KR101252107B1 - 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 치료용 조성물의 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통하여, 면역글로불린 IgE, 히스타민(histamine), 및 사이토카인의 분비를 억제시키며, 또한 특이적으로 아토피를 유발시킨 항원에 대한 IgE를 감소시키는 효과를 나타내므로, 본 발명에 따른 혼합 생약재 추출물을 아토피 예방 및 치료용 조성물로써 유용하게 이용할 수 있다.

Description

혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물{Composition for the prevention or treatment of atopic dermatitis containing herbal medicines}
본 발명은 아토피 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
아토피는 심한 가려움증을 가지는 재발성 만성피부염으로, 어린이의 약 10 ~ 15%가 아토피성 피부염을 가지고 있으며, 90%는 5년 내 저절로 호전되는 것으로 보고되어 있다. 이러한 아토피는 성인기에는 대체로 호전되어 약 30 ~ 40%는 외관상으로 피부염이 재발되지 않으나, 나머지는 성인이 되어서도 피부 건조, 자극성 물질에 의한 피부자극, 주부습진 등의 피부염으로 어려움을 겪는 것으로 알려져 있다. 또한, 민감성 피부의 경우, 수분 보유력 및 그 회복력이 낮고, 피부 각질화, 가려움증 등이 나타나기 쉽기 때문에 아토피성 피부로 될 확률이 높다.
아토피의 정확한 병리 생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않지만 유전적 소인과 함께 면역학적, 비면역학적 기전이 관여한다고 보고 있다. 아토피의 대부분을 차지하는 외인성 아토피은 IgE와 연관된 면역 기전에 의해 발생되는데 특정 알레르겐(알레르겐(allergen))에 대한 즉시형 면역 반응보다는 T 세포 이상에 의한 지연성 면역 반응이 관여한다는 보고들이 많다. 또한, 요즘은 B세포로 부터 IgE의 생성을 유도하는 IL-4 등 Th2 관련 사이토카인(cytokine)들이 아토피의 원인이라고 보고되고 있다(JS Kang et al., Ihhibition of atopic dermatitis by topical application of silymarin in NC/Nga mice. intl immunopharm. (2008) 8. 1475-1480).
이러한 아토피를 치료하기 위하여, 종래 세라마이드, 리놀레산, 식물유 또는 광물성 오일 등의 성분들, 하이드로코티손(hydrocortisone) 등의 스테로이드(steroid) 제제 또는 이들에 항균 및 항염 기능을 강화한 물질, 자외선 요법을 통한 DNA 합성 억제게, 세포 과증식 억제제, 염증 및 가려움증 억제제 등이 제안된 바 있다. 그러나, 상기 스테로이드 제제는 표피의 성장억제나 부작용 등의 역효과를 유발할 수 있으며, 우레아 퍼록사이드 등은 피부의 과다 자극을 야기할 수 있고, 항히스타민제 등의 항생물질은 균의 내성(resistance) 및 광과민 등의 부작용을 유발할 가능성이 높은 문제점이 있다. 또한, 장기간 피부에 적용시 모세 혈관 확장증 및/또는 각질층의 두께 증가 내지 확장을 유발하는 등의 심각한 부작용을 발생시킬 염려가 있으며, 최근 아토피 완화에 많이 쓰이는 감마-리놀레산(한국특허공개 2000-0046633호)은 쉽게 산화되므로 안정성이 열등함과 아울러, 피부 자극성이 비교적 강하여 민감한 피부에는 사용하기 곤란한 등의 문제점이 있다.
이에 최근에는 아토피에 효과를 갖는 천연물질을 탐색하는데 초점을 맞추고 있다. 대표적으로, 쑥 추출물(대한민국 특허등록 제10-0377262호), 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마 및 백년초의 추출물(대한민국 특허등록 제10-0517465호), 달맞이유, 알로에, 목초액, 제비꽃, 대추, 송이버섯, 두릅, 인삼, 녹차, 두충, 복분자, 오미자, 쑥, 포공영, 삼백초, 황기, 하고초, 해송, 황금 및 우슬의 추출물(대한민국 특허등록 제10-0451444호), 청자소엽과 적자소엽의 추출물(대한민국 특허등록 제10-0454752호), 건률, 의이인, 오미자, 길경, 나복자, 맥문동 및 석창포의 추출물(대한민국 특허등록 제10-0483539호), 라벤더, 유칼립투스 및 티트리 오일(대한민국 특허등록 제10-0597997호) 등이 있고, 그 외에도 상기생, 합환피, 창이자, 맥아 등이 효과가 있다고 알려져 있다. 그러나, 상기 천연물질들은 그 효능이 미미하거나, 효과는 있더라도 민감성 피부에 있어서는 알레르기 과민반응을 보여 그 사용이 제한되는 단점이 있었다.
따라서, 종래 알려진 아토피 개선 및 치료제에 비하여 보다 효과가 뛰어나고 안전한 물질을 개발하는 것이 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물 제조하여, 상기 추출물이 세포독성을 유발하지 않는 농도를 확립한 후, 세포에서 사이토카인의 분비를 억제하는 효과를 확인하였으며, 이러한 효과가 생체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo)에서 아토피과 관련된 면역 사이토카인의 분비를 감소시키는 효과 및 항균활성을 확인함으로써, 아토피 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피의 예방 및 치료용 외용제를 제공한다.
본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지 및 감초의 혼합 추출물은 천연물 유래의 추출물로 세포 독성이 거의 없어 안전하고, 아토피에서 관찰되는 IgE, 사이토카인(cytokine), 및 히스타민(hitamine)의 분비를 억제시키며, 아토피 증상을 완화시키는 효과를 나타내므로, 아토피 예방 및 치료용 조성물, 개선용 건강식품, 치료용 피부 외용제, 및 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 혼합 추출물의 세포독성 시험결과이다.
도 2는 혼합 추출물과 이를 구성하고 있는 각각의 약물의 IgE 분비 억제를 나타낸 그래프이다.
도 3은 혼합 추출물과 이를 구성하고 있는 각각의 약물의 히스타민(histamine) 분비억제를 나타낸 그래프이다.
도 4는 혼합 추출물과 구성약물의 생체 외(ex vivo)에서 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13 및 IFNg) 분비 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 혼합 추출물과 구성약물의 생체 외(ex vivo)에서 IgE 분비 억제를 나타낸 그래프이다.
도 6은 아토피 모델 마우스를 제조한 방법을 나타낸 그림이다:
boosting: 2, 4-디니트로클로로벤(2, 4-Dinitrochlorobenzene, DNCB)과 집먼지 진드기 추출물에 의한 아토피 인덕션 이전에 생체내의 알레르겐(allergen)에 대한 면역 반응을 증폭시키기 위해 동일한 알레르겐인 DNCB로 일주일 전에 귀에 발라줌;
DNCB: 아세톤과 올리브 오일이 1:3으로 섞인 용액에 녹인 1%의 2, 4-디니트로클로로벤(2, 4-Dinitrochlorobenzene, DNCB)을 20 ㎕씩 양쪽 귀에 처리함;
house dust mite: 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae, Der.f)를 10 ㎎/㎖의 농도로 녹인 후 양쪽 귀에 20 ㎕를 처리함; 및
paiting: 혼합 추출물의 효능을 확인하기 위해 해당되는 농도(1 ㎎/ear, 5 ㎎/ear)의 양을 매일 각각의 귀의 양면에 발라줌.
도 7의 A는 혼합 추출물의 경피투여에 따른 아토피 모델 마우스의 귀 두께의 변화를 나타낸 그래프이다:
cont: 무처리 대조군;
1 ㎎: 70% 에탄올 혼합 추출물(50 ㎎/㎖)을 양쪽 귀에 20㎕ 씩 발라, 최종 처리 농도가 1 ㎎으로 처리한 군(1㎎/ear);
5 ㎎: 70% 에탄올 혼합 추출물(250 ㎎/㎖)을 양쪽 귀에 20㎕ 씩 발라, 최종 처리 농도가 5 ㎎으로 처리한 군(1㎎/ear);
유도횟수 : 추출물 및 '집먼지 진드기+ DNCB'를 처리한 횟수;
도 7의 B는 혼합 추출물의 처리 양에 따른, 아토피 증상 완화를 나타내는 그림이다;
cont: 무처리 대조군;
1 ㎎: 70% 에탄올 혼합 추출물(50 ㎎/㎖)을 양쪽 귀에 20㎕ 씩 발라, 최종 처리 농도가 1 ㎎으로 처리한 군(1㎎/ear); 및
5 ㎎: 70% 에탄올 혼합 추출물(250 ㎎/㎖)을 양쪽 귀에 20㎕ 씩 발라, 최종 처리 농도가 5 ㎎으로 처리한 군(1㎎/ear).
도 8은 혼합 추출물 투여에 따른 생체 내(in vivo) IgE 분비억제를 나타낸 그래프이다:
cont: 무처리 대조군;
1 ㎎: 70% 에탄올 혼합 추출물(50 ㎎/㎖)을 양쪽 귀에 20㎕ 씩 발라, 최종 처리 농도가 1 ㎎으로 처리한 군(1㎎/ear); 및
5 ㎎: 70% 에탄올 혼합 추출물(250 ㎎/㎖)을 양쪽 귀에 20㎕ 씩 발라, 최종 처리 농도가 5 ㎎으로 처리한 군(1㎎/ear).
도 9는 혼합 추출물 투여에 따른 쥐 림프절 사이토카인 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 혼합 추출물의 아토피 마우스 모델의 귀 세포에서의 사이토카인 분비 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 혼합 추출물을 포함하는 연고의 처치에 따른 아토피 마우스 모델 혈청의 IgE 변화를 관찰한 나타낸 그래프이다:
Control: 무처리 대조군;
2.50 %: 혼합 추출물 2.50%가 함유된 연고를 처리한 군; 및
5 %: 혼합 추출물 5 %가 함유된 연고를 처리한 군.
도 12은 혼합 추출물의 피부 외용제제의 유동성 평가를 나타낸 그래프이다:
#9: 혼합 추출물이 함유된 o/w 제제 처방 9번;
#11: 혼합 추출물이 함유된 액정제제처방 11번; 및
#18: 혼합 추출물이 함유된 액정제제처방 18번.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다
본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 아토피 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부%, 황기는 3 ~ 15 중량부%, 작약은 3 ~ 10 중량부%, 당귀는 3 ~ 24 중량부%, 백출은 3 ~ 15 중량부%, 진피는 3 ~ 9 중량부%, 연교는 3 ~ 15 중량부%, 금은화는 3 ~ 9 중량부%, 복령은 3 ~ 18 중량부%, 백지는 3 ~ 9 중량부% 및 감초는 3 ~ 10 중량부%의 혼합 추출물을 함유하는 하는 것이 바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의 생약재에 대하여 이에 대한 10배 부피의 용매를 이용하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 아토피 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 혼합 추출물은 추출 용매로 물, 알코올 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 바람직하며, 에탄올인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출 용매의 양은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초 전체 건조 중량의 5배 내지 15배를 첨가하는 것이 바람직하고, 전체 건조 중량의 10를 첨가하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
추출시 온도는 10℃ 내지 120℃ 인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 40℃ 내지 100℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 시간은 1시간 내지 7시간인 것이 바람직하고, 3시간 내지 5시간인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 3시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출물을 제조하는 방법은 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출, 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물의 아토피 예방 및 치료효과를 측정하기 위하여, 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통하여, 아토피에서 관찰되는 면역글로불린 IgE, 히스타민(histamine), 및 사이토카인의 분비 또는 발현을 측정하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 시험관 내(in vitro) 실험을 통하여, 본 발명에 따른 혼합 추출물의 세포독성을 나타내지 않는 농도를 확인하였으며(도 1 참조), 세포주에 혼합 추출물을 처리하였을 때, 아토피에서 관찰되는 면역글로불린 IgE의 분비 및 사이토카인 및 히스타민의 분비가 감소하는 것을 확인하였다(도 1, 도 2 및 도 3 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마우스 아토피 모델을 제조하여, 본 발명에 따른 혼합 추출물을 처리한 후 마우스의 T 세포와 B 세포를 분리하여 사이토카인의 분비를 측정하였으며, 그 결과는 시험관 내 실험 결과와 유사하게 혼합 추출물 처리에 의해서 사이토카인의 분비가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4 및 도 5 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 마우스 아토피 모델에 본 발명에 따른 혼합 추출물을 처리하였을 때, 아토피 증상이 완화되는 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 혼합 추출물은 마우스 아토피 모델의 혈청의 IgE 분비를 감소시켰으며, T 세포에서의 사이토카인의 분비를 억제하였다(도 7, 도 8 및 도 9 참조). 또한, 아토피를 유발시킨 후, 본 발명에 따른 혼합 추출물을 경피투여한 마우스의 귀 조직을 분리하여, 사이토카인의 분비를 살펴본 결과, 아토피 마우스 모델의 T 세포에서보다 사이토카인의 분비가 더욱 효과적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 10 참조). 이러한 결과는 아토피 마우스 모델의 귀 부위에 직접 본 발명에 따른 혼합 추출물을 처리하여, 그 효과가 증가된 것으로 추정되었다.
따라서, 본 발명에 따른 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 아토피 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 국소 투여가 더 바람직하며, 경피 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g／㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 ㎎／㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물에 있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부%, 황기는 3 ~ 15 중량부%, 작약은 3 ~ 10 중량부%, 당귀는 3 ~ 24 중량부%, 백출은 3 ~ 15 중량부%, 진피는 3 ~ 9 중량부%, 연교는 3 ~ 15 중량부%, 금은화는 3 ~ 9 중량부%, 복령은 3 ~ 18 중량부%, 백지는 3 ~ 9 중량부% 및 감초는 3 ~ 10 중량부%의 혼합 추출물을 함유하는 하는 것이 바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의 생약재에 대하여 이에 대한 10배 부피의 용매를 이용하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물은 아토피 마우스 모델에서 전체 IgE 및 아토피 마우스 모델을 제조하는데 사용한 집먼지 진드기에 대한 IgE를 특이적으로 감소시키는 효과를 보이며, 아토피 동물 모델에서 임상적 아토피 증세를 현저히 호전시키므로, 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 나노리포좀 제형으로 만들어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로 평균 입자 지름이1-100nm인 리포좀인것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 30-70nm인것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 리포좀은 수용성 머리와 불용성의 꼬리를 가진 양친매성 분자로 구성된 입자의 상호 자발적인 결합 및 정렬된 콜로이드 입자로, 세포막과 유사한 이중막 구조를 가지며, 이를 함유한 조성물은 손상된 피부 장벽의 회복, 피부 장벽의 강화, 피부 자극의 완화의 효과를 기대할 수 있다.
또한, 나노리포좀은 C12 -22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산 및 세포간 지질을 포함한다. 본 발명의 나노 리포좀의 제조에 이용되는 C12 -22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산은, 바람직하게는 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레산 및 팔미트올레인산을 포함하며, 보다 바람직하게는 스테아린산, 팔미트올레인산 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 나노 리포좀은 피부 외용제 총 중량에 대하여 0.05 - 5.0 중량%로 함유되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 더욱 바람직하게는 0.1 - 4.0 중량%이나, 이에 한정되지 않는다. 나노리포좀에 포함되는 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물의 함량은 나노리포좀의 총 중량에 대해서 1.0 - 20.0 중량%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 3.0 - 12.0 중량%인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 피부 외용제를 제공한다.
상기 아토피 예방 및 치료용 피부 외용제에 있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부%, 황기는 3 ~ 15 중량부%, 작약은 3 ~ 10 중량부%, 당귀는 3 ~ 24 중량부%, 백출은 3 ~ 15 중량부%, 진피는 3 ~ 9 중량부%, 연교는 3 ~ 15 중량부%, 금은화는 3 ~ 9 중량부%, 복령은 3 ~ 18 중량부%, 백지는 3 ~ 9 중량부% 및 감초는 3 ~ 10 중량부%의 혼합 추출물을 함유하는 하는 것이 바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의 생약재에 대하여 이에 대한 10배 부피의 용매를 이용하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물은 아토피 마우스 모델에서 전체 IgE 및 아토피 마우스 모델을 제조하는데 사용한 집먼지 진드기에 대한 IgE를 특이적으로 감소시키는 효과를 보이며, 아토피 동물 모델에서 임상적 아토피 증세를 현저히 호전시키므로, 아토피 예방 및 치료용 피부 외용제로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 피부 외용제는 나노리포좀 제형으로 만들어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로 평균 입자 지름이1-100nm인 리포좀인것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 30-70nm인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 리포좀은 수용성 머리와 불용성의 꼬리를 가진 양친매성 분자로 구성된 입자의 상호 자발적인 결합 및 정렬된 콜로이드 입자로, 세포막과 유사한 이중막 구조를 가지며, 이를 함유한 조성물은 손상된 피부 장벽의 회복, 피부 장벽의 강화, 피부 자극의 완화의 효과를 기대할 수 있다.
또한, 나노리포좀은 C12 -22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산 및 세포간 지질을 포함한다. 본 발명의 나노 리포좀의 제조에 이용되는 C12 -22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산은, 바람직하게는 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레산 및 팔미트올레인산을 포함하며, 보다 바람직하게는 스테아린산, 팔미트올레인산 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 나노 리포좀은 피부 외용제 총 중량에 대하여 0.05 - 5.0 중량%로 함유되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 더욱 바람직하게는 0.1 - 4.0 중량%이나, 이에 한정되지 않는다. 나노리포좀에 포함되는 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물의 함량은 나노리포좀의 총 중량에 대해서 1.0 - 20.0 중량%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 3.0 - 12.0 중량%인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
또한, 본 발명은 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 아토피 예방 및 개선용 건강기능식품에 있어서, 인삼은 1.5 ~ 9 중량부%, 황기는 3 ~ 15 중량부%, 작약은 3 ~ 10 중량부%, 당귀는 3 ~ 24 중량부%, 백출은 3 ~ 15 중량부%, 진피는 3 ~ 9 중량부%, 연교는 3 ~ 15 중량부%, 금은화는 3 ~ 9 중량부%, 복령은 3 ~ 18 중량부%, 백지는 3 ~ 9 중량부% 및 감초는 3 ~ 10 중량부%의 혼합 추출물을 함유하는 하는 것이 바람직하며, 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 총 1.25kg의 생약재에 대하여 이에 대한 10배 부피의 용매를 이용하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물은 아토피 마우스 모델에서 전체 IgE 및 아토피 마우스 모델을 제조하는데 사용한 집먼지 진드기에 대한 IgE를 특이적으로 감소시키는 효과를 보이며, 아토피 동물 모델에서 임상적 아토피 증세를 현저히 호전시키므로, 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 아토피 예방 및 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초의 혼합 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 혼합 추출물 제조
<1-1> 70% 에탄올 추출물
본 발명의 혼합 추출물에 포함되는 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초를 정선하여 약전 통칙 중 절도에 따라 조절로 한 다음 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 각 생약을 추출기에 넣고(총 1.25kg), 약품 무게에 대해 10배량의 70%(v/v) 에탄올(12.5L)을 넣어 침지하고, 80℃에서 3시간 추출한 후 농축 건조하였다. 건조한 추출물을 생체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo)에 실험하기 직전 70% 에탄올에 농도별로 녹여 평가하였다. 이하, 실시예의 실험은 70% 에탄올 추출물을 이용하여 실험하였다.
<1-2> 70% 메탄올 추출물
본 발명의 혼합 추출물에 포함되는 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초를 정선하여 약전 통칙 중 절도에 따라 조절로 한 다음 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 각 생약을 추출기에 넣고(총 1.25kg), 약품 무게에 대해 10 배량의 70%(v/v) 메탄올 (12.5L)을 넣고 40℃에서 3 시간 동안 초음파 추출하여 추출액을 여과하고 여액을 60℃ 이하에서 감압농축하여 건조하였다.
<1-3> 열수 추출물
본 발명의 혼합 추출물에 포함되는 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초를 정선하여 약전 통칙 중 절도에 따라 조절로 한 다음 인삼 125 g, 황기 125 g, 작약 125 g, 당귀 125 g, 백출 125 g, 진피 125 g, 연교 125 g, 금은화 125 g, 복령 125 g, 백지 63 g, 감초 63 g 씩, 각 생약을 추출기에 넣고(총 1.25kg), 약품 무게에 대해 10 배량의 정제수(12.5L)를 넣어 100 ℃에서 3 시간 추출하여 추출액을 여과하고 여액을 60 ℃이하에서 감압농축하여 건조하였다.
혼합 추출물의 제조방법에 따른 추출수율 함량 (%)
70% 에탄올 70% 메탄올 100% 증류수
건조분말 16.8 13.1 28.56
단일 구성성분 추출물의 제조
본 발명의 혼합 추출물에 포함되는 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지 및 감초를 정선하여 약전 통칙 중 절도에 따라 조절로 한 다음 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복령, 백지, 감초 각각 200g 따로 추출기에 넣고, 약품 무게에 대해 10배량의 70%(v/v) 에탄올을 넣어 침지하고, 80℃에서 3시간 추출한 후 농축 건조하였다. 건조한 추출물을 생체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo)에 실험하기 직전 70% 에탄올에 농도별로 녹여 평가하였다.
단일 구성성분 추출물의 제조방법에 따른 추출수율 함량 (%)
복령 진피 작약 백지 인삼 황기 당귀 백출 감초 연교 금은화
수율 11.5 21.5 25.7 38.5 26.0 11.9 33.3 10.3 19.6 22.8 24.9
세포배양
<3-1> 비장 세포 배양
6 ~ 8주령의 암컷 Balb/c 마우스에서 비장을 체취한 후, 갈아서 전체 비장 세포를 획득하였다. 상기 세포들을 DMEM 배지에 10% FBS, 3 mM L-글루타민(L-glutamine), 10mM HEPES, 100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 100 U/㎖ 스트렙토마이신(spreptomycin), 0.05 mM 2-베타-메르캅토에탄올(2-beta-mercaptoethanol)이 포함되어 있는 T 세포 배지에 깔아 준 후 37℃, 5% CO2 의 농도의 배양기에서 배양하였다.
<3-2> B 세포주 배양
사람의 다발성골수종 세포(multiple myeloma cells)인 U266B1를 RPMI 1640 기본 배지에 10% FBS, 1 mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 2mML-글루타민(2mML-glutamine), 100U 페니실린(penicillin) 및 50 mg/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin) 이 첨가되어 있는 B세포 배지에서 37℃, 5% CO2 의 농도의 배양기에서 배양하였다.
<3-3> HMC -1 세포주 배양
사람의 대식 세포주인 HMC-1 세포를 IMDM 기본 배지에 10% FBS와 1%의 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 배양액에서 37℃, 5% CO2 의 농도의 배양기에서 배양하였다.
<3-4> T 세포주 배양
아토피가 유도된 마우스의 림프절을 체취한 후 갈아서, 단일 세포로 분리한 후, 비드 시스템(bead system)을 이용해 T 세포를 분리하였다.
T 세포의 표면에 발현되고 있는 CD4를 인지하는 항체가 연결되어 있는 마그네틱 비드(bead)를 전체 세포와 15분 동안 4℃에서 인큐베이션을 하였다. 이를 통해 T 세포와 마그네틱 비드간의 상호작용을 통해 결합을 이루게 되고 이를 강한 자석 판에 연결된 컬럼에 흘러 주게 되면 이 CD4+T 세포만이 컬럼 안에 존재하게 된다. 마지막에 이 컬럼에 결합되어 있는 T 세포를 용리(elution)시켜 분리하였다.
상기의 과정을 통하여 분리된 CD4+T 세포는 DMEM 배지에 10% FBS, 3 mM L-글루타민(L-glutamine), 10mM HEPES, 100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 100 U/㎖ 스트렙토마이신(spreptomycin), 0.05 mM 2-베타-메르캅토에탄올(2-beta-mercaptoethanol)이 포함되어 있는 T 세포 배지에 1.5 × 106 세포/㎖의 농도로 깔아 준 후, 37℃, 5% CO2 의 농도의 배양기에서 배양하였다. T 세포를 자극하기 위하여, PMA 또는 이오노마이신(ionomycine)을 배지에 첨가하였다.
마우스 아토피 모델 제조
마우스 아토피 모델을 제조하기 위하여, 본 과기원의 동물 사육실에서 직접 키운 6 ~ 8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 사용하였다. 먼저 3 그룹을 각각 5마리의 마우스로 나누고 7일 동안 알레르겐(allergen)에 대한 면역 시스템을 활성화시키기 위한 부스팅(boosting)기간을 보냈다.
그 후, 4 주간에 걸쳐 마우스의 양쪽 귀에 10 mg/㎖의 집먼지 진드기(house dust mite extract, GREER source materials) 20 ㎕와 햅틴(hapten)계열의 1% DNCB(2, 4-Dinitrochlorobenzene)(Sigma)를 20 ㎕ 각각 주 1회씩 교대로 처리하였다. (도 6).
혼합 추출물을 포함하는 피부 외용제제 제조
하기 표 3의 조성에 따라 "실시예"는 액정 유화기술을 통한 외용 제제를 개발하였고, "비교예"는 일반 O/W 에멀젼 외용 제제를 제조하였다. 먼저 수상과 유상을 각각 75℃로 가열 용해한 후 유상을 수상에 첨가하고 호모믹서 6,000 rpm 조건 하에서 10분간 유화시킨 후 30℃까지 냉각하여 제조하였다.
아토피 예방 및 치료용 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제의 구성성분
성분 제조예 1 제조예 2 비교예 1 비교예 2
수상 정제수 to 100 to 100 to 100 to 100
트리에탄올아민 0.15 0.15 0.15 0.15
카르복시비닐폴리머(1 중량% 용액) 15 15 15 15
글리세린 5 5 5 5
부틸렌글리콜 5 5 5 5
파라옥시안식향산에스테르 0.2 0.2 0.2 0.2
에탄올 복합 추출물 2.5 5.0 2.5 5.0
유상
 세토스테아릴알콜 3 3 1 1
글리세릴모노스테아레이트 1 1 1 1
레시친 1 1 - -
세라마이드 03 0.6 0.6 - -
스쿠알란 5 5 5 5
카프릴릭,카프릴트리글리세리드 3 3 3 3
디메치콘 0.5 0.5 0.5 0.5
PEG-100스테아레이트 1.5 1.5 1.5 1.5
파라옥시안식향산프로필 0.1 0.1 0.1 0.1
파라옥시안식향산메칠 0.2 0.2 0.2 0.2
파라옥시안식향산에칠 0.1 0.1 0.1 0.1
상기 표 3의 수치 단위는 중량%이며, 카르복시비닐폴리머로는 미국 비.에프.굿리치(B.F.Goodrich)사의 상품인 카보폴 940(Carbopol 940)을 1 중량% 수용액으로 사용하였다.
본 발명의 혼합 추출물의 세포독성 측정
<6-1> 본 발명의 혼합 추출물 세포독성 측정
시험관 내(in vitro)에서 본 발명에 따른 혼합 추출물의 아토피 개선 및 치료의 효능을 확인하기에 앞서, 세포에 대한 독성이 없으며 최적의 효과를 낼 수 있는 적합한 농도를 결정하기 위해 세포독성 검사를 하였다.
MTT assay의 일종인 WST-assay를 통해서 세포에 독성을 주지 않고, 세포 사멸을 유도하지 않는 최적의 농도를 확인하고자 하였다. WST-1 assay는 살아 있는 세포 내의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 테트라졸리움(tetrazolium) 염(WST-1)이 포르마잔(formazan) 색소로 변환되는 원리를 이용한다. 배지에 첨가한 테트라졸리움 염은 미토콘드리아의 호흡 사슬에 존재하며 생존세포에만 활성이 있는 succinate-tetrazolium-reductase에 의해 포르마잔 색소로 변환한다. 살아있는 세포수가 증가하면 시료 중의 미토콘드리아 탈수소효소의 전체의 활성이 증가하여 이 효소활성의 증가가 포르마잔 색소의 생성증가를 유도하기 때문에 포르마잔 색소와 배지 중에서 대사활성이 있는 세포의 수는 직선적인 상관관계를 나타내게 된다. 즉, 농도가 높을수록 살아있는 세포수가 많다는 것을 확인할 수 있다.
우선, 마우스의 비장에서 비장세포(splenocyte)를 분리한 후 적혈구 세포(red blood cell, RBC)를 제거한 후, 5×105 세포에 0.25 ㎎/㎖ 또는 0.5 ㎎/㎖의 두 가지 농도의 70% 에탄올 혼합 추출물 및 이를 구성하고 있는 구성성분을 처리한 후, 37 ℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 48시간 후, WST-1 테스트를 위해 10 ㎕의 테트라졸리움 염을 배양액에 첨가한 후, 다시 37 ℃ 배양기에서 배양하여 배양액의 색깔이 변하는 적당한 O.D가 된 시점에 440 nm에서 O.D를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 같이 혼합 추출물 및 이를 구성하고 있는 11가지의 구성 한약재들은 대부분 두 가지 농도에서 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인이 되었으며, 0.25 ㎎/㎖에서 세포독성이 좀더 낮게 나타났으므로 상기 농도를 이용하여 본 발명에 따른 혼합 추출물의 아토피 치료효과를 확인하였다(도 1).
ELISA 를 이용한 혼합 추출물의 IgE 분비 측정
아토피에 있어 가장 큰 지표 타겟으로 알려진 물질은 IgE이므로, 본 발명자들은 가장 먼저 혼합 추출물과 이를 구성하고 있는 각각의 구성 성분이 세포주에서의 IgE의 분비를 억제하는 효과가 있는지를 확인하고자 하였다.
IgE의 분비를 억제하는 효과를 확인하기 위하여, U266B1 세포주를 이용하였다. 상기 세포주는 여러 가지 항체 아이소타입(isotype) 중에서도 특별히 IgE를 많이 분비하는 사람에서 유래된 B세포주이다. B 세포가 분화가 되어 플라스마 세포가 되면 기본적으로 여러 가지 면역글로불린(immunoglob㎕in) 중에서 IgM을 분비하게 되고 클래스 스위칭 반응(class switching reaction)에 의해서 여러 가지 아이소타입(isotype)으로 전환된다고 알려져 있다. 이러한 아이소타입 결정에 있어서, T 세포에서 분비되는 다양한 사이토카인(cytokine)이 중요한 역할을 하며 각각의 환경에 많이 존재하는 사이토카인에 의해 IgA, IgE, IgE 등의 다양한 아이소타입으로 변화된다고 알려져 있다. 이 중에서 IgE로의 변환에 있어서는 지질다당류(polysaccharide, LPS)/ 안티-CD40 및 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)에 의한 자극이 필요하다는 것이 알려져 있으므로, 본 발명자들은 B 세포가 IgE를 분비시키는 환경을 조성하기 위하여, B 세포의 배양시 LPS와 IL-4을 배양액에 첨가하였다.
우선, 상기 실시예 <4-1>에서 배양한 B 세포에 10 ㎍/㎖의 LPS와 5 ng/㎖의 IL-4를 배양액에 첨가한 후, 세포를 72시간 정도 37 ℃ 배양기에서 배양하여, B 세포를 자극하였다.
72시간 후, 0.25 ㎎/㎖의 혼합 추출물 및 이를 구성하고 있는 각각의 구성성분(0.25 ㎎/㎖)을 세포에 처리한 후, 3일을 배양하였다. 3일 배양 후, 세포를 수득한 후, 배양액에 존재하는 IgE의 농도를 ELISA(BETHYL)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 혼합 추출물과 이를 구성하고 있는 각각의 구성성분은 B 세포의 IgE 분비를 억제하였으며, 구체적으로 구성성분 중 당귀가 IgE 분비 억제 능력이 가장 낮았으며, 그 외의 성분 및 전체 성분을 함유하고 있는 혼합 추출물에서 IgE 분비 억제능이 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 이러한 효과가 동물 실헐(in vivo)에서도 동일하게 나타나는 것인지 확인하기 위하여, 하기 실시예에서 본 발명에 따른 혼합 추출물 및 각각의 구성성분에 대한 IgE 분비 억제능을 측정하였다(도 2).
ELISA 를 이용한 혼합 추출물의 히스타민 분비 측정
아토피에 있어서 가장 큰 특징은 IgE의 분비 증가이지만, 또 다른 특징으로 아토피 및 알러지 환자에서 관찰되는 비만세포(mast cell)나 호염세포(basophil)가 분비하는 히스타민(histamine) 농도의 증가가 있다. 비만 세포의 경우 세포 표면에 IgE에 대한 강한 반응성의 수용체(high affinity receptor)를 발현하고 있어 외부의 알러젠(알레르겐(allergen))이 몸속으로 들어왔을 때 IgE가 여기에 결합하게 되고 이 IgE가 다시 알러젠을 붙잡기 때문에 비만 세포가 활성화되게 된다. 이때 활성화된 비만 세포는 탈과립(degran㎕ation)에 의해 히스타민 및 염증성 매개 인자들을 분비하게 되고 아토피나 알러지 증상을 심화시킨다. 따라서 세포에 적정 농도의 혼합 추출물을 처리하여 자극을 준 후 배양액에 분비되는 히스타민의 농도를 히스타민 검출 키트(histamine assay kit)을 이용해 측정하하여, 혼합 추출물 및 이를 구성하고 있는 구성 성분의 항알러지 또는 항아토피 효과를 간접적으로 확인하고자 하였다.
우선, 사람에서 유래된 비만 세포주인 HMC-1세포주에 0.25 ㎎/㎖의 혼합 추출물 및 0.25 ㎎/㎖ 의 혼합 추출물을 구성하고 있는 각각의 구성성분을 세포에 처리함과 동시에, 세포를 활성화시키기 위하여, 20 nM의 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma)와 2 mM의 아이오노마이신(ionomycin, sigma)을 24시간 처리한 후 세포 배양액에 분비된 히스타민의 양을 ELISA를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 세포배양액에 아무것도 처리하지 않은 무처리 대조군에 비하여, 감초, 당귀, 복령, 및 혼합 추출물이 히스타민의 분비정도를 감소시켰으며, 특히 감초와 복령은 약 40%정도로 크게 감소시키는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 3).
본 발명의 혼합 추출물의 생체 외( ex vivo ) 사이토카인의 발현 억제 효과
<9-1> 혼합 추출물의 T 세포에서 분비하는 사이토카인의 발현 억제 효과
혼합 추출물의 세포주를 이용해 확인된 사이토카인의 분비를 억제하는 효과가 생체내(in vivo) 상황에서도 나타나는지 확인하고자, 상기 <실시예 4>에서 아토피에 근접한 상황으로 아토피를 유도한 마우스의 림프절에서 같이 MACs bead를 이용하여 T세포를 분리하여 혼합 추출물 및 혼합물을 구성하는 구성 성분을 처리하여 추출물의 효능을 검증하였다.
T 세포에서 분비하는 사이토카인의 발현량에 미치는 영향을 살펴보기 위해 아토피를 유도한 마우스에서 T 세포를 분리한 후, 혼합 추출물 및 구성 성분을 0.25mg/ml의 농도로 세포에 처리하고, 이때 20 nM의 PMA와 2 mM의 ionomycin으로 함께 4시간 자극하였다.
상기 세포에서 RNA를 분리한 후, cDNA를 합성해 아토피에서 알려진 병리학적 사이토카인(pathogenic cytokine)인 IL-4, IL-5, IL-13, IFNg의 mRNA 발현량을 정량적 실시간 PCR(quantitative real time PCR)을 통해 확인하였다. 실험에 있어서 항상 일정량 발현한다고 알려져 있는 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)인 HPRT를 내부적 대조군(internal control)로 사용하였고, 대조군에 대해서 상대적인 발현량을 그래프로 나타내었다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성(denature)를 수행한 후, '94 ℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초'의 과정을 40회 반복한 후, 72℃에서 5분동안 연장(extension) 과정을 수행하였으며, 사용한 프라이머 서열은 하기와 같다:
마우스 HPRT;
정방향 프라이머(서열번호 1): 5'-GCC CAA GAT CGT CAA AAA GA-3';
역방향 프라이머(서열번호 2): 5'-ATT GTG GAC CAG GAA CTT GC-3';
IL-4;
정방향 프라이머(서열번호 3): 5'-ACA GGA GAA GGG ACG CCA T-3';
역방향 프라이머(서열번호 4): 5'-GAA GCC GTA CAG ACG AGC TCA-3';
IL-5;
정방향 프라이머(서열번호 5): 5'-AGC ACA GTG GTG AAA GAG AC-3';
역방향 프라이머(서열번호 6): 5'-TCC AAT GCA TAG CTG GTG ATT T-3';
IL-13;
정방향 프라이머(서열번호 7): 5'-GCA ACA TCA CAC AGG ACC AGA-3';
역방향 프라이머(서열번호 8): 5'-GTC AGG GAA TCC AGG GCT AC-3';
IFN-g;
정방향 프라이머(서열번호 9): 5'-TCA AGT GGC ATA GAT GTG GAA GAA-3';
역방향 프라이머(서열번호 10): 5'-TGG CTC TGC AGG ATT TTC ATG-3';
TNF-a;
정방향 프라이머(서열번호 11): 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3';
IL-17;
정방향 프라이머(서열번호 12): 5'-TTC ATC TGT GTC TCT GAT GCT-3';
역방향 프라이머(서열번호 13): 5'-TTG ACC TTC ACA TTC TGG AG-3';
IL-31;
정방향 프라이머(서열번호 14): 5'-ATA CAG CTG CCG TGT TTC AG-3'; 및
역방향 프라이머(서열번호 15): 5'-AGC CAT CTT ATC ACC CAA GAA-3'.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 먼저 IL-4의 경우 감초, 당귀, 백출, 연교, 복령, 작약, 혼합 추출물이, IL-5의 경우 당귀, 백출, 연교, 혼합 추출물이, IL-13의 경우 감초, 당귀, 백출, 연교, 혼합 추출물이, IFNg의 경우 감초, 당귀, 백출, 연교, 백지, 작약, 혼합 추출물이 사이토카인의 발현량을 유의하게 감소시켰다. 본 발명에 따른 구성 성분 중에서는 공통적으로 감초, 당귀, 백출, 연교가 IL-4, IL-5, IL-13 및 IFNg에서 공통적으로 효능이 있는 것을 확인할 수 있었으며, 각 구성성분을 모두 포함하고 있는 혼합 추출물 또한 확인한 4가지의 사이토카인을 모두 유의하게 감소시킴을 확인할 수 있었다.
<9-2> 본 발명의 혼합 추출물의 B 세포에서 분비하는 사이토카인의 발현 억제 효과
혼합 추출물의 B 세포에서 분비하는 사이토카인의 분비를 억제하는지 확인하고자, 본 발명에서 제조한 아토피를 유도시킨 마우스의 B 세포를 분리하여, LPS와 IL-4를 B 세포 배양시 첨가한 후, 0.25 ㎎/㎖ 또는 0.5 ㎎/㎖ 농도의 혼합 추출물을 배양액체 첨가한 후, 72시간 동안 배양하였다. 배양 3일 후, 배양액에 존재하는 B세포에서 분비된 IgE의 농도를 ELISA를 통해 확인하였다. 대조군으로 사용한 70% 알코올을 처리한 경우의 농도를 100%로 보고 나머지 처리 샘플들의 농도를 상대적으로 나타냈다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 혼합 추출물을 비롯한 이를 구성하고 있는 각각의 구성성분이 무처리 대조군에 비하여 IgE 농도를 크게 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다. 그 중에서도 감초, 당귀, 연교, 백출 및 혼합 추출물이 더욱 큰 감소 효과를 나타냈다. 또한 두 가지 농도(0.25 ㎎/㎖ 또는 0.5 ㎎/㎖)를 처리하여 비교하였을 경우, 농도가 증가함에 따라 IgE가 감소되는 정도가 증가하였다. 이러한 본 발명의 혼합 추출물의 B 세포에 있어서 IgE 농도를 감소시키는 효과는 T 세포에서 있어서 혼합 추출물의 효과와 일관성을 보였으며, 본 발명에 따른 혼합 추출물이 B세포뿐만 아니라 T 세포에도 영향을 미쳐 아토피의 유발 인자들을 감소시킴을 확인할 수 있었고 특히 각 구성 성분 중에서는 감초, 당귀, 연교, 백출이 효능이 가장 우수함을 확인할 수 있었다(도 5).
본 발명의 혼합 추출물의 아토피 증상 완화 효과
본 발명자들은 <실시예 4>에서 제조한 아토피 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 혼합 추출물의 약리활성을 측정하고자 하였다. 4주 동안 집먼지 진드기와 DNCB를 처리한 마우스 모델에, 나머지 3주 동안 집먼지 진드기와 DNCB로 주 1회씩 인덕션을 계속 진행하면서 70% 에탄올에서 추출한 혼합 추출물(1 ㎎ 또는 5 ㎎)을 매일 귀에 처리하였다.
집먼지 진드기와 DNCB를 마우스의 귀에 처리하였을 때, 아토피가 유도됨에 따라서 염증이 유도되어 귀 두께가 증가하므로, 아토피 마우스 모델의 귀 두께를 측정함으로써 혼합 추출물의 효능을 간접적으로 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, 추출물 처리 2주 후에 대조군에 비해 추출물을 처리한 그룹의 평균 귀 두께가 감소됨을 확인하였고 그 효과가 농도에 의존적임을 확인할 수 있었다.
또한 도 7의 B에 나타난 바와 같이, 아토피가 유도되면서 건조함이 심화되어 각질, 홍반 및 염증 등의 아토피 증상이 대조군에서 관찰되었으나, 본 발명에 따른 혼합 추출물을 귀에 바른 경우에는 대조군에서 관찰되는 아토피 증상이 감소되며, 건조함이 크게 감소되어 부드러워짐을 확인할 수 있었다(도 7).
본 발명의 혼합 추출물의 생체 외( in vivo ) 사이토카인의 발현 억제 효과
<11-1> 본 발명의 혼합 추출물의 B 세포에서 분비하는 사이토카인의 발현 억제 효과
B세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 각 그룹의 쥐들에서 피를 뽑아 혈청을 준비한 후 항원 비특이적 IgE(antigen non specific IgE) 및 항원으로 사용한 집먼지 진드기에 대한 IgE의 농도를 ELISA(BD bioscience)를 통해 확인해 보았다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 전체 IgE의 농도 및 집먼지 진드기 특이적인 IgE의 농도가 본 발명에 따른 혼합 추출물을 처리한 군에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 아토피의 경우 알레르겐 (알레르겐(allergen))이 다양하기 때문에, 항원으로 사용한 집먼지 진드기 특이적인 IgE의 농도가 혼합 추출물에 의해서 감소하였다는 점에서 더 의미가 있다고 볼 수 있다(도 8).
<11-2> 본 발명의 혼합 추출물의 T 세포에서 분비하는 사이토카인의 발현 억제 효과
상기 <실시예 10>에서 혼합 추출물을 아토피를 유발시킨 마우스의 귀에 처리하였을 때, 아토피의 증상이 완화되는 효과를 관찰하였다. 이에, 본 발명자들은 본 발명에 따른 혼합 추출물의 아토피 증상 완화효과에 관련된 구체적인 기작을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 10>에서 아토피 증상을 관찰한 마우스를 희생시켜, 혼합 추출물의 마우스의 생체 내(in vivo)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
상기 <실시예 10>에서 2주 동안 아토피 유도를 위하여 집먼지 진드기 추출물 및 DNCB를 혼합 추출물과 함께 처리한 마우스를 희생시킨 후, 마우스로부터 T 세포를 추출하였다. 쥐의 림프절에서 CD4+T세포를 분리한 후, 20 nM의 PMA와 2uM의 ionomycin으로 4시간 동안 세포를 활성화시킨 후 아토피에 있어 병리학적 사이토카인으로 알려져 있는 IL-4, IL-5, IL-13, IL-17, IL-31, IFNg, TNFa의 mRNA 발현량을 실시간 PCR(real time PCR)을 통해 확인하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성(denature)를 수행한 후, '94 ℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초'의 과정을 40회 반복한 후, 72℃에서 5분동안 연장(extension) 과정을 수행하였으며, 사용한 프라이머 서열은 상기 <실시예 9>와 동일하다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 IL-4, IL-5, IL-13의 양이 혼합 추출물을 처리했을 때 크게 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는. IL-4, IL-5, IL-13 사이토카인은 B 세포가 IgE를 생성하는 데 있어 중요한 사이토카인이라는 사실을 고려할 때, 혼합 추출물을 처리에 의한 T 세포에서 상기 사이토카인의 감소로 인해서 B세포의 IgE양이 감소하였다는 것을 알 수 있었다(도 9).
<11-3> 본 발명의 혼합 추출물의의 아토피 모델 마우스 귀 조직에서 사이토카인의 발현 억제 효과
아토피를 유도하고 추출물을 처리한 직접적인 위치인 귀에서의 변화를 살펴보기 위해 귀에서 전체 세포를 분리한, IL-4, IL-5, IL-13, IL-17, IL -31, IFNg, TNFa의 mRNA 발현량을 실시간 PCR(real time PCR)을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 혼합 추출물을 처리한 군에서 무처리 대조군에 비하여 염증성 사아토카인의 분비가 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 효과는 처리한 조성물의 농도가 1mg/ear 에서 5mg/ear으로 증가함에 따라 비례하였다. 또한, 본 발명에 따른 혼합 추출물이 림프절에서 분리한 T 세포보다 더욱 효과적으로 IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, TNFa의 발현량을 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 10).
본 발명의 혼합 추출물을 포함하는 피부 외용제의 아토피 치료 효과 측정
<실시예 5>에서 제조한 혼합 추출물을 포함하는 외용제를 연고 형태로 만든 "제조예 1"과 "제조예 2"의 완제품을 이용해 아토피 마우스에 효능이 있는지를 혈청 내에 존재하는 IgE level을 측정하여 확인하였다.
집먼지 진드기와 DNCB를 이용해 아토피를 4주간 유도한 후 나머지 3주 동안 위와 동일한 방법으로 아토피를 계속 유도하면서(각 주 1회씩 처리), 외용제를 3주동안 매일 동일량을 귀에 발라 주어 그 효능을 확인하였다. 이 때, 동일량을 발라 주기 위해 노란색 팁의 끝으로 외용제를 찍은 후, 귀에 발라 흡수가 잘 되게 문질러 주었으며, 외용제 처리 3주 후 쥐를 죽여서 심장에서 피를 뽑아 혈청을 준비한 후 IgE 농도를 ELISA로 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 표 3에서 기재된 "제조예 1"의 2.5 w/w%로 함유된 외용제제는 큰 효과가 보이지 않았으나 표 3에서 기재된 "제조예 2"의 5.0 w/w%로 함유된 외용제제의 경우는 30% 정도의 감소를 보여 완제품 또한 지속적으로 바를 경우 아토피에 효능이 있음을 알 수 있었다(도 11).
본 발명의 혼합 추출물의 유동성 평가
본 발명의 혼합 추출물을 함유하는 제형의 유동성을 평가하기 위하여, 상기 표 3에 기재된 피부 외용제의 비교예(도 12의 #9, #11) 및 실시예 2(도 12의 #18)의 처방을 Rheometer(RHEOTECH사, MODEL;FUDOH RHEO METER RT-2002J)를 이용해 상온에서 2.5cm로 압력을 가했을 때의 유동성을 평가하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 액정 유화기술을 이용하였을 때 실시예의 제형은 거의 일정하였으나, 비교예의 제형은 보름에서 1달 정도가 경과한 후, 점도가 떨어지는 양상을 보였다(도 12).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
< 제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
에탄올 혼합 추출물 20 ㎎
유당 20 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
에탄올 혼합 추출물 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
에탄올 혼합 추출물 10 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
락토오스 14.8 ㎎
스테아린산 마그네슘 0.2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 액제의 제조
에탄올 혼합 추출물 20 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
<1-5> 주사제의 제조
에탄올 혼합 추출물 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지
주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 에탄올 혼합 추출물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
< 제조예 2> 식품의 제조
본 발명의 열수 혼합 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
<2-1> 밀가루 식품의 제조
본 발명의 열수 혼합 추출물 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
<2-2> 유제품( dairy products )의 제조
본 발명의 열수 혼합 추출물 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-3> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 열수 혼합 추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 에탄올 혼합 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
열수 혼합 추출물(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<2-4> 건강보조식품의 제조
열수 혼합 추출물 100 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
< 제조예 3> 건강음료의 제조
열수 혼합 추출물 100 ㎎
구연산 100 ㎎
올리고당 100 ㎎
매실농축액 2 ㎎
타우린 100 ㎎
정제수를 가하여 전체 500 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
< 제조예 4> 나노리포좀의 제조
하기 [표 4]의 조성으로 나노 리포좀을 제조할 수 있다.
성분 함량 (중량%)
글리세린 15.0
레시친 5.0
콜레스테롤 5.0
유사세라마이드 5.0
스테아린산 2.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
에탄올 혼합 추출물 20.0
정제수 To 100
< 제조예 5> 화장품의 제조
<5-1> 유연화장수( 스킨 )
본 발명의 에탄올 혼합 추출물을 포함하는 아토피 피부용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 [표 5]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량( 중량％)
에탄올 혼합 추출물 0.1 ~ 30 ％
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<5-2> 영양화장수(로션)
본 발명의 에탄올 혼합 추출물을 포함하는 아토피 피부용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 [표 6]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량( 중량％)
에탄올 혼합 추출물 0.1 ~ 30 ％
1,3-부틸렌글리콜 8.0
글리세린 5.0
스쿠알란 10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0
유창목오일 0.1 ~ 30 ％
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<5-3> 에센스
본 발명의 에탄올 혼합 추출물을 포함하는 아토피 피부용 에센스를 제조하기 위해 하기 [표 7]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량( 중량％)
에탄올 혼합 추출물 0.1 ~ 30 ％
시토스테롤 1.7
플리글리세릴2-올레이트 1.5
세라마이드 0.7
세테아레스-4 1.2
콜레스테롤 1.5
디세틸포스페이트 0.4
농글리세린 5.0
카르복시비닐폴리머 0.2
산탄검 0.2
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<5-4> 세안제( 클렌징폼 )
본 발명의 에탄올 혼합 추출물을 포함하는 아토피 피부용 세안제(클렌징폼)를 제조하기 위해 하기 [표 8]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
성분 함량( 중량％)
에탄올 혼합 추출물 0.1 ~ 30 ％
N-아실글루타민산나트륨 20.0
글리세린 10.0
PEG-400 15.0
프로필렌글리콜 10.0
POE(15) 올레일알코올에테르 3.0
라우린유도체 2.0
메틸파라벤 0.2
EDTA-4Na 0.03
향료 0.2
정제수 To 100
<5-5> 영양크림
본 발명의 에탄올 혼합 추출물을 포함하는 아토피 피부용 영양크림을 제조하기 위해 하기 [표 9]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
배합성분 함량( 중량％)
에탄올 혼합 추출물 0.1 ~ 30 ％
바셀린 7.0
유동파라핀 10.0
밀납 2.0
폴리솔베이트60 2.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
스쿠알란 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
산탄검 0.5
토코페닐아세테이트 0.1
향, 방부제 미량
정제수 To 100
<5-6> 마사지크림
본 발명의 에탄올 혼합 추출물을 포함하는 아토피 피부용 마사지크림을 제조하기 위해 하기 [표 10]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.
배합성분 함량( 중량％)
에탄올 혼합 추출물 0.1 ~ 30 ％
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
밀납 2.0
토코페닐아세테이트 0.1
폴리솔베이트60 3.0
솔비탄세스퀴올레이트 2.5
세테아릴알코올 2.0
유동파라핀 30.0
산탄검 0.5
향, 방부제 미량
정제수 To 100
<5-7> 팩
본 발명의 에탄올 혼합 추출물을 포함하는 아토피 피부용 팩을 제조하기 위해 하기 [표 11]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
배합성분 함량( 중량％)
에탄올 혼합 추출물 0.1 ~ 30 ％
프로필렌글리콜 2.0
글리세린 4.0
폴리비닐알코올 10.0
에탄올 7.0
파이지-40 히드로게비이티드캐스터오일 0.8
트리에탄올아민 0.3
향, 방부제 미량
정제수 To 100
이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예들에 의해 한정되지 않고, 당업자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그외의 색채 화장품을 포함하는다양한 용도의 화장품에 적용될 수 있는 것이고, 그 효능에 따라 인체에 얇게 도포하여 바를 수 있는 약제 즉, 연고로 제조에 이용될 수 있고, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 인삼, 황기, 작약, 당귀, 백출, 진피, 연교, 금은화, 복력, 백지 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 치료용 조성물은 IgE, 사이토카인 및 히스타민의 분비를 억제시킴으로써, 아토피의 증상의 완화효과를 나타내므로, 아토피 예방 및 치료용 조성물, 화장료 조성물, 건강기능식품 및 피부 외용제로 유용하게 사용될 수 있다.
<110> LEE, JUNG BOK <120> omposition for the prevention or treatment of atopic dermatitis containing herbal medicines <130> 10p-06-22 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse HPRT forward primer <400> 1 gcccaagatc gtcaaaaaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse HPRT reward primer <400> 2 attgtggacc aggaacttgc 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 forward primer <400> 3 acaggagaag ggacgcca 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 reward primer <400> 4 gaagccgtac agacgagctc a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-5 forward primer <400> 5 agcacagtgg tgaaagagac 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-5 reward primer <400> 6 tccaatgcat agctggtgat tt 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 forward primer <400> 7 gcaacatcac acaggaccag a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 reward primer <400> 8 gtcagggaat ccagggctac 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-g forward primer <400> 9 tcaagtggca tagatgtgga agaa 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-g reward primer <400> 10 tggctctgca ggattttcat g 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a forward primer <400> 11 catcttctca aaattcgagt gacaa 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 forward primer <400> 12 ttcatctgtg tctctgatgc t 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 reward primer <400> 13 ttgaccttca cattctggag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-31 forward primer <400> 14 atacagctgc cgtgtttcag 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-31 reward primer <400> 15 agccatctta tcacccaaga a 21

Claims (10)

  1. 물, C1 ~ C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부 및 감초 3 ~ 10 중량부의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 물, C1 ~ C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부 및 감초 3 ~ 10 중량부의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피의 예방 및 개선용 화장료 조성물.
  6. 삭제
  7. 물, C1 ~ C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부 및 감초 3 ~ 10 중량부의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피의 예방 및 치료용 외용제.
  8. 삭제
  9. 물, C1 ~ C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 인삼 1.5 ~ 9 중량부, 황기 3 ~ 15 중량부, 작약 3 ~ 10 중량부, 당귀 3 ~ 24 중량부, 백출 3 ~ 15 중량부, 진피 3 ~ 9 중량부, 연교 3 ~ 15 중량부, 금은화 3 ~ 9 중량부, 복령 3 ~ 18 중량부, 백지 3 ~ 9 중량부 및 감초 3 ~ 10 중량부의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 건강기능식품.


  10. 삭제
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