KR20170090073A

KR20170090073A - 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170090073A
Application number: KR1020160010467A
Authority: KR
Inventors: 전미라; 이선아; 윤금주; 박지현
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2017-08-07

Abstract

본 발명은 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 목적으로한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 노빌레틴은 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료(개선)을 위한 약제학적 의약품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 노빌레틴은 천연물인 진주초로부터 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 인체에 부작용이 없이 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising nobiletin}

본 발명은 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 목적으로한 약학적 조성물에 관한 것이다.

신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 뇌질환의 주요 요인이 된다. 이중 산화적 스트레스는 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환과 같은 퇴행성 뇌질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며, 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계, 해마, 선조체, 흑질 그리고 전뇌피질 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환을 초래하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

특히 산소에서 유리되는 자유라디칼은 조직 손상의 주요 원인으로 알려져 있고, 신경독성과 관련된 산화적 라디칼의 종류에는 과산화수소, 과산화수소 음이온, 수산화기 등이 있고, 이 중 과산화수소가 고반응성 자유 라디칼의 전구체로 가장 중요한 물질로 알려져 있고, 중추신경계의 세포사멸을 유발할 것으로 유력시되고 있다.

뇌신경세포에 산화적 스트레스를 주게 되면 활성산소종이 촉발되고, 이는 미토콘드리아에서의 시토크롬 C의 유리와 카스파아제-3 활성화를 일으켜 세포사멸을 가져온다. 이와 동시에 ROS는 글루타메이트, 특히 NMDA 수용체의 활성화를 가져와 메타보트로피칼 폭포(metabotrophical cascade)에 의한 Ca²⁺ 이온의 증가를 가져오고, ROS와 연관된 세포내 Ca²⁺의 증가는 또한 카스파아제-2의 활성화를 가져와 DNA 손상을 초래하게 된다.

또한 현재 전 세계적으로 고령인구가 증가하고 있으며, 우리나라도 2000년도에 이미 고령화 사회에 접어들었고, 2010년에는 65세 이상 인구가 차지하는 비율이 11%로 상승했다. 2018년이면 고령 사회, 2026년이면 초고령 사회로 접어들 것이라고 예견되고 있는 상황에서 고령인구의 노인성 질병의 해결이 시급한 사회적 문제로 대두되고 있다.

특히 노인성 치매질환의 약 절반을 차지하는 알츠하이머병은 현재로써는 유효한 치료방법과 예방방법이 없으며, 고령화 사회에 있어서 가장 시급히 해결해야할 신경질환중의 하나이기에 연구가 많이 요구되는 분야이나 아직 연구가 미미한 실정이다.

한국등록특허 제0838253호

따라서 본 발명의 목적은 노빌레틴에 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 노빌레틴에 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선에 유용한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

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본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 조성물에 대하여 0.01 내지 100μM의 농도로 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 활성산소(ROS) 생성 또는 세포사멸(apoptosis)을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 카파아제-3 또는 TNF-의 활성을 억제 또는 저해할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 iNOS, COX-2 또는 NF-κB의 활성을 억제 또는 저해할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

.

본 발명의 노빌레틴은 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료(개선)을 위한 약제학적 의약품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 노빌레틴은 천연물인 감귤로부터 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 인체에 부작용이 없이 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1은 노빌레틴의 화학적 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 MTT assay를 이용해 노빌레틴의 PC12 세포에 대한 독성평가와 베타-아밀로이드 단백질(Aβ₂₅ _-35)에 대한 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 유세포 분석기를 이용해 노빌레틴 처리에 의한 Aβ₂₅ _-35에 대한 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 노빌레틴 처리에 의한 Aβ₂₅ _-35 유도 활성산소종 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 형광염색을 통한 노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35 유도 세포사멸 억제 효과를 형태학적으로 나타낸 결과이다.
도 6은 유세포분석을 통한 노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35 유도 세포사멸 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35처리 시 활성화된 caspase-3 감소효과를 확인한 결과이다.
도 8은 Aβ₂₅ _- ₃₅을 처리한 PC12 세포에 대한 노빌레틴의 세포주기에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 9는 노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35에 대한 TNF-α 활성 저해를 확인한 결과이다.
도 10은 노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35에 대한 IL-1β 생성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 Aβ₂₅ _-35 유도 NO 생성에 대한 노빌레틴의 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35에 대한 iNOS 발현 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 13은 Aβ₂₅ _-35 유도 PGE2 생성에 대한 노빌레틴의 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 14는 노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35에 대한 COX2 발현 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 15는 Aβ₂₅ _-35 유도 NF-κB 및 I-κB 인산화에 미치는 노빌레틴의 영향을 보여주는 결과이다.
도 16은 Aβ₂₅ _-35 처리시 증가한 MAPKs에 대해 노빌레틴의 저해 효과를 보여주는 결과이다.

본 발명은 노빌레틴의 신규 용도에 관한 것으로서 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 ‘노빌레틴(nobiletin)'은 감귤에서 분리한 물질로서 지방 연소 효과가 뛰어나 비만의 예방에 효과가 있다고 알려져 있으며, 암을 예방하는 효과가 있다고 알려져 있으나, 알츠하이머성 치매 등의 퇴행성 뇌질환에 사용할 수 있다는 문헌은 현재까지 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 알츠하이머병의 치료를 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 노빌레틴에 Aβ 유도 신경독성을 효과적으로 억제시킬 수 있다는 사실을 최조로 규명하였다.

이러한 사실은 본 발명의 일실시예를 통해 확인할 수 있는데 Aβ₂₅ _-35유도독성에 대한 노빌레틴의 활성산소종 억제 효과가 있는지 여부를 알아보기 위하여 Aβ₂₅ _-35를 처리한 다음 노빌레틴을 농도별로 달리 하여 처리한 군 및 Aβ₂₅ _-35를 처리하지 않은 대조군을 대상으로 ROS assay를 실시한 결과, Aβ₂₅ _-35를 처리하지 않은 대조군에 비해 Aβ₂₅ _-35처리 시 산화적 스트레스가 급격히 증가하였다. 한편 노빌레틴처리에 의하여 ROS 생성량이 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다(도 2 및 3 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 노빌레틴 처리에 의한 PC12 세포의 형태 및 핵 단편화를 확인한 결과, Aβ₂₅ _-35 독성은 PC12세포에 핵 응축(nuclear condensation), 멤브레인 기포(membrance blebbing), 세포 수축(cell shrinkage), 핵분단(nuclear fragmentation) 등의 형태학적인 변화를 일으키는 반면 노빌레틴 처리 시 정상세포와 유사한 형태로 회복되었음을 알 수 있었다(도 5 참조). 특히 노빌레틴 25 μM 농도에서는 양성대조군인 레스베라트롤(resveratrol) 50μM보다 더 탁월하게 세포사멸(apoptosis)을 억제하였다. 나아가, 유세포 분석기를 통해 아포토시스(apoptosis)를 자세히 살펴본 결과에서도 노빌레틴 처리 시 초기 뿐 만 아니라 후기 세포사멸(apoptosis)까지 효과적으로 저해하였음을 알 수 있었다(도 6 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 노빌레틴은 Aβ25-35에 의해 증가된 caspase-3 활성을 농도 의존적으로 억제시켰다(도 7 참조).

또한, 세포주기 진행에는 Go/G1기, S기, G2/M기의 순서가 주기적으로 반복하면서 세포가 증식하게 된다. PC12세포에서 Aβ₂₅ _-35는 Go/G1기에서 S기로 진행을 억류(arrest)하여 Go/G1기가 증가되고 S기를 감소시켰다. 반면, 본 발명의 노빌레틴 처리 시 G0/G1에서 억류되었던 세포주기를 회복시키며 증가했던 Go/G1기가 다시 감소하였음을 알 수 있었다(도 8 참조).

나아가 본 발명에서는 Aβ25-35에 의해 증가된 염증성 반응이 노빌레틴 처리에 의해서 효과적으로 억제됨을 확인하였다(도 9 내지 16 참조).

따라서 본 발명자들은 노빌레틴이 Aβ 유도 산화적 스트레스 및 NF-κB 신호전달기전을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 실험적으로 입증하였다.

그러므로 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 노빌레틴은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

<화학식 1>

본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 노빌레틴은 시중에서 판매되는 것을 사용할 수도 있으며, 또는 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물로서 이러한 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제,좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 노빌레틴은 조성물에 0.01 내지 100μM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 퇴행성 신경질환으로는, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석경화증, 다발성 경화증, 면역계 이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니나 보다 자세하게는 알츠하이머 질환일 수 있다.

또한, 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 노빌레틴을 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 노빌레틴을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg ~ 250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 노빌레틴을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 퇴행성 신경질환의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 노빌레틴을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의유효성분인 노빌레틴을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 노빌레틴을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 노빌레틴과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 노빌레틴과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험재료 및 실험방법

<1-1> 세포 배양

본 발명의 실험에서 사용한 PC12 세포(ATCC CRL 1721)는 rat의 부신 수질의 크롬친화성 세포종에서 유도된 것으로 37℃의 5% CO₂ 및 95% air 조건에서 5% horse serum, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 (Hyclone Laboratories, INc) 배지에 배양하였다.

<1-2> 세포생존율 측정 ( MTT assay ) 방법

PC12 세포를 RPMI1640 배지를 이용하여 96 well plate에 1×10⁵ cells/well로 넣고 24시간 배양한 후 0, 1, 10, 25 μM 농도의 노빌레틴을 넣고 1시간 배양 후 Aβ₂₅ _-35를 50 μM이 되도록 첨가한 다음 24 시간 배양하였다. 이후, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol -2-yl]-2,5 -diphenyl tetrazoliumbromide) 용액 10 μL를 넣고 3 시간 반응시키고 상층액을 제거한 후 DMSO로 생성된 포르마잔(formazan)을 용해시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<1-3> 활성산소종 억제 효과 측정 ( ROS assay ) 방법

세포독성 평가와 동일한 0, 1, 10, 25 μM의 농도범위에서 노빌레틴의 활성산소종(ROS) 생성 억제활성을 확인하였다. ROS 측정을 위해 형광염료 CH₂DCF-DA를 이용하여 확인하였다. PC12 세포를 근접 빛이 차단된 96 웰 플레이트(well plate)에 24시간 배양 후 CH₂DCF-DA를 차광 상태에서 30분간 배양하였다. 반응 종료 직후, HBSS로 세척 후 형광측정장치를 이용하여 485 nm/535 nm 파장에서 축적된 ROS에 결합된 형광 DCF-DA를 측정하여 Aβ₂₅ _-35 처리군에 대해 상대적인 수치로 나타내었다.

<1-4> PC12 세포의 형태 및 세포사멸 저해 양상 분석 방법

세포의 형태학적 변화는 Hoechst33342 dye를 이용하여 측정하였다. 세포를 8 웰 플레이트(well plate)에 분주하여 노빌레틴을 농도별로 처리, 1시간 후 Aβ₂₅ _-35를 처리하고 24시간 뒤 배양한 세포를 4% 포름알데히드로 20분간 고정시킨 후 PBS로 세척하였다. Hoechst33342 (1 μg/mL)를 첨가하고 실온에서 15분간 반응시킨 다음 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

또한, Aβ₂₅ _-35 처리로 야기된 세포사멸의 양상를 구체적으로 알아보기 위해 Annexin V & Dead Cell Kit (Merk Milipore, USA)를 이용하여 분석하였다. 배양한 세포는 trypsin EDTA를 넣고 회수하여 PBS로 세척 후 annexin V & Dead Cell 용액을 첨가하여 어두운 곳에서 20분 반응시키 뒤, 유세포 분석기(Milipore, USA)를 이용하여 세포사멸 유형을 분석하였다.

<1-5> Caspase -3 활성의 측정 방법

6-웰 플레이트(well plate)에 PC12 세포를 1×10⁶ cells/well로 접종하고 노빌레틴을 처리한 후 한 시간 뒤 Aβ₂₅ _-35를 처리하였다. 24 시간 후 세포를trypsin-EDTA로 떼어내고 PBS로 세척 후, 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 10 분 동안 얼음 위에서 반응시켰다. 반응산물을 13,000 rpm으로 원심 분리하여 세포파쇄액을 얻은 후, 96 웰 플레이트에서 DTT 용액 및 DEVD-pNA와 한 시간 동안 반응시킨 다음 ELX808를 이용해 405 nm에서 잘려진 pNA의 흡광도값을 측정하였다.

<1-6> 세포주기 측정 방법

노빌레틴과 Aβ₂₅ _-35를 처리한 후 well 에 부착된 세포는 trypsin-EDTA 용액을 가해 PBS로 세포 부유액을 만들었다. 세포 부유액은 70% 에탄올로 -20℃에서 3시간 이상 고정시킨 후, Muse cell cycle 용액을 넣어 유세포 분석기를 이용하여 제조사의 지시에 따라 실험하였다.

<1-7> NO 생성량 측정 방법

생성된 일산화질소는 세포 배양액에 Griess 시약을 첨가하는 방법으로 아질산염(nitrite) 형태의 일산화질소량을 측정하였다. 세포 배양액 100 μL와 동량의 Griess 시약[1% 설파닐아미드(sulfanilamide), 0.1% N-1-나프틸에틸렌 디아민(N-1-napthylethylene diamine) in 2.5% 인산(phosphoric acid)]을 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분간 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(Sodium nitrite)을 이용해 표준곡선을 구하고 이와 비교하여 생성된 일산화질소 생성량을 산출하였다.

<1-8> PGE2 생성량 측정 방법

세포 내 PGE2의 농도변화는 ELISA(enzyme-linked immunosorvent assay) 방법을 이용한 assay kit(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 정량하였다. Goat anti-mouse Ig가 부착된 96 웰 플레이트에 PGE₂ 표준액 또는 시료를 가한 후, PGE2-페록시다아제 콘쥬게이트를 각각 50μL 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. PBS로 세척을 거친 다음, 기질 용액을 넣고 암소에서 30분 반응 후 반응을 정지시켰다. 결과는 450nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선을 이용하여 각 세포배양액에 함유된 PGE2 함량을 계산하였다.

<1-9> 웨스턴블롯 분석 방법

PC12 세포를 6 웰 플레이트(well plate)에 3×10⁶ cells/well로 넣고 24시간 후, 노빌레틴을 넣고 1시간 배양하고 이후 Aβ₂₅ _-35를 첨가하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 프로테아제 억제제(protease inhibitor)가 포함된 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 이용해 1시간 동안 세포를 용해시킨 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)을 표준으로 정량하였다. 정량한 단백을 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하고 PVDF막(poly-vinylidene difluoride membrane)에 15V, 300 mA 로 30분 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 막을 5% 탈지분유를 포함한 1X PBST에 넣고 1시간 블락킹(blocking) 시킨 후, 1차 항체와 밤새 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 막은 1X PBST 로 8회 세척한 후, 2차 항체를 4℃에서 2시간 반응한 뒤 1X PBST로 세척하였다. 단백질은 Ez Capture ST(ATTO, Tokyo, Japan)로 결과를 확인하였다.

< 실시예 2>

실험결과

<2-1> 노빌레틴 처리에 의한 세포 생존율 측정 결과

본 발명의 노빌레틴이 PC12 세포에서의 세포생존률에 미치는 영향을 알아보기 위해 1 μM부터 200 μM까지 처리한 후 세포 독성 유무를 확인한 결과, 노빌레틴이 PC12 세포에서 25 μM의 농도까지 세포독성이 없음을 알 수 있었다(도 2 참조). 따라서, 세포 생존률에 영향을 미치지 않는 25 μM를 최고농도로 하여 두 가지 방법으로 노빌레틴이 Aβ₂₅ _- ₃₅로 유발된 독성에 대한 세포보호능이 있는지 유무를 확인하였다.

먼저, MTT assay를 통해 살펴본 결과, Aβ₂₅ _-35에 의해 자극된 PC12 세포에서 급격한 생존율 저하를 보였으나, 노빌레틴은 1 μM부터 세포생존율을 회복시켰다. 유세포 분석을 통해 확인한 결과에서도 모든 농도구간에서 뛰어난 세포보호효과를 보임을 알 수 있었다(도 3 참조).

<2-2> 노빌레틴 처리에 의한 활성산소종 억제 효과 확인

노빌레틴의 Aβ₂₅ _-35에 의한 활성산소종(reactive oxigen species;ROS) 억제효과를 알아보기 위해 세포내 축적된 ROS를 CH₂DCF-DA로 염색하여 측정하였다.

그 결과, 도 4와 같이 대조군에 비해 Aβ₂₅ _-35 처리군에서 강한 형광을 나타내어 세포 내 ROS 축적이 관찰되었고, 이는 노빌레틴을 1, 10, 25 μM 전 처리함으로써 각각 88.86±3.70, 76.34±4.62, 70.69±1.86% 로 감소되었음을 알 수 있었다(도 4 참조).

<2-3> 노빌레틴 처리에 의한 PC12 세포의 형태 및 세포사멸 저해 양상 확인

세포사멸(apoptosis) 동안에 나타나는 형태학적 변화를 DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 hoechst33342로 염색한 후 형광현미경 하에서 관찰하였다. 그 결과, 대조군 7.50±1.2%에 비해 Aβ₂₅ _-35는 38.3±2.6%까지 세포사멸(apoptosis)을 일으켰으나 노빌레틴은 농도 유의적으로 그 수를 감소시켰다. 특히, 노빌레틴 25 μM 농도에서는 양성대조군인 레스베라트롤(resveratrol) 50μM보다 더 탁월하게 세포사멸(apoptosis)을 억제하였음을 알 수 있었다(도 5 참조).

노빌레틴의 apoptosis 저해 양상을 구체적으로 알기 위해 초기 세포사멸 마커인 annexin V와 후기 세포사멸 마커인 7-AAD로 유세포 분석기를 이용해 확인한 결과, Aβ₂₅ _-35는 초기와 후기 세포사멸(apoptosis)을 모두 증가시켰으며, 이에 노빌레틴은 초기 뿐 만 아니라 후기 세포사멸(apoptosis)까지 효과적으로 저해하였음을 알 수 있었다(도 6 참조).

<2-4> 노빌레틴 처리에 의한 Caspase -3 활성 확인

Aβ₂₅ _-35로 인한 세포사멸의 형태를 규명하기 위해 세포사멸(apoptosis)을 조절하는 대표적인 지표중의 하나인 caspase-3를 측정하였다. 그 결과, Aβ₂₅ _-35만 처리한 경우 caspase-3가 활성화된 것을 확인 할 수 있었으며, 이는 노빌레틴 농도 의존적으로 caspase-3가 감소되었음을 알 수 있었다(도 7 참조).

<2-5> 노빌레틴 처리에 의한 PC12 세포의 세포주기 정상화 확인

세포주기 진행에는 Go/G1기, S기, G2/M기의 순서가 주기적으로 반복하면서 세포가 증식하게 된다. PC12세포에서 Aβ₂₅ _-35는 Go/G1기에서 S기로 진행을 억류(arrest)하여 Go/G1기가 증가되고 S기를 감소시켰다. 반면, 본 발명의 노빌레틴 처리 시 G0/G1에서 억류되었던 세포주기를 회복시키며 증가했던 Go/G1기가 다시 감소하였음을 알 수 있었다(도 8 참조).

<2-6> 노빌레틴 처리에 의한 염증성 사이토카인 생산 억제 확인

Aβ₂₅ _-35 자극에 의해 생산되는 염증매개 사이토카인 중 TNF-α와 IL-1β를 분석한 결과, TNF-α의 생성은 Aβ₂₅ _-35를 처리했을 때 대조군과 비교하여 10배 이상으로 높게 발현되었으나, 노빌레틴을 10 μM 이상의 농도로 처리하였을 경우 억제효과를 보였음을 알 수 있었다(도 9 참조).

또한, Aβ₂₅ _-35로 인해 상승한 IL-1β의 생성 역시 10 μM 이상의 노빌레틴 처리 시 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).

<2-7> 노빌레틴 처리에 의한 NO 생성 및 iNOS 발현 억제 확인

과량의 NO는 정상세포를 죽이고 염증을 유도하여 알츠하이머에 있어 세포 손상 및 사멸을 매개하는데 중요한 역할을 한다. NO를 측정하기 위해 PC12 세포에 Aβ₂₅ _-35로 자극한 뒤, 노빌레틴 농도에 따라 NO의 생성을 조사한 결과, Aβ₂₅ _-35단독 처리 시 10배 이상 증가한 NO 생성과 비교하여 노빌레틴 1 μM의 저 농도에서도 절반정도로 감소시키며 10 μM 이상에서는 양성대조군인 레스베라트롤 50 μM과도 유사한 수준으로 억제효과가 관찰되었다(p<0.001)(도 11 참조).

이에 NO 생성 저해 기전을 확인하기 위해 iNOS의 발현 억제를 알아본 결과는 도 12와 같다. PC12 세포에 노빌레틴을 1시간 처리하고 Aβ₂₅ _-35로 자극한 뒤 iNOS의 발현 감소를 조사한 결과, Aβ₂₅ _-35로 유도한 iNOS에 대해 노빌레틴은 탁월한 효과를 나타냈다. 따라서, 노빌레틴은 iNOS를 저해하여 Aβ₂₅ _-35에 의해 과도하게 생성된 NO의 억제에 큰 역할을 하는 것으로 판단된다.

<2-8> 노빌레틴 처리에 의한 PGE2 생성 및 COX -2 발현 억제 확인

PC12 세포에 Aβ₂₅ _-35를 처리하여 PGE2의 생성을 유도시켰으며, 노빌레틴의 PGE2 생성억제능을 조사한 결과, 농도의존적으로 PGE2 생성을 억제하였으며, 특히, 고농도에서 강력한 PGE2 생성 억제 활성이 관측되었다(도 13 참조).

PGE2를 생성하는 COX-2의 발현양상의 변화를 확인한 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 Aβ₂₅ _-35만 처리한 군에서의 발현양은 대조군에 비해 286.7 ± 25.9%로 증가되었다. 그러나 노빌레틴을 농도별로 (1, 10, 25 μM) 처리했을 때, 저농도에서도 134.5±25.1%로 COX-2 발현을 줄이며, 10 μM 에서는 111.3±24.3% 로 감소시켜 강력한 COX-2 저해능이 관찰되었다.

<2-9> 노빌레틴 처리에 의한 NF - κB 및 I- κB 생성 저해 확인

활성화된 NF-κB가 핵 내로 이동하여 염증성 사이토카인과 iNOS, COX-2와 같은 효소의 생산을 유도함으로써 궁극적으로 염증반응이 유발된다(Noh et al, 2011).

따라서 본 실험에서는 Aβ₂₅ _-35 처리에 의해 증가된 NF-κB 억제활성을 조사하였으며, 그 결과 노빌레틴 10 μM 이상에서 NF-κB subunit인 p65를 유의적으로 감소시킴을 알 수 있었다(도 15 참조). NF-κB 활성화 과정에서 IκB는 세린(serine) 잔기가 인산화 되어야 떨어져 나간다. Aβ₂₅ _-35 처리는 IκB 인산화를 촉진했으며, 노빌레틴은 이를 억제하였다. 이와 같은 결과는 노빌레틴이 세포 내에서 NF-κB의 발현을 조절하며, IκB 분해에 영향을 미치는 것을 의미한다.

<2-10> 노빌레틴 처리에 의한 MAPKs 저해 확인

NF-κB 활성화를 매개하는 상위 메커니즘을 규명하기 위해 ERK1/2, JNK, p38 MAPKs의 인산화된 형태를 측정하였다.

그 결과, Aβ₂₅ _-35로 인해 증가된 MAPKs의 활성에 대해 노빌레틴은 p-JNK와 p-p38의 발현을 억제하였으나, p-ERK에서는 유의적 차이를 볼 수 없었다(도 16 참조). 이러한 결과를 미루어보아 노빌레틴에 의해 억제된 NF-κB 발현에 MAPKs 중 JNK, p38 MAPKs 가 상위신호전달 경로로서 작용할 가능성을 시사해준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
[화학식 1]

.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 조성물에 대하여 0.01 내지 100μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 활성산소(ROS) 생성 또는 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 카파아제-3 또는 TNF-의 활성을 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 iNOS, COX-2 또는 NF-κB의 활성을 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품;
[화학식 1]

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