JP6009498B2 - アルツハイマー病予防薬 - Google Patents
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Description
カンジュウは植物名オシダ(ゼンマイ)であり、特にその根茎をエキスの原料として用いる。オシダのエキス、特にオシダの根茎エキスは、市販されているものであってもよい(例えば製造元:栄進商事、品番:A50)。
ライコウトウは植物名クロヅルであり、特にその根、葉および花をエキスの原料として用いる。ライコウトウのエキス、特にライコウトウの根、葉または花エキスは、市販されているものであってもよい(例えば製造元:栄進商事、品番:H34)。
フンボウイは植物名シマハスノハカズラであり、特にその蔓性の根茎および茎をエキスの原料として用いる。フンボウイのエキス、特にフンボウイの根茎または茎エキスは、市販されているものであってもよい(例えば製造元:栄進商事、品番:A27)。
クレンピは植物名センダンであり、特にその樹皮および根皮をエキスの原料として用いる。クレンピのエキス、特にクレンピの樹皮または根皮エキスは、市販されているものであってもよい(例えば製造元:栄進商事、品番:C15)。
カダンリュウは植物名オキナワクジャクシダであり、特にその全草または根茎をエキスの原料として用いる。カダンリュウのエキス、特にカダンリュウの全草または根茎エキスは、市販されているものであってもよい(例えば製造元:栄進商事、品番:H22)。
ハクシュウは植物名ダイコンゴヒショウであり、特にその根をエキスの原料として用いる。ハクシュウのエキス、特にハクシュウの根エキスは、市販されているものであってもよい(例えば製造元:栄進商事、品番:A3)。
本発明において、「飲料」は、動物、特にヒトが飲用するものであれば特にその範囲が限定されず、例えば水、茶、栄養補助飲料、アルコール飲料等を含む。
本発明において、「食品/飲料添加剤」は、それのみを喫食することを意図しないが、食品または飲料と共に喫食されるものを意味し、例えば調味料等を含む。
本発明の「食品」、「飲料」および「食品/飲料添加剤」は、食品工学の分野において通常用いられる成分を含んでいてよく、またその分野における当業者が通常実施するとおりに製造することができる。
本発明において、「アルツハイマー病の予防」は、アルツハイマー病またはアルツハイマー型認知症の発症の予防を意味する。
本発明において、「治療上有効量」は、アルツハイマー病の処置および/または予防に有効な量を意味し、具体的な量は、様々な要因、例えば、用いる具体的なエキス、患者の性別、体重、年齢、さらに、患者の一般的な健康状態、疾患の程度、剤形、投与経路、投与回数などの種々の条件に応じて適宜設定することができる。例えば、γセクレターゼ阻害剤の1日の投与量は、体重1kg当たり10〜640mg(エキス質量)となるように設定することが好ましく、20〜480mg(エキス質量)となるように設定することがより好ましく、40〜320mg(エキス質量)となるように設定することがさらに好ましい。なお、投与は1日数回に分けてすることができ、1回の投与で使用される薬剤中に含まれる組成物の含有量は、投与回数にあわせて適宜調整することができる。
Aβの前駆体であるAPPのC−末部位に酵母の転写因子であるGAL4のDNA結合領域と単純ヘルペスウイルスの転写活性化領域を融合したGAL4−VP16(G4V16)を付加した蛋白質(APP−G4V16)を発現させるベクターを構築した。このGAL4−VP16は、転写研究領域で汎用されている強力な転写因子で、その活性は、プロモーター領域にGAL4認識配列(UAS)を4個挿入したルシフェラーゼのレポーター(TK 4x(UAS)LUC)で測定することができる。このAPP−G4V16とTK 4x(UAS)LUCを培養細胞にトランスフェクションし、24時間後に細胞を回収し、その抽出液のルシフェラーゼ活性を測定した。このルシフェラーゼ活性は、既存のγセクレターゼの阻害剤であるDAPTを添加することで減少したので、γセクレターゼによって膜に存在するAPP−G4V16が切断された結果、G4V16が核に移行してレポーターの転写を活性化していることが確認できた。従って、このアッセイ(以下レポーターアッセイ)を用いることで、γセクレターゼに対する阻害活性をルシフェラーゼの活性を指標に評価することが可能となった。レポーターアッセイの概略を図1に示す。
上記レポーターアッセイを用いて、現在ヒトに対して使用されている漢方薬の原材料となっている約1600種類の植物エキスに対して、それらのエキスがγセクレターゼの阻害活性を含んでいるかどうかを検証した。このアッセイでは、非特異的な転写抑制作用が擬陽性になるため、サイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターでβガラクトシダーゼ(βgal)を発現させるプラスミッド(pCMV−βgal)を同時にトランスフェクションし、βgal 活性に変化を与えずルシフェラーゼ活性を低下させるものをポジティブと判定した。このスクリーニングによって、ヒシュカと他に幾つかの漢方薬エキスがルシフェラーゼ活性の特異的な低下を示した。結果を図2に示す。有意差検定は、student’s t−testで行った。
スクリーニングした漢方薬エキスが実際にγセクレターゼの阻害活性があることを下記ELISA法によって確認した。
方法:家族性アルツハイマー病で同定されたLondon変異(V717F)をもつ変異APPを発現させるベクターとβgalを発現させるベクターをHEK293A細胞にトランスフェクションし、24時間後に、エキスを培地に投与した。さらに24時間後、βgalの活性の定量とAβ40およびAβ42の産生量の定量を、WAKO humanβ amiloid ELISAキットを用いて行った。トランスフェクション効率を補正するため、Aβ40およびAβ42の産生量は、βgalの活性で補正した。γセクレターゼ阻害のポジティブコントロールには、既知のβセクレターゼ阻害剤であるDAPTを用いた。また、βgalを発現させるベクターのみをトランスフェクションし変異APPを発現させていない時(mock)のAβ40およびAβ42の産生量も測定し、βgalの活性で補正した。結果を図3および4に示す。有意差検定は、student’s t−testで行った。
ヒシュカエキスをBligh Dyer法により水溶性、脂溶性の2層に分離した後、レポーターアッセイによりエキス中のγセクレターゼ阻害活性が脂溶性分画に移行していることを確認した。続いて、この脂溶性分画をSilica Cartridgesを使用した固相抽出により3分画に分離した。用いた溶媒は(1)ヘキサン:クロロホルム=50:50、(2)クロロホルム:メタノール=99:1、(3)100%メタノールで、レポーターアッセイによりγセクレターゼ阻害活性が、(2)クロロホルム:メタノール=99:1分画に移行していることを確認した。
次に、(2)の分画を5CN−MS順相カラムにより、ヘキサン:クロロホルム=50:50の溶媒からスタートし、毎分1%ずつメタノール濃度を上昇させるプロトコールでHPLCを実施した。結果、5分〜7分の分画に活性成分が溶出していることを確認した。さらに、この順相HPLCで得た分画を5C18−AR−IIカラム、及びπ−NAPカラムにより逆相HPLCを行うことでさらに分離した。アセトニトリル:水=80:20からスタートし、毎分アセトニトリル濃度を1%ずつ上昇させるプロトコールで行い、これら2種類のカラムで合計3回(5C18−AR−IIカラムで1回とπ−NAPカラムで2回)の逆相HPLCを行うことで、活性成分をシングルピークになるまで精製することに成功した。
一連の実験を8mgのエキスからスタートすることで、約20μgの精製物を得ることができた。このサイクルを約100回繰り返し、最終的に2mgの極めて純度の高い化合物を得た。質量分析によりこの化合物の分子量は416であり、下記核磁気共鳴(NMR)により、構造を式:
1H NMRはJEOL社JNM-LA 500 (500 MHz)により重クロロホルムを溶媒に用いて測定した。残存CHCl3 (δ = 7.27 ppm)を内部標準物質として化学シフトを報告した。
13C NMRはJEOL社JNM-LA 500 (125 MHz)により重クロロホルムを溶媒に用いて測定した。重クロロホルム(δ = 77.0 ppm)を内部標準物質として化学シフトを報告した。
各種二次元NMR (COSY, HMQC, HMBC, NOESY)は重クロロホルムを溶媒にしてJNM-LA 500 (500 MHz)により測定した。
NMR測定値
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.81-4.76 (m, 3H), 3.64 (m, 1H), 2.93 (dd, J = 14.4, 10.9 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 14.4, 8.0 Hz, 1H), 2.70-2.59 (m, 4H), 1.57 (s, 6H), 1.52 (s, 6H), 1.30 (s, 3H), 1.24 (s, 3H), 1.23 (d, J = 6.3Hz, 3H), 1.21 (d, J = 6.9Hz, 3H); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 204.8, 202.3, 199.3, 158.1, 135.2, 135.0, 118.1, 117.7, 108.9, 102.3, 92.5, 72.0, 61.8, 39.2, 37.4, 34.9, 26.5, 25.8, 25.7, 25.1, 24.3, 20.1, 18.8, 17.9, 17.7; HRMS (FAB) C25H37O5 [(M+H)+]の計算値 417.2641、実測値417.2632.
神経特異的エノラーゼ(neuron−specific enolase:NSE)遺伝子のプロモーターの支配下に家族性アルツハイマー病で同定されたLondon変異(V717F)をもつ変異APPを発現させるトランスジーンをマウスの受精卵にインジェクションをおこない、トランスジェニックマウスを得た。
それぞれ2ヶ月齢および6ヶ月齢のトランスジェニック(TG)マウスおよび野生型(WT)マウスを用いて、モリスの水迷路試験を行った。試験1日目〜5日目まで1日3回ずつ、白濁させたプールでマウスを泳がせ、プラットホームへたどり着くまでの時間を測定した。このモリスの水迷路試験の結果は平均値と標準誤差(SEM)で示した(図5)。たどりつくまでの時間の測定は、60秒を最大として、それ以上の測定は行っていない。それぞれのマウスには、6週齢より水またはヒシュカエキス0.2%を含む水を自由に飲ませた。群間で飲水量に有意差はなく、一日あたり約5mlであった。また、群間で体重の変化にも有意な差はなかった。WTマウスでは、2ヶ月齢および6ヶ月齢のいずれであっても、ヒシュカエキスの摂取の有無に拘わらず、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は5日間の間で短縮され、また2ヶ月齢のTGマウスでも短縮されたが、6ヶ月齢のTGマウスでは、ヒシュカエキスを摂取しなかった群では、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は5日間の間で短縮されず、ヒシュカエキスを摂取した群では、時間が短縮され、5日目にstudent’s t−testで差が見られた(P<0.1)。
上記と同様、6週齢より水またはヒシュカエキス0.2%を含む水を自由に飲ませたトランスジェニック(TG)マウスに対して、9ヶ月齢で、初めてモリスの水迷路試験を行った。上記と同様、試験1日目〜5日目まで1日3回ずつ、白濁させたプールでマウスを泳がせ、プラットホームへたどり着くまでの時間を測定した。このモリスの水迷路試験の結果は平均値と標準誤差(SEM)で示した(図6)。この試験では、マウスは初めてモリスの水迷路試験を経験するため、過去の経験・記憶の影響を一切受けない状態での現在の記憶・学習能力を反映している。また、この実験では、水槽の回りの模様に異なる色を付け、マウスが水槽内での自分の位置をより確認し易くした。9ヶ月齢のTGマウスでは、ヒシュカエキスを摂取しなかった群では、プラットホームにたどりつくまでに要した時間は5日間の全てで60秒以上を要し、全く短縮されなかった。一方、ヒシュカエキスを摂取した群では、日を追うごとに時間が短縮され、3〜5日にわたりstudent’s t−testで有意な差が見られた(P<0.05及びP<0.01)。
Claims (2)
- 式:
- アルツハイマー病の発症抑制のための、請求項1に記載の組成物。
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