KR101788665B1

KR101788665B1 - 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101788665B1
Application number: KR1020140077546A
Authority: KR
Inventors: 진영원; 조정숙
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2017-10-20
Also published as: KR20160000319A

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염을 포함함으로써, 치매의 주요 원인으로 알려진 아밀로이드 베타() 펩타이드 생성에 관여하는 베타 세크레타제(β-secretase)의 활성 저해 효과, 아밀로이드 베타 유발 독성 억제 효과, 산화적 손상에 대한 신경 세포 손상 억제 효과 등의 효과가 있어, 우수한 약효를 나타내는 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE BRAIN DISEASES}

본 발명은 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

퇴행성 뇌질환은 뇌의 기능이 퇴화함에 따라 발생하는 모든 뇌기능 장애 및 질병을 총칭하는 말로, 알쯔하이머병 등의 치매성 질환과 인지장애, 뇌졸중 등을 포함한다.

치매는 '정신이 없어진 것'이라는 의미의 라틴어에서 유래된 말로, 정상적으로 생활을 영위하던 사람이 다양한 원인에 의해 기능이 손상되면서 이전에 비해 인지 기능이 지속적이고 전반적으로 저하되어 일상생활에 상당한 지장을 나타내게 되는 상태를 말한다. 치매는 기억력과 더불어 그외 다양한 지적 능력이 감퇴되는 것으로, 노인이 되면 자연스럽게 기억력이 감퇴되는 증상과는 구별된다. 이러한 치매는 뇌의 기질적인 병변으로 인해 신경세포 및 조직이 파괴됨으로써, 뇌기능 장애 및 저하가 지속적으로 발생하여 유발되는 것으로 알려져 있다. 외과적 수술 후 발생하는 혼돈 상태 등의 의식 장애는 이차적으로 인지 기능의 저하를 유발하는데 이를 '섬망'이라 하며, 치매와는 구별되는 증상이다.

과거에는 치매를 망령, 노망이라고 부르면서 노인이 되면 당연히 일어나는 노화 현상이라고 생각했으나, 최근 많은 연구를 통해 뇌질환의 하나로 인식되고 있다.

흔히, 치매를 하나의 질병으로 생각하고 모두 똑같으며, 별다른 치료법이 없다고 속단해버리는 경향이 있다. 그러나, 치매는 원인에 따라 세분화할 경우 70여 가지에 달한다. 치매는 크게 노인성 치매와 혈관성 치매로 구분되며, 특히 알쯔하이머병과 혈관성 치매가 가장 많이 발생하는 치매인 것으로 알려져 있다.

치매는 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매 등을 포함하는 퇴행성 뇌질환으로, 정상압 뇌수두증, 두부 외상, 뇌종양, 대사성 질환, 결핍성 질환, 중독성 질환, 감염성 질환 등 다양한 원인 질환에 의해 유발될 수 있다.

한편, 우리나라는 출산율 저하 및 고령화 등으로 인해 노령화 사회에 진입하면서 총 인구에 대한 노인 인구의 비중이 점차 커지고 있는 실정이다. 이러한 노인 인구의 증가와 더불어 치매 환자수도 급증하고 있는 것으로 알려져 있다. "노인의 치매 실태와 대책에 대한 한국보건사회연구소의 연구 결과에 따르면, 국내 치매 환자수는 2010년에 약 47만명, 2012년에 약 52만명으로 통계되었으며, 2030년에 약 114만명으로 예상되고 있다. 또한, 치매 유병율은 2010년에 8.76%로 통계되었으며, 2020년에 9.74%로 증대할 것으로 예상되고 있다.

이러한 치매 환자수의 증가는 치매 관련 의료비의 급증을 초래하였다. 치매를 위해 소비되는 연간 의료비 총액은 2002년에 약 470억원으로 통계된 반면, 2007년에는 약 3026억원으로 통계되어 약 6배가 증가되었다. 또한, 노인 장기요양 보험 가입자 중에서 치매 환자가 22.1%의 비율을 차지하는 것으로 확인되어 이에 대한 심각성을 반영하고 있다. 국민건강보험공단에서 제공한 자료에 따르면, 건강보험 실제 진료 환자수가 매년 증가하고 있다고 한다. 미국에서도 2010년 알쯔하이머병의 환자수는 50만명을 상회하였으며, 2050년에는 약 1,350만명에 이를 것으로 예상되고 있다고 한다. 더불어, 미국에서 2010년 알쯔하이머 및 치매로 인해 지출된 의료비는 약 1,720억 달러로 통계되었다고 알려져 있다. 치매의 발병을 5년 정도 지연시킬 경우, 약 4,470억 달러의 의료비 절감이 예상된다.

치매 치료제는 현재 총 4종, 즉 콜린 에스테라아제(cholineesterase) 저해제인 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 타크린(tacrine) 및 NMDA 수용체 길항제(receptor antagonist)인 메만틴(memantine)만이 제한적으로 사용되고 있는 실정이며, 이의 치료 효과 또한, 광범위하게 사용될 수 없다는 문제점이 있어 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

미국, 영국, 프랑스, 독일, 일본, 이탈리아 및 스페인 등 7개국에서의 치매 치료제 시장은 2007년 약 30억 달러로 추산되었으며, 2017년에는 90억 달러에 이를 것으로 예상되고 있다. 한편, 베타 세크레타제(β-secretase)는 치매의 주요 원인으로 알려진 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드의 생성에 관여하는 효소이다. 또한, 아스파틱 세크레타제(aspartic secretase)의 일종인 베타 세크레타제는 최근 노인성 치매를 비롯한 퇴행성 뇌신경 질환의 치료제 개발을 위한 약물 타겟으로 주목받고 있다.

한국공개특허 제2012-38372호에는 당귀 추출물, 은행엽 추출물 단독 또는 당귀 추출물 및 은행엽 추출물의 혼합물을 포함하는 치매 치료보조용 또는 치매치료용 약학적 조성물이 개시되어 있으나, 상기 문제점에 대한 대안을 제시하지 못하였다.

한국공개특허 제2012-38372호

본 발명은 베타 세크레타제 활성 저해 효과, 산화적 신경 세포 손상 억제 효과, 반응성 산소종 억제 효과 등의 신경 세포 보호 효과를 가져, 퇴행성 신경계 뇌 질환에 대한 우수한 약효를 갖는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 개선용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염을 포함하는, 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물:

[화학식 1]

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2. 위 1에 있어서, 상기 꽈리 추출물은 꽈리 추출액의 에틸아세테이트 분획물인, 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 히비스카틴은 꽈리 추출액의 에틸아세테이트 분획물에서 분리된 것인, 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

4. 위 1에 있어서, 퇴행성 신경계 뇌 질환은 파킨슨병, 알츠하이머 치매, 뇌졸중, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 뇌졸중, 외상 후 스트레스 장애 및 기억상실증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인, 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

5. 위 1에 있어서, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 환제, 주사제 또는 좌제로 제형화되는, 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

6. 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염을 포함하는, 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품:

[화학식 1]

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본 발명의 꽈리 추출물 및 히비스카틴은 치매의 주요 원인으로 알려진 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드 생성에 관여하는 베타 세크레타제(β-secretase)의 활성 저해 효과, 아밀로이드 베타 유발 독성 억제 효과, 산화적 손상에 대한 신경 세포 손상 억제 효과 등의 효과가 있어, 퇴행성 신경계 뇌질환에 대한 우수한 약효를 나타낸다.

도 1은 꽈리 추출물의 H₂O₂-유발 산화적 신경 세포 손상 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 꽈리 추출물의 xanthine/xanthine oxidase-유발 산화적 신경 세포 손상 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 꽈리 추출물의 H₂O₂-유발 반응성 산소종 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 꽈리 추출물의 xanthine/xanthine oxidase-유발 반응성 산소종 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화합물들의 H₂O₂-유발 반응성 산소종 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화합물들의 xanthine/xanthine oxidase-유발 반응성 산소종 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 꽈리 추출물의 NMDA-유발 흥분성 신경세포독성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 꽈리 추출물의 NMDA-유발 반응성 산소종 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 Aβ_(25-35)-유발 신경 독성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 꽈리 추출물의 베타 세크레타제(β-Secretase) 활성 저해 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염을 포함함으로써, 치매의 주요 원인으로 알려진 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드 생성에 관여하는 베타 세크레타제(β-secretase)의 활성 저해 효과, 아밀로이드 베타 유발 독성 억제 효과, 산화적 손상에 대한 신경 세포 손상 억제 효과 등의 효과가 있어, 우수한 약효를 나타내는 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염을 포함하는 것을 특징으로 한다:

[화학식 1]

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꽈리 추출물은 종래 청열해독, 이뇨 등에 효능이 있는 약재로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서는 꽈리 추출물 및 이에 포함된 활성 성분인 히비스카틴이 치매의 주요 원인으로 알려진 아밀로이드 베타(Aβ) 펩타이드 생성에 관여하는 베타 세크레타제(β-secretase)의 활성 저해 효과, 아밀로이드 베타 유발 독성 억제 효과, 산화적 손상에 대한 신경 세포 손상 억제 효과 등의 효과가 있어, 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서 적용된다.

본 발명의 퇴행성 신경계 뇌 질환은 알츠하이머 치매 및 이와 공통적인 병리 기작을 갖는 루게릭병, 픽크병, 파킨슨병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 신경 세포의 소실에 의해 발생하는 노인성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 뇌졸중, 기억상실증 및 외상 후 스트레스 장애 등의 퇴행성 신경계 뇌 질환 중에서 선택된 단독 또는 혼합형 질환일 수 있다.

본 발명에 따른 꽈리 추출물은 당 분야에 공지된 추출 용매를 사용하여 얻어진 것일 수 있다. 예를 들면, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

꽈리 추출물은 추출 처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액의 용매 분획물, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함한다.

상기 추출은 상온 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출 및 증기 추출로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

분획물은 특정 용매를 이용하여 상기 꽈리 추출물로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 가지는 물질을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다.

꽈리 추출물의 분획물은 당 분야에 공지된 용매, 예를 들면 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 분획된 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 꽈리 추출물에 추가로 물을 넣어 현탁시키고 에틸아세테이트를 사용하여 분획함으로써 얻을 수 있다. 보다 구체적인 예를 들자면, 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름과 메탄올 혼합 용매로 칼럼 크로마토그래피를 진행하여 얻어지는 분획물일 수 있다.

화학식 1로 표시되는 히비스카틴은 특정의 방법으로 얻어진 것일 필요는 없다. 예컨대, 천연물에서 얻을 수도 있고 화학적으로 합성할 수도 있다.

천연물에서 얻는 경우 예컨대, 꽈리의 추출물로부터, 보다 구체적인 예를 들자면, 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 히비스카틴은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 히비스카틴을 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법을 통해 제제화될 수 있다. 예컨대, 제제 형태는 경구 투여를 위한 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 캡슐제, 트로키제 또는 환제일 수 있으며, 비경구 투여를 위한 경피흡수제, 로션제, 연고제, 첩부제, 카타플라즈마제, 페이스트제, 현탁제, 액제, 주사제 또는 좌제일 수 있다.

또한, 약학 조성물은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 적절한 담체 또는 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 담체로는 약학적으로 허용 가능한 것으로서, 물, 식염수, 용액이나 현탁액을 형성하는 인산, 아세트산, 구연산, 타르타르산 및 기타 완충액과 같은 완충액, 천연 또는 합성 생분해성 중합체 또는 공중합체를 포함하는 액체, 고체 또는 반고형 담체를 들 수 있다. 부형제로는 미세결정 셀룰로오스, 락토오스, 전분, 탄산칼슘, 당, 덱스트로스, 이염기성 인산칼슘 2수화물, 삼염기성 인산칼슘, 카올린, 말토텍스트린 또는 만니톨과 같은 희석제; 아카시아, 알긴산, 카보머, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 에틸셀룰로오스, 젤라틴, 구아검, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 말토덱스트린, 메틸셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 포비돈 또는 알긴산나트륨염과 같은 결합제; 겔화된 전분, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 크로스카멜로즈 나트륨, 크로스포비돈 또는 나트륨 전분 글리코레이트와 같은 붕해제; 알코올, 벤조산나트륨, 부틸화된 히드록시 톨루엔, 부틸화된 히드록시아니솔 또는 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제 및 산화방지제; 메틸파라벤 또는 프로필파라벤과 같은 항균제; 글루콘산, 락트산, 시트르산 또는 아세트산, 글루콘산나트륨, 락트산나트륨, 시트르산나트륨 또는 아세트산나트륨과 같은 완충제; 이산화티탄, 산화제일철 또는 산화제이철과 같은 착색제; 및 수크로즈 또는 아스파르탐과 같은 감미료 및 향신료 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 양은 의사 또는 숙련자에 의해 결정될 수 있으며, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 간 및 신장 기능, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 유효성분인 파라벤 화합물 100 내지 200 /의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 파라벤 화합물, 예컨대 메틸파라벤, 에틸파라벤 및 프로필파라벤의 일일 적정 섭취량을 10 /으로 정해놓고 있다.

또한, 본 발명은 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염을 포함하는 건강 기능성 식품을 제공한다.

[화학식 1]

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꽈리 추출물은 전술한 꽈리 추출물일 수 있고, 히비카스틴 또는 그 염도 전술한 범위 내의 것일 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 식품은 상기 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 그의 사용목적, 예를 들면, 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강 기능성 식품에 포함되는 꽈리 추출물 또는 하기 화학식 1로 표시되는 히비스카틴 또는 그 염의 유효량은 상기 약학 조성물의 유효량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안정성 면에서는 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

또한, 상기 건강 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

I. 실험재료 및 방법

(1) 실험재료

임신된 Sprague-Dawley (SD) 흰쥐 및 웅성 SD 흰쥐는 대한바이오링크로부터 구입하였으며, minimum essential media (MEM, with Earles salt), fetal bovine serum (FBS) 및 horse serum (HS)은 Gibco BRL (Gaithersburg, USA)로부터, laminin, poly-L-lysine, glucose, glutamic acid, N-methyl-D-aspartate (NMDA), H₂O₂,xanthine(X),xanthineoxidase(XO),cytosinearabinoside,3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide(MTT),2,7-dichlorofluorescindiacetate(DCF-DA),2-thiobarbituricacid(TBA)는 Sigma Chemical Company (ST. Louis, USA)로부터 구입하였다.

Amyloid β protein fragment (25-35) (Aβ_(25-35))는 Bachem (Bubendorf, Switzerland)으로부터 구입하였고, β-secretase fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay kit은 Invitrogen (Carlsbad, USA)에서 구입하였으며, Deadend^TMColorimetricTUNELAssayKit은 Promega (Madison, USA)에서 구입하였다.

Caspase 3 (8G10) rabbit antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, USA)에서 구입하였고, 세포배양용기는 Falcon (Lincoln Park, USA)에서 구입하여 사용하였다.

꽈리 추출물 및 화합물은 동국대학교 약학대학 진영원 교수로부터 제공받아 사용하였다. 기타 일반 시약은 특급품을 사용하였다.

(2) 실험방법

1) 꽈리 추출물의 제조

음건한 꽈리열매(1.19 kg)를 100% 메탄올로 4 L씩 3회 초음파 추출하여 여과 및 감압 농축 뒤 메탄올 추출물 564 g을 얻었다. 이 중에서 560 g 메탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 n-헥산 (52 g), 클로로포름 (4.3 g), 에틸아세테이트(36g), n-부탄올(30 g)로 용매 분획을 실시하여 감압 농축 뒤 에틸아세테이트 분획물(5.4 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 분획물(5.4g)에서 침전이 형성되어 각종 분광학적 분석기기 확인 결과 루테올린-7-O-glucoside (compound 1, 64mg)으로 동정되었다.

에틸아세테이트 분획층에서 침전물을 제외한 분획물을 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매로 gradient silica gel (130 g) open column chromatography를 진행하여 12개의 분획물 (PAE1 내지 PAE12)로 소분획하였고, 그 중 제7 소분획물(PAE7, 300mg)에 대하여 MPLC (C-18, 25g, methanol 18%-100%, 5ml/min) 컬럼을 실시하여, 12개의 소분획물(PAE7M1 내지 PAE7M12)을 얻었으며, 제7-5 소분획물 (PAE7M5, 19mg)을 아세톤과 물의 혼합 용매 조건(40: 60 부피비)에서 Sephadex LH-20을 실시하여 카페인산(compound 4, 3 mg)를 분리하였다.

제7-9 소분획물(PAE7M9, 47mg)을 HPLC(컬럼, Watchers 120 ODS-BP, 10x250 mm, 메탄올 72%, 1.3ml/min)로 루테올린(compound 2, t_R15.0,2mg)을 분리하였다.

제9 소분획물(PAE9, 317mg)은 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매 조건(1:1의 부피비)에서 Sephadex LH-20을 실시하여 7개의 소분획물(PAE9S1 내지 PAE9S7)을 얻었다. 소분획물 중 제9-5 소분획물 (PAE9S5,22 mg)에 대하여 HPLC (inertsil-ODS3 10x250mm, 메탄올 55%-20min, 70%-35min, 3 ml/min) 하여 히비스카틴(compound 3, t_R31.2min,0.8mg)을 분리하였다.

2) 화합물의 구조 동정

i) 루테올린-7-O-글루코시드의 구조 동정

C₂₁H₂₀O₁₁(m.w448.1006)

HRESIMS: m/z 449.1072 [M+H]⁺(calcd.,449.1083)

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆):6.75(1H,s,H-3),6.45(1H,brs,H-6),6.79(1H,brs,H-8),7.42(1H,brs,H-2), 6.91 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 7.45 (1H, brd, J = 8.4 Hz, H-6)

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆):163.4(C-2),103.4(C-3),18.2(C-4),161.6(C-5),100.3(C-6),164.9(C-7),95.2(C-8),157.4(C-9),105.8(C-10),121.8(C-1), 113.8 (C-2), 146.2 (C-3), 150.4 (C-4), 116.4 (C-5), 119.6 (C-6), 100.3 (Glc-1), 73.5 (Glc-2), 76.8 (Glc-3), 70.0 (Glc-4), 77.6 (Glc-5), 61.1 (Glc-6)

[화학식 2]

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ii ) 루테올린의 구조 동정

C₁₅H₁₀O₆(m.w286.0477)

HRESIMS: m/z 287.0558 [M+H]⁺(calcd:287.0556)

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD):6.44(1H,s,H-3),6.11(1H,s,H-6),6.35(1H,s,H-8),7.29(2H,d,J = 7.2 Hz, H-2), 6.80 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-5), 7.92 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-6)

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):163.5(C-2),100.2(C-3),183.8(C-4),98.0(C-6),166.4(C-7),95.8(C-8),159.4(C-9),103.9(C-10),120.3(C-1), 112.8 (C-2), 145.6 (C-3), 147.1 (C-4), 114.7 (C-5), 116.8 (C-8)

[화학식 3]

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iii ) 히비스카틴의 구조 동정

C₂₃H₂₄O₁₂(m.w492.4295)

HRESIMS: m/z 493.1335 [M+H]⁺(calcd:493.1346)

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD):6.34(1H,d,J = 2.2 Hz, H-6), 6.63 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 7.94 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.92 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 7.63 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6), 3.95 (3H, s, 7-OMe), 3.89 (3H, s, 3-OMe)

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):149.5(C-2),134.1(C-3),178.1(C-4),157.6(C-5),97.6(C-6),165.9(C-7),91.7(C-8),161.4(C-9),105.3(C-10),122.5(C-1), 112.9 (C-2), 147.0 (C-3), 156.9 (C-4), 114.6 (C-5), 121.6 (C-6), 102.0 (Glc-1), 74.5 (Glc-2), 76.6 (Glc-3), 70.1 (Glc-4), 77.1 (Glc-5), 61.1 (Glc-6), 55.4 (7-OMe), 55.1 (3-OMe)

[화학식 1]

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iv ) 카페인산의 구조 동정

C₉H₈O₄(m.w.180.1574)

HRESIMS: m/z 181.0502 [M+H]⁺(calcd:181.0500)

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD):6.26(1H,d,J = 8.0 Hz, H-2), 7.02 (1H, s, H-5), 6.90 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.22 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7), 7.48 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8)

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):126.1(C-1),113.6(C-2),145.3(C-3),147.8(C-4),115.0(C-5),121.2(C-6),144.7(C-7),126.6(C-8),170.6(C-9)

[화학식 4]

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3) 흰쥐 대뇌피질 신경 세포의 1차 배양

임신 17일자 SD 흰쥐의 태자에서 대뇌를 적출하여 뇌막을 제거하고 피질 부분만을 분리하여 잘게 자른 후 순차적으로 구멍의 크기를 작게 한 3개의 파스퇴르 피펫을 사용하여 단일세포로 분리하였으며, poly-L-lysine과 laminin으로 미리 코팅해 놓은 24-well plate 또는 35 mm dish에 6x10⁵/well 또는 6x10⁶/dish의 밀도로 각각 이식하였다.

세포는 5% FBS, 5% HS, 2 mM glutamine 및 25 mM 포도당을 함유한 MEM (with Earles salts)에서 95% 공기, 5% CO₂를 유지하면서 37 배양기에서 배양하였으며, 7일 후 10 M cytosine arabinoside로 처리하여 신경 세포 이외의 세포성장을 억제시킨 후 배양 10일 이상 경과 후 실험에 사용하였다.

4) 배양한 신경 세포에서 세포 손상 유발

i) 산화적 신경 세포 손상 유발

일차 배양한 흰쥐의 대뇌피질 신경 세포를 HEPES control salt solution (HCSS; 120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.6 mM MgCl₂, 2.3 mM CaCl₂, 14.9 mM glucose, 16.8 mM HEPES, 10 mM NaOH)으로 세척한 후 100 M H₂O₂ 또는 0.5 mM/10 mU/ml X/XO를 함유한 HCSS로 각각 5분 또는 10분 동안 처리한 다음 25 mM 포도당을 함유하는 MEM으로 배양액을 교환하여 20시간 동안 95% 공기, 5% CO₂를 유지하면서 37 배양기에서 배양하여 유발하였다.

ii ) 아밀로이드 베타(A)에 의한 신경 세포 손상 유발

아밀로이드 베타(A)에 의한 신경 세포 손상은 Aβ_(25-35)를 1 mM로 용해한 다음 일주일간 37 배양기에서 aggregation 시킨 후 사용하였다. 그 다음 배양한 신경 세포를 HCSS로 세척한 다음 40 M Aβ_(25-35)를 용해시킨 25 mM 포도당을 함유하는 MEM 배양액으로 처리하여 95% 공기, 5% CO₂를 유지하면서 37 배양기에서 24시간 동안 배양하여 유발하였다.

iii ) 흥분성 신경 세포 독성 유발

흥분성 신경 세포 독성은 배양한 신경 세포를 HCSS로 세척한 다음 100 M glutamic acid 또는 300 M NMDA를 함유하는 Mg² ⁺-free HCSS로 15분간 처리하고, 25 mM 포도당을 함유하는 MEM으로 배양액을 교환하여 20-24시간 동안 95% 공기, 5% CO₂를 유지하면서 37 배양기에서 배양하여 유발하였다.

iv ) 신경 세포 손상에 대한 꽈리 추출물 또는 분리된 화합물의 영향 평가

신경 세포 손상에 대한 꽈리 추출물 또는 분리된 화합물의 영향을 측정하기 위해서는 각각의 손상 유발 30분 전에 적정 농도로 희석한 꽈리 추출물 또는 분리된 화학물로 처리한 다음 손상 유발 약물과 꽈리 추출물 또는 분리된 화합물을 동시에 적용하여 시험하였다. 꽈리 추출물 또는 분리된 화합물은 10 mM 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시켰으며, 세포에 적용하기 직전에 배지에 희석하여 사용하였다.

5) 세포의 손상 정도 측정

배양한 신경 세포에서 유발된 손상 정도는 MTT 환원법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다. 즉, 각 well 당 MTT를 2 mg/ml 농도로 가하고 3시간 동안 37 배양기에서 배양한 다음, 배양액을 제거하고 500 DMSO를 가하여 환원된 formazan 결정을 녹여 SpectraMax M2 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 위상차 현미경으로 세포의 형태학적 변화를 관찰하여 세포의 손상 정도를 확인하였다.

6) 지질 과산화에 대한 작용

웅성 SD 흰쥐로부터 얻은 뇌 균질액에서 유발한 지질 과산화에 대한 작용은 일정양의 뇌 균질액과 10 M Fe²⁺, 100M ascorbic acid및 적정 농도의 실험용 시료를 함유하는 반응액을 37에서 1시간 동안 반응시킨 다음, trichloroacetic acid와 TBA를 차례로 가하여 혼합하고 100에서 15분 동안 가열한 후, 원심 분리하여 얻은 상등액의 흡광도를 SpectraMax M2^e microplate reader를 이용하여 532 nm에서 측정하였다.

시험 약물에 의한 지질 과산화 억제율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다. 이 때 대조군은 약물을 용해시킨 용매만을 처리한 경우이며, 실험 결과는 1회 2군씩 3회 이상 반복하여 얻은 값으로부터 계산한 평균값S.E.M.으로 나타내었다.

[수학식 1]

억제율(%)= 100 X (대조군의 흡광도 - 약물 처리군의 흡광도)/ 대조군의 흡광도.

7) 배양한 신경 세포에서 생성된 반응성 산소종 측정

배양한 신경 세포에서 H₂O₂, X/XO, glutamate 및 NMDA로 유발되는 반응성 산소종에 대한 영향은 DCF-DA를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 배양한 세포를 HCSS로 세척하고 10 M DCF-DA를 함유하는 MEM으로 30분 동안 처리한 다음 200 M H₂O₂, 0.5mM/10mU/ml X/XO, 100 M glutamate 및 300 M NMDA로 2시간 동안 처리하거나 적정 농도의 추출물 또는 분리된 화합물들과 동시에 적용하였으며, 일정 시간 경과 후 SpectraMax M2^e microplate reader를 이용하여 excitation 490 nm, emission 520 nm에서 형광을 측정하였다.

8) 베타 세크레타제 (β- Secretase ) 활성 측정

베타 세크레타제 활성은 β-secretase FRET assay kit을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 96-well plate에 적정 농도의 시료 10 (대조군은 assay buffer로 대체)와 기질 20 를 가한 후 조심스럽게 섞은 다음 베타 세크레타제 10 를 넣고 SpectraMax M2^e microplate를 이용하여 excitation 545 nm, emission 585 nm에서 형광을 측정하였으며, 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 동일한 조건으로 형광을 측정하였다. 베타 세크레타제 활성 억제율(%)은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

3. 꽈리 추출물의 산화적 신경 세포 손상 억제에 의한 신경 보호 효과

(1) 꽈리 추출물의 산화적 신경 세포 손상 억제 작용

1차 배양한 흰쥐 대뇌피질 세포를 100 M H₂O₂로 5분 동안 처리하고 20시간 배양한 후 유발되는 손상을 MTT 법을 이용하여 측정한 결과, 90 내지 95% 정도의 세포 손상이 관찰되었다(미도시).

이와 같은 산화적 신경 세포 손상은 손상 유발물질인 H2O2와 함께 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물로 동시에 처리하였을 때 효과적으로 억제되어 세포 생존율이 증가하는 것으로 나타났다(도 1). 한편 클로로포름 분획물로 처리한 경우 H₂O₂-유발 신경세포독성을 억제하여 세포의 생존율이 가장 높은 것으로 확인되나, 후술할 도 5를 참조하면 300/ml의 농도로 처리시 세포 생존율이 0%로, 세포 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

마찬가지로, 배양한 신경 세포를 X (0.5 mM)와 XO (10 mU/ml)로 처리하여 유발되는 산화적 신경 세포 손상의 경우에도 동시에 처리한 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 의해 억제되어 세포 생존율이 현저히 증가하는 것으로 나타났다(도 2).

(2) 꽈리 추출물 또는 화합물의 반응성 산소종 생성 억제 작용

꽈리 추출물에 의한 산화적 신경 세포 손상 억제 작용의 기전을 알아보기 위하여 먼저 H₂O₂ 또는 X/XO로 처리하여 생성되는 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)에 미치는 영향을 알아보았다.

그 결과, 꽈리 추출물중 에틸아세테이트 분획층은 H₂O₂ 또는 X/XO에 의해 생성되는 ROS를 각각 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 3 및 도 4). 이로부터 꽈리 추출물 중 에틸아세테이트 분획층에 의한 ROS 억제가 산화적 신경 세포 손상 억제 및 신경 보호 효과에 기여할 것으로 사료된다.

도 5 및 6은 꽈리 추출물 중 에틸아세테이트 분획층으로부터 분리된 4개의 화합물의 반응성 산소종 억제 효과를 나타낸 것으로서, 이를 참조하면, 4개의 화합물 모두 농도 의존적으로 반응성 산소종 억제 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다.

4. 꽈리 추출물 또는 화합물의 흥분성 신경 세포 독성 및 A-유발 독성 억제 작용

(1) 꽈리 추출물의 흥분성 신경 세포 독성 억제 작용

1차 배양한 대뇌피질 세포를 300 M NMDA로 15분 동안 처리하고 20 내지 24시간 동안 배양한 후 MTT 법을 이용해 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 꽈리의 에틸아세테이트 분획은 3 내지 300 g/ml 농도 범위에서 NMDA에 의해 유발되는 흥분성 신경세포 독성을 억제하여 세포 생존율을 최대 100% 정도 증가시키는 것으로 관찰되었다(도 7). 한편, 클로로포름 분획층의 경우 100 g/ml 농도까지는 흥분성 신경세포 독성을 어느 정도 억제하는 것으로 나타났으나, 적용 농도를 300 g/ml로 증가시켰을 때에는 NMDA로 처리한 경우보다 세포생존율이 더 감소하는 것으로 나타나(미도시) 세포독성이 발현됨을 알 수 있었다.

또한, NMDA 처리에 의해 생성되는 ROS에 대한 영향을 측정한 결과, 꽈리의 에틸아세테이트 분획은 흥분성 아미노산에 의해 생성되는 ROS를 농도 의존적으로 감소시키는 것을 관찰하였다(도 8).

이 결과로부터 꽈리의 에틸아세테이트 분획에 의한 흥분성 신경독성 억제 작용에 ROS 생성 억제가 관여할 수 있을 것으로 생각된다.

(2) 꽈리 에틸아세테이트 추출물의 A-유발 신경독성 억제 작용

1차 배양한 대뇌피질 세포를 40 M Aβ_(25-35)로 24시간 동안 처리하였을 때 유발되는 손상을 MTT 법으로 측정한 결과, 대조군과 비교할 때 최대 30 내지 40% 정도의 생존율을 나타내었다(미도시).

꽈리 에틸아세테이트 분획을 3 내지 300 g/ml 농도로 동시에 처리하였을 때 Aβ_(25-35)-유발 신경독성이 유의하게 억제되었다(도 9).

5. 꽈리 추출물 및 활성분획 성분의 베타 세크레타제 활성 억제 작용

Amyloid precursor protein (APP)으로부터 Aβ peptide를 생성하는데 관여하는 효소인 베타 세크레타제에 대한 꽈리 추출물의 작용을 알아보기 위하여 BACE1 FRET 실험법을 이용하여 다양한 농도의 꽈리 추출물 존재 하에서 베타 세크레타제의 활성을 측정하였다.

그 결과, 꽈리 추출물 중 에틸아세테이트 분획물은 농도 의존적으로 β-secretase 활성을 억제하는 것으로 관찰되었다(도 10).

이 결과로부터 꽈리 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 APP로부터 생성되는 Aβ peptide를 감소시킬 것으로 예측된다.

Claims

꽈리 추출액의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는, 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
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청구항 1에 있어서, 퇴행성 신경계 뇌 질환은 파킨슨병, 알츠하이머 치매(노인성 치매), 뇌졸중, 루게릭병, 픽크병, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅톤병, 진행성 핵상마비, 척수소뇌 변성증, 소뇌 위축증, 다발성 경화증, 외상 후 스트레스 장애 및 기억상실증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인, 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 환제, 주사제 또는 좌제로 제형화되는, 퇴행성 신경계 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
꽈리 추출액의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는, 퇴행성 신경계 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품.