KR20200046773A

KR20200046773A - 풀무치 추출물을 함유하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20200046773A
Application number: KR1020180128367A
Authority: KR
Inventors: 황재삼; 서민철; 김미애; 김인우; 김선영; 김성현; 이준하; 백민희
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-05-07
Also published as: KR102185436B1

Abstract

본 발명은 풀무치 추출물을 함유하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 상기 풀무치 추출물이 포함된 조성물은 조골세포에서의 ALP(alkaline phosphatase) 또는 Runx2(Runt-related transcription factor 2)의 발현을 촉진하는 효과가 우수하여 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염과 같은 골질환의 예방과 개선을 위한 약학 조성물과 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

풀무치 추출물을 함유하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물 {Composition comprising Locusta migratoria extract for promoting osteoblast differentiation}

본 발명은 풀무치 추출물을 함유하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조골세포의 분화 촉진용 조성물을 함유하는 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

뼈는 우리 몸에서 물리적 지지체로서, 몸의 형태와 관절을 유지하고, 중요한 장기를 외부의 충격으로부터 보호하며, 칼슘, 인의 저장소로서 이의 무기질이 몸에서 부족하거나 증가할 때 일정한 농도로 유지시켜주는 역할을 한다. 또한, 뼈도 다른 장기와 마찬가지로 신진대사가 활발하게 일어나는데, 신체가 성장할 때에는 뼈가 길어지고 굵어지며, 성장이 멈춘 후에는 노후된 뼈가 파골세포에 의해 제거되고, 뼈가 제거된 곳에서 조골세포에 의해 다시 새로운 뼈가 생성되는 반응이 일생동안 진행된다. 이와 같은 뼈의 제거, 뼈의 흡수, 흡수된 뼈의 재생(remodeling) 등의 균형의 신진대사에 의해 우리 몸의 뼈가 유지되는 것이다.

그러나, 파골세포와 조골세포의 형성 속도에 균형이 깨져서, 뼈의 재흡수가 뼈의 재생보다 빠르게 되면, 뼈의 증가보다 더 빠른 속도로 뼈 손실이 발생하여, 뼈의 크기가 감소하게 되는데, 이러한 증상으로 골다공증(osteoporosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염과 같은 퇴행성 골질환 등이 있다.

이 중에서도, 골다공증은 점차적으로 골 조직의 석회가 감소되면서, 골밀도가 낮아져 결국 골수강이 넓어지는 상태를 말하는데, 골수강이 넓어진 상태가 계속 진행되어, 뼈가 약해지면서 작은 충격에도 쉽게 골절이 되는 증상이 나타나며, 요통, 견통, 등결림, 관절통 및 무기력 증상이 나타난다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14~18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.

이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한, 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 시장 규모가 점차 증가할 것으로 예상되기 때문에, 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.

RUNX2는 뼈의 생성에 가장 중요한 골형성 마스터 유전자 중의 하나이다. RUNX2의 활성은 다양한 외부 신호전달로 조절이 된다. 인산화작용, 아세틸화, 단백질 분해작용(ubiquitination) 등이 이에 대한 활성과 안정성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. RUNX2는 조골세포 분화 및 뼈의 생성에 가장 중요한 조절인자이며 RUNX2 유전자를 제거한 마우스(RUNX2 knockout mice)는 조골세포의 성숙과정이 지연되어, 막 내 및 연골의 골화 작용이 중단되는 것이 확인되었다. 또한 RUNX2는 조골세포에 특이적인 ALP(alkaline phosphatase), OC(osteocalcin), OP(osteopontin), 1형 콜라겐(type I collagen) 등의 다양한 유전자의 발현을 조절한다. 성숙한 조골세포에서 RUNX2의 발현이 억제(expression of a dominant negative RUNX2)되면 조골세포의 활성저하로 뼈의 생성과 뼈의 밀도가 심각하게 줄어드는 것으로 확인되었다. 인간 RUNX2 유전자의 돌연변이로는 쇄골두개골 형성이상(cleidocranial dysplasia, CCD), 빗장뼈(clavicle)의 결손, 개방형 숨구멍(open fontanelles), 여분의 치아생성(supernumerary teeth), 단신(short stature) 등으로 대표되는 상염색체우성질환(autosomal dominant disease) 등이 있다. RUNX2의 타겟유전자로는 전사인자(transcriptional factor)인 OC(osteocalcin), ALP(alkaline phosphatase), OSE(osteoblast specific element) 등이 있으며, 이러한 유전자들도 RUNX2와 더불어 대표적인 조골세포분화 마커로 알려져있다.

이에 본 발명자들은 풀무치 추출물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 풀무치 추출물이 조골세포의 분화 촉진 효능이 있어 골다공증이나 관절염, 퇴행성 골진환과 관련된 다양한 질환의 치료제로 이용가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1374683호 (발명의 명칭 : 누에 유래 Ｄｐｐ 단백질을 포함하는 뼈 관련 질환 예방 및 개선용 식품 조성물, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2014.03.10) 대한민국 등록특허 제10-1686420호 (발명의 명칭 : 장수풍뎅이 추출물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2016.12.08.) 대한민국 등록특허 제10-0835214호 (발명의 명칭 : 항산화활성 및 골대사 관련인자 억제활성을 나타내는 청동풍뎅이 추출물, 출원인 : 재단법인 제주테크노파크, 등록일 : 2008.05.29) 대한민국 공개특허 제10-2016-0041110호 (발명의 명칭 : 갈색거저리의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물, 출원인 : 대한민국, 공개일 : 2016.04.18)

본 발명의 목적은 풀무치 추출물을 함유하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데에 있다. 또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조골세포의 분화 촉진용 조성물을 함유하는 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

상기 풀무치 추출물은 풀무치를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다.

상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 풀무치 추출물은 ALP(alkaline phosphatase) 또는 Runx2(Runt-related transcription factor 2)의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 풀무치 추출물을 포함하는 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

이에 본 발명은 풀무치 추출물을 포함하는 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 풀무치 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 풀무치 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 풀무치 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.

또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 풀무치의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다.

상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 풀무치 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 풀무치 추출물 또는 분획물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 풀무치 추출물 제조시, 풀무치의 건조 분말을 용매와 혼합한 후, 200~250J의 세기로 5~30초간 1~3회 파쇄한 후 추출을 시작할 수 있다. 또한 초음파 처리 후 10~60분간 4~30℃에서 방치하여 추출을 진행할 수도 있다. 상기 풀무치의 건조 분말은 동결건조나 4~30℃에서의 자연건조 방법을 통해 건조한 풀무치를 분말화하여 얻을 수 있다.

상기 풀무치 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 풀무치 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 풀무치 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 풀무치 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 풀무치 추출물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명은 풀무치 추출물을 함유하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 상기 풀무치 추출물이 포함된 조성물은 조골세포에서의 ALP(alkaline phosphatase) 또는 Runx2(Runt-related transcription factor 2)의 발현을 촉진하는 효과가 우수하여 골다공증, 류마티스성 관절염 또는 퇴행성 관절염과 같은 골질환의 예방과 개선을 위한 약학 조성물과 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다. 이와 관련하여 장수풍뎅이 등의 각종 곤충이 파골세포의 분화를 억제하여 류마티스 관절염의 치료 효과가 있다는 선행문헌 등이 개시되어 있기는 하지만, 현재까지는 풀무치에 대해서는 어떤 생리학적인 활성이 보고되어 있지는 않다.

도 1은 조골세포 MG-63에 대해 본 발명의 풀무치 추출물(LME)이 갖는 세포독성을 MTS 어세이를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 조골세포 MG-63에서 본 발명의 풀무치 추출물(LME)이 갖는 ALP 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 조골세포 MG-63에서 본 발명의 풀무치 추출물(LME)이 갖는 Alkaline phosphatase 유전자(ALPL)의 mRNA 발현 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 조골세포 MG-63에서 본 발명의 풀무치 추출물(LME)이 갖는 Runx2의 mRNA 발현 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 조골세포 MG-63에서 본 발명의 풀무치 추출물(LME)이 갖는 ALP(Alkaline phosphatase) 및 Runx2의 단백질 발현 억제 효과(상단) 및 이를 수치화하여 그래프(하단)로 나타낸 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 풀무치 추출물의 제조>

풀무치(Locusta migratoria)는 국립농업과학원 곤충산업과에서 실내 계대 사육한 해남 6세대를 사용하였다. 실험 곤충은 밀을 먹이로 사용하였으며 30℃, 65% R. H., 9L/15D, 1,800 Lux의 조건에서 사육하였다. 상기 풀무치(성충)를 물로 2회 세척한 후, 동결건조기(Eyela, Japan)를 이용하여 건조시켜 수분을 제거한 후, 이를 다기능 분쇄기(Korea Medi, Korea)로 분쇄하여 풀무치 분말을 수득하였다. 이렇게 수득된 풀무치 분말은 70%(v/v) 에탄올 수용액에 용해(100g/1L) 시킨 후 초음파 파쇄기(LabaX, MAm USA)를 이용하여 230J의 세기로 10초간 2회 파쇄 후 30분간 25℃에서 방치하고, 4500rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨 후, 상등액을 얻어 0.25㎛ syringe filter(Whatman, ND, USA)로 여과 후 centrifugal evaporator (CVE-3100, Tokyo, Japan)를 이용하여 완전히 건조함으로써 본 발명의 풀무치 추출물(Locusta migratoria ethanol extract, LME)을 제조하였다.

<실시예 2. 세포 생존율 측정>

MG-63 세포는 인간 골육종으로부터 추출된 세포로 Alkaline phosphatase (ALP), Runt-related transcription factor 2 (Runx2) 및 Osteoprotegerin (OPG) 등 다양한 골 형성 관련 인자들이 발현되어 골 형성 연구에서 primary osteoblast cell을 대체하여 폭넓게 사용되고 있다.

조골세포 MG-63(human osteoblast-like cell, MG-63)은 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며 10% FBS (fetal bovine serum) (Hyclone, Logan, UT, USA)와 1× penicillin-streptomycin (Hyclone)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Hyclone)을 사용하여 배양하였고 세포는 37℃, 5% CO₂의 배양조건을 유지하였다. 세포가 충분히 성장하는 2-3일 간격으로 계대 배양하며 실험을 진행하였다. 이 후의 실험은 MG-63 세포를 이용하여 실험하였다.

MG-63에 대한 풀무치 추출물의 세포독성 및 세포증식을 확인하기 위하여 MG-63을 96 well-plate에 5.0 × 10³ cells/well로 분주하여 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 10% FBS가 들어있는 배지에서 약 24시간 동안 배양하였다. 그 후 실시예 1의 풀무치 추출물(LME)을 100, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간 및 48시간 동안 추가 배양한 후 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) reagent를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.

세포 생존율 측정 결과, 도 1과 같이 본 발명의 풀무치 추출물(LME)은 0 ~ 1000 ㎍/㎖의 범위에서 MG-63 세포독성을 유발하지 않았으며, 48시간 동안 배양한 경우, 500 ㎍/㎖과 1000 ㎍/㎖농도에서 유의적으로 세포 생존율이 증가함에 따라 풀무치 추출물의 세포증식 효능을 확인할 수 있다. 따라서 이후의 실험은 풀무치 추출물의 안전한 농도인 1000 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 수행하였다.

<실시예 3. ALP 효소 활성 측정>

염기성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase, ALP)는 거의 모든 조직에 분포하며 특히 골 조직에서는 골 성장이 일어날 때 그 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다(27, 28). 따라서 조골세포의 활성을 나타내는 표지인자로써 조골세포에서의 ALP 활성을 측정하여 풀무치 추출물이 조골세포의 골 성장 및 골 세포 분화 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 확인하는 ALP 효소 활성 검사는 p-nitrophenyl phosphate (p-NPP)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하는 원리를 이용하여, 가수분해 산물인 p-nitrophenol의 양을 측정함으로써 ALP의 활성을 간접적으로 확인하는 방법이다.

이에 풀무치 추출물 처리 시 조골세포의 분화 정도 비교를 위해 positive control로서 10 mM β-glycerophosphate와 50㎍/㎖ ascorbic acid(AA)가 함유된 배지를 함께 처리하였다. 이를 위해 MG-63 세포를 96 well-plate에 1.5 × 10⁴ cells/well 농도로 분주하여 24시간 배양한 다음, 농도별 풀무치 추출물(100, 500, 1000 ㎍/㎖) 또는 10 mM β -glycerophosphate와 50 ㎍/㎖ascorbic acid(AA)이 함유된 배지로 교환하여 2일마다 배지를 교체해주며 3일 및 5일간 배양하였다. 배양한 세포는 PBS로 세척하고 0.1% Triton X-100을 20 ㎕ 씩 분주하여 37℃, 5% CO₂조건에서 30분간 lysis 한 후, 100 ㎕의 p-NPP(sigma)을 분주하여 30분간 반응시켰다. 반응 후 3 M NaOH로 반응을 정지한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 측정하였고 이를 통해 ALP 효소 활성을 산출하였다. 조골세포의 ALP 활성은 시료처리를 하지 않은 control(CTR) 군에 대한 비율로 나타내었으며 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2를 참고하면, 풀무치 추출물(LME)을 농도별로 처리한 결과 100 ㎍/㎖부터 활성이 유의적으로 증가하였고 1000 ㎍/㎖에서는 control(CTR) 군에 비해 3배 정도 활성이 증가하는 것으로 나타난다. 또한 Positive control로서 함께 처리한 AA (ascorbic acid and β-glycerophosphate) 군의 활성은 풀무치 추출물(LME)의 100 ㎍/㎖에서의 활성과 유사한 것으로 파악된다.

<실시예 4. ALP 염색 방법 수행>

ALP (염기성 인산 분해 효소) 활성 및 조골세포의 분화 정도를 확인하기 위하여 ALP staining을 통해 염색 정도를 확인하였다. MG-63 세포를 96 well-plate에 1.5 × 10⁴ cells/well 농도로 분주하여 24시간 배양한 다음, 농도별 풀무치 추출물(50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖) 또는 10 mM β-glycerophosphate와 50 ㎍/㎖ ascorbic acid(AA)이 함유된 배지로 교환하여 2일마다 배지를 교체해주며 5일간 배양하였다. 배양된 세포는 PBS로 세척하였고 10% formalin을 사용하여 세포를 고정한 후, BCIP/NBT substrate solution을 분주하여 빛이 없는 조건에서 2시간 동안 방치하였다. 세포에 푸르게 염색된 정도를 통해 조골세포의 분화 및 ALP 활성을 확인하였다.

이에 대한 결과를 살펴보면, CTR군에 비해 AA와 실시예 1의 풀무치 추출물(LME) 처리군에서 푸른색이 더욱 진하게 나타났으며 풀무치 추출물(LME) 처리 시 농도의존적으로 진하기가 증가하였다. 따라서 풀무치 추출물은 MG-63 조골세포의 ALP 활성을 증가시키며 이에 따라 조골세포의 분화가 촉진되었음을 확인할 수 있으며, 풀무치 추출물이 골 성장 촉진에 도움을 줄 수 있는 소재로 이용가능함을 알 수 있다.

<실시예 5. ALPL 및 Runx2의 유전자 발현 확인>

풀무치 추출물을 MG-63 세포에 처리하고 3일 또는 5일 후, MG-63 조골세포로부터 RNA를 추출하여 골 성장 및 분화와 관련된 유전자 발현의 변화를 확인하고자 하였다.

이를 위해 MG-63 세포를 3 × 10⁵ cells/well의 농도로 6 well-plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 농도별 풀무치 추출물(50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖) 및 10 mM β-glycerophosphate와 50 ㎍/㎖ ascorbic acid이 함유된 배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 3일 및 5일간 배양하였다. TRIzol reagent (Invitrogen Life Technology, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였으며 RNA의 정량은 50배 희석한 후 UV/vis 분광광도계를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정량한 RNA와 cDNA reverse transcription kit (Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, qPCR Green Mix (ENZO, USA)와 하기 표 1의 primer를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 측정하고자 하는 mRNA의 발현은 GAPDH로 수치를 정량화하였고, 이에 대한 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다.

Primer	Sequence
GAPDH	F: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’
GAPDH	R: 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
ALPL	F: 5’-AAACCGAGATACAAGCACTC-3’
ALPL	R: 5’-TCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAG-3’
Runx2	F: 5’-GCCTTCAAGGTGGTAGCCC-3’
Runx2	R: 5’-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3’

도 3을 참고하면, ALP 활성과 관련된 Alkaline phosphatase (ALPL) 유전자의 발현은 CTR군에 비하여 농도의존적으로 약 4배까지 증가하였으며 3일 배양했을 때 보다 5일까지 배양한 경우에 유전자 발현량이 보다 높은 것이 확인된다. 덧붙여, AA군과 유사하거나 높은 ALPL 발현량은 앞서 ALP 활성 및 염색을 통해 확인한 결과와 유사하다.

또한, 도 4를 참고하면, Runt-related transcription factor 2 (Runx2)의 유전자 발현량은 ALPL과 반대로 5일 동안 배양했을 때보다 3일간 배양했을 때 발현량이 현저하게 높으며, 3일 동안 배양한 경우에는 Runx2 유전자 발현량이 CTR군에 비해 6배 정도로 증가하는 것으로 확인된다. 특히, 3일 배양한 경우에는 1000 ㎍/㎖에서 발현량이 2배 증가하였으나 5일간 배양했을 때에는 500 ㎍/㎖ 에서도 2배 정도로 3일의 1000 ㎍/㎖과 유사한 정도의 발현량을 나타나며, 1000 ㎍/㎖에서는 현저한 발현량 증가가 확인된다.

이러한 결과를 통해 풀무치 추출물에 의해서 Runx2가 먼저 발현이 되고 그 영향으로 ALPL의 발현이 증가한 것을 파악할 수 있다. 이와 같은 결과는 풀무치 추출물이 Runx2와 ALPL 유전자 발현에 영향을 주며 이에 따라 조골세포의 분화를 촉진하며 골 형성을 촉진하는 효과가 있음을 입증한다.

<실시예 6. ALP 및 Runx2의 단백질 발현 확인>

풀무치 추출물을 처리하고 5일 후에 MG-63 조골세포로부터 단백질을 추출하여 골 성장 및 분화와 관련된 단백질의 발현을 확인하고자 하였다.

MG-63 세포를 3 × 10⁵ cells/well의 농도로 6 well-plate에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 농도별 풀무치 추출물(50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖) 또는 10 mM β-glycerophosphate와 50 ㎍/㎖ascorbic acid(AA)이 함유된 배지로 교환하여 2일마다 배지를 갈아주며 5일간 배양하였다. 배양이 끝나는 날, 세포를 PBS로 세척한 뒤 protease와 phosphatase inhibitor cocktail가 함유된 RIPA buffer를 사용하여 세포를 lysis하였고 원심분리하여 상등액을 얻어 BCA protein assay를 이용하여 단백질을 정량하였다. 그 후 SDS-PAGE gel에 단백질을 분주하여 전기영동하고, gel 내의 단백질을 PVDF membrane으로 transfer하였고 membrane을 5% skim milk 용액으로 blocking하였다. ALP 및 Runx2에 대한 항체를 4℃에서 overnight으로 배양하였고, 그 후 각 항체에 대한 2차 항체를 반응시킨 후 ECL kit를 이용하여 각 band를 발현시켜 관찰하였으며 이에 대한 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5를 참고하면, 50 ㎍/㎖부터 1000 ㎍/㎖까지 농도의존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이는 앞서 ALPL의 유전자 발현을 확인한 결과와 유사한 것으로 파악된다. Runx2 단백질 발현의 경우 유전자 발현 결과와 유사하게 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖농도에서는 증가하지 않았으나 500㎍/㎖과 1000 ㎍/㎖농도에서는 농도에 따라 발현량이 증가하였다. 반면, Positive control인 AA군에서는 Runx2의 발현량이 증가하지 않았는데 이 결과 또한 앞서 Runx2의 유전자 발현량을 확인한 결과와 유사하였다. 이는 Runx2의 유전자 및 단백질 발현은 ascorbic acid로부터 영향을 받지 않는 이전의 연구에 부합하는 결과인 것을 알 수 있다. 단백질 발현량의 측정 결과에 따라 풀무치 추출물은 MG-63 조골세포에서 ALP 및 Runx2의 단백질 발현을 증가시키며 이를 통해 MG-63 조골세포의 분화를 촉진하고 골 형성 기능을 가지며 결과적으로 골다공증이나 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염 등의 다양한 골질환의 예방, 개선과 치료에 이용가능함을 확인할 수 있다.

<제제예 1. 약학적 제제>

실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

실시예 1의 풀무치 70%(v/v) 에탄올 추출물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

풀무치 추출물(Locusta migratoria)을 함유하는 것을 특징으로 하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 풀무치 추출물은 풀무치를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 풀무치 추출물은 ALP(alkaline phosphatase) 또는 Runx2(Runt-related transcription factor 2)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조골세포의 분화 촉진용 조성물.
제1항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증, 류마티스성 관절염 및 퇴행성 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증, 류마티스성 관절염 및 퇴행성 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.