)은 상기 비교예 1의 결명자 추출물(ST)에 비해 R28 세포 보호 효능이 확연히 뛰어난 것으로 확인되었다.
[ 시험예 4] 실시예 5 및 6의 결명 새싹 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 5의 망막전구세포 (R28) 보호 효능 확인
상기 시험예 3의 결명 새싹 추출물(STS)의 망막전구세포(R28) 보호 효능이 결명자 추출물(ST)의 효능보다 뛰어난 이유를 확인하기 위하여, R28 세포에 대한 실시예 5 및 6의 화합물 1 내지 5의 보호 효능을 비교하였다.
상기 시험예 3과 동일한 방법으로, R28 세포 생존율을 측정하되, 비교예 1, 실시예 1 및 2의 결명자 추출물(ST), 결명 새싹 추출물(STS, STS-C, STS-385, STS-465, STS-645 및 STS-780) 대신 실시예 5 및 6의 화합물 1 내지 5를 50 μM, 16.6 μM, 5.55 μM로 처리하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 글루타메이트에 의해서 유발되는 신경독성으로부터 화합물 1 내지 5는 R28 세포를 보호하는 효과를 보였으며, 상기 화합물들은 결명 새싹 추출물(STS)에 상대적 함량이 매우 높거나 또는 결명 새싹 추출물(STS)에 주로 존재하는 화합물들이므로 결명 새싹 추출물(STS) 의 R28 세포 보호 효능이 결명자 추출물(ST) 의 효능보다 뛰어난 이유를 확인할 수 있었다.
[ 시험예 5] 실시예 1 및 2의 7종의 결명 새싹 추출물의 해마신경세포(HT-22) 보호 효능
상기 비교예 1 및 실시예 1에서 수득된 결명자 추출물(ST)과 결명 새싹 추출물(STS), 및 상기 실시예 2에서 수득된 다양한 빛 조건 하에서 재배된 결명 새싹 추출물(STS-C, STS-385, STS-465, STS-645, STS-780) 의 해마신경세포(HT-22) 보호 효능을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, HT-22 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)/low glucose 배지에서 37.5 ℃ 인큐베이터에서 5% CO2 조건하에서 배양하고, 2일마다 0.05% 트립신(Trypsin)을 사용하여 계대배양한 후, 96 플레이트에 3*?*103의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 배양된 HT-22 세포에 상기 7종의 추출물들을 도 7의 (A) 내지 (C)의 농도로 처리하고 2시간 후, 5 mM 글루타메이트(glutamate)를 첨가하여 22시간 배양하였다. 그런 다음, 세포 생존률을 측정하기 위해 10 μL EZ-cytox를 처리하여 2시간 유지하였으며, UV 흡광도 450 nm에서 측정하였다.
도 7에서 (A)는 글루타메이트에 의해서 유발되는 산화적 스트레스로부터 3가지 농도에서 상기 비교예 1의 결명자 추출물(ST), 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS), 상기 실시예 2의 빛 조건을 다르게 하여 재배된 5종의 결명 새싹 추출물(STS-C, STS-385, STS-465, STS-645, STS-780)의 HT-22 세포 보호 효능을 세포 생존률로 나타낸 결과이다. 도 7에서 (B) 및 (C)는 5가지 농도에서 글루타메이트에 의해서 유발되는 산화적 스트레스로부터 상기 비교예 1의 결명자 추출물(ST) 및 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS)의 HT-22 세포 보호 효능을 세포 생존률로 나타낸 결과이다.
도 7의 (A)에 나타난 바와 같이, 모든 추출물 처리군에서 글루타메이트에 의해서 유발되는 산화적 스트레스로부터 HT-22 세포를 보호하는 효과를 보였으나, 특히 도 7의 (B), (C)에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS)은 상기 비교예 1의 결명자 추출물(ST)에 비해 우수한 HT-22 세포 보호 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
[ 시험예 6] 실시예 5 및 6의 결명 새싹 추출물로부터 분리된 화합물 1 내지 5의 해마신경세포(HT-22) 보호 효능 확인
상기 시험예 5의 결명 새싹 추출물(STS)의 해마신경세포(HT-22) 보호 효능이 결명자 추출물(ST)보다 뛰어난 이유를 확인하기 위하여, R28 세포에 대한 실시예 5 및 6의 화합물 1 내지 5 및 비교예 2의 화합물 A 내지 X의 보호 효능을 비교하였다.
상기 시험예 5와 동일한 방법으로 HT-22 세포 생존율을 측정하되, 비교예 1, 실시예 1 및 2의 결명자 추출물(ST), 결명 새싹 추출물(STS, STS-C, STS-385, STS-465, STS-645 및 STS-780) 대신 실시예 5 및 6의 화합물 1 내지 5를 50 μM, 16.6 μM, 5.55 μM로 처리하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 글루타메이트에 의해서 유발되는 신경독성으로부터 실시예 5 및 6의 화합물 1 내지 5와 비교예 2의 피크 K와 피크 T에 각각 해당하는 화합물 K 및 화합물 T이 HT-22 세포를 보호하는 효과를 나타냈다. 즉, 상기 화합물 1 내지 5는 결명 새싹 추출물(STS)에 상대적 함량이 매우 높거나 또는 결명 새싹 추출물(STS)에 주로 존재하는 화합물들이므로 결명 새싹 추출물(STS)의 HT-22 세포 보호 효능이 결명자 추출물(ST)의 효능보다 뛰어난 이유를 확인할 수 있었다.
상기 시험예 1, 시험예 4 및 시험예 6에서 평가한 성분별 생리활성은 하기 표 1과 같다.
[표 1] 실시예 1의 결명 새싹 추출물(STS)로부터 분리한 성분들의 생리활성
Figure 112020021274530-pat00020

Claims (19)

  1. 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 조성물은 결명 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 신경 질환은 기억력 감퇴, 학습능력 감퇴, 우울장애, 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 파킨슨병, 뇌허혈성 신경장애, 당뇨병성 망막병증, 황반변성, 시력장애, 망막색소변성, 망막박리, 망막혈관폐쇄 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 신경 질환은 망막신경세포 또는 해마신경세포의 손상 또는 사멸에 의해 유발된 것인, 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 신경 질환은 산화적 스트레스에 의해 유발된 것인, 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 산화적 스트레스는 글루타메이트 신경독성에 의한 것인, 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것인, 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 추출물은 에탄올 용매로 추출한 것인, 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 추출물은 결명 새싹의 조추출물을 물, 에틸아세테이트, 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 분획한 것인, 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 결명 새싹 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 식품 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 산화적 스트레스는 글루타메이트 신경독성에 의한 것인, 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 식품 조성물.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 신경세포는 망막신경세포 또는 해마신경세포인, 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 식품 조성물.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것인, 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 식품 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 추출물은 에탄올 용매로 추출한 것인, 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 식품 조성물.
  14. 제 9항에 있어서,
    상기 추출물은 결명 새싹의 조추출물을 물, 에틸아세테이트, 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 분획한 것인, 산화적 스트레스로부터의 신경세포 보호용 또는 신경세포 사멸 억제용 식품 조성물.
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