KR101775267B1

KR101775267B1 - 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101775267B1
Application number: KR1020160026868A
Authority: KR
Inventors: 전미라; 이선아; 윤금주; 박지현
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2017-09-06

Abstract

본 발명은 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 홍삼오일은 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료(개선)을 위한 약제학적 의약품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 홍삼오일은 천연물에서 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 인체에 부작용이 없이 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising red ginseng oil}

본 발명은 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 뇌질환의 주요 요인이 된다. 이중 산화적 스트레스는 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환과 같은 퇴행성 뇌질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며, 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계, 해마, 선조체, 흑질 그리고 전뇌피질 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환을 초래하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

특히 산소에서 유리되는 자유라디칼은 조직 손상의 주요 원인으로 알려져 있고, 신경독성과 관련된 산화적 라디칼의 종류에는 과산화수소, 과산화수소 음이온, 수산화기 등이 있고, 이 중 과산화수소가 고반응성 자유 라디칼의 전구체로 가장 중요한 물질로 알려져 있고, 중추신경계의 세포사멸을 유발할 것으로 유력시되고 있다.

뇌신경세포에 산화적 스트레스를 주게 되면 활성산소종이 촉발되고, 이는 미토콘드리아에서의 시토크롬 C의 유리와 카스파아제-3 활성화를 일으켜 세포사멸을 가져온다. 이와 동시에 ROS는 글루타메이트, 특히 NMDA 수용체의 활성화를 가져와 메타보트로피칼 폭포(metabotrophical cascade)에 의한 Ca²⁺ 이온의 증가를 가져오고, ROS와 연관된 세포내 Ca²⁺의 증가는 또한 카스파아제-2의 활성화를 가져와 DNA 손상을 초래하게 된다.

또한 현재 전 세계적으로 고령인구가 증가하고 있으며, 우리나라도 2000년도에 이미 고령화 사회에 접어들었고, 2010년에는 65세 이상 인구가 차지하는 비율이 11%로 상승했다. 2018년이면 고령 사회, 2026년이면 초고령 사회로 접어들 것이라고 예견되고 있는 상황에서 고령인구의 노인성 질병의 해결이 시급한 사회적 문제로 대두되고 있다.

특히 노인성 치매질환의 약 절반을 차지하는 알츠하이머병은 현재로써는 유효한 치료방법과 예방방법이 없으며, 고령화 사회에 있어서 가장 시급히 해결해야할 신경질환중의 하나이기에 연구가 많이 요구되는 분야이나 아직 연구가 미미한 실정이다.

한국등록특허 제0838253호

따라서 본 발명의 목적은 홍삼오일에 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 홍삼오일에 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선에 유용한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 홍삼 또는 홍삼박 분말에 초임계 추출하는 방법을 포함하는, 홍삼오일 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초음계 추출은 순수 초임계 이산화탄소를 40 ~ 100℃의 온도에서 6000 ~ 7000psi의 압력으로 3 ~4시간 추출한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 홍삼오일은 조성물에 대하여 0.01 내지 200μg/mL의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 홍삼오일은 Aβ 유도독성에 의한 활성산소(ROS) 생성 또는 세포사멸(apoptosis)을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 홍삼오일은 Aβ 유도독성에 의한 카파아제-3 또는 TNF-의 활성을 억제 또는 저해할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 홍삼오일은 iNOS, COX-2 또는 NF-κB의 활성을 억제 또는 저해할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 방법으로 제조된 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 홍삼오일은 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료(개선)을 위한 약제학적 의약품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 홍삼오일은 천연물에서 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 인체에 부작용이 없이 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1은 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 PC12 세포에 대한 독성평가 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 MTT assay를 통한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 베타-아밀로이드 단백질(Aβ₂₅ _- ₃₅)에 대한 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 유세포 분석기를 통한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 Aβ₂₅ _-35에 대한 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 Aβ₂₅ _-35 유도 활성산소종 저해 효과를 나타내는 결과이다.
도 5는 형광염색을 통한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 Aβ₂₅ _-35 유도 apoptosis 억제 효과를 형태학적으로 보여주는 결과이다.
도 6은 유세포분석을 통한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 Aβ₂₅ _-35 유도 apoptosis 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 Aβ₂₅ _-35를 처리한 PC12 세포에 대한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 세포주기에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 8은 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 Aβ₂₅ _-35에 대한 TNF-α 활성 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 9는 Aβ₂₅ _-35 유도 NO 생성에 대한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 억제 효과를 나타내는 결과이다.
도 10은 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 Aβ₂₅ _-35에 대한 iNOS 발현 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 11은 Aβ₂₅ _-35 유도 PGE₂ 생성에 대한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 억제 효과를 나타내는 결과이다.
도 12는 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 Aβ₂₅ _-35에 대한 COX2 발현 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 13은 Aβ₂₅ _-35 유도 NF-κB 및 I-κB 인산화에 미치는 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 영향을 보여주는 결과이다.
도 14는 Aβ₂₅ _-35 처리시 증가한 MAPKs에 대해 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 저해 효과를 보여주는 결과이다.

본 발명은 홍삼오일의 신규 용도에 관한 것으로서 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 ‘홍삼오일(red ginseng oil)’은 항염 작용과 보습작용에 효과가 있다고 알려져 있으나, 알츠하이머성 치매 등의 퇴행성 뇌질환에 사용할 수 있다는 문헌은 현재까지 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 알츠하이머병의 치료를 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 홍삼오일에 Aβ 유도 신경독성을 효과적으로 억제시킬 수 있다는 사실을 최조로 규명하였다.

이러한 사실은 본 발명의 일실시예를 통해 확인할 수 있는데 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 ROS 억제효과를 확인하기 위해 PC12 세포에 Aβ₂₅ _-35를처리하여 ROS의 생성을 유도시킨 후 억제 효과를 확인한 결과, 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물 모두 전 농도구간에서 뛰어난 효과를 보였다.(p<0.001) 특히, 본 발명의 홍삼오일(RGO)은 같은 농도의 홍삼 물 추출물(RGW) 보다 더 효과적으로 ROS를 줄였으며, 홍삼오일 100 μg/mL에서는 아무 처리하지 않은 수준까지 회복하며 양성 대조군인 레스베라트롤(resveratrol) 보다도 강력한 ROS 소거능을 보임을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 Aβ₂₅ _-35로유도된 세포 사멸에 대한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 보호효과를 hoechst33342 염색을 통해 확인한 결과, 대조군에 비해 Aβ₂₅ _-35를 처리했을 때 형광이 강하게 나타난 것을 관찰할 수 있었으며, 40% 이상 증가된 apoptosis는 홍삼오일(RGO) 전처리 시 농도 의존적으로 탁월한 효과를 보이며(p<0.001) 100 μg/mL 에서는 양성대조군과 형태학적으로 유사한 양상을 보였다. 이는, 홍삼 물추출물(RGW)보다도 더 뛰어난 수준으로 Aβ₂₅ _-35 유도 세포사멸에 큰 효과를 나타내었음을 알 수 있었다(도 5 참조).

또한, Apoptosis 저해양상을 구체적으로 확인하기 위해 유세포 분석기를 이용하여 살펴본 결과는 도4-2와 같다.apoptosis에 들어간 세포는 세포외 표면(extracellular surface)에 PS(phospholipid phosphatidylserin)가 드러나 annexin V에 결합하며, 후기 apoptosis나 죽음까지 이르면 세포막이 파괴되어 PI가 세포 내로 들어가 핵에 염색되어 검출(detection) 가능하다. 두 샘플 모두 초기 apoptosis 에는 영향을 미치지 않았으나 후기 apoptosis에 대해 보호효과를 보임을 알 수 있었다(도 6 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 Aβ₂₅ _-35처리에 의하여 중단되었던 세포주기가 홍삼오일 처리에 의하여 PC12 세포의 세포주기를 정상화 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

나아가 본 발명에서는 Aβ25-35에 의해 증가된 염증성 반응이 홍삼오일 처리에 의해서 효과적으로 억제됨을 알 수 있었으며, 이러한 효과는 홍삼 물 추출물에 비하여 더 큼을 알 수 있었다(도 8 내지 도 14 참조).

따라서 본 발명자들은 홍삼오일이 Aβ 유도 산화적 스트레스 및 NF-κB 신호전달기전을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 실험적으로 입증하였다.

그러므로 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 ‘홍삼오일’은 홍삼 또는 홍삼박 분말에 초임계 추출하는 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 ‘초음계 추출’은 순수 초임계 이산화탄소를 40 ~ 100℃의 온도에서 6000 ~ 7000psi의 압력으로 3 ~4시간 추출할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 가장 바람직하게는 초임계 상태의 CO₂를 65℃에서 6,500 psi 으로 3~4시간동안 가하여 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 방법으로 제조된 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물로서 이러한 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제,좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 홍삼오일은 조성물에 0.01 내지 200μg/mL의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 퇴행성 신경질환으로는, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석경화증, 다발성 경화증, 면역계 이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니나 보다 자세하게는 알츠하이머 질환일 수 있다.

또한, 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 홍삼오일을 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 홍삼오일을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg ~ 250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 퇴행성 신경질환의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 홍삼오일을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의유효성분인 홍삼오일을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 홍삼오일을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 홍삼오일과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 홍삼오일과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험재료 및 실험방법

<1-1> 홍삼오일 제조방법

본 발명에 사용한 홍삼오일은 한국인삼공사 및 한국식품연구원에서 제공받아 사용하였다. 열수 추출 후 남은 홍삼박 100 kg을 초임계 추출 시스템 (Ilshin Autoclave Co., Ltd., Daejeon, Korea)을 이용하여 초임계 상태의 CO₂를 65℃에서 6,500 psi 으로 3~4시간동안 가하여 추출하였다.

<1-2> 세포 배양

본 발명의 실험에 사용된 집쥐의 부신 수질 크롬친화성 세포종에서 유래한 PC12 세포는 ATCC에서 분양받아 사용하였으며 세포는 RPMI1640 배지에 10% fetal bovine serum(FBS)와 5% horse serum 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

<1-3> 세포독성 평가( MTT assay ) 방법

PC12 세포를 RPMI1640 배지를 이용하여 96 웰 플레이트(well plate)에 1×10⁵ cells/well로 넣고 24시간 배양한 후 10, 50, 100 μg/mL 농도의 홍삼오일(red ginseng oil; RGO) 및 물 추출물(red ginseng water extract; RGW)을 넣고 1시간 배양 후 48 시간 응집(aggregation) 시킨 Aβ₂₅ _-35 50 μM을 첨가하여 24 시간 배양하였다. 이후, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol -2-yl]-2,5 -diphenyl tetrazoliumbromide) 용액과 3 시간 반응시키고 상층액을 제거한 후 생성된 formazan은 DMSO로 용해하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<1-4> 활성산소종 억제 효과 측정 ( ROS assay ) 방법

세포독성 평가와 동일한 0, 10, 50, 100 μg/mL의 농도범위에서 홍삼오일(RGO) 및 RGW(홍삼 물 추출물)의 ROS 생성 억제활성을 확인하였다. PC12 세포를 근접 빛이 차단된 96 웰 플레이트(well plate)에 24시간 배양 후 ROS를 선택적으로 염색시키는 형광염료 CH₂DCF-DA를 차광 상태에서 30분간 배양하였다. 반응 종료 직후, HBSS로 세척 후 형광측정장치를 이용하여 485 nm/535 nm 파장에서 형광값를 측정하여 Aβ₂₅ _-35 처리군에 대해 상대적인 수치로 나타내었다.

<1-5> PC12 세포의 형태 및 세포사멸 저해 양상 분석 방법

세포의 형태학적 변화는 Hoechst33342 dye를 이용하여 측정하였다. 세포를 8 웰 플레이트에 분주하여 RGO 및 RGW를 농도별로 처리, 1시간 후 Aβ₂₅ _-35를 처리하고 24시간 뒤 배양한 세포를 4% 포름알데히드로 20분간 고정시킨 후 PBS로 세척하였다. Hoechst33342 (1 μg/mL)를 첨가하고 실온에서 15분간 반응시킨 다음 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

또한, Aβ₂₅ _-35 처리로 야기된 세포사멸의 양상를 구체적으로 알아보기 위해 Annexin V & Dead Cell Kit (Merk Milipore, USA)를 이용하여 분석하였다. 배양한 세포는 trypsin EDTA를 넣고 회수하여 PBS로 세척 후 annexin V&Dead Cell 용액을 첨가하여 어두운 곳에서 20분 반응시킨 뒤, 유세포 분석기(Milipore, USA)를 이용하여 세포사멸 유형을 분석하였다.

<1-6> 세포주기 측정

홍삼오일(RGO) 또는 RGW(홍삼 물 추출물)와 Aβ₂₅ _-35를 처리한 후 well 에 부착된 세포는 trypsin-EDTA 용액을 가해 떼어내어 PBS로 세포 부유액을 만들었다. 세포 부유액은 70% 에탄올로 -20℃에서 3시간 이상 고정시킨 후, Muse cell cycle 용액을 넣어 유세포 분석기를 이용하여 제조사의 지시에 따라 실험하였다.

<1-7> NO 생성량 측정

생성된 일산화질소는 세포 배양액에 Griess 시약을 첨가하는 방법으로 아질산염(nitrite) 형태의 일산화질소량을 측정하였다. 세포 배양액 100 μL와 동량의 Griess 시약[1% 설파닐아미드(sulfanilamide), 0.1% N-1-나프틸에틸렌 디아민(N-1-napthylethylene diamine) in 2.5% 인산(phosphoric acid)]을 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분간 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(Sodium nitrite)을 이용해 표준곡선을 구하고 이와 비교하여 생성된 일산화질소 생성량을 산출하였다.

<1-8> PGE ₂ 생성량 측정

세포 내 PGE₂의 농도변화는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 방법을 이용한 assay kit(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 정량하였다. Goat anti-mouse Ig가 부착된 96 웰 플레이트에 PGE₂ 표준액 또는 시료를 가한 후, PGE₂-페록시다아제 콘쥬게이트(peroxidase conjugate)를 각각 50μL 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. PBS로 세척을 거친 다음, 기질 용액을 넣고 암소에서 30분 반응 후 반응을 정지시켰다. 결과는 450nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선을 이용하여 각 세포배양액에 함유된 PGE₂ 함량을 계산하였다.

<1-9> 웨스턴블롯팅 분석

PC12 세포를 6 웰 플레이트에 3×10⁶ cells/well로 넣고 24시간 후, 홍삼오일(RGO) 또는 RGW(홍삼 물 추출물)를 넣고 1시간 배양하고 이후 Aβ₂₅ _-35를 첨가하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 프로테아제 억제제(protease inhibitor)가 포함된 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 이용해 1시간 동안 세포를 용해시킨 후 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)을 표준으로 정량하였다. 정량한 단백을 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하고 PVDF막(poly-vinylidene difluoride membrane)에 15V, 300 mA 로 30분 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 막을 5% 탈지분유를 포함한 1X PBST에 넣고 1시간 blocking 시킨 후, 1차 항체와 밤새 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 막은 1X PBST 로 8회 세척한 후, 2차 항체를 4℃에서 2시간 반응한 뒤 1X PBST로 세척하였다. 단백질은 Ez Capture ST(ATTO, Tokyo, Japan)로 결과를 확인하였다.

< 실시예 2>

실험결과

<2-1> 홍삼오일 처리에 의한 세포 생존율 측정 결과

본 발명의 홍삼오일 또는 홍삼 물 추출물이 PC12 세포에서의 세포생존률에 미치는 영향을 알아보기 위해 100 μg/mL까지 처리한 후 세포 독성 유무를 확인한 결과, 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물 모두 100 μg/mL까지 아무 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포 생존율에 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다.

PC12 세포에서 Aβ₂₅ _-35를 유도하여 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 세포보효효과를 조사한 결과는 도 2에 나타내었다. MTT assay에서 Aβ₂₅ _-35처리 시 60%까지 세포를 사멸시켰으나, 홍삼오일(RGO)은 10 μg/mL부터 유의적으로 세포 생존율이 증가시키며, 고농도에서 양성대조군인 레스베라트롤(resveratrol)과 유사한 수준까지 회복하였다. 홍삼 물 추출물(RGW)과 비교해도 같은 농도에서 유의적인 차이는 보이지 않으며 Aβ_25-35에 대해 세포보호능을 확인하였다.

유세포 분석기를 이용한 실험에서는 홍삼 물 추출물(RGW) 10 μg/mL에서는 효과가 나타나지 않았으나, 본 발명의 홍삼 오일(RGO)은 모든 구간에서 Aβ₂₅ _-35에 대해 세포 보호효과를 보임을 알 수 있었다(도 3 참조).

<2-2> 홍삼오일 처리에 의한 활성산소종 억제 효과 확인

본 발명자들은 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 ROS 억제효과를 확인하기 위해 PC12 세포에 Aβ₂₅ _-35를처리하여 ROS의 생성을 유도시킨 후 억제 효과를 확인하였다.

그 결과, 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물 모두 전 농도구간에서 뛰어난 효과를 보였다.(p<0.001) 특히, 본 발명의 홍삼오일(RGO)은 같은 농도의 홍삼 물 추출물(RGW) 보다 더 효과적으로 ROS를 줄였으며, 홍삼오일 100 μg/mL에서는 아무 처리하지 않은 수준까지 회복하며 양성 대조군인 레스베라트롤(resveratrol) 보다도 강력한 ROS 소거능을 보임을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

<2-3> 홍삼오일 처리에 의한 PC12 세포의 형태 및 세포사멸 저해 양상 확인

본 발명자들은 Aβ₂₅ _-35로유도된 세포 사멸에 대한 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 보호효과는 apoptosis의 대표적인 지표 중 하나인 DNA fragment를 hoechst33342 염색을 통해 확인하였다.

그 결과, 대조군에 비해 Aβ₂₅ _-35를 처리했을 때 형광이 강하게 나타난 것을 관찰할 수 있었으며, 40% 이상 증가된 apoptosis는 홍삼오일(RGO) 전처리 시 농도 의존적으로 탁월한 효과를 보이며(p<0.001) 100 μg/mL 에서는 양성대조군과 형태학적으로 유사한 양상을 보였다. 이는, 홍삼 물추출물(RGW)보다도 더 뛰어난 수준으로 Aβ₂₅ _-35 유도 세포사멸에 큰 효과를 나타내었음을 알 수 있었다(도 5 참조).

<2-4> 홍삼오일 처리에 의한 PC12 세포의 세포주기 정상화 확인

Aβ와 같은 외부 자극에 의해 DNA 손상이 일어나면, 손상된 DNA의 수선을 위해 세포 주기 진행을 일시적으로 중단시킨다. Aβ₂₅ _-35처리 시 G0/G1기에서 S기로의 이행이 억제되어 G0/G1기가 증가하고 S기가 감소하였으나, 홍삼오일은 G0/G1기를 감소시키며 arrest 되었던 세포 주기를 회복시켰다(도 7 참조). 이는 홍삼 물 추출물(RGW)과 비교해도 비슷한 수준이었다.

<2-5> 홍삼오일 처리에 의한 염증성 사이토카인 생산 억제 활성 확인

PC12 세포에서 Aβ₂₅ _-35에 의해 유도되는 TNF-α의 조절 효과는 다음과 같다. 10 μg/mL에서부터 감소효과를 보인 홍삼 물 추출물(RGW)에 비해, 본 발명의 홍삼오일(RGO)은 10 μg/mL에서는 영향을 나타내지 않았으나, 50 μg/mL 이상부터 효과를 보였다. 또한 100 μg/mL에서는 오히려 홍삼 물 추출물보다도 뛰어난 활성을 보이며, TNF-α를 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다(도 8 참조).

<2-6> 홍삼오일 처리에 의한 NO 생성 및 iNOS 발현 억제 효과

홍삼오일 및 홍삼 물 추출물은 Aβ₂₅ _-35에 의해 다량 발생되는 NO에 대해 농도 의존적으로 억제시켰다(도 9 참조). 본 발명의 홍삼오일(RGO) 10 μg/mL 는 홍삼 물 추출물(RGW) 50 μg/mL에서의 NO 억제능과 유사한 수준의 NO 저해능을 보였고,(p<0.001) 100 μg/mL에서는 양성대조군인 레스베라트롤(resveratrol) 이상의 효과를 나타냈다.

NO 생성효소인 iNOS의 경우, Aβ₂₅ _-35로 인해 2배 이상 증가하였다(도 10 참조). 이에 홍삼오일(RGO)은 50 μg/mL 이상에서 홍삼 물 추출물(RGW)과 유사한 활성을 보였다.(p<0.001) 오히려 10 μg/mL에서는 효과가 나타나지 않은 홍삼 물 추출물에 비해 본 발명의 홍삼오일은 10 μg/mL에서도 효과를 보였다(p<0.05).

이를 통해 NO 생성에 대해 홍삼오일(RGO)은 10 μg/mL부터, 홍삼 물 추출물(RGW)은 50 μg/mL부터 iNOS 의 단백질 발현 단계에서 조절하고 있음을 나타내었다.

<2-7> 홍삼오일 처리에 의한 PGE ₂ 생성 및 COX2 발현 억제 효과

홍삼오일 및 홍삼 물 추출물이 Aβ₂₅ _-35에 의한 PGE₂ 생성에 대한 효과는 도 11에 나타내었다. 홍삼오일은 10 μg/mL에서도 Aβ₂₅ _-35를 처리했을 때와 비교하여 2/3 수준으로 PGE₂ 생성을 억제하였으며, 100 μg/mL에서는 24.4%까지 급격하게 감소시켰다. 이는 홍삼 물 추출물 뿐만 아니라 레스베라트롤(resveratrol)과도 비슷한 수준이었다.

홍삼오일 및 홍삼 물 추출물의 PGE₂ 저해 기전을 알아보기 위해 COX2 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, Aβ₂₅ _-35로 2배 이상 증가한 COX2를 10 μg/mL에서는 홍삼 물 추출물은 효과를 보였으나,(p<0.05) 홍삼오일은 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 그러나 50 μg/mL 이상의 홍삼오일(RGO) 처리시 아무 처리하지 않은 대조군수준까지 회복하였으며,(p<0.001) 홍삼 물 추출물(RGW) 못지않게 COX2 저해활성을 나타냈다(도 12 참조).

이를 통해 홍삼오일 및 홍삼 물 추출물은 COX2를 저해하여 PGE₂ 생성을 조절하는 것으로 확인하였다.

<2-8> 홍삼오일 처리에 의한 NF - κB 및 I- κB 생성 저해 효과

Aβ₂₅ _-35를 PC12 세포에 처리한 결과 NF-κB subunit인 p65 및 I-κB의 인산화가 증가하였다(도 13 참조). 이에 홍삼오일(RGO)과 함께 처리했을 때, 전 농도구간에서 p65 및 I-κB의 인산화를 감소시켰고, 100 μg/mL에서는 p65와 I-κB 모두 대조군 수준까지 억제하였다. 이에 비해 홍삼 물 추출물(RGW) 10 μg/mL에서 p65와 I-κB에 대해 유의적인 효과가 나타나지 않았고, 50 μg/mL에서도 p65만을 감소시켰다.(p<0.05)

이를 통해 홍삼의 지용성 성분이 Aβ₂₅ _-35로 인산화된 p65 및 I-κB를 억제하여 과도한 염증반응을 줄이며, NF-κB 경로에 대해 홍삼 물 추출물보다도 더 효과적으로 차단하는 것을 알 수 있다.

<2-9> 홍삼오일 처리에 의한 MAPKs 저해 효과

본 발명에서는 MAPKs family로 알려진 extracellular signal-regulated kinases(ERK)와 c-Jun N-terminal kinases(JNK), p38 MAPK의 활성화를 측정하였다. Aβ_25-35가 MAPKs의 인산화를 촉진한 것을 확인하였으며, 홍삼 물 추출물(RGW)은 ERK, JNK, p38에서 모두 효과를 보였고 그 중 ERK에서 뛰어난 효과를 보였다. 홍삼오일(RGO)은 ERK에서는 유의적 차이를 나타내지 않았으나, p38과 JNK의 인산화를 탁월하게 저해하였다. 특히, 홍삼오일(RGO)은 10 μg/mL에서도 p38을 대조군 수준까지 회복시키며, 홍삼 물 추출물(RGW)보다 뛰어나게 p38의 인산화를 저해하였다. 또한 JNK에 대해 홍삼오일(RGO)은 10, 50 μg/mL에서 홍삼 물 추출물(RGW)과 유사한 활성을 보였고,(p<0.05) 100 μg/mL에서는 홍삼 물 추출물(RGW)보다도 JNK를 효과적으로 감소시켰음을 알 수 있었다(도 14 참조).

이를 통해 NF-κB pathway 억제 효과가 홍삼 물 추출물은 특히 ERK에서, 홍삼오일에서는 p38과 JNK의 인산화 저해에서 기인되는 것으로 보인다.

따라서, 본 발명의 방법으로 제조된 홍삼 오일은 홍삼 물 추출물에 비하여 베타아밀로이드로 유도된 산화적 스트레스 및 과도한 염증반응을 억제하여 신경세포 자체를 보호하는 효과가 우수한 바 알츠하이머 질환의 치료에 사용하기 적합함을 실험으로써 규명하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

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홍삼 또는 홍삼박 분말에 초임계 추출하여 제조된 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 홍삼오일은 조성물에 대하여 0.01 내지 200μg/mL의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 홍삼오일은 Aβ 유도독성에 의한 활성산소(ROS) 생성 또는 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 홍삼오일은 Aβ 유도독성에 의한 카파아제-3 또는 TNF-의 활성을 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 홍삼오일은 iNOS, COX-2 또는 NF-κB의 활성을 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
홍삼 또는 홍삼박 분말에 초임계 추출하여 제조된 홍삼오일을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.