KR20000008399A - 신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체 - Google Patents

신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체 Download PDF

Info

Publication number
KR20000008399A
KR20000008399A KR1019980028189A KR19980028189A KR20000008399A KR 20000008399 A KR20000008399 A KR 20000008399A KR 1019980028189 A KR1019980028189 A KR 1019980028189A KR 19980028189 A KR19980028189 A KR 19980028189A KR 20000008399 A KR20000008399 A KR 20000008399A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
formula
compound
methanol
glutamate
cinnamate derivative
Prior art date
Application number
KR1019980028189A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100291524B1 (ko
Inventor
김영중
김소라
Original Assignee
김영중
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 김영중 filed Critical 김영중
Priority to KR1019980028189A priority Critical patent/KR100291524B1/ko
Publication of KR20000008399A publication Critical patent/KR20000008399A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100291524B1 publication Critical patent/KR100291524B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/58—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C59/64—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups containing six-membered aromatic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/80—Scrophulariaceae (Figwort family)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/42—Unsaturated compounds containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C59/52—Unsaturated compounds containing hydroxy or O-metal groups a hydroxy or O-metal group being bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 신나메이트 유도체의 새로운 용도에 관한 것으로, 구체적으로 약용식물인 현삼을 클로로포름, 메탄올 혼합용매로 추출한 다음 디클로로메탄, 메탄올 등을 포함하는 유기용매로 다시 분획하여 신경세포 보호활성을 가지는 현삼 추출물을 제조하고 이를 이용하여 칼럼크로마토그래피 및 재결정함으로 활성물질인 신나메이트 유도체를 분리, 정제하여 얻어지는 본 발명의 신나메이트 유도체는 신경세포 보호활성이 우수하여 뇌졸중, 퇴행성 신경계 질환의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식에서 R1은 CH3또는 H 이고, R2는 H 또는 α-L-람노스(Rhamnose)이다.

Description

신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체
본 발명은 하기 화학식 1의 신나메이트 유도체의 새로운 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게는 약용식물인 현삼을 클로로포름, 메탄올 혼합용매로 추출한 다음 디클로로메탄, 메탄올 등을 포함하는 유기용매로 다시 분획하여 신경세포 보호활성을 가지는 현삼 추출물을 제조하고 이를 이용하여 칼럼크로마토그래피 및 재결정함으로 활성물질인 신나메이트 유도체를 분리, 정제하여 얻어지는 본 발명의 신나메이트 유도체는 신경세포 보호활성이 우수하여 뇌졸중, 퇴행성 신경계 질환의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
화학식 1
상기 식에서 R1은 CH3또는 H 이고, R2는 H 또는 α-L-람노스(Rhamnose)이다.
최근 노인 인구가 늘어남에 따라 퇴행성 뇌신경계 질환, 특히 노인성 치매 환자도 급증하고 있다. 노인성 치매는 기억력의 상실, 학습력의 저하가 주 증상인 질환으로 환자는 물론 그 가족까지 함께 커다란 고통을 겪어야 하는 질환으로 이미 사회적인 문제로 대두되어 이의 예방 및 치료에 대한 관심은 날로 높아져 가고 있으나 아직까지도 이렇다 할 치료제가 개발되어 있지 않아 그 심각성이 매우 크게 부각되고 있는 질환이다.
퇴행성 뇌신경계 질환은 노화에 의한 뇌신경세포의 구조적인 퇴화, 순환기 장애 등과 같은 성인병에 기인한 2차적 증상, 또는 교통사고, 산업재해, 일산화탄소 중독 등과 같은 물리적, 기계적 요인에 의하여 뇌가 손상을 입으면 발병될 수 있다(Rothman. S. M. (1984) J. Neurosci. 4: 1884-1891; Weiloch, T. (1985) Science. 230: 681-683). 즉, 뇌로 공급되는 혈류량이 감소되거나 차단되어 뇌조직이 저산소, 저포도당 상태가 되면 정상대사를 할 수 없어 결국 뇌조직은 회복될 수 없는 손상을 입게 된다. 이러한 경우는 뇌졸중(stroke), 외상(trauma) 및 허혈성 손상(ischemic injury)뿐만 아니라 퇴행성 뇌신경계 질환에서 아주 흔하게 볼 수 있다(Benveniste, H. et al. (1984) J. Neurochem. 43: 1369-1374 ; Hagberg, H. et al. (1985) J. Cereb. Blood Flow & Metab. 5: 413-419).
일반적으로 뇌조직의 손상은 크게 두가지 기전에 의한 것으로 알려져 있다. 첫 번째로는 세포막 전압의 변화에 의한 흥분성 아미노산의 유리 증가에 의한 것이며, 두 번째로는 직접적인 산화적 스트레스(oxidative stress)에 의한 것이다(Choi, D. W. (1988) Neuron. 1: 623-634 ; Coyle, J. T. et al. (1993) Science. 262: 689-695). 최근의 연구에 의하면 뇌졸중(stroke), 외상(trauma) 및 허혈성 손상(ischemic injury)의 경우 글루타메이트가 이온작용 수용체(ionotrophic receptor)를 활성화시킴으로써 산화적 스트레스를 일으켜 글루타메이트성 신경에 이상이 초래되어 발병되는 것으로 알려지고 있다(Halliwell, B. et al. (1985a) Trends Neurosci. 5: 22-26 ; Halliwell, B. et al. (1985b) Mol. Aspects Med. 8: 89-193).
뇌조직에서의 혈류량이 감소되면 신경 접합부에서 글루타메이트의 농도가 급속히 증가되면서 독성을 유발시켜 신경세포는 결국 사멸하게 된다(Benveniste, H. et al. (1984) J. Neurochem. 43: 1369-1374 ; Hagberg, H. et al. (1985) J. Cereb. Blood Flow & Metab. 5: 413-419). 이러한 글루타메이트에 의한 신경독성은 "급성독성"과 "만성독성"으로 나누어진다(Choi, D. W. (1988) Neuron. 1: 623-634).
급성독성은 세포 외에 있는 Ca2+이 세포 내로 과량으로 유입됨으로써 시작되며, 세포의 삼투압 유지를 위해 Na+, K+및 Cl-등의 이온들의 유입이 뒤따라 세포는 부풀게 되고 결국은 터져 사멸되는 형태로 나타난다(Kauppisen, R. A. (1988) Neurosci. 27: 175-182 ; Garthwaite, G. et al. (1988) J. Neurosci. 17: 755-767).
글루타메이트에 의한 만성독성은 글루타메이트의 수용체인 NMDA 수용체와 비-NMDA(non-NMDA) 수용체인 카이닉산(kainic acid)/AMPA 수용체를 활성화시킴으로써 일어난다(Coyle, J. T. et al. (1993) Science. 262: 689-695). 즉, 글루타메이트에 의해 NMDA와 비-NMDA 수용체가 활성화되어 Ca2+가 유입되고 세포내 칼슘-의존(calcium-dependent) 효소인 포스포리파제 A2(phospholipase A2)가 비정상적으로 활성화되면 다중불포화 유리 지방산(polyunsaturated free fatty acids) 생성이 증가되고, 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 및 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)과 같은 유리 라디칼(free radicals)이 과다하게 생성되어 세포의 과산화를 촉진시켜 결국은 세포가 죽게 되는 만성독성이 일어나게 된다(Coyle, J. T. et al. (1993) Science. 262: 689-695 ; Halliwell, B. et al. (1985a) Trends Neurosci. 5: 22-26 ; Halliwell, B. et al. (1985b) Mol. Aspects Med. 8: 89-193 ; Siesjo, B. K. et al. (1985) Br. J. Anaesth. 47: 47-62 ; Sladeczek, F. et al. (1985) Nature. 317: 717-719 ; Choi, D. W. et al. (1987) J. Neurosci. 7: 369-379). NMDA 수용체가 활성화되면 니트릭 옥사이드(nitric oxide) 합성효소의 활성도 또한 증대되어 니트릭 옥사이드가 과다하게 생성되며 이 또한 세포의 과산화를 촉진시킨다(Strijbos, P. J. L. M. et al. (1996) J. Neurosci. 16: 5004-5013).
글루타메이트에 의한 신경독성은 글루타메이트의 길항물질, Na+및 Ca2+채널 차단제, 항산화제, 유리 라디칼 체인 절단제(free radical chain breakers) 및 잔틴 디하이드로게네이즈(xanthine dehydrogenase)로부터 잔틴 옥시데이즈(xanthine oxidase)로의 전환을 억제하는 효소인 안티프로테아제(antiproteases) 등에 의하여 방지될 수 있으나 특히 NMDA 수용체에 대한 길항물질이 효과적이다(Choi, D. W. et al. (1988) J. Neurosci. 8: 185-196 ; Olney, J. W. et al. (1969) Science. 166: 368-388).
현삼(Scrophularia buergeriana)은 현삼과의 다년생 초본이며 높이는 1 ∼ 1.5 m 가량이며 잎은 마주나고 엽병이 있고 장란형 또는 난상 피침형으로 밑이 다소 둥글거나 다소 일자형이며 끝은 날카롭고 날카로운 톱니가 있다. 꽃은 엷은 황록색으로 8 ∼ 9월에 피며 밀추화서로서 줄기 끝 포엽에 착생한다. 화관은 병모양의 순형이며 하순은 뒤로 젖혀지고 2강 수술이 있으며, 꽃받침은 5열되고 열편은 난형 또는 난원형이다. 과실은 삭과로서 난형이고 2각편으로 벌어진다. 건조된 뿌리를 현삼(Scrophulariae Radix)이라 하여 양혈자음, 사화해독, 열병상음, 번갈증 등에 사용하며 특히 소염, 인후염, 비염 종기, 변비 등에 사용한다(육창수 (1997) 아세아 생약도감, p483). 현삼속은 전 세계적으로 300여종이 분포하고 있으며 우리나라에는 5종이 있다. 연구된 성분으로는 해열성분이며 주성분인 p-메톡시시나믹 산(p-methoxycinnamic acid)과 이리도이드(iridoid)계 배당체인 하파고사이드(harpagoside), 하파지드(harpagide), 8-(O-메틸-p-쿠마로일) 하파지드[8-(O-methyl-p-coumaroyl) harpagide] 등이 보고되었으나 각각의 성분과 활성이 연관지어져 체계적으로 연구된 바는 없다(Woo, W. S. (1968) J. pharm Sci. 57(1): 27-30 ; Okano, T. (1967) Chem. Pharm. Bull. 15(8): 1254 ; Weinges, K. et al. (1978) Ann. Chem. 1968).
이에 본 발명자들은 새로운 신경세포 보호활성을 갖는 물질을 분리하기 위하여 예로부터 건망증이나 뇌졸중에 유효하다고 알려져 민간이나 전승의약으로 사용되어 온 생약으로부터 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트로 인위적으로 독성을 유발시켜 이를 검색계로 이용하여 이러한 신경독성을 약화시키는 천연물을 검색하던 중, 현삼의 추출물이 유의성있는 신경세포 보호 활성을 가짐을 발견하고 이로부터 신나메이트 유도체를 분리·정제하여 그 구조를 확인하고 그의 새로운 신경세포 보호 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 신경세포 보호활성을 보이는 신나메이트 유도체가 뇌졸중이나 노인성 치매와 같은 퇴행성 뇌신경계 질환 등을 예방하거나 치료하는데 사용할 수 있는 새로운 용도를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 현삼 추출물을 제조하는 과정을 도시한 것이고,
도 2는 90% 메탄올 분획으로부터 본 발명의 화합물 1, 2 및 3을 분리, 정제하는 과정을 도시한 것이다.
본 발명은 신경세포 보호활성을 가지는 하기 화학식 1의 신나메이트 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체가 신경세포 보호제로 사용될 수 있는 새로운 용도를 제공한다.
화학식 1
상기 식에서 R1은 CH3또는 H 이고, R2는 H 또는 α-L-람노스(Rhamnose)이다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 신나메이트 유도체는 하기 화학식 2의 p-메톡시-trans-신나민산(p-methoxy-trans-cinnamic acid), 하기 화학식 3의 p-메톡시-trans-신나모일-4'-α-L-람노스 에스테르(p-methoxy-trans-cinnamoyl-4'-α-L-rhamnose ester) 또는 하기 화학식 4의 신나민산(cinnamic acid)이다.
또한 본 발명은 약용식물인 현삼을 클로로포름-메탄올의 혼합용매로 추출한 다음 디클로로메탄, 헥산 및 부탄올 등을 포함하는 유기용매로 다시 추출한 신경세포 보호활성을 가지는 현삼 추출물을 칼럼 크로마토그래피 및 재결정하여 얻는 상기 화학식 1의 신나메이트 유도체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 현삼을 클로로포름-메탄올의 혼합용매로 추출한 다음 디클로로메탄, 헥산 및 부탄올 등을 포함하는 유기용매로 다시 추출한 현삼 추출물을 유효성분으로 하는 신경세포 보호제용 약학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1의 신나메이트 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체가 신경세포 보호제로 사용될 수 있는 새로운 용도를 제공한다.
화학식 1
상기 식에서 R1은 CH3또는 H 이고, R2는 H 또는 α-L-람노스(Rhamnose)이다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 신나메이트 유도체는 하기 화학식 2의 p-메톡시-trans-신나민산(p-methoxy-trans-cinnamic acid), 하기 화학식 3의 p-메톡시-trans-신나모일-4'-α-L-람노스 에스테르(p-methoxy-trans-cinnamoyl-4'-α-L-rhamnose ester) 또는 하기 화학식 4의 신나민산(cinnamic acid)이다.
본 발명에서는 신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체를 약용식물인 현삼으로부터 분리, 정제한다.
우선, 본 발명은 현삼을 유기용매로 추출한 신경세포 보호활성을 가지는 현삼 추출물을 제공한다. 이 때 상기 유기용매로는 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 이용하는 것이 바람직하다.
구체적으로 본 발명에서는 현삼의 뿌리를 클로로포름-메탄올(CHCl3- MeOH)의 혼합용매로 열탕 추출한 다음 감압 농축하여 조 추출물을 얻었다.
또한 본 발명은 상기 과정에 더하여 디클로로메탄(CH2Cl2), 헥산(hexane) 또는 부탄올(BuOH) 등의 유기용매로 다시 추출한 신경세포 보호활성을 가지는 현삼 추출물을 제공한다.
구체적으로 본 발명에서는 상기 과정에 더하여 조 추출물을 물에 현탁하고 디클로로메탄으로 추출하여 신경세포 보호활성을 가지는 물 분획 및 디클로로메탄 분획을 얻었다. 또한 이 디클로로메탄 분획을 다시 메탄올(MeOH)로 현탁하고 헥산으로 추출하여 신경세포 보호활성을 가지는 메탄올 분획 및 헥산 분획을 얻었다.
본 발명의 현삼 추출물이 신경세포 보호활성을 가지는 것을 확인하기 위하여, 흰쥐의 대뇌피질세포에 현삼 추출물을 처리한 다음 MTT 분석(assay)을 수행하였다.
구체적으로 흰쥐의 대뇌피질세포를 배양하여 본 발명의 현삼 추출물을 투여한 다음 1시간 후에 글루타메이트를 작용시켜 인위적으로 독성을 유발시키면서 배양을 계속하였다 (Throughout treatment). 상기 대뇌피질세포의 배양액에 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가한 다음 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO(dimethylsulfoxide)로 녹여낸 다음 흡광도를 측정하는 방법으로 MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, 현삼의 조 추출물, 디클로로메탄 분획 및 메탄올 분획물은 글루타메이트에 의한 신경독성을 유의성있게 차단시켜 사멸되는 신경세포를 감소시켰다.
본 발명에서는 상기 현삼 추출물로부터 신경세포 보호활성을 가지는 화합물을 순수분리하기 위하여, 상기 현삼 추출물을 칼럼 크로마토그래피한 다음 재결정하였다.
구체적으로 현삼의 메탄올분획을 실리카겔 칼럼에 걸고 클로로포름과 메탄올의 혼합용매로 크로마토그래피하여 신경세포 보호활성이 우수한 분획을 분리한 다음 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매로 다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하고 헥산 : 디클로로메탄 : 메탄올의 혼합용매로 재결정하여 무색 침상 결정인 화합물 1과 무색 프리즘(prism)인 화합물 3을 얻었다.
상기 화합물 1의 이화학적 성질 및 분광학적 성질을 다음과 같이 규명하였다.
(1) 물질의 성상 : 무색 침상 결정(in EtOH)
(2) 분자량 : EIMS(m/z) 179 [M+]
(3) 분자식 : C10H10O3
(4) 용융점 (mp) : 188-189.5°
(5) 수소 핵자기 공명 스펙트럼1H-NMR(CD3OD, 300MHz) δ 3.81(3H, s, OCH3), 6.31(1H, d, J=15.93, H-α), 6.94(1H × 2, d, J=9.51, H-3, 5), 7.53(1H × 2, d, J=9.51, H-2, 6), 7.61(1H, d, J=15.93, H-β).
(6) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼13C NMR(CD3OD, 100MHz) δ 56.65(OCH3), 116.21(C-3, 5), 117.39(C-α), 129.22(C-1), 131.68(C-2, 6), 146.99(C-β), 163.89(C-4), 171.59(COOH).
이상의 이화학적 및 분광학적 데이터를 근거로 화합물 1을 p-메톡시-trans-신나민산(p-methoxy-trans-cinnamic acid)으로 추정하였으며 문헌치와 (Kajimoto, T. et al. (1989) Phytochem. 28(10): 2701-2704 ; Falsone, G. et al. (1982) Verbascun sinuatum. Planta Med. 44: 150-153 ; Fernandez, L. et al. (1995) Scrophularia scorodonia. Phytochem. 34: 1569-1571) 비교하여 동정하였다.
(7) 화학구조식
화학식 2
또한 현삼의 메탄올 분획을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피한 다음 헥산과 디클로로메탄의 혼합용매로 재결정하여 또 하나의 신경세포 보호활성을 가지는 화합물 2를 분리, 정제하였다.
화합물 2의 이화학적 성질 및 분광학적 성질을 다음과 같이 규명하였다.
(1) 물질의 성상 : 미황색의 무정형 가루
(2) 분자량 : FabMS(m/z) 347 [M+Na]
(3) 분자식 : C16H20O7
(4) 수소 핵자기 공명 스펙트럼1H-NMR(CDCl3: CD3OD = 2 : 1, 300 MHz) δ 1.20(3H, d, J=6.33, H-6'), 3.62(3H, s, OCH3), 3.67(1H, dd, J=1.71, 3.42, H-2'), 3.75(1H, dd, J=9.75, 3.3, H-3'), 3.86(1H, dq, J=6.09, 9.75, H-5'), 4.76(1H, t, J=9.75, H-4'), 4.88(1H, d, J=1.71, H-1'), 6.13(1H, d, J=15.84, H-α), 6.69(1H × 2, d, J=8.79, H-3, 5), 7.28(1H × 2, d, J=8.79, H-2, 6), 7.44(1H, d, J=15.84, H-β)
(5) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼13C NMR(CDCl3: CD3OD = 2 : 1, 100MHz) δ 16.95(C-6'), 54.86(OCH3), 65.52(C-5'), 68.94(C-3'), 71.28(C-4'), 74.34(C-4'), 93.83(C-1'), 113.96(C-3, 5), 114.55(C-α), 126.54(C-1), 129.49(C-2, 6), 145.05(C-β), 161.26(C-4), 167.51(COO)
이상의 스펙트럼 데이터를 근거로 화합물 2를 p-메톡시-trans-신나모일-4'-α-L-람노스 에스테르(p-methoxy-trans-cinnamoyl-4'-α-L-rhamnose ester)로 결정하였다.
(6) 화학구조식
화학식 3
또한 화합물 3의 이화학적 성질 및 분광학적 성질을 다음과 같이 규명하였다.
(1) 물질의 성상 : 무색
(2) 분자량 : EIMS(m/z) 149 [M+]
(3) 분자식 : C9H8O2
(4) 용융점 (mp) : 133°
(5) 자외선 흡수 스펙트럼 UV(nm) 205, 224, 311
(6) 수소 핵자기 공명 스펙트럼1H-NMR(CD3OD, 300 MHz) δ 6.47(1H, d, J=15.93, H-α), 7.39(1H, × 3, m, H-3, 4, 5), 7.59(1H × 2, m, H-2, 6), 7.67(1H, d, J=15.93, H-β)
(7) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼13C NMR(CD3OD, 100 MHz) δ 1198.38(C-α), 129.18(C-2, 6), 130.01(C-3, 5), 131.40(C-4), 13.86(C-1), 146.30(C-β), 170.33(COOH)
이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 화합물 3을 신나민산(cinnamic acid)으로 추정하였으며 문헌치(Calis, I. et al. (1993) Scrophularia ilwensis. J. Nat. Prod. 56(4): 606-609 ; Calis, I. et al. (1988) Scrophularia scopolii. Planta Med. 168-180)와 비교하여 동정하였다.
(8) 화학구조식
화학식 4
상기의 현삼으로부터 분리,정제한 화합물 1, 2 및 3의 신경세포 보호 활성을 현삼 추출물의 신경세포 보호활성을 검색한 방법과 동일하게 글루타메이트로 신경독성을 유발시킨 일차 배양 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용하여 검색하였다.
그 결과 화합물 1, 2 및 3은 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다.
또한 본 발명에서는 신경세포 보호 활성이 확인된 본 발명의 화합물이 어떠한 기전으로 글루타메이트에 의한 신경독성을 차단시키는지 알아보기 위하여, 우선 일차 배양한 대뇌피질세포에 화합물의 투여시기를 글루타메이트의 처리 전(pretreatment)후 (recovery treatment)로 나누어 각각 달리하여 보았다.
그 결과 화합물 1 및 2는 글루타메이트 작용전후에 모두 처리(throughout treatment)하였거나 전처리하였을 때 모두 유의성 있게 신경세포를 보호하는 효과를 나타내었으나 후처리하였을 경우에는 신경세포 보호 활성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 한편 화합물 3은 투여시기를 달리 하여도 그 효과가 증대되거나 감소됨이 없이 유의성있게 유지되는 것으로 보아 화합물 1 및 2와는 다른 기전으로 신경세포 보호활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
또한 본 발명의 화합물 1, 2 및 3이 글루타메이트성 수용체에 작용하여 신경세포 보호활성을 나타내는지 알아보기 위하여, 글루타메이트 수용체 중 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate, NMDA) 및 비-NMDA 수용체에 대한 작용을 알아보았다.
그 결과 화합물 2는 NMDA에 의해 유발된 신경독성은 유의성 있게 감소시켰으나 비-NMDA 효능제인 카이닉산(kainic acid, 이하 'KA'로 약칭함)으로 인하여 유발된 신경독성을 차단시키는 효과는 미비하여 글루타메이트 수용체 중 비-NMDA 수용체보다 NMDA 수용체에 대한 선택성이 뛰어남을 알 수 있었고, 화합물 1 및 3은 NMDA에 의해 유발된 신경독성 및 KA에 의한 신경독성도 유의성 있게 감소시켜 NMDA나 비-NMDA 수용체에 대한 선택성이 화합물 2와 비교하여 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 글루타메이트에 의한 신경독성은 글루타메이트를 작용시켰을 경우 초기에 나타나는 Ca2+의 유입에 따른 여러 효소들의 활성화에 의한 것이므로 본 발명의 화합물 1, 2 및 3의 신경세포 보호활성이 칼슘의 유입에 영향을 미침으로써 나타낼 것으로 생각되어 이들 화합물이 Ca2+유입에 어떻게 영향을 미치는지 알아보았다.
대뇌피질세포 내의 Ca2+의 농도는 그린키에윅스(Grynkiewicz) 등의 방법에 따라 측정하였으며 그 결과 화합물 1, 2 및 3은 글루타메이트로 인하여 세포 내로 유입되는 Ca2+의 농도를 유의성 있게 저하시켰으며 특히, 화합물 1 및 2는 기존에 알려진 Ca2+채널 차단제(Ca2+channel blocker)인 MK-801보다 낮은 EC50을 가짐을 알 수 있었다.
이에 본 발명에서는 Ca2+-의존성 효소(Ca2+-dependent enzyme)의 활성화에 따라 뒤따르는 산화질소(nitric oxide, NO)나 자유 라디칼(free radical)의 과다한 생성도 어느정도 저하되리라 기대되어 본 발명의 화합물 1, 2 및 3이 산화질소의 생성에 미치는 영향을 알아보았다.
구체적으로 화합물 1, 2 및 3을 농도별로 20일동안 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 전처리 또는 후처리하여 글루타메이트의 처리에 의하여 증가되는 NO의 생성량의 변화를 알아보았다. 이 때 일차 배양한 대뇌피질세포로부터 배양액 중으로 유리되는 아질산염(nitrite)의 양은 다우즌(Dawson) 등의 방법으로 측정하였다(Kohno, K. et al. (1995) Neurosci. Lett. 199: 65-68).
그 결과 화합물 2를 전처리하였을 경우 글루타메이트에 의해 증가된 NO의 양을 정상상태 때의 95% 수준까지 감소시켰으며, 후처리하였을 때에도 80% 수준까지 감소시켜 Ca2+농도의 저하에 따른 NO 생성량의 감소 효과를 가져온다는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 화합물 1 및 3도 글루타메이트에 의하여 과다하게 생성되는 NO의 양을 유의성 있게 감소시켰으나 화합물 2와 비교하면 그 효과가 훨씬 낮았다.
이상의 실험결과로 일차 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트로 유발시킨 신경독성에 대하여 현삼으로부터 분리한 화합물 1, 2 및 3은 유의성 있는 신경세포 보호 활성을 가짐을 알 수 있었으며, 글루타메이트로 인하여 세포내로 과다하게 유입되는 Ca2+의 농도를 저하시킴으로써 1차적으로 신경세포 보호활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 화합물 2는 글루타메이트로 인하여 과다하게 생성된 NO의 양을 감소시켜 지속적으로 일어나는 신경세포의 사멸을 차단하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 현삼 추출물 및/또는 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 신경세포 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 현삼 추출물 또는 상기 화학식 1의 화합물을 치료용 약제로 이용하는 경우에는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 현삼 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 0.2 ㎎/㎏ 의 농도로 1일 3회 정도로 나누어 투여할 수 있다.
이하, 하기 실시예에서 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 현삼의 추출 및 분획
현삼 24 kg을 클로로포름-메탄올(CHCl3- MeOH, 1 : 1)의 혼합용매로 2시간동안 3회 열탕 추출한 다음 추출물을 감압 농축하여 조 엑기스 1.8 kg을 얻었다. 현삼 엑기스(1.8 kg)를 증류수에 현탁시킨 다음, 디클로로메탄(CH2Cl2)으로 분획하고 감압농축하여 디클로로메탄 분획(350g)과 물 분획을 얻었다. 농축한 디클로로메탄분획을 다시 90% 메탄올에 현탁시킨 다음, 노르말 헥산(n-hexane)으로 분획하여 90% 메탄올 분획(273 g)과 노르말 헥산 분획(65 g)을 얻었다. 물 분획을 다시 노르말 부탄올(n-BuOH)로 분획하여 노르말 부탄올 분획 562 g을 얻었다(도 1 참조).
<실시예 2> 현삼 추출물의 활성조사
상기 실시예 1에서 제조한 현삼 추출물의 글루타메이트에 의한 신경독성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 흰쥐의 일차배양한 대뇌피질세포에 현삼 추출물을 처리한 다음 MTT 분석(assay)을 수행하였다.
실험동물로는 스프래그 다우리(Sprague-Dawley)계 흰쥐를 서울대학교 동물사육장에서 공급받아 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 사육장의 환경은 실내온도를 22 ± 5 ℃로 유지하고 조명시간을 아침 7시에서 저녁 7시로 고정하였으며, 사료는 조단백 23.2%, 조지방 4.0%, 조섬유 6.0%, 조회분 10.0%, 조칼슘 0.6%, 조인 0.4% 등이 함유된 고형사료(삼양사)를 사용하였다.
상기 사용한 흰쥐로부터 대뇌피질세포를 분리하기 위하여, 태자의 대뇌 부분만을 적출하여 해부 현미경 밑에서 조심스럽게 경막(meninges)을 제거한 후 대뇌조직을 0.25% 트립신(trypsin)으로 30분 동안 처리하여 조직을 연화시켜 개개의 세포로 유리되도록 하였다.
분리한 대뇌피질세포의 배양은 2.0 × 105세포/㎖이 되게 하여 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)으로 도포한 배양 용기(Falcon, 15 × 24 mm)에 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/㎖으로 구성된 배양액을 사용하였다. 세포의 배양은 37 ℃ 배양기에서 공기(95%)와 CO2(5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 수행하였으며 배양 4일이 지난 후 5 × 10-5M 5-플루오로데옥시유리딘(fluorodeoxyuridine)으로 처리하여 신경세포가 아닌 다른 세포의 성장을 억제시켰다(Choi, D. W. (1985) Neurosci. Lett. 58: 293-297).
현삼의 조 추출물, 분획물은 DMSO(최종 농도 0.1% 이내)에 용해시킨 후 증류수로 희석하여 1 mg/㎖의 농도로 제조한 다음 밀리포어 막(millipore membrane 0.22 ㎛; Millex-GV, U.S.A.)을 통과시켜 무균상태로 만들고 농도를 달리하여 상기 과정으로 20일동안 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 투여하고 1시간 후에 다시 50μM 글루타메이트를 15분동안 작용시킨 후 배양액을 제거하고 DMEM만으로 갈아준 다음 24시간 세포를 더 배양하였다. 이 때에도 계속하여 현삼의 조 추출물 및 각각의 분획물을 처리하였다(Throughout treatment).
배양중인 대뇌피질세포의 배양액에 MTT(5 mg/㎖)를 배양액의 10%가 되도록 가하고 계속하여 3시간 더 배양한 후 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 녹여낸 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 MTT 분석을 수행하였다(Mosmann, T. (1983) J. Immuno. Methods. 65: 55-61).
농도(㎍/㎖) 생존율(%)c
대조구a 100.0 ± 4.2
비교예b 0.0 ± 1.3
조 추출물 50 68.2 ± 5.5***
100 35.8 ± 3.1*
디클로로메탄 분획 5 46.2 ± 1.9**
10 68.7 ± 1.2***
노르말 헥산 분획 5 0.3 ± 2.5
10 -10.1 ± 7.3
90% 메탄올 5 77.5 ± 5.0***
10 67.4 ± 2.2***
물 분획 -
대조구a: 일차 배양한 대뇌피질세포비교예b: 글루타메이트에 15분간 노출된 대뇌피질세포, 대조구와 p<0.001생존율c: 100×(시료처리 OD-비교예 OD)/(대조구 OD-비교예 OD)유의성 :*p>0.05,**p<0.01,***p<0.001
통계적 유의성 검토는 각 실험군의 수를 3으로 하였으며(n=3) 대조치로부터의 변동을 "아노바 테스트(ANOVA test)"로 하였다. P값이 5% 미만일 때는 통계적으로 유의성 있다고 판정하였다.
그 결과 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 현삼의 조 추출물, 디클로로메탄 분획 및 90% 메탄올 분획물은 글루타메이트에 의한 신경독성을 유의성 있게 차단시켜 사멸되는 신경세포를 감소시켜 결과적으로 생존하는 세포의 수를 증가시켰다.
<실시예 3> 현삼 추출물로부터 화합물의 분리, 정제
상기 실시예 2에서 유의성 있는 신경세포 보호활성을 보인 90% 메탄올 분획(270 g)을 클로로포름 : 메탄올의 혼합용매(100:1 → 0:1)로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silicagel column chromatography)하여 8개의 소분획(분획 I ∼ Ⅷ)으로 나누고 각각의 신경세포 보호활성을 측정하였다.
농도(㎍/㎖) 생존율(%)
대조구 100.0 ± 4.2
비교예 0.0 ± 1.3
분획 Ⅰ 1 2.0 ± 2.2
10 -5.8 ± 4.3
분획 Ⅱ 1 56.2 ± 2.5***
10 38.1 ± 3.8**
분획 Ⅲ 1 0.3 ± 1.4
10 -10.1 ± 1.0
분획 Ⅳ 1 16.5 ± 3.1
10 24.4 ± 2.8*
분획 Ⅴ 1 59.7 ± 1.2***
10 82.4 ± 4.0***
분획 Ⅵ 1 -4.5 ± 0.3
10 21.1 ± 1.6*
분획 Ⅶ 1 0.5 ± 3.3
10 5.3 ± 2.1
분획 Ⅷ 결정안됨
그 결과 상기 표2에서 나타난 바와 같이, 소분획 2(분획 Ⅱ) 및 소분획 5(분획 V)가 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 가짐을 알 수 있었다.
이에 현삼의 90% 메탄올의 소분획중 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 나타낸 2번 소분획 2(분획 Ⅱ, 20 g)로부터 뇌신경세포 보호활성을 가지는 화합물을 분리하기 위하여 노르말 헥산 : 에틸아세테이트(EtOAc)의 혼합용매(100:1 → 0:1)로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하여 7개의 소분획(분획 Ⅱ-1 ∼ Ⅱ-7)으로 나누고 이중 분획 Ⅱ-2를 노르말 헥산 : 디클로로메탄 : 메탄올(5:1:1)의 혼합용매로 재결정하여 무색 침상 결정인 화합물 1을 980 mg과 무색 프리즘(prism)인 화합물 3을 50 mg 얻었다(도 2 참조).
또한 현삼의 90% 메탄올의 소분획 4(분획Ⅳ, 11 g)에서 생긴 침전물을 노르말 헥산 : 디클로로메탄(1:4)의 혼합용매로 재결정하여 미황색의 무정형 가루인 화합물 2를 642 mg 얻었다(도 2 참조).
<실시예 4> 화합물 1의 구조결정
실시예 3에서 분리 및 정제된 화합물 1의 이화학적 성질 및 분광학적 성질을 다음과 같이 규명하였다.
(1) 물질의 성상 : 무색 침상 결정(in EtOH)
(2) 분자량 : EIMS(m/z) 179 [M+]
(3) 분자식 : C10H10O3
(4) 용융점 (mp) : 188-189.5°
(5) 수소 핵자기 공명 스펙트럼1H-NMR(CD3OD, 300MHz) δ 3.81(3H, s, OCH3), 6.31(1H, d, J=15.93, H-α), 6.94(1H × 2, d, J=9.51, H-3, 5), 7.53(1H × 2, d, J=9.51, H-2, 6), 7.61(1H, d, J=15.93, H-β).
(6) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼13C NMR(CD3OD, 100MHz) δ 56.65(OCH3), 116.21(C-3, 5), 117.39(C-α), 129.22(C-1), 131.68(C-2, 6), 146.99(C-β), 163.89(C-4), 171.59(COOH).
이상의 이화학적 및 분광학적 데이터를 근거로 화합물 1을 p-메톡시-trans-신나믹 산(p-methoxy-trans-cinnamic acid)으로 추정하였으며 문헌치와 비교하여 동정하였다.
(7) 화학구조식
화학식 2
<실시예 5> 화합물 2의 구조결정
실시예 3에서 분리 및 정제된 화합물 2의 이화학적 성질 및 분광학적 성질을 다음과 같이 규명하였다.
(1) 물질의 성상 : 미황색의 무정형 가루
(2) 분자량 : FabMS(m/z) 347 [M+Na]
(3) 분자식 : C16H20O7
(4) 수소 핵자기 공명 스펙트럼1H-NMR(CDCl3: CD3OD = 2 : 1, 300 MHz) δ 1.20(3H, d, J=6.33, H-6'), 3.62(3H, s, OCH3), 3.67(1H, dd, J=1.71, 3.42, H-2'), 3.75(1H, dd, J=9.75, 3.3, H-3'), 3.86(1H, dq, J=6.09, 9.75, H-5'), 4.76(1H, t, J=9.75, H-4'), 4.88(1H, d, J=1.71, H-1'), 6.13(1H, d, J=15.84, H-α), 6.69(1H × 2, d, J=8.79, H-3, 5), 7.28(1H × 2, d, J=8.79, H-2, 6), 7.44(1H, d, J=15.84, H-β)
(5) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼13C NMR(CDCl3: CD3OD = 2 : 1, 100MHz) δ 16.95(C-6'), 54.86(OCH3), 65.52(C-5'), 68.94(C-3'), 71.28(C-4'), 74.34(C-4'), 93.83(C-1'), 113.96(C-3, 5), 114.55(C-α), 126.54(C-1), 129.49(C-2, 6), 145.05(C-β), 161.26(C-4), 167.51(COO)
이상의 스펙트럼 데이터를 근거로 화합물 2를 p-메톡시-trans-신나모일-4'-α-L-람노스 에스테르(p-methoxy-trans-cinnamoyl-4'-α-L-rhamnose ester)로 결정하였다.
(6) 화학구조식
화학식 3
<실시예 6> 화합물 3의 구조결정
실시예 3에서 분리 및 정제된 화합물 3의 이화학적 성질 및 분광학적 성질을 다음과 같이 규명하였다.
(1) 물질의 성상 : 무색
(2) 분자량 : EIMS(m/z) 149 [M+]
(3) 분자식 : C9H8O2
(4) 용융점 (mp) : 133°
(5) 자외선 흡수 스펙트럼 UV(nm) 205, 224, 311
(6) 수소 핵자기 공명 스펙트럼1H-NMR(CD3OD, 300 MHz) δ 6.47(1H, d, J=15.93, H-α), 7.39(1H, × 3, m, H-3, 4, 5), 7.59(1H × 2, m, H-2, 6), 7.67(1H, d, J=15.93, H-β)
(7) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼13C NMR(CD3OD, 100 MHz) δ 1198.38(C-α), 129.18(C-2, 6), 130.01(C-3, 5), 131.40(C-4), 13.86(C-1), 146.30(C-β), 170.33(COOH)
이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 화합물 3을 신나민산(cinnamic acid)으로 추정하였으며 문헌치와 비교하여 동정하였다.
(8) 화학구조식
화학식 3
<실시예 7> 화합물 1, 2 및 3의 신경세포 보호활성 조사
분리한 화합물의 신경세포 보호 활성을 글루타메이트로 신경독성을 유발시킨 일차 배양 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용하여 검색하였다.
농도(μM) 생존율(%)
대조구 100.0 ± 4.2
비교예 0.0 ± 1.3
화합물 1 0.1 66.4 ± 2.6***
1.0 78.8 ± 3.9***
10.0 72.5 ± 1.1***
화합물 2 0.1 48.3 ± 3.3**
1.0 77.6 ± 3.6***
10.0 36.6 ± 2.2**
화합물 3 0.1 38.5 ± 1.5**
1.0 28.2 ± 2.9*
10.0 24.7 ± 3.0
상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 화합물 1, 2 및 3을 농도별로 일차 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용한 검색계에서 글루타메이트 작용전후 모두 처리(throughout treatment)하고 MTT 분석을 시행하여 그 효과를 측정한 결과 상기 표 3에서 나타난 바와 같이 화합물 1, 2 및 3은 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 나타내어 1 μM 의 농도에서 각각 78.8%, 77.6% 및 28.4%의 활성을 보였다.
<실시예 8> 화합물 1, 2 및 3의 작용단계 조사
상기 실시예 7에서 신경세포 보호 활성이 확인된 본 발명의 화합물이 어떠한 기전으로 글루타메이트에 의한 신경독성을 차단시키는지 알아보기 위하여 화합물의 투여시기를 달리하여 보았다.
즉, 화합물 1, 2 및 3을 농도별로 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트를 처리하기 1시간전부터 글루타메이트를 처리하기 직전까지만 투여하고(pretreatment), 배양액을 DMEM으로 교환하고 24시간 더 배양한 다음 MTT 분석을 시행하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
농도(μM) 생존율(%)
대조구 100.0 ± 4.2
비교예 0.0 ± 1.3
화합물 1 0.1 73.5 ± 5.1***
1.0 81.2 ± 2.6***
10.0 74.4 ± 4.3***
화합물 2 0.1 69.5 ± 1.5***
1.0 89.6 ± 0.8***
10.0 50.0 ± 2.0**
화합물 3 0.1 39.4 ± 1.1**
1.0 49.3 ± 4.2***
10.0 32.7 ± 1.9*
또한, 흰쥐의 대뇌피질세포를 20일 동안 배양한 다음 글루타메이트를 15분동안 작용시킨 후 배양액을 DMEM으로 갈아주면서 화합물 1, 2 및 3을 농도별로 투여하여 24시간 더 배양하고(recovery only) MTT 분석을 시행하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
농도(μM) 생존율(%)
대조구 100.0 ± 4.2
비교예 0.0 ± 1.3
화합물 1 0.1 16.0 ± 0.6
1.0 19.8 ± 1.9
10.0 0.0 ± 3.2
화합물 2 0.1 3.3 ± 0.3
1.0 34.1 ± 0.9*
10.0 22.0 ± 1.1
화합물 3 0.1 33.5 ± 5.1*
1.0 42.1 ± 2.6**
10.0 34.4 ± 2.3*
상기 표 4 및 표 5에 나타난 바와 같이, 화합물 1 및 2는 전후 모두(throughout) 처리하였거나 전처리하였을 때 모두 유의성 있게 신경세포를 보호하는 효과를 나타내었으나 후처리를 하였을 경우에는 신경세포 보호 활성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 한편 화합물 3은 투여시기를 달리 하여도 그 효과가 증대되거나 감소됨이 없이 유의성 있게 유지되는 것으로 보아 화합물 1 및 2와는 다른 기전으로 신경세포 보호활성을 나타내는 것으로 생각되었다.
<실시예 9> 화합물 1, 2 및 3의 글루타메이트성 수용체와의 작용조사
본 발명의 화합물 1, 2 및 3이 글루타메이트성 수용체에 작용하여 신경세포 보호활성을 나타내는지 알아보기 위하여, 글루타메이트 수용체 중 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate, NMDA) 및 비-NMDA 수용체에 대한 작용을 알아보았다.
즉, 1차 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 화합물 1, 2 및 3을 농도별로 작용시키고 1시간 후에 NMDA 효능제인 NMDA 및 비-NMDA 효능제인 KA를 투여하여 신경독성을 유발시키면서 화합물 1, 2 및 3이 유발되는 신경독성에 어떠한 영향을 미치는 가를 알아보았다(표 6 및 표 7).
농도(μM) 생존율(%)
대조구 100.0 ± 4.2
비교예(NMDA-처리구)a 0.0 ± 1.3
화합물 1 0.1 36.3 ± 1.3**
1.0 60.0 ± 1.8***
화합물 2 0.1 52.5 ± 1.7***
1.0 67.8 ± 2.6***
화합물 3 0.1 36.1 ± 2.2**
1.0 33.3 ± 3.1*
농도(μM) 생존율(%)
대조구 100.0 ± 4.2
비교예(KA-처리구)a 0.0 ± 1.3
화합물 1 0.1 33.9 ± 2.3*
1.0 29.7 ± 1.9*
화합물 2 0.1 5.0 ± 1.6
1.0 18.4 ± 1.1
화합물 3 0.1 17.5 ± 1.1
1.0 24.6 ± 0.6*
그 결과 화합물 2는 NMDA에 의해 유발된 신경독성은 유의성 있게 감소시켰으나 KA로 인하여 유발된 신경독성을 차단시키는 효과는 미비하여 글루타메이트 수용체 중 비-NMDA 수용체보다 NMDA 수용체에 대한 선택성이 뛰어났다. 한편, 화합물 1 및 3은 NMDA에 의해 유발된 신경독성을 유의성 있게 차단시키는 효과를 나타내었으며, KA에 의한 신경독성도 유의성 있게 감소시켜 NMDA나 비-NMDA 수용체에 대한 선택성이 화합물 2와 비교하여 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 10> 화합물 1, 2 및 3이 세포내 칼슘유입에 미치는 영향 조사
본 발명의 화합물 1, 2 및 3이 세포내로 칼슘이 유입되는 데 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 화합물을 흰쥐 대뇌피질세포에 처리한 다음 그린키에윅스(Grynkiewicz) 등의 방법에 따라 대뇌피질세포 내의 Ca2+의 농도를 측정하였다(Grynkiewicz, G. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 3440-3450).
구체적으로 유리 커버 슬라이드(glass cover slides)에서 20일간 배양한 대뇌피질세포에 화합물 1, 2 및 3을 농도별로 투여하고 1시간 후에 50 μM 의 글루타메이트를 15분동안 작용시키고 다시 배양액을 인산 완충 생리 식염수로 대치하고 5 μM FURA-2 AM에 1시간동안 반응시킨 후 슬라이드를 떼어내어 2.5 ㎖ 생리식염수가 담긴 분광기 큐벳(spectrophotometer cuvettes)에 넣고 형광도를 측정하였다(여기 340/380 nm, 방출 520 nm).
농도(μM) 세포내 [Ca2+](nM) 상대적 보호 활성(%)
대조구 75.0 ± 15.0 100.0
비교예(글루타메이트-처리구)b 423.0 ± 20.0 0.0
화합물 1 0.1 160.6 ± 9.1*** 75.4
1.0 174.8 ± 7.8*** 71.6
화합물 2 0.1 178.0 ± 6.0*** 70.4
1.0 159.9 ± 3.7*** 75.6
화합물 3 0.1 256.2 ± 5.1** 47.9
1.0 265.3 ± 9.2** 45.3
MK-801d 0.1 294.4 ± 4.1** 37.0
1.0 136.7 ± 2.9** 82.3
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 화합물 1, 2 및 3은 글루타메이트로 인하여 세포 내로 유입되는 칼슘의 농도를 유의성 있게 저하시켰으며(표 8) 특히, 화합물 1 및 2는 기존에 알려진 Ca2+채널 차단제(Ca2+channel blocker)인 MK-801보다 낮은 EC50을 가짐을 알 수 있었다.
<실시예 11> 화합물 1, 2 및 3의 산화질소의 생성에 미치는 영향 조사
상기 실시예 10의 결과로 비루어 본 발명의 화합물이 Ca2+-의존성 효소의 활성화에 따라 뒤따르는 산화질소(nitric oxide, NO)나 자유 라디칼(free radical)의 과다한 생성도 어느정도 저하시키리라 기대되어 NO의 생성에 미치는 영향을 알아보았다.
화합물 1, 2 및 3을 농도별로 20일동안 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 전처리(pretreatment) 또는 후처리(recovery treatment)하여 글루타메이트의 처리에 의하여 증가되는 NO의 생성량에 어떻게 영향을 미치는가를 정량함으로써 알아보았다(표 9 및 표 10).
농도(μM) 아질산염(nM) 상대적 보호활성(%)
대조구 65.5 ± 2.7 100.0
비교예(글루타메이트-처리구)b 153.7 ± 5.2 0.0
화합물 1 0.1 106.5 ± 8.9** 53.5
1.0 111.2 ± 5.7** 48.2
화합물 2 0.1 91.7 ± 6.3*** 70.3
1.0 69.9 ± 2.4*** 95.0
화합물 3 0.1 109.8 ± 1.7** 49.8
1.0 104.1 ± 8.6** 56.2
MK-801d 0.1 103.9 ± 1.5** 56.5
1.0 88.5 ± 4.1*** 74.0
농도(μM) 아질산염(nM) 상대적 보호활성(%)
대조구 65.5 ± 2.7 100.0
비교예(글루타메이트-처리구)b 153.7 ± 5.2 0.0
화합물 1 0.1 116.3 ± 2.5** 42.4
1.0 136.9 ± 3.0 19.0
화합물 2 0.1 102.6 ± 1.5** 57.9
1.0 87.0 ± 2.0*** 81.1
화합물 3 0.1 137.2 ± 1.2 18.7
1.0 115.3 ± 6.6** 43.5
MK-801d 0.1 100.7 ± 3.2** 60.1
1.0 79.7 ± 3.5*** 83.9
일차 배양한 대뇌피질세포로부터 배양액 중으로 유리되는 아질산염의 양은 다우즌(Dawson) 등의 방법으로 측정하였다.
그 결과 화합물 2는 글루타메이트에 의해 증가된 NO의 양을 1 μM 에서 전처리하였을 경우 정상상태 때의 95% 수준까지 감소시켰으며, 후처리하였을 때에도 1 μM 에서 80% 수준까지 감소시켜 Ca2+농도의 저하에 따른 NO 생성량의 감소 효과뿐만 아니라 직접적으로 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 작용하여 NO의 생성을 저하시키는 효과도 가지리라 추측되었다. 한편, 화합물 1 및 3도 글루타메이트에 의하여 과다하게 생성되는 NO의 양을 유의성 있게 감소시켰으나 화합물2와 비교하여 그 효과가 훨씬 낮았다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 현삼 추출물 및 화학식 1의 신나메이트 유도체는 농도 의존적으로 글루타메이트에 의한 신경독성으로부터 신경세포를 유의성있게 보호하는 활성을 지님으로 뇌졸중 및 치매등의 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방이나 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 화합물 1, 2 및 3의 신나메이트 유도체는 글루타메이트로 인하여 세포내로 과다하게 유입되는 Ca2+의 농도를 저하시킴으로써 1차적으로 신경세포 보호활성을 나타내는 것이며, 특히 화합물 2는 글루타메이트로 인하여 과다하게 생성된 NO의 양을 감소시켜 지속적으로 일어나는 신경세포의 사멸을 차단하는 효과가 있다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1의 구조를 가지는 신경세포 보호제용 신나메이트 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체.
    화학식 1
    R1은 CH3, 또는 H 이고, R2는 H 또는 α-L-람노스(Rhamnose)이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 신나메이트 유도체는 하기 화학식 2의 p-메톡시-trans-신나민산(p-methoxy-trans-cinnamic acid), 하기 화학식 3의 p-메톡시-trans-신나모일-4'-α-L-람노스 에스테르(p-methoxy-trans-cinnamoyl-4'-α-L-rhamnose ester) 또는 하기 화학식 4의 신나민산(cinnamic acid)인 것을 특징으로 하는 신경세포 보호제용 신나메이트 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물, 용매화물 및 이성질체.
    화학식 2
    화학식 3
    화학식 4
  3. 현삼을 클로로포름-메탄올의 혼합용매로 추출하고 디클로로메탄으로 분획한 다음 다시 메탄올에 현탁하고 헥산으로 분획한 현삼 메탄올 분획을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매로 칼럼 크로마토그래피한 다음 다시 칼럼 크로마토그래피하거나 재결정하여 분리하는 것을 특징으로 하는 제 1 항의 신나메이트 유도체의 제조 방법.
  4. 제 1 항의 신나메이트 유도체를 유효성분으로 하는 뇌졸중, 퇴행성 신경계 질환의 예방 또는 치료제용 약학적 조성물.
  5. 현삼을 클로로포름-메탄올의 혼합용매로 추출하거나, 다시 디클로로메탄으로 분획하여 이를 메탄올에 현탁하고 헥산으로 분획한 현삼 추출물을 유효성분으로 하는 신경세포 보호제용 약학적 조성물.
KR1019980028189A 1998-07-13 1998-07-13 신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체 KR100291524B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980028189A KR100291524B1 (ko) 1998-07-13 1998-07-13 신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980028189A KR100291524B1 (ko) 1998-07-13 1998-07-13 신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000008399A true KR20000008399A (ko) 2000-02-07
KR100291524B1 KR100291524B1 (ko) 2001-07-12

Family

ID=19543992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980028189A KR100291524B1 (ko) 1998-07-13 1998-07-13 신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100291524B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100740566B1 (ko) * 2006-03-13 2007-07-18 경희대학교 산학협력단 페닐프로파노이드 계 화합물을 포함하는 항불안 및 기억력개선 효과를 나타내는 조성물
WO2009020304A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Kwang Dong Pharmaceutical Co. A composition comprising an extract of scrophularia radix for treating and preventing cognitive impairment involved disease
KR100890177B1 (ko) * 2007-08-09 2009-03-25 광동제약 주식회사 현삼 추출물 및 아미노산 조합물을 유효성분으로 함유하는인지기능 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR102162531B1 (ko) * 2019-07-03 2020-10-07 경희대학교 산학협력단 미리스타게놀 a를 포함하는 신경세포 보호용 조성물

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100446090B1 (ko) * 2000-10-19 2004-08-30 주식회사 엘컴사이언스 사우로락탐계 알카로이드의 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료제로서의 용도 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6299324A (ja) * 1985-10-25 1987-05-08 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 脳循環代謝改善剤

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100740566B1 (ko) * 2006-03-13 2007-07-18 경희대학교 산학협력단 페닐프로파노이드 계 화합물을 포함하는 항불안 및 기억력개선 효과를 나타내는 조성물
WO2009020304A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Kwang Dong Pharmaceutical Co. A composition comprising an extract of scrophularia radix for treating and preventing cognitive impairment involved disease
KR100890179B1 (ko) * 2007-08-09 2009-03-25 광동제약 주식회사 현삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애 관련질환의 예방 및 치료용 조성물
KR100890177B1 (ko) * 2007-08-09 2009-03-25 광동제약 주식회사 현삼 추출물 및 아미노산 조합물을 유효성분으로 함유하는인지기능 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR102162531B1 (ko) * 2019-07-03 2020-10-07 경희대학교 산학협력단 미리스타게놀 a를 포함하는 신경세포 보호용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR100291524B1 (ko) 2001-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Supasuteekul et al. Antioxidant, DNA damage protective, neuroprotective, and α-glucosidase inhibitory activities of a flavonoid glycoside from leaves of Garcinia gracilis
DE60202603T2 (de) 8-(c-beta-d-glucopyranosyl)-7,3&#39;,4&#39;-trihydroxyflavone, verfahren zur isolation aus pterocarpus marsupium und pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung von diabetes
KR100815476B1 (ko) 케나프 추출물과 이로부터 분리된 신규 캠프페롤 화합물 및 이의 용도
KR20040099300A (ko) 온혈 동물의 면역, 소염, 항암 및 ｄｎａ 수복 과정을향상시키기 위한 식물 종의 수용성 추출물의 생체 활성성분을 단리 및 정제하고 그의 구조를 확인하는 방법
Merghache et al. Evaluation of hypoglycaemic and hypolipidemic activities of Globularin isolated from Globularia alypum L. in normal and streptozotocin-induced diabetic rats
WO2006137139A1 (ja) マンゴスチンの単離方法とそれを含有する医薬品、及び健康食品
KR20110036040A (ko) 인지 장해 개선제
KR100291524B1 (ko) 신경세포 보호활성을 가지는 신나메이트 유도체
CN111848565B (zh) 单萜基双香豆素类化合物、药物组合物及其制备方法和用途
KR101384423B1 (ko) 자소엽 추출물을 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물
KR102121915B1 (ko) 결명 새싹 유래 나프토파이론 유도체를 포함하는 신경세포 보호용 조성물
KR100446089B1 (ko) 퇴행성 뇌신경계 질환 예방 또는 치료 효과를 갖는 삼백초 추출물 및 이 추출물을 활성성분으로 함유하는 약학적 제제
KR100514076B1 (ko) 페닐에타노이드 유도체를 포함하는 퇴행성 뇌신경계질환의 예방 및 치료용 조성물
KR101164020B1 (ko) 손바닥선인장 추출물을 함유하는 약학 조성물
KR20130128677A (ko) 뽕나무로부터 분리한 화합물을 포함하는 뇌질환 예방 및 치료용 조성물
KR20060110968A (ko) 신규 리그난 화합물, 이를 제조하는 방법 및 이를 함유하는조성물
KR102169240B1 (ko) 결명 새싹 유래 나프토파이론 유도체를 포함하는 신경세포 보호용 조성물
KR101208566B1 (ko) 산겨릅나무 추출물을 포함하는 조성물
DE60128120T2 (de) Saururus chinensis-extrakt zur prophylaxis und behandlung neurodegenerativer krankheiten
KR20100060949A (ko) 신경세포 보호용 조성물
CN108314618A (zh) 倍半萜类化合物及提取方法和抗阿尔兹海默症的医药用途
KR100481684B1 (ko) 피누솔리드 유도체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌신경계 질환의 예방 및 치료제
Chung Inhibition of monamine oxidase by a flavone and its glycoside from Ixeris dentata Nakai
KR100446090B1 (ko) 사우로락탐계 알카로이드의 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료제로서의 용도 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제
US20090143318A1 (en) Degranulation inhibitor

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130304

Year of fee payment: 13

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140409

Year of fee payment: 14

LAPS Lapse due to unpaid annual fee