KR20170045955A

KR20170045955A - 미나리 추출물을 포함하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170045955A
Application number: KR1020150146115A
Authority: KR
Inventors: 노주원; 김명석; 김상민; 이희주; 오상록
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2017-04-28
Also published as: KR101769864B1

Abstract

본 명세서에는 미나리(Oenanthe javanica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 개시된다. 상기 미나리 추출물은 미나리의 줄기 추출물 또는 돌미나리 추출물일 수 있으며, 상기 조성물은 조골세포의 분화 또는 골형성 단백질의 활성을 촉진시키거나 파골세포의 생성을 억제하여 골질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있다.

Description

미나리 추출물을 포함하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTION, IMPROVEMENT OR TREATMENT OF BONE DISEASES COMPRISING DROPWORT EXTRACT}

본 명세서에는 미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 개시된다.

골다공증(osteoporosis)은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 말하며, 가장 흔한 골격계 질환으로서 일반적으로 골절의 증가 및 골 강도의 감소로 특징된다. 정상적인 골의 기능을 위해서는 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 뼈의 항상성 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 필요하다(Nat. Rev. Endocrinol. 8: 212-227, 2011, J. Dent. Res. 91: 736-744, 2012).

그러나, 파골세포의 지나친 활성이나 조골세포의 활성 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여 골다공증과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 접근 방법으로 여겨지고 있다(Nat. Rev. Rheumatol. 7: 631-638, 2011).

조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성된다. 조골세포의 분화에 의해 형성되는 칼슘 등을 포함한 무기질화는 뼈의 세기를 유지시켜 줄 수 있을 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 수행한다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘 형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 세포 내에서 뼈 형태 형성단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호 전달 체계의 상호 작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화에 관련된 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)가 초기 분화 단계에서 합성된 후, 무기질화에 관련된 오스테오폰틴(osteopontin; OPN), 오스테오칼신 (osteocalcin; OCN), 타입 I 콜라겐(Type Ι collagen; ColA1) 등이 합성됨으로써 조골세포 분화에 의한 골형성이 이루어진다고 알려져 있다(Nat. Rev. Drug Discov. 11: 234-250, 2012).

현재까지 개발된 대표적인 골다공증 치료제는 파골세포(골 흡수에 관여하는 세포)의 기능을 약화시켜 뼈 손실을 막아주는 비스포스포네이트(Bisphosphonates) 제제가 주류를 이루며, 머크사(社)의 '포사맥스', 프록터갬블사(社)의 '악토넬' 등이 있다. 하지만 이들 치료제는 뼈의 형성을 촉진하는 것이 아닌 분해 억제제로서, 지속적인 사용시 뼈를 푸석푸석하게 하여 추가적인 골절을 유도할 수 있기 때문에 근본적인 치료는 될 수 없는 상황으로 대체제가 절실한 실정이다(Datamonitor Research Reports, 2007).

한국 공개특허 제10-2014-0147967호

일 측면에서, 본 명세서는 골세포 활성 촉진 효과를 가지며 부작용 없이 안전하게 적용할 수 있는 미나리(Oenanthe javanica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 골세포 활성 촉진 효과를 가지며 부작용 없이 안전하게 적용할 수 있는 미나리(Oenanthe javanica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 미나리(Oenanthe javanica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 미나리(Oenanthe javanica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 골질환은 골다공증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 디스크, 골연화증, 구루병, 섬유성 골이형성증, 고칼슘혈증, 고PTH혈증, 골 파제트병, 외상성 골절, 피로 골절 및 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리는 돌미나리일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 미나리의 줄기 추출물일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 미나리 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 메탄올 추출물일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 헥산, 메틸클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획한 헥산 분획물, 메틸클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 분획물을 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 80 중량%의 미나리 추출물을 포함할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 조골세포의 분화 또는 골형성 단백질의 활성을 촉진하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 파골세포의 생성을 억제하는 것일 수 있다.

골다공증을 포함하는 골질환의 치료 등을 위하여 화합물 성분의 약제를 사용하는 경우 내성이 쉽게 생기는 반면, 본 명세서에 개시된 기술은 자연 유래의 미나리 추출물을 유효성분으로 포함함으로써 장기간 복용시에도 내성이 없고 부작용 없이 안전하게 적용할 수 있는 골질환을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 효과가 있다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 미나리(Oenanthe javanica) 추출물을 유효성분으로 포함함으로써 조골세포의 분화 또는 골형성 단백질의 활성을 촉진하여 골질환을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 효과가 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 미나리(Oenanthe javanica) 추출물을 유효성분으로 포함함으로써 파골세포의 생성을 억제하여 골질환을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 MC3T3-E1 조골세포에서 돌미나리 추출물 처리에 의한 조골세포 초기 분화 마커인 알칼라인 포스파아타제(alkaline phosphatase(ALP))의 활성 증가를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 MC3T3-E1 조골세포에서 돌미나리 추출물 및 분획물 처리에 의한 조골세포 초기 분화 마커인 알칼라인 포스파아타제(alkaline phosphatase(ALP))의 활성 증가를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 MC3T3-E1 조골세포에서 돌미나리 추출물 및 분획물 처리에 의한 조골세포 분화 유전자(ALP 및 (OPN)), 파골세포 생성 억제 유전자(osteoprotegerin(OPG)), 골형성 단백질(bone morphogenic protein 2(BMP2)) 및 신호전달계 유전자(Runt-related transcription factor 2(Runx2))의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 골질환은 대사성 골질환일 수 있다. 상기 대사성 골질환은 골대사의 이상에 의한 질환을 총칭하며, 곱사병, 골연화증, 골소공증, 상피소체기능항진증, 베제트병 등이 이에 포함된다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 골질환은 골다공증, 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염, 디스크, 골연화증, 구루병, 섬유성 골이형성증, 고칼슘혈증, 고PTH혈증, 골 파제트병, 외상성 골절, 피로 골절 및 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.

더욱 구체적으로, 다음과 같은 골질환을 포함할 수 있다:

골다공증, 예를 들어 일차성 골다공증, 내분비성 골다공증 (갑상선항진증, 부갑상선항진증, 쿠싱증후군 및 말단거대증), 골다공증의 유전적 및 선천적 형태 (불완전골형성증, 호모시스틴뇨증, 멘케스증후군 및 릴리-데이증후군) 및 단고정에 의한 골다공증, 성인 및 청소년 골의 파제트병 (변형성골염);

골수염 또는 골손실을 유도하는 골의 감염성 병변;

종양(유방, 폐 및 신장) 및 혈액학적 악성종양 (복합적인 골수종, 임파종 및 백혈병)에서 생기는 칼슘과잉혈증, 내인성 칼슘과잉혈증 및 부갑상선항진증 및 신장 기능 질환과 관련된 칼슘과잉혈증;

소장, 대장 질환 및 만성 간, 신장 질환과 관련되고 스테로이드 투여에 의해 유도되는 수술 후의 골감소증;

외상과 관련된 골괴사 또는 골세포 사멸, 또는 고세병, 겸상빈혈증, 전신 홍반성 루푸스 및 그외의 상태와 관련된 비외상성 괴사;

류마티스성 관절염으로 인한 골손실;

치근막 골손실; 및

골용해성 전이.

미나리(dropwort)는 쌍떡잎식물 산형화목 미나리과의 여러해살이풀로서, 미나리는 크게 물미나리와 돌미나리로 구분된다. 물미나리는 논에서 재배되어 논미나리라고도 하는데, 줄기가 길고 상품성이 높다. 돌미나리는 본래 계곡의 샘터나 들의 습지 또는 물가에서 야생하는 것으로서, 물미나리에 비해 줄기가 짧고 잎사귀가 많다. 최근에는 야생의 돌미나리를 채취하는 것보다 밭에서 돌미나리를 재배하여 상품화하여 이용하고 있다.

상기 미나리는 추출물의 생성을 위해 그의 지상부 또는 지하부의 일부 또는 전부를 포함하는 식물의 전 범위에 걸쳐 제한이 없이 사용 가능하며, 예시적인 일 구현예에서 상기 미나리 추출물은 미나리의 줄기 추출물일 수 있다. 아울러, 상기 미나리는 재배한 것 또는 시판되는 것 등의 제한이 없이 사용 가능하다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 미나리의 조추출물뿐만 아니라 추출물의 가공물, 예를 들어 건조, 농축, 분획, 발효 등 추가적인 가공에 의한 모든 형태를 포함하는 것을 의미한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 미나리 그 자체 또는 이를 분쇄물이거나, 추출공정을 통해 수득한 추출물 또는 이의 분획물일 수 있다. 상기 추출공정은 당해 기술분야에서 이용되는 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출, 초음파 추출, 미생물을 이용한 발효나 자연발효대사 또는 XAD 및 HP-20을 포함하는 흡착 수지를 이용한 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법에 따라 제조될 수 있다. 구체적으로, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 추출횟수는 1 내지 5회일 수 있으나, 구체적으로 3회 반복하여 추출할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 추출시간은 2 내지 12시간일 수 있고, 구체적으로 3 내지 10시간, 또는 3 내지 5시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 상기 추출 이후 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.

상기 탄소수 1 내지 6의 유기용매는 탄소수 1 내지 6의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6의 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

초임계 유체(supercritical fluid)란 물질이 액체와 기체의 두 상태가 서로 분간할 수 없게 되는 임계 상태에서의 온도와 이때의 증기압 즉, 그의 임계점보다 높은 온도와 압력 하에 있을 때 즉, 초임계점 이상의 상태에 있는 유체를 의미하며, 아임계 유체(sub-supercritical fluid)란 초임계점 이상의 상태에 있지는 아니하나, 초임계 유체와 거의 비슷한 성격을 가진 유체를 의미한다. 상기 유체는 물, 이산화탄소, 아세톤, 물을 포함한 공용매 중의 어느 하나인 아임계 또는 초임계 유체를 이용할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 미나리 추출물을 분획한 분획물일 수 있다. 상기 '분획물'은 미나리 추출물이 그 일부의 성분으로 나누어진 물질 즉, 분획화된 물질을 의미하며, 예를 들어 미나리 추출물을 용매와 혼합하고 상기 용매에 존재하는 물질을 분리하여 제조될 수 있다.

상기 분획화는 1회 이상, 예를 들면, 1 내지 5회 반복될 수 있다. 상기 분획물을 분리하는 방법은 여과 등의 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 분획화는 수득한 분획물을 농축 및/또는 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 농축은 감압 농축일 수 있다. 상기 건조는 감압 건조, 비등 건조, 분무 건조, 상온 건조 또는 동결건조일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 미나리 추출물을 물에 현탁시킨 후, 헥산, 메틸클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획한 헥산 분획물, 메틸클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 분획물을 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 미나리 추출물은 메탄올 추출물일 수 있다. 구체적으로, 상기 미나리 추출물은 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 80 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 미나리 추출물이 조성물 내 상기 범위로 포함됨으로써, 다른 함유 물질들과의 적절한 조성비를 갖고 골질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있으며, 경제성 및 효율성 면에서도 바람직할 수 있다. 구체적으로 상기 미나리 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.005 내지 78 중량%, 또는 0.01 내지 76 중량%, 또는 0.05 내지 74 중량%, 또는 0.1 내지 72 중량%, 또는 0.5 내지 70 중량%, 또는 1.0 내지 68 중량%, 또는 1.0 내지 66 중량%, 또는 1.0 내지 64 중량%, 또는 1.0 내지 62 중량%, 또는 1.0 내지 60 중량%, 또는 1.0 내지 50 중량%, 또는 1.0 내지 40 중량%, 또는 1.0 내지 30 중량%, 또는 1.0 내지 20 중량%, 또는 1.0 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 명세서에 따른 조성물은 골다공증을 포함하는 골질환 유발물질의 생성을 근본적으로 억제하여 골질환을 예방하고, 조골세포의 분화 또는 골형성 단백질의 활성을 촉진시켜 골질환을 개선 또는 치료하는 효과가 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 ALP(alkaline phosphatase), OPN(Osteopontin), OPG(osteoprotegerin), BMP2(bone morphogenic protein 2) 및 Runx2(Runt-related transcription factor 2)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 발현량을 증진시키는 효과가 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 ALP 자체의 생성을 증가시킬 수 있거나 또는 ALP의 활성을 증가시킬 수 있다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 또한 ALP를 생성시키는 전단계(up-stream)의 효소 또는 단백질의 활성을 증가시킬 수 있다.

BMP는 뼈 형태 형성 단백질의 일종이며, OPN은 조골세포의 무기질화에 기여한다. 구체적으로, BMP 및 OPN 등이 합성됨으로써 조골세포의 분화에 의한 골형성이 이루어진다. 골다공증 환자의 BMP 및 OPN 합성 정도는 유의하게 낮은 값을 나타내며 이는 골다공증의 중증도에 따라 증가한다. 그러므로, BMP 및 OPN은 골다공증의 병태를 객관적으로 평가할 수 있는 주요 지표가 될 수 있다. 예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 BMP 및 OPN 자체의 생성을 증가시킬 수 있거나 또는 BMP 및 OPN의 활성을 증가시킬 수 있다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 또한 BMP 및 OPN을 생성시키는 전단계(up-stream)의 효소 또는 단백질의 활성을 증가시킬 수 있다.

OPG는 tumor necrosis factor(TNF) receptor superfamily의 일종인 사이토카인 수용체이며, Runx2은 조골세포의 분화와 관련된 전사인자이다. 구체적으로, OPG가 합성됨으로써 파골세포의 분화에 의한 RANK 매개 NF-κB의 활성을 억제하고 Runx2가 합성되어 조골세포의 분화를 촉진한다. 골다공증 환자의 OPG 및 Runx2 합성 정도는 유의하게 낮은 값을 나타내며 이는 골다공증의 중증도에 따라 증가한다. 그러므로, OPG 및 Runx2은 골다공증의 병태를 객관적으로 평가할 수 있는 주요 지표가 될 수 있다. 예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 OPG 및 Runx2 자체의 생성을 증가시킬 수 있거나 또는 OPG 및 Runx2의 활성을 증가시킬 수 있다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 또한 OPG 및 Runx2을 생성시키는 전단계(up-stream)의 효소 또는 단백질의 활성을 증가시킬 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 미나리 추출물은 골질환의 치료 또는 예방을 위해 다른 인자와 함께 또는 단독으로 사용할 수 있다. 한 실시 형태에 있어서, 예컨대, BMP-1 내지 BMP-12로 명명한 골발생 인자, 형질전환 성장 인자 - β (TGF-β) 및 TGF-β 군 요소, 인터루킨-1 저해제, TFNα 저해제, 부갑상선 호르몬 및 그 유사체, 부갑상선 관련 단백질 및 그 유사체, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스포네이트 (아렌드로네이트 및 그외의 것) 및 플루오르화물 및 칼슘과 같은 골-촉진 미네랄을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제제로서는 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제제로서는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다. 본 명세서의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

또한, 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여할 수 있으며, 약학 조성물의 유효성분은 투여받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 mg/g/일 내지 100 mg/g/일, 보다 구체적으로는 5 mg/g/일 내지 50 mg/g/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 식품 조성물은 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물을 포함하는 침출차, 액상차, 음료, 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 또는 건강보조식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.

또한, 식품 조성물은 유효성분이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화 방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조성분을 더 포함할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 명세서의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01 내지 5 중량%, 또는 0.01 내지 3 중량% 범위일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 돌미나리 추출물 제조

본 실시예에서 사용된 미나리는 돌미나리(Oenanthe javanica)로서 2015년 평창 근교 산지에서 재배한 것을 입수하여 사용하였다. 돌미나리의 지상부(줄기 및 잎)를 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 적당량의 메탄올을 넣었다. 이들을 초음파 추출기를 사용하여 3 시간씩 2회 반복하여 추출한 후, 거름종이로 여과하여 돌미나리 메탄올 추출물을 얻었다. 구체적으로, 돌미나리 지상부의 생중량 1 kg에 1 L 메탄올을 추가한 후, 추출 및 농축하여 추출물 29 g을 얻었다. 이렇게 얻어진 추출물을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹인 후, 하기 시험예에서 이용하였다.

실시예 2. 돌미나리 추출물의 분획물 제조

상기 <실시예 1>에서 제조한 돌미나리 추출물 건조물 10 g과 물 100 mL를 삼각플라스크에 넣어 현탁한 후 분별깔때기(250 mL)에 넣고 여기에 n-헥산(Extra pure grade, 95% 이상) 100 mL를 첨가하고 충분히 흔들어 준 다음, 상온에서 3 시간 동안 방치하였다. 이후, 분별깔때기를 이용하여 상기 혼합물로부터 헥산층만을 취하였다. 위와 같은 과정을 3회 반복하여 실시하였으며, 얻어진 헥산 분획은 감압농축(EYELA, N-1100)하여 헥산 분획을 얻었다.

또한, 동일한 방법으로 상기 헥산 분획이 제거된 물 분획에 대하여 메틸클로라이드를 첨가하고 혼합한 후 동일한 과정을 거쳐 메틸클로라이드 분획을 얻었다.

또한, 동일한 방법으로 상기 메틸클로라이드 분획이 제거된 물 분획에 대하여 에틸아세테이트를 첨가하고 혼합한 후 동일한 과정을 거쳐 에틸아세테이트 분획을 얻었다.

또한, 동일한 방법으로 상기 에틸아세테이트 분획이 제거된 물 분획에 대하여 수포화 부탄올을 첨가하고 혼합한 후 동일한 과정을 거쳐 부탄올 분획을 얻었다.

상기 돌미나리 추출물의 분획물은 DMSO에 20 mg/ml 농도로 녹인 후, 하기 시험예에서 이용하였다.

시험예 1. 돌미나리 추출물 및 분획물의 조골세포 초기 분화 마커인 알칼라인 포스파아타제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성 증가

상기 <실시예 1 및 2>를 통해 얻은 돌미나리 추출물 및 분획물이 ALP 활성을 증가시키는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.

MC3T3-E1 조골세포를 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 세척한 후 0.2% Triton X-100을 이용하여 세포막을 용해시킨 뒤 2,500×g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 취하고, SensoLyte p-nitrophenyl phosphate(p-NPP) ALP activity assay kit(AnaSpec, Inc., Fremont, CA, USA)를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다. 단백질량은 Bio-Rad protein assay kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 Bradford법으로 정량하였다. 양성대조군은 β-estradiol 100 nM을 처리하였다. ALP 활성은 ng/mg 단백질로 표기하였다.

그 결과, 돌미나리 추출물 및 분획물은 농도 의존적으로 ALP 활성을 증가시켰으며, 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차이를 나타내었다(*p< 0.05, **p< 0.01). 이에 따라 본 명세서에 따른 돌미나리 추출물 및 분획물은 조골세포 초기 분화 마커인 ALP 활성을 증가시킴으로써 조골세포 분화를 촉진하는 능력이 우수함을 알 수 있었다(도 1 및 2 참조).

시험예 2. 돌미나리 추출물 및 분획물의 조골세포 분화 증진 및 파골세포 생성 억제

돌미나리 추출물 및 분획물이 조골세포의 분화를 증진하고 파골세포의 생성을 억제하는지 여부를 아래와 같이 확인하였다(Jeong. H. J. et al., Cytokine, 18:252-9, 2002).

MC3T3-E1 조골세포(American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA)를 10%의 우태아 혈청이 함유된 α-MEM(α-modified Eagle's Medium) 배지에서 배양한 후, 6-웰 평판배양기(6-well microtiter plate)에 100,000 세포/웰이 되도록 넣었다. 세포가 90%까지 자란 후 50 ㎍/㎖ L-아스코르브산(Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM β-glycerol phosphate disodium salt hydrate(Sigma)이 든 배양액에 상기 <실시예 1 및 2>에서 제조한 돌미나리 추출물 및 분획물을 각각 50 μg/ml 농도로 조골세포에 처리하여 3일 동안 조골세포의 분화를 유도하였다. 돌미나리 추출물 또는 이의 분획물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였으며, 조골세포 내 분화 및 골형성에 관여하는 주요 유전자 BMP2, ALP, OPN, Runx2와 골세포 생성에 관여하는 유전자 OPG의 mRNA 발현량을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 분화한 세포로부터 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사시킨 후, RT-PCR 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사 효소로 역전사시켰다. RT-PCR은 다음의 특정 프라이머로 수행하였다:

ALP:

서열번호 1: 5'-CCATGGTAGATTACGCTCACA-3'(Forward primer)

서열번호 2: 5'-ATGGAGGATTCCAGATACAGG-3'(Reverse primer)

BMP2:

서열번호 3: 5'-CCAAGACACAGTTCCCTACA-3'(Forward primer)

서열번호 4: 5'-CACGGCTTCTAGTTGATGGA-3'(Reverse primer)

OPG:

서열번호 5: 5'-AAAGCACCCTGTATAAAACA-3'(Forward primer)

서열번호 6: 5'-CCGTTTTATCCTCTCTACACTC-3'(Reverse primer)

OPN:

서열번호 7: 5'-GACCACATGGACGACGATG -3'(Forward primer)

서열번호 8: 5'-TGGAACTTGCTTGACTATCGA-3'(Reverse primer)

Runx2:

서열번호 9: 5'-GCCAATCCCTAAGTGTGGCT-3'(Forward primer)

서열번호 10: 5'-AACAGAGAGCGAGGGGGTAT-3'(Reverse primer)

β-액틴:

서열번호 11: 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'(Forward primer)

서열번호 12: 5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'(Reverse primer).

그 결과, 돌미나리 추출물 또는 분획물은 조골세포 분화 및 골형성 관련 유전자인 BMP, ALP, OPN 및 Runx2의 mRNA 발현량과 파골세포 생성 억제 유전자인 OPG의 mRNA 발현량을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는, MC3T3-E1 조골세포 내에서 돌미나리 추출물 및 분획물이 뼈 형성을 촉진하며 파골세포의 생성 억제 효과가 있음을 의미한다(도 3 참조).

본 발명의 일 측면에 따른 조성물의 제제예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제제로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 연질캅셀제

돌미나리 추출물 또는 분획물 150 mg, 팜유 2 mg, 팜경화유 8 mg, 황납 4 mg 및 레시틴 6 mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1 캡슐당 400 mg씩 충진하여 연질캅셀제를 제조하였다.

제제예 2. 정제

돌미나리 추출물 또는 분획물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg, 전분 96 mg 및 마그네슘 스테아레이트 4 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 40 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하고 타정기를 이용하여 정제로 타정하였다.

제제예 3. 과립제

돌미나리 추출물 또는 분획물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg 및 전분 600 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 100 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 다음 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1 g으로 하였다.

제제예 4. 드링크제

돌미나리 추출물 또는 분획물 150 mg, 포도당 10 g, 홍삼추출물 50 mg, 구연산 2 g 및 정제수 187.8 g을 혼합하고 병에 충진하였다. 내용물의 최종 용량은 200 ml로 하였다.

제제예 5. 건강식품의 제조

돌미나리 추출물 또는 분획물............. 1000 ㎎

비타민 혼합물

비타민 A 아세테이트.......................70 ㎍

비타민 E ................................ 1.0 ㎎

비타민 B1................................ 0.13 ㎎

비타민 B2 ............................... 0.15 ㎎

비타민 B6................................ 0.5 ㎎

비타민 B12............................... 0.2 ㎍

비타민 C.................................. 10 ㎎

비오틴.................................... 10 ㎍

니코틴산아미드............................ 1.7 ㎎

엽산...................................... 50 ㎍

판토텐산 칼슘............................. 0.5 ㎎

무기질 혼합물

황산제1철................................. 1.75 ㎎

산화아연.................................. 0.82 ㎎

탄산마그네슘.............................. 25.3 ㎎

제1인산칼륨............................... 15 ㎎

제2인산칼슘............................... 55 ㎎

구연산칼륨................................ 90 ㎎

탄산칼슘................................. 100 ㎎

염화마그네슘.............................. 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강음료의 제조

돌미나리 추출물 또는 분획물............. 1000 ㎎

구연산.................................. 1000 ㎎

올리고당................................. 100 g

매실농축액................................ 2 g

타우린.................................... 1 g

정제수를 가하여 전체..................... 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다. 이후, 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비율을 임의로 변형 실시하여도 무방하다. 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> COMPOSITION FOR PREVENTION, IMPROVEMENT OR TREATMENT OF BONE DISEASES COMPRISING DROPWORT EXTRACT <130> 15P297/IND <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ccatggtaga ttacgctcac a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 atggaggatt ccagatacag g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 ccaagacaca gttccctaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 cacggcttct agttgatgga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 aaagcaccct gtataaaaca 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 ccgttttatc ctctctacac tc 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 gaccacatgg acgacgatg 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 tggaacttgc ttgactatcg a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 gccaatccct aagtgtggct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 aacagagagc gagggggtat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 agccatgtac gtagccatcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 ctctcagctg tggtggtgaa 20

Claims

미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 디스크, 골연화증, 구루병, 섬유성 골이형성증, 고칼슘혈증, 고PTH혈증, 골 파제트병, 외상성 골절, 피로 골절 및 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 미나리는 돌미나리인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 미나리 추출물은 미나리의 줄기 추출물인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 미나리 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 용매로 추출한 것인, 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 미나리 추출물은 메탄올 추출물인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 미나리 추출물은 헥산, 메틸클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획한 헥산 분획물, 메틸클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 분획물을 포함하는, 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 미나리 추출물은 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 포함하는, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 80 중량%의 미나리 추출물을 포함하는, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 조골세포의 분화 또는 골형성 단백질의 활성을 촉진하는, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물은 파골세포의 생성을 억제하는, 조성물.