KR20170076264A

KR20170076264A - 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170076264A
Application number: KR1020150186312A
Authority: KR
Inventors: 전미라; 윤금주; 이선아; 박지현
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2015-12-24
Filing date: 2015-12-24
Publication date: 2017-07-04

Abstract

본 발명은 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 목적으로한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 로가닌은 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료(개선)을 위한 약제학적 의약품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 코릴라진은 천연물인 진주초로부터 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 인체에 부작용이 없이 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

코릴라진을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising corilagin}

본 발명은 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 목적으로한 약학적 조성물에 관한 것이다.

신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 뇌질환의 주요 요인이 된다. 이중 산화적 스트레스는 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환과 같은 퇴행성 뇌질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며, 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계, 해마, 선조체, 흑질 그리고 전뇌피질 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 파킨슨씨 질환, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환을 초래하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

특히 산소에서 유리되는 자유라디칼은 조직 손상의 주요 원인으로 알려져 있고, 신경독성과 관련된 산화적 라디칼의 종류에는 과산화수소, 과산화수소 음이온, 수산화기 등이 있고, 이 중 과산화수소가 고반응성 자유 라디칼의 전구체로 가장 중요한 물질로 알려져 있고, 중추신경계의 세포사멸을 유발할 것으로 유력시되고 있다.

뇌신경세포에 산화적 스트레스를 주게 되면 활성산소종이 촉발되고, 이는 미토콘드리아에서의 시토크롬 C의 유리와 카스파아제-3 활성화를 일으켜 세포사멸을 가져온다. 이와 동시에 ROS는 글루타메이트, 특히 NMDA 수용체의 활성화를 가져와 메타보트로피칼 폭포(metabotrophical cascade)에 의한 Ca²⁺ 이온의 증가를 가져오고, ROS와 연관된 세포내 Ca²⁺의 증가는 또한 카스파아제-2의 활성화를 가져와 DNA 손상을 초래하게 된다.

또한 현재 전 세계적으로 고령인구가 증가하고 있으며, 우리나라도 2000년도에 이미 고령화 사회에 접어들었고, 2010년에는 65세 이상 인구가 차지하는 비율이 11%로 상승했다. 2018년이면 고령 사회, 2026년이면 초고령 사회로 접어들 것이라고 예견되고 있는 상황에서 고령인구의 노인성 질병의 해결이 시급한 사회적 문제로 대두되고 있다.

특히 노인성 치매질환의 약 절반을 차지하는 알츠하이머병은 현재로써는 유효한 치료방법과 예방방법이 없으며, 고령화 사회에 있어서 가장 시급히 해결해야할 신경질환중의 하나이기에 연구가 많이 요구되는 분야이나 아직 연구가 미미한 실정이다.

한국등록특허 제0838253호

따라서 본 발명의 목적은 코릴라진에 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 코릴라진에 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선에 유용한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

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본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 조성물에 대하여 0.01 내지 100μM의 농도로 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 활성산소(ROS) 생성 또는 세포사멸(apoptosis)을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 카파아제-3 또는 TNF-의 활성을 억제 또는 저해할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 iNOS, COX-2 또는 NF-κB의 활성을 억제 또는 저해할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

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본 발명의 코릴라진은 Aβ 유도 신경독성을 억제하는 활성이 우수하여 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료(개선)을 위한 약제학적 의약품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 코릴라진은 천연물인 진주초로부터 유래된 물질로서, 세포독성 없이 안정성을 가지므로 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 인체에 부작용이 없이 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1은 코릴라진의 화학적 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 MTT assay를 이용해 코릴라진의 베타-아밀로이드 단백질(Aβ25-35)에 대한 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 유세포 분석기를 이용해 코릴라진의 Aβ25-35에 대한 세포생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 코릴라진의 Aβ25-35 유도 세포 내 산화적 스트레스 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 형광염색을 통해 코릴라진의 Aβ25-35 유도 세포사멸(apoptosis) 억제 효과를 형태학적으로 나타낸 결과이다.
도 6은 유세포분석을 통한 코릴라진의 Aβ25-35 유도 세포사멸(apoptosis) 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 코릴라진의 Aβ25-35 유도 독성에 의한 caspase-3 활성 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 Aβ25-35을 처리한 PC12 세포에 대한 코릴라진의 세포주기 조절효과를 관찰한 결과이다.
도 9는 코릴라진의 Aβ25-35에 대한 TNF-α 활성 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 Aβ25-35 유도 독성에 의해 증가된 NO 생성에 대한 코릴라진의 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 코릴라진의 Aβ25-35에 대한 iNOS 발현 저해 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 Aβ25-35 유도 PGE2 생성에 대한 코릴라진의 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 13은 코릴라진의 Aβ25-35에 의한 COX-2 발현 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 14는 Aβ25-35로 유도된 NF-κB 및 I-κB 인산화에 대한 코릴라진 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 15는 Aβ25-35 처리 시 증가한 MAPKs에 대해 코릴라진의 저해 효과를 확인한 결과이다.

본 발명은 코릴라진의 신규 용도에 관한 것으로서 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 ‘코릴라진(corilagin)'은 진주초에서 분리한 물질로서 B형 간염 바이러스가 증식하는데 필요한 DNA 복제효소의 활성을 억제, 바이러스 숫자를 줄여주고 바이러스 표면항체(HbsAb) 출현을 유도하는 효과가 있다고 알려져 있으며, 또한, 간암, 대장암, 위암에 대한 항암 효과가 있다고 알려졌으나 알츠하이머성 치매 등의 퇴행성 뇌질환에 사용할 수 있다는 문헌은 현재까지 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 알츠하이머병의 치료를 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 코릴라진에 Aβ 유도 신경독성을 효과적으로 억제시킬 수 있다는 사실을 최조로 규명하였다.

이러한 사실은 본 발명의 일실시예를 통해 확인할 수 있는데 Aβ₂₅ _-35유도독성에 대한 코릴라진의 활성산소종 억제 효과가 있는지 여부를 알아보기 위하여 Aβ₂₅ _-35를 처리한 다음 코릴라진을 농도별로 달리 하여 처리한 군 및 Aβ₂₅ _-35를 처리하지 않은 대조군을 대상으로 ROS assay를 실시한 결과, Aβ₂₅ _-35를 처리하지 않은 대조군에 비해 Aβ₂₅ _-35처리 시 산화적 스트레스가 급격히 증가하였다. 한편 코릴라진처리에 의하여 ROS 생성량이 감소하였으며, 특히 코릴라진을 10 μM의 농도로 처리한 군에서는 20μM 농도에 비하여 더 효과적으로 ROS 생성량을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 코릴라진은 Aβ25-35로 인해 생성된 산화스트레스를 확연히 억제할 수 있으며, 특히 코릴라진을 10 μM의 농도로 처리한 군에서 그 효과가 가장 큼을 알 수 있었다(도 4 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 코릴라진 처리에 의한 PC12 세포의 형태 및 핵 단편화를 확인한 결과, Aβ₂₅ _-35 독성은 PC12세포에 핵 응축(nuclear condensation), 멤브레인 기포(membrance blebbing), 세포 수축(cell shrinkage), 핵분단(nuclear fragmentation) 등의 형태학적인 변화를 일으키는 반면 코릴라진 처리 시 정상세포와 유사한 형태로 회복되었음을 알 수 있었다(도 5 참조). 특히 코릴라진 10 μM 농도에서 양성대조군인 레스베라트롤 50 μM 수준의 효과를 보였다. 나아가, 유세포 분석기를 통해 아포토시스(apoptosis)를 자세히 살펴본 결과에서도 코릴라진 처리 시 late apoptosis를 감소시킴으로 살아있는 세포(live cell)를 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 코릴라진은 Aβ25-35에 의해 2.5배 가량 증가된 caspase-3 활성을 전체 농도구간에서 유의적으로 억제시켰다 (p<0.001). 이를 통해 코릴라진이 caspase-3를 불활성화(deactivation)함으로써 아포토시스(apoptosis)를 부분적으로 저해한다는 것을 확인하였다(도 7 참조). Aβ25-35 유도독성은 PC12 세포의 G0/G1기를 증가시키고, S기를 감소시킨 반면 코릴라진 처리 시 Go/G1기 감소 및 S기 증가효과를 보임으로, Go/G1기에서 arrest 되었던 세포주기를 회복시켰다(도 8 참조).

나아가 본 발명에서는 Aβ25-35에 의해 증가된 염증성 반응이 코릴라진 처리에 의해서 효과적으로 억제됨을 확인하였다(도 9 내지 15 참조).

따라서 본 발명자들은 코릴라진이 Aβ 유도 산화적 스트레스 및 NF-κB 신호전달기전을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 실험적으로 입증하였다.

그러므로 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 코릴라진은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

<화학식 1>

본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 코릴라진은 시중에서 판매되는 것을 사용할 수도 있으며, 또는 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물로서 이러한 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제,좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 코릴라진은 조성물에 0.01 내지 100μM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 퇴행성 신경질환으로는, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석경화증, 다발성 경화증, 면역계 이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니나 보다 자세하게는 알츠하이머 질환일 수 있다.

또한, 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 코릴라진을 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 코릴라진을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg ~ 250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 코릴라진을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 퇴행성 신경질환의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 코릴라진을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의유효성분인 코릴라진을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 코릴라진을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 코릴라진과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 코릴라진과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험재료 및 실험방법

<1-1> 세포 배양

본 발명의 실험에서 사용한 PC12 세포(ATCC CRL 1721)는 rat의 부신 수질의 크롬친화성 세포종에서 유도된 것으로 37℃의 5% CO₂ 및 95% air 조건에서 5% horse serum, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 (Hyclone Laboratories, INc) 배지에 배양하였다.

<1-2> 세포생존율 측정 ( MTT assay )

Aβ25-35에 의해 유도독성에 대한 세포 생존율은 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol -2-yl]-2,5 -diphenyl tetrazoliumbromide) assay를 이용하였다. PC12 세포를 96-웰 플레이트에 1×10/well을 분주하여 배양 후 샘플과 Aβ25-35 (Sigma Aldrich, USA)를 처리하여 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. 24시간 후 MTT reagent (Sigma Aldrich, USA)를 분주하여 3시간 배양하였고 상층액을 제거한 후 100 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔(formazan)을 완전히 녹여준 후 ELX808로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<1-3> 활성산소종 억제 효과 측정 ( ROS assay )

세포 내 생성된 ROS 양은 산화도에 민감한 프로브(oxidative sensitive probe)인 CH₂DCF-DA가 산화되어 생성되는 디클로로플루오레세인(dichlorofluorescein; DCF)의 형광 값으로 나타냈다. PC12 세포에 코릴라진을 0.1, 1 및 10 μM의 농도별로 처리하여 1 시간동안 배양 시킨 후, Aβ25-35 50 μM을 24 시간동안 처리하였다. 배양 후 CM-H₂DCFDA를 가하고 30 분 반응 후 배지를 제거한 다음, HBSS 100 μL를 넣고 FLX800를 사용하여 excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다.

<1-4> PC12 세포의 형태 및 핵 단편화 측정

세포의 형태학적 변화는 Hoechst33342 dye를 이용하여 측정하였다. 배양한 세포에 Hoechst33342 (1 μg/mL) reagent를 첨가하고 실온에서 15 분간 반응시킨 다음 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

<1-5> Cspase -3 활성의 측정

6-웰 플레이트에 PC12 세포를 1×10⁶밀도로 처리한 다음 코릴라진을 처리하고 한 시간 뒤 Aβ25-35를 처리하였다. 24 시간 후 세포를 trypsin-EDTA로 세포를 떼어내고 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 10 분 동안 얼음 위에서 반응시켰다. 반응산물을 원심분리하여 얻은 세포파쇄액은 96-웰 플레이트에 옮긴 후, DDT 용액 및 DEVD-pNA와 한 시간 동안 반응시킨 다음 흡광기(microplate reader)를 이용해 405 nm에서 잘려진 pNA의 OD값을 측정하였다.

<1-6> NO 생성량 측정

PC12 세포로부터 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. PC12 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1× 10⁶으로 처리하고 코릴라진과 Aβ25-35를 처리한 후 상층액을 얻었다. 상층액과 Griess 시약을 혼합하여 10 분간 반응 후 microplate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 농도는 NaNO₂를 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

<1-7> PGE2 생성량 측정

PC12 세포(3×10⁶/well)를 6-웰 플레이트에 접종하여 24 시간 배양 후, 코릴라진을 농도별로 처리하였다. 1 시간 후, 응집(aggregation) 시킨 Aβ25-35를 넣고 24 시간 후 상층액을 얻었다. 상층액 내 PGE₂는 제조사의 지시에 따라 효소면역법을 이용한 kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 측정하였다.

<1-8> 유세포 분석

6-웰 플레이트에서 PC12 세포를 3×10⁶밀도로24 시간 동안 배양한 후, 각각 코릴라진 0.1, 1, 10 μM를 가하였다. Aβ25-35를 처리하여 24 시간 후 웰(well)에 부착된 세포는 trypsin-EDTA 용액을 가하여 떼어내어 PBS 로 세포 부유액을 만들었다. 세포 부유액은 Muse 세포분석기(Merck Millipore, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 실험하였다.

<1-9> 웨스턴블롯팅 분석

PC12 세포에 코릴라진을 처리한 후 포집하여 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 얻어진 세포는 세포 분해 버퍼(cell lysis buffer)와 얼음에서 1 시간 반응 후 세포 파쇄액은 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여, 상층액은 BCA 용액을 이용하여 단백질을 정량하였다. 동량의 세포파쇄액(단백질:40 μg)은 샘플 버퍼(sample buffer)와 혼합하여 100℃에서 5 분간 가열한 다음 10% SDS-PAGE를 시행하였다. 전기영동이 끝난 gel의 단백질은 semi-dry 방법으로 PVDF 멤브레인 상에 이동시켰다. 그 후 5% 탈지유와 4℃ overnight 반응 후, 1차 항체는 1:1000으로 희석하여 4℃ overnight 반응한 후 2차 항체와 2시간 반응하였다. PVDF 멤브레인은 1X PBST로 7회 세척한 후 Ez Capture ST (ATTO, Tokyo, Japan)로 현상하였다.

< 실시예 2>

실험결과

<2-1> 코릴라진 처리에 의한 세포 생존율 측정 결과

본 발명의 코릴라진의 Aβ25-35유도 독성에 대한 세포 보호 효과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.

MTT assay 결과, Aβ25-35 처리 시 60% 이하로 감소했던 세포 생존율은 코릴라진 처리에 의해 생존이 증가하였음을 알 수 있었으며, 특히 10 μM에서는 Aβ25-35를 처리하지 않은 대조군과 유사한 세포생존율을 보였으며, 양성대조군인 레스베라트롤(resveratrol) 처리군보다도 높은 세포생존율을 보임을 알 수 있었다(도 2 참조). 또한, 유세포 분석기를 통해 측정한 결과에서는 1 μM 농도구간에서부터 뛰어난 세포생존율의 회복을 보임을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

<2-2> 코릴라진 처리에 의한 활성산소종 억제 효과 확인

본 발명자들은 코릴라진 처리에 의한 활성산소종 억제 효과를 확인하기 위하여 상기 실시예 <1-3>과 같이 실험하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.

Aβ25-35 유도를 하였을 때 세포 내 산화적 스트레스가 급격히 증가하였으나, 본 발명의 코릴라진 처리에 의하여 ROS 생성량이 감소하였으며, 특히 코릴라진을 10 μM의 농도로 처리한 군에서는 20μM 농도에 비하여 더 효과적으로 ROS 생성량을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 코릴라진은 Aβ25-35로 인해 생성된 산화스트레스를 확연히 억제할 수 있으며, 특히 코릴라진을 10 μM의 농도로 처리한 군에서 그 효과가 가장 큼을 알 수 있었다.

<2-3> 코릴라진 처리에 의한 PC12 세포의 형태 및 핵 단편화 측정 결과

본 발명자들은 코릴라진 처리가 PC12 세포의 형태 및 핵 단편화의 변화를 유도하는지 알아보기 위해 실시예 <1-4>와 같이 실험한 결과, Aβ₂₅ _-35 독성은 PC12세포에 핵 응축(nuclear condensation), 멤브레인 기포(membrance blebbing), 세포 수축(cell shrinkage), 핵분단(nuclear fragmentation) 등의 형태학적인 변화를 일으키는 반면 코릴라진 처리 시 정상세포와 유사한 형태로 회복되었음을 알 수 있었다(도 5 참조). 특히 코릴라진 10 μM 농도에서 양성대조군인 레스베라트롤 50 μM 수준의 효과를 보였다.

나아가, 유세포 분석기를 통해 아포토시스(apoptosis)를 자세히 살펴본 결과에서도 코릴라진 처리 시 late apoptosis를 감소시킴으로 살아있는 세포(live cell)를 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

<2-4> 코릴라진 처리에 의한 Caspase -3 활성 및 세포주기 조절 효과 확인

본 발명자들은 코릴라진 처리에 의한 Caspase-3 활성을 확인하기 위하여 상기 실시예 <1-5>의 방법으로 실험한 결과, 코릴라진은 Aβ25-35에 의해 2.5배 가량 증가된 caspase-3 활성을 전체 농도구간에서 유의적으로 억제시켰다 (p<0.001). 이를 통해 코릴라진이 caspase-3를 불활성화(deactivation)함으로써 아포토시스(apoptosis)를 부분적으로 저해한다는 것을 확인하였다(도 7 참조).

Aβ25-35 유도독성은 PC12 세포의 G0/G1기를 증가시키고, S기를 감소시킨 반면 코릴라진 처리 시 Go/G1기 감소 및 S기 증가효과를 보임으로, Go/G1기에서 arrest 되었던 세포주기를 회복시켰다(도 8 참조).

<2-5> 코릴라진 처리에 의한 TNF -α 생성 저해 효과

본 발명자들은 코릴라진 처리에 의한 TNF-α 생성 저해 효과를 확인한 결과, Aβ25-35 처리 시 TNF- 발현양은 2배 이상 증가하였으나 (p<0.001), 코릴라진 처리 시 TNF- 생성을 효과적으로 억제하였으며, 특히 1, 10 μM의 농도에서는 대조군 수준까지 회복시켰음을 알 수 있었다(도 9 참조).

<2-6> 코릴라진 처리에 의한 NO 생성 및 iNOS 발현 억제 효과

코릴라진 처리에 의한 NO 생성 및 iNOS 발현 억제를 확인한 결과, Aβ₂₅ _-35 처리 시 NO 생성양은 10배 가까이 증가하였으나 (p<0.01), 코릴라진 전체 농도구간에서 NO생성을 유의적 감소효과를 보였으며 특히, 10 μM에서는 양성대조군인 레스베라톨(resveratrol)과 유사한 효과를 보여, 코릴라진 10 μM의 농도에서 NO 생성 및 iNOS 발현을 가장 월등히 억제할 수 있음을 알 수 있었다(도 10 참조).

또한, 코릴라진의 NO 생성 저해가 iNOS 발현 억제와 관련된 것인지 확인하기 위해 western blot을 실시한 결과, 코릴라진의 전체 농도구간에서 NO 저해효과를 보인 것과 마찬가지로 iNOS 발현도 전 농도구간에서 유의적인 감소효과를 보였음을 확인하였다(도 11 참조). 이를 통해 코릴라진의 Aβ25-35 유도 독성에 의한 NO 생성 억제효과는 iNOS의 발현 저해를 통해 기인되었음을 확인할 수 있었다.

<2-7> 코릴라진 처리에 의한 PGE2 생성 및 COX -2 발현 억제 효과

코릴라진 처리에 의한 PGE2 생성 정도를 확인하기 위하여 상기 실시예 <1-7>의 방법으로 실험을 진행하였고, COX-2의 생성 정도를 확인하기 위하여 실시예 <1-5>의 방법으로 실험을 진행하였다.

그 결과, Aβ₂₅ _-35에 의해PGE2 생성양은 급격하게 증가하였으나 코릴라진 처리 시 1, 10 μM에서 p<0.001 수준의 탁월한 억제효과를 보였다(도 12 참조). 또한, PGE₂의 합성에 관여하는 효소인 COX-2의 발현량의 경우에서도 0.1 μM에서는 유의적인 억제 효과를 보이지 않았으나 코릴라진 1 μM 이상의 농도구간에서는 유의적인 효과를 보임을 알 수 있었다(도 13 참조).

<2-8> 코릴라진 처리에 의한 NF - κB 및 I- κB 생성 저해 효과

Aβ₂₅ _-35는 p65의 인산화를 2배 이상 증가시켰으나 코릴라진(corilagin) 처리 시 농도 의존적으로 감소되었으며 전 농도구간에서 유의적인 p65 인산화 억제 효과를 보임을 확인하였다(도 14 참조). 또한 IκB에서도 NF-κB와 마찬가지로 탁월한 효과를 보임으로 본 발명의 코릴라진은 Aβ에 의한 염증 신호전달과정을 효과적으로 억제시킨다는 사실을 알 수 있었다.

<2-9> 코릴라진 처리에 의한 MAPKs 저해 효과

NF-κB signaling pathway의 가장 상위단계인 MAPK family에 대한 코릴라진(corilagin)의 저해효과를 살펴본 결과, 코릴라진 처리에 의해 p38, ERK, JNK 모두 억제되었으며, 특히 p-ERK에서 가장 탁월한 저해효과를 보임을 알 수 있었다(도 15 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
[화학식 1]

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제1항에 있어서,
상기 화합물은 조성물에 대하여 0.01 내지 100μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 활성산소(ROS) 생성 또는 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 Aβ 유도독성에 의한 카파아제-3 또는 TNF-의 활성을 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 iNOS, COX-2 또는 NF-κB의 활성을 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품;
[화학식 1]

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