KR20220008525A

KR20220008525A - 벤질티오 아르테미시닌을 유효성분으로 함유하는 대장암 세포 및 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20220008525A
Application number: KR1020200086715A
Authority: KR
Inventors: 이석준; 신운섭
Original assignee: 주식회사 바이오파마
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2022-01-21

Abstract

본 발명은 벤질티오 아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 벤질티오 아르테미시닌 화합물은 대장암 세포와 대장암 줄기세포의 성장을 억제하고, 대장암 세포보다 대장암 줄기세포의 성장을 10배 이상 특이적으로 억제할 뿐만 아니라 대장암 줄기세포의 스피어 형성을 억제하여 암 줄기세포의 줄기세포능을 억제하므로 대장암의 전이, 재발 또는 내성을 억제하는 치료제로 활용이 가능하다.

Description

벤질티오 아르테미시닌을 유효성분으로 함유하는 대장암 세포 및 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물{Pharmaceutical Composition for growth inhibition of colorectal cancer cells and cancer stem cells comprising benzylthioartemisinin}

본 발명은 벤질티오 아르테미시닌을 유효성분으로 함유하는, 대장암 세포 및 대장암 줄기세포의 성장뿐만 아니라 클론원성 활성을 효과적으로 억제하는 대장암 세포 및 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

노령사회 생활습관의 변화로 대장암 발생이 높아지고 있으며 이미 세계적으로 매년 100만 건 이상의 대장암이 발생하고 있으며 매년 70만 명 이상이 사망하고 있다. 이에 따라 많은 사회 비용이 발생하고 있다.

대장암은 주로 수술요법과 항암제를 사용하고 있으나 대장암 치료에 사용할 수 있는 약제의 수가 많지 않다. 현재 대장암치료에 사용되는 약제로는 옥살리플라틴, 이리노테칸 같은 항암제와 세툭시맙이나 베바시주맙 같은 항체 치료제를 병용하여 사용하고 있으나 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 치명적일 뿐만 아니라 항암제 내성으로 재발률이 높아 항암치료를 하여도 5년 생존율이 65%이다(Front Pharmacol. 2019; 10: 912.). 이러한 현상을 나타내는 이유는 암 줄기세포에 기인하는 것으로 보고되었다(Stem Cells Int. 2018; Vol. 2018: 5416923). 즉, 암 줄기세포는 원래부터 항암제에 대해 내성이 있어 기존 항암제 치료시 분화된 암세포는 사멸하지만 암 줄기세포는 생존하여 다시 암이 재발하기 때문이다(Stem Cells Int. 2018; Vol. 2018: 5416923).

암 줄기세포의 존재는 급성골수성 백혈병(leukemia)에서 처음 증명되었으며(J. Cell. Physiol. 2007, 213, 440), 최근에는 유방암 등을 포함한 일반 고형암에서도 암 줄기세포의 존재를 증명함으로써, 고형암에서도 줄기세포가 존재함을 확인하게 되었다(FASEB J. 2013, 27, 13-24). 암 줄기세포는 자가재생능력(self-renew)과 함께 다양한 생물학적 특징을 가지는 세포로 분화하여 암세포의 침윤 및 전이를 용이하게 하고, 분화된 암세포들에 비하여 화학치료요법(항암제 및 방사선)에 대하여 더 높은 내생을 가져 종양의 재발 등 환자의 예후에 나쁜 영향을 줄 수 있다고 보고되고 있다(Stem Cells Int. 2018; Vol. 2018: 5416923). 따라서 대장암치료용 항암제의 개발이 절실하며 특히 암 줄기세포에도 효과적인 항암제가 필요하다.

아르테미시닌은 개똥쑥에서 유래된 말라리아 치료약제로서 인체에 안전한 약물이며 더욱이 내성이 잘 생기지 않는 것으로 알려졌다(Engineering 2019, 5, 32). 따라서 새로운 아르테미시닌 유도체 개발에 관한 많은 연구가 이루어져 왔으며, 항말라리아 활성 뿐만 아니라 혈관신생을 비롯한 다양한 활성이 보고되었다(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2003, 13, 3665).

티오형 아르테미시닌의 제조와 항말라리아 효과는 1995년 처음으로 보고되었고(Eur. J. Med. Chem. 1995, 30, 697-706, The Korean Journal of Parasitology, 2005, 43, 51), 인간 탯줄유래 정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)을 억제하는 효과가 2003년부터 보고되었지만 IC₅₀값이 1μM 이상에서 나타나 항암제로서 활성은 높지 않았다(Bull. Korean Chem. Soc. 2011, 32, 2823). 더욱이 암혈관신생(Tumor angiogenesis)을 억제하여 암을 치료하는 치료제가 개발되었지만 기대와 달리 혈관신생 억제제는 한정된 종류의 고형암에 치료 효과를 보일뿐 암 억제 효과가 미미하다.

이에 본 발명자들은 아르테미시닌 유도체 중 대장암 세포와 대장암 줄기세포에 대한 효과적인 성장 억제 효과를 갖는 대장암 치료제 또는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 벤질티오 아르테미시닌이 대장암 세포의 성장을 억제할 뿐만 아니라, 대장암 세포 보다 대장암 줄기세포의 성장도 특이적으로 더욱 억제하며, 줄기세포능을 나타내는 클론원성 활성(clonogenic activity)을 효과적으로 억제함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 특허공개 제2020-0021893호: 세트라리아 속 지의류로부터 분리된 신규 지의류 내생 곰팡이의 추출물을 포함하는 대장암 줄기세포 성장억제용 조성물

대한민국 등록특허 제10-1774652호: 암 줄기세포 치료용 조성물

본 발명의 과제는 대장암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 대장암 줄기세포에 대해 특이적 성장 억제 효과를 나타내고, 대장암 세포의 스피어 형성능(sphere formation), 즉 대장암 세포의 줄기세포화를 억제하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명은,

하기 화학식 1로 표시되는 벤질티오 아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

또한 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 벤질티오 아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 대장암 치료를 위하여 기존의 항암제와는 종류가 다른 새로운 화합물군을 제공하므로 항암제 선택의 기회를 제공할 수 있다. 또한 대장암 세포와 대장암 줄기세포를 억제함으로써 대장암의 근본적 치료를 가능하게 하고, 방사선, 수술, 화학요법 등 기존의 항암요법에 내성이 있는 암 줄기세포를 표적으로 할 수 있으므로 기존 항암요법과 병행시 암재발을 방지할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 제조된 벤질티오 아르테미시닌의 대장암 세포 및 대장암 줄기세포에 대한 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(BP-1001: α-벤질티오 아르테미시닌, BP-1002: β-벤질티오 아르테미시닌, NCSC: 대장암 세포, CSC: 대장암 줄기세포, CSC-Ad: 양성 대조군으로 아드리아마이신을 대장암 줄기세포에 처리).
도 2는 실시예 1에서 제조된 벤질티오 아르테미시닌의 대장암 줄기세포의 스피어 형성 억제 효과를 관찰한 사진이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 약학 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 벤질티오 아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함한다:

[화학식 1]

본 명세서에서 사용된 용어 '암 줄기세포'는 일반 줄기세포와 같은 자기재생능력, 암 형성능력 및 약물 저항성의 특성을 갖는 암세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '예방'이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증상을 차단하거나, 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '치료'란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 '이성질체'는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 의미한다. 이러한 이성질체 및 그의 염 및 이성질체의 혼합물(racemic mixture) 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염, 염기 부가염 및 약학적으로 허용 가능한 금속염을 포함한다.

산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 무독산 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 약학적으로 무독한 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴- 1,4-디오에이트, 핵산-1，6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 를투엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β_하이드톡시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함할 수 있다.

또한 약제학적으로 허용되는 염에는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속염 또는 알칼리토 금속염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등과의 아미노산염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과의 유기염 등이 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 벤질티오 아르테미시닌은 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다:

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명의 벤질티오 아르테미시닌 화합물은 대장암 줄기세포에 작용하여 현격히 적은 농도에서 대장암 세포의 스피어 형성능(sphere formation), 즉 대장암 세포의 줄기세포화를 억제하고, 또한 대장암 세포의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

많은 연구에서 암세포의 치료저항성, 혈관의 신생, 침윤, 전이 및 재발을 비롯한 암의 악성 형질이 모두 암 줄기세포(cancer stem cell)에 의해 유발됨이 밝혀졌다. 본 발명의 약학 조성물은 대장암 세포의 성장을 억제할 뿐만 아니라 대장암 세포 보다 대장암 줄기세포의 성장을 특이적으로 억제하여 대장암 줄기세포의 성장과, 대장암 세포의 줄기세포화를 억제함으로써, 대장암의 증식, 생존, 전이, 재발, 항암제 내성을 방지할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 다른 항암제와도 추가로 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 대장암 세포 및 대장암 줄기세포에 대한 성장 억제 효과를 더욱 증강시킬 수 있다. 상기 항암제는 바람직하게는 옥살리플라틴, 이리노테칸, 세툭시맙, 베바시주맙 등일 수 있으나, 항암제로 사용되고 있는 화합물이라면 이에 제한되지 않는다. 일 예로 이때, 추가로 포함되는 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 마시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 파조파닙, 토세라닙, 닌테다닙, 레고라페닙, 세막사닙, 티보자닙, 포나티닙, 카보잔티닙 카보플라틴, 소라페닙, 렌바티닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 케페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 흡입제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 무수알콜, 레시틴, 올레산, 락토스모노하이드레이트, 무수 락토스, HFA-134a, HFA-227 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서, '비경구'는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출률, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제, 흡입제로 제형될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기의 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1. 벤질티오 아르테미시닌(Benzylthioartemisinin)의 제조

1.1 디하이드로아르테미시닌(Dihydroartemisinin)의 제조

[반응식 1]

Eur. J. Med. Chem. 1995, 30, 697-706에 기재된 내용을 참조하여 반응식 1에 나타낸 바와 같이 아르테미시닌으로부터 디하이드로아르테미시닌을 합성하였다. 아르테미시닌(Artemisinin) 5g(17.7mmol)을 메탄올 200㎖에 녹인 후, 얼음 중탕에서 수소화붕소나트륨(NaBH₄) 3g(39mmol)을 천천히 적가한 후, 실온에서 4시간 교반하고, 박층 크로마토그래피로 출발 물질이 없어진 것을 확인한 다음 과량의 수소화붕소나트륨을 제거하기 위해 아세트산을 1㎖ 정도 넣어주고, 10분간 다시 교반하였다. 그 후 용매를 제거하기 위하여 감압 하에서 증류하고, 남은 여액에 물 100㎖를 가하고, 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 추출(100㎖X3회)하였다. 유기층을 포화탄산수소나트륨과 포화 식염수로 세척한 후, 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거하고, 감압 하에 에틸아세테이트를 증류하였다. 순수한 생성물을 얻기 위해 헥산(Hexane)/에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 재결정하여 고체상 화합물 디하이드로아데미시닌 4.9g(수율 91%)을 얻었다.

1.2 벤질티오 아르테미시닌(Benzylthioartemisinin)의 제조

[반응식 2]

Bull. Korean Chem. Soc. 2011, 32, 2823에 기재된 내용을 참조하여 반응식 2에 나타낸 바와 같이 디하이드로아데미시닌 3g(10.5mmol)과 페닐메탄티올 (phenylmethanethiol) 6.51g(52.5mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane) 100㎖에 녹인 후 삼불화붕소에테르(BF₃Et₂O) 1.65g(1.16mmol)을 실온에서 첨가하였다. 5분 교반 후 포화탄산수소나트륨 50㎖을 가하여 반응을 종결시키고, 디클로로메탄으로 추출(100㎖X3회)하였다. 포화식염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 수분을 제거한 후, 용매를 감압 하에 증류하고 남은 여액을 컬럼 크로마토그래피를 통하여 고체상 생성물 화학식 2 α-벤질티오 아르테미시닌 3.36g (82%)과 무색 유상물 화학식 3 β-벤질티오 아르테미시닌 0.33g을(8%) 얻었다.

α-벤질티오 아르테미시닌; ¹H-μMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.29 (m, 5H), 5.25 (s, 1H), 4.41 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.00 (d, J = 13.2 Hz, 1H),3.87 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 2.61 (m, 1H), 2.38 (m, 1H), 2.03 (m, 1H), 1.88 (m, 1H), 1.46 (s, 3H), 0.94 (d, J = 5.9 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 7.1 Hz, 3H) ppm;

β-벤질티오 아르테미시닌: ¹H-μMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.29 (m, 5H), 5.66 (s, 1H), 5.20 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 3.87 (s, 2H), 2.99 (m, 1H), 2.37 (m, 1H), 2.05 (m, 1H), 1.46 (s, 3H), 1.26 (m, 1H), 0.95 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 7.3 Hz, 3H) ppm.

실험예 1: 대장암세포에 대한 아르테미시닌 유도체의 작용 효과 확인

1-1.세포 배양 및 암줄기세포의 분리

인간 유래 대장암세포는 DLD-1 세포주를 사용하였고, 일반 암세포배양은 10%혈청이 함유된 DMEM배지를 이용하여 세포배양플라스크에서 단층배양하면서 유지하였다. 이 세포주로부터 sphere forming assay를 이용하여 암줄기세포를 분리하였다. 이를 위하여 DMEM/F12 배지 (20ng/mL의 EGF, 10ng/mL의 bFGF, 0.1% B27 (GIBCO), 및 1% 항생제-항균제 용액(Welgene) (암 줄기세포 배지)을 사용하였다. 단층 배양된 DLD-1 세포를 0.2% 트립신으로 처리하어 96웰 플레이트 웰당 1개 이하의 세포가 들어가도록 암줄기세포배지로 희석하여 96웰 플레이트 각웰에 넣은 후 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 이때 단일세포로부터 유도된 구형의 부유 상태(floating sphere state)로 성장하는 세포를 분리하여 암줄기세포를 확보하였고, 부착상태로 자라는 세포는 따로 분리하여 줄기세포능이 없는 암세포( non-cancer stem cell: NCSC)로 사용하였다. 암 줄기세포는 암 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 구형의 부유상태로 키우면서 유지하였고, 줄기세포능이 없는 암세포는 10% 혈청이 포함된 일반 세포배양배지에서 키우면서 실험에 사용하였다.

1-2. 암 줄기세포 및 줄기세포능이 없는 암세포에 대한 억제효과

상기 실시예 1에서 제조된 벤질티오 아르테미시닌은 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해하여, 하기 실험에서 사용하였다.

암 줄기세포는 줄기세포배양배지에서 성장할 때 스피어(sphere)를 형성하므로 단층배양을 위하여는 미리 배양플레이트에 피브로넥틴(fibronectin)을 코팅하여야 한다. 벤질티오 아르테미시닌의 대장암 줄기세포와 줄기세포능이 없는 대장암 세포에 대한 증식 억제활성을 조사하기 위하여 96웰 플레이트를 피브로넥틴으로 코팅한 후 여기에 대장암 줄기세포와 줄기세포능이 없는 대장암 세포를 각 웰에 3000 cell씩 넣어 부착시켰다. 이후 벤질티오 아르테미시닌을 농도별로 처리하여 CO₂ 배양기에서 5~7일 동안 배양하였다. 배양 후 MTS시약으로 1시간 처리하여 세포생존율을 측정하였다. 이때 세포증식 억제활성은 100-(처리군의 흡광도-음성대조군의 흡광도) x 100/(약물비처리대조군의 흡광도-음성대조군의 흡광도)의 공식에 따라 백분율로 나타내었으며, 프리즘프로그램을 이용하여 IC₅₀농도를 계산하였다. 그 결과는 도 1 및 아래 표 1에 나타내었다.

도 1은 실시예 1에서 제조된 벤질티오 아르테미시닌의 대장암 세포 및 대장암 줄기세포에 대한 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(BP-1001: α-벤질티오 아르테미시닌, BP-1002: β-벤질티오 아르테미시닌, NCSC: 대장암 세포, CSC: 대장암 줄기세포, CSC-Ad: 양성 대조군으로 아드리아마이신을 대장암 줄기세포에 처리).

아르테미시닌 유도체	Inhibition Concentration (nM)
아르테미시닌 유도체	대장암 줄기세포 (DLD-1S)	대장암세포 (DLD-1NS)
α-벤질티오 아르테미시닌(BP-1001)	12	133
β-벤질티오 아르테미시닌(BP-1002)	12	134

도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002) 모두 농도 의존적으로 대장암 줄기세포와 대장암 세포의 성장을 억제하였으며, 특히 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002)의 대장암 줄기세포에 대한 50% 억제활성(IC₅₀)은 12nM, 대장암 세포에 대한 50% 억제활성(IC₅₀)은 각각 133, 134nM이었다. 이와 같은 결과로부터 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002)은 줄기세포능이 없는 대장암 세포 보다 대장암 줄기세포에 대하여 10배 이상 억제활성이 높은 것은 확인할 수 있었다.

1-3. 벤질티오 아르테미시닌의 대장암 줄기세포 스피어 형성 억제활성 분석

인간 유래 대장암 줄기세포의 스피어 형성(sphere formation) 능력에 대하여 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002)이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 0.2% 트립신을 이용하여, 대장암 줄기세포를 단일세포로 분리하고 재현탁시켰다. 스피어 형성(sphere formation)을 위하여, 0.3㎖의 배지를 함유하는 48 웰 플레이트에 각 웰당 단일 대장암 줄기세포 300cell를 접종하였다. 실시예 1의 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002)을 농도별로 처리하여 10일 동안 배양하였다. 이후, 10% FBS를 첨가하여 스피어를 형성한 대장암 줄기세포를 플레이트에 부착시키고, 0.05% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet in 20% 메탄올)으로 염색한 뒤, 계수하였다.

실험 결과, 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002)을 처리하였을 대장암 세포주의 스피어 형성 능력이 200nM에서 완전히 억제되었으며, 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002)의 IC₅₀ 값은 각각 30nM과 50nM이었다.

이상의 결과로부터, 실시예 1에서 제조된 화학식 2, 화학식 3의 벤질티오 아르테미시닌(BP-1001, BP-1002)는 대장암 줄기세포의 성장뿐만 아니라 줄기세포능을 나타내는 클론원성 활성(clonogenic activity)을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 벤질티오 아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물:
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 입체 이성질체는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물:
[화학식 2]

[화학식 3]
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은
대장암의 전이, 재발, 또는 항암제 내성을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 줄기세포 성장 억제용 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 벤질티오 아르테미시닌 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 라세미체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물:
[화학식 1]
제5항에 있어서, 상기 입체 이성질체는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 약학 조성물:
[화학식 2]

[화학식 3]