KR20010037653A

KR20010037653A - 베타-카르볼린유도체를 포함하는 항염증제 조성물

Info

Publication number: KR20010037653A
Application number: KR1019990045304A
Authority: KR
Inventors: 이향우; 지옥표; 이강노; 홍성렬; 한정환; 이병곤; 권학철
Original assignee: 이향우
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 1999-10-19
Publication date: 2001-05-15

Abstract

본 발명은 하기의 화학식으로 표시되는 베타-카르볼린유도체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항염증제 조성물에 관한 것이다.

[상기 식에서 R은 수소 또는 탄소수 1~5의 알콕시기를 나타내며, 바람직하게는 수소 또는 메톡시기이다.]

4-메톡시-1-비닐-β-카르볼린 (C-1) 및 4,8-디메톡시-1-비닐-β-카르볼린 (C-2)를 포함하는 본 발명의 베타-카르볼린 유도체는 염증을 유도하는 중요효소인 iNOS 및 COX-2의 작용에 대하여 동시에 선택적이면서 우수한 저해작용을 나타내며 따라서 이들 약효물질들을 단독으로 또는 배합하여 포함할 수 있는 본 발명의 항염증제 조성물은 iNOS 및 COX-2의 과도한 발현에 관련된 염증에 대하여 매우 효과적인 치료효과를 나타낼 뿐만 아니라 iNOS 및 COX-2 작용과 관련된 기타의 여러가지 질병에 대해서도 우수한 치료 효과를 얻을 수 있다.

Description

베타-카르볼린유도체를 포함하는 항염증제 조성물 {Anti-inflammatory composition containing beta-carbolin derivatives}

본 발명은 베타-카르볼린유도체를 유효성분으로 하는 항염증제에 관한 것이다.

생체에 있어서 염증의 발생원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 니트릭옥사이드(nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드신테이즈 (nitric Oxide synthase; NOS)와, 프로스타글란딘의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX (시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 몇가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(Cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(induced NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로 시클로옥시게나제도 2종류가 존재하는데, 시클로옥시게나제-1(이하 COX-1이라 칭함)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 프로스타글란딘을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증반응 시에 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 따라서 바람직한 항염증제는 iNOS나 COX-2에 대한 선택적인 저해효과를 갖는 물질이어야 하며, 가장 이상적인 항염증제는 iNOS와 COX-2에 선택적이며 이들 두가지 모두를 저해하는 것이라 할 수 있다.

지금까지 알려진 NOS 저해제로는 L-NMA (N^G-methyl-L-arginine), L-NNA (N^G-nitro-L-arginine), L-NAME (N^G-nitroarginine methy ester), 아미노구아니딘 (Aminoguanidine), L-티오시트룰린 (N^W-thioureido-L-norvaline), S-메틸-L-시트룰린 (S-methyl-L-thiocitrulline) 등이 있으나, 이들 대부분은 NOS의 기질인 L-아르기닌과 상경적으로 작용하여 NOS를 저해하는 것으로 iNOS에 선택적이지 못한 단점이 있다.

또한 최근에 합성적인 방법으로 제조된 COX-2에 대한 저해제로 NS-398, CGP-29238, SC-58125, L-745337, 멜옥시캄(meloxicam) 등이 보고되고 있으나 아직 널리 이용되지는 않고 있으며, 그들의 부작용에 대해서도 확실히 검증되지 않은 상태이다.

한편, 천연식물에서는 일부 식물 등의 추출물이 iNOS나 COX-1에 대한 저해활성이 있다고 보고된 것을 제외하고는 거의 연구가 이루어지지 않은 상황이며, 더구나 iNOS 및 COX-2 에 대하여 동시에 선택적인 저해작용을 나타내어 항염증제로서 적용 가능한 물질에 대해서는 보고된 바가 아직 없는 실정이다.

본 발명의 목적은 iNOS 및 COX-2에 대한 동시 저해 작용을 통하여 효과적인 항염증 효과를 나타낼 수 있는 항염증제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 베타-카르볼린유도체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항염증제 조성물에 관한 것이다.

[상기 식에서 R은 수소 또는 탄소수 1~5의 알콕시기를 나타내며, 바람직하게는 수소 또는 메톡시기이다. 하기의 화학식 2와 3은 바람직한 예로서 각각 4-메톡시-1-비닐-β-카르볼린 (이하 C-1이라 함)및 4,8-디메톡시-1-비닐-β-카르볼린(이하 C-2라 함)을 나타낸 것이다.]

베타-카르볼린계 알칼로이드의 여러가지 유도체들은 여러 발명자들에 의해 합성되어 다양한 용도로 특허출원된 바 있으며(미국특허 5,434,148, 5,506,234, 5,604,236 및 5,861,408-10 등), 특히 C-1 및 C-2에 대해서는 그의 구조 확인 및 분석이 발표되어 있으나[Ohmoto, T. and Koike, K., Studies on the constituents of Picrasma quassioides Bennet. I. On the alkaloidal constituents. Chem, Pharm. Bull., 30 (4), 1204-1209, 1982; Ohmoto, T. and Koike, K., Studies on the constituents of Picrasma quassioides Bennet. II. On the alkaloidal constituents. Chem, Pharm. Bull., 31 (9), 3198-3204, 1982], 본 발명의 유효성분들이 본 발명의 용도로서 밝혀진 바는 전혀 없다.

본 발명의 조성물은, 유효성분인 베타-카르볼린유도체들 중 어느 하나의 단일 물질만을 포함할 수도 있고, 여러 물질들의 혼합물을 포함할 수도 있다.

상기 베타-카르볼린유도체는 iNOS 및 COX-2의 작용을 동시에 저해함으로써 효과적인 항염증 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 관절염, 면역성 당뇨병, 패혈성 쇼크, 다발성 경색증, 조산, 혈전, 천식, 건선, 피부알레르기 등 iNOS 나 COX-2가 관여하는 각종 질병의 치료제로 유용하다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로서 포함되는 베타-카르볼린 유도체는 화학합성 방법으로 얻어질 수도 있으나 생약으로부터 추출하여 얻을 수도 있다. 생약으로부터 추출하여 얻을 경우 본 발명의 유효성분인 베타-카르볼린 유도체를 포함하는 추출물을 그대로 적용할 수도 있으며 다시 정제 단리하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 예로서는, 생약 중 특히 고련피로부터 유기용매를 사용하여 추출물을 얻은 후 다시 정제하여 단일성분들을 얻어 이용하는 것이다. 고련피로부터 추출물을 얻고 다시 단일성분들을 얻는 방법은, 실시예에 그 구체적인 예를 보였다.

본 발명의 유효성분을 얻을 수 있는 생약인 고련피는 멀구슬나무과 (Meliaceae)에 속하는 고련피(Melia azedarach L. 또는 Melia azedarach L. var japonica Makino)의 줄기껍질이나 뿌리껍질을 말하며, 원식물은 높이 15-20미터의 낙엽성 교목으로 동아시아나 호주 등지에 분포되어 있으며, 우리나라에서는 주로 남부지방이나 제주도에서 자생하고 있다. 개화기는 4-5월이고 결실기는 10-11월이다. 고련피에는 고미를 나타내는 여러 종류의 트리테르펜계 성분 및 락톤 화합물이 함유되어 있으며, 기타 시토스테롤(sitosterol), 카테친(catechin) 및 플라보노이드(flavonoids) 등도 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 고련피 나무 열매(고련자)의 과육과 과피에도 멜리아논(melianone), 멜리아놀(melianol)과 같은 고미성분이 들어 있으며, 기타 불포화지방산이 다량 함유되어 있다. 고련피 및 그 열매의 성분 중, 바닐린산(vanillic acid), 메르소신(mersosin) 및 기타 구조가 확정되지 않은 몇 가지 성분들은 회충, 요충 등에 대한 강력한 구충작용이 있다고 알려져 있으며, 실제로 민간 의약에서는 종래부터 고련피 및 그 열매를 구충목적으로 사용해 온 바 있다. 그러나 본 발명의 용도인 항염증제로서는 알려져 있지 않다.

본 발명에 있어서의 고련피는 한방에서 종래로부터 사용되어 온 멀구슬나무과의 고련피 (Melia azedarach L., Melia azedarach L. var japonica Makino) 및 동속식물인 천련 (Melia toosendan Sieb. et Zucc)의 근피 및 수피, 또는 그 열매를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르는 약학적 조성물은 임상적으로 투여시에 약학적으로 허용되는 담체와 유효성분을 배합하여 경구 또는 비경구 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 특히 기제에 배합하여 외용제로서 적용할 수 있다. 이러한 목적으로 적합하게 사용할 수 있는 약학적으로 허용되는 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 붕해제 중의 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.

본 발명의 베타-카르볼린 유도체를 포함하는 약학적 조성물의 일일 투여량은 C-2로서 체중 ㎏당 0.1 ㎎ 내지 5 ㎎이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 투여 경로, 환자의 나이, 성별 및 증상의 중증도를 포함하는 관련된 조건에 따라 적절히 조절될 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어느 면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

이하, 실시예, 실험예 및 제제 제조예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 고련피 메탄올 추출물의 제조

고련나무의 수피를 채취하여 코르크층을 벗기고 양건한 고련피 1 kg 을 잘게 분쇄한 다음, 메탄올 5 리터를 넣고 냉각콘덴서가 달린 추출기에서 3 시간 동안 끓여서 냉각시킨 후 와트만 2번 여과지로 여과한다. 이 추출물을 냉각콘덴서가 달린 감압증발기에서 감압농축하여 건조중량 70g의 메탄올추출물을 얻었다.

실시예 2 : 고련피 에탄올 추출물의 제조

실시예 1에서 사용한 고련피 1 kg을 잘게 분쇄한 다음 에탄올 5 리터를 넣고 4-25℃에서 10일간 침적시켜 추출한 후 와트만 2번 여과지로 여과한다. 이 추출물을 냉각콘덴서가 달린 감압증발기에서 40℃로 감압농축하여 건조중량 59g의 에탄올추출물을 얻었다.

실시예 3 : 고련피 에테르 추출물의 제조

고련피 500 g 을 잘게 분쇄한 다음 에테르 3 리터를 넣고 4-25℃에서 10일간 침적시켜 추출한 후 와트만 2번 여과지로 여과한다. 이 추출물을 냉각콘덴서가 달린 감압증발기에서 40℃로 감압농축하여 건조중량 17g의 에테르추출물을 얻었다.

실시예 4 : 고련피 에칠아세테이트 추출물의 제조

고련피 500g 을 잘게 분쇄한 다음 에칠아세테이트 3 리터를 넣고 4-25℃에서 10일간 침적시켜 추출한 후 와트만 2번 여과지로 여과한다. 이 추출물을 냉각콘덴서가 달린 감압증발기에서 40℃로 감압농축하여 건조중량 25g의 에틸아세테이트추출물을 얻었다.

실시예 5 : 고련피 메탄올추출물로부터 에틸아세테이트 가용분획의 분리

실시예 1로부터 얻은 고련피 메탄올추출물 70g을 소량의 물에 분산시킨 후 에틸아세테이트를 가하고 진탕하여 정치시켜, 상층부의 에틸아세테이트 분획을 분취한 다음, 냉각콘덴서가 달린 감압증발기에서 40℃로 감압농축하여 건조중량 31.5g의 에틸아세테이트 가용분획을 얻었다.

실시예 6 : 고련피의 에틸아세테이트 분획으로부터 4-메톡시-1-비닐-β-카르볼린 (C-1) 및 4,8-디메톡시-1-비닐-β-카르볼린(C-2)의 분리

실시예 5로부터 얻은 고련피 추출물을 실리카겔이 충진된 관의 상부에 장전하고 헥산-에칠아세테이트의 혼합용매를 이용하여 용출시켜 총 22 분획을 얻었으며, 그중 iNOS 저해활성이 우수한 12-15번 분획을 모아 감압증발기에서 감압농축시켰다. 계속하여 클로르포름-에틸아세테이트 (15:1) 및 헥산-디클로르메탄-에틸아세테이트 (1:1:1)를 용출용매로 이용한 실리카겔 관 컬럼크로마토그라피를 실시하여 iNOS 저해활성성분을 정제하였으며, 그중 활성을 보인 분획을 최종적으로 LPLC에서 디클로르메탄-에틸아세테이트 8:1의 혼합용매로 분리하여 베타카르볼린계 알칼로이드 계의 단일물질인 4-메톡시-1-비닐-β-카르볼린(C-1) 50 mg 과 4,8-디메톡시-1-비닐-β-카르볼린(C-2) 45 mg 을 얻었다.

참고예 1 : 4-메톡시-1-비닐-β-카르볼린 (C-1) 및 4,8-디메톡시-1-비닐-β-카르볼린(C-2)의 구조

실시예 6에서 얻은 C-1 및 C-2 화합물의 구조를 규명하기 위해 물리화학적 시험 및 기기분석을 실시하였다.

C-2 화합물의 기기분석 자료 :황색물질; 녹는점 156℃;

UV λ_maxnm(EtOH) : 231, 253, 270, 358 ;

IR υ_maxcm^-1(CHCl₃) : 3450, 2900, 1620, 1590, 1500, 1250 ;

EI-MS m/z (rel. int.) : 254(M⁺, 100), 239(30), 224(35), 211(20), 169(11), 168(9);

¹H-NMR (500MHz, CDCl₃) : δ 4.01(3H, s, 8-OCH₃), 4.14(3H, s, 4-OCH₃), 5.59(1H, dd, J=11.5, 1.0Hz, cis H-B), 6.24(1H, dd, J=17.5, 1.0Hz, trans H-B), 6.97(1H, d, J=8.0Hz, H-7), 7.16(1H, dd, J=17.5, 11.5Hz, H-A), 7.23(1H, t, J=8.0Hz, H-6), 7.90(1H, d, J=8.0Hz, H-5), 8.07(1H, s, H-3), 8.76(1H, br.s, NH)

¹³C-NMR (125MHz, CDCl₃) : δ 56.23 (8-OCH₃), 56.83 (4-OCH₃), 107.91 (C-7), 116.96 (C-5), 117.68 (C-B), 119.78 (C-11), 121.65 (C-6), 122.02 (C-3), 122.75 (C-12), 130.64 (C-13), 133.46 (C-A), 134.83 (C-1), 134.93 (C-10), 146.45 (C-8), 152.04 (C-4)

C-1 화합물의 기기분석 자료: 황색 물질 ; 녹는점 145℃ ;

UV λ_maxnm(EtOH) : 225, 244, 267, 358 ;

IR υ_maxcm^-1(CHCl₃) : 3400, 2900, 1630, 1580, 1500, 1270 ;

EI-MS m/z (rel. int.) : 224(M⁺, 100), 209(28), 181(50), 154(28), 127(16) ;

¹H-NMR (500MHz, CDCl₃) : δ 4.17(3H, s, 4-OCH₃), 5.59(1H, dd, J=11.5, 1.0Hz, cis H-B), 6.22(1H, dd, J=17.5, 1.0Hz, trans H-B), 7.16(1H, dd, J=17.5, 11.5Hz, H-A), 7.32(1H, td, J=8.0, 1.0Hz, H-6), 7.50(1H, td, J=8.0, 1.0Hz, H-7), 7.51(1H, dd, J=8.0, 1.0Hz, H-8), 8.11(1H, s, H-3), 8.33(1H, dd, J=8.0, 1.0Hz, H-5), 8.73(1H, br.s, NH)

¹³C-NMR (125MHz, CDCl₃) : δ 56.85 (4-OCH₃), 111.73 (C-8), 117.54 (C-B), 119.37 (C-11), 121.25 (C-7), 121.89 (C-12), 122.39 (C-3), 124.87 (C-5), 128.22 (C-6), 133.72 (C-A), 134.58 (C-1), 135.29 (C-10), 140.11 (C-13), 152.04 (C-4)

C-2 화합물은 녹는점이 156℃의 황색 결정이고, 드라겐도르프(dragendorff) 알칼로이드발색시약에 오랜지색으로 양성반응을 나타내어 알칼로이드로 추정되었다. UV 스펙트럼에서 234, 256, 272, 360nm에서 강한 흡수대가 관찰되었고, 이는 β-카르볼린 골격의 전형적인 UV 양상임을 알 수 있었다(Ohmoto, T. and Koike, K., Studies on the constituents of Picrasma quassioides Bennet. I. On the Alkaloidal Constituents, Chem. Pharm. Bull., 30 (4), 1204-1209, 1982; Ohmoto, T. and Koike, K., Studies on the constituents of Picrasma quassioides Bennet. Ⅱ. On the Alkaloidal Constituents, Chem. Pharm. Bull., 31 (9), 3198-3204, 1983). 분자이온피크가 m/z 254에서 나타난 EI-MS 자료와¹³C-NMR 스펙트럼자료를 통해 C-2 화합물의 분자식은 C₁₅H₁₄N₂O₂로 추정하였다. EI-MS 스펙트럼에서 분자이온피크가 (m/z 254)가 가장큰피크(base peak)로 나타났으며, 비닐기가 모핵으로부터 떨어짐으로써 나타나는 m/z 211([M-CH₃-C₂H₄])와 β-카르볼린의 기본골격 피크인 m/z 168이 관찰되었다.¹H-NMR 스펙트럼에서 δ4.01과 4.14에서 각각 메톡시 수소의 단일피크가 관찰되었고, δ5.59(1H, dd, J=11.5, 1.0Hz), δ6.24(1H, dd, J=17.5, 1.0Hz)와 7.16(1H, dd, J=17.5, 11.5Hz)에서 vinyl기의 AMX 결합 시스템이 관찰되었으며, δ6.97(1H, d, J=8.0Hz), 7.23(1H, t, J=8.0Hz), 7.90(1H, d, J=8.0Hz)에서 방향족 수소들과 δ8.07에서 하나의 단일 피크와 δ8.76에서 NH의 넓은 단일피크가 관찰되었다.¹³C-NMR 스펙트럼에서 총 15개의 탄소 피크가 관찰되었고, DEPT 스펙트럼에서는 2개의 메틸기, 1개의 메틸렌, 5개의 메틴, 7개의 4급 탄소들을 관찰할 수 있었다.¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC등의 2D-NMR 스펙트럼을 통해 각각의 수소와 탄소의 결합관계 및 2개의 메톡시기와 1개의 비닐기의 결합위치를 결정하였다. 이상의 자료를 통해 C-2 화합물의 구조는 4,8-디메톡시-1-비닐-β-카르볼린으로 추정하였으며, 기존문헌²⁾의 이화학적 성상 및 스펙트럼자료의 비교를 통해 그 구조를 확정하였다.

C-1 화합물은 녹는점이 145℃의 황색 결정이고, 드라겐도르프(dragendorff) 알칼로이드발색시약에 오랜지색으로 양성반응을 나타내어 알칼로이드 성분으로 추정되었다. UV 스펙트럼은 228, 246, 270, 358nm에서 화합물 M-1과 매우 유사한 흡수대를 나타내었다. 분자이온 피크가 m/z 224에서 나타난 EI-MS 자료와 NMR 자료를 종합하여 화합물 M-2의 분자식은 C₁₄H₁₂N₂O로 추정하였다. EI-MS 스펙트럼에서 M⁺피크(m/z 224)가 가장 큰 피크(base peak)로 나타났으며, 비닐기가 모핵으로부터 떨어짐으로써 나타나는 m/z 181([M-CH₃-C₂H₄]) 피크가 관찰되었다.화합물 C-2의¹H-NMR 스펙트럼은 OCH₃피크 하나가 없어지고, A 환의 수소로부터 유래되는 피크가 나타나는 변화를 제외하고는 C-2 화합물의 스펙트럼과 매우 유사하였다.¹⁴C-NMR 스펙트럼에서는 총 14개의 탄소피크가 관찰되었으며, C-2 화합물의 스펙트럼과 비교할 때 δ56.83에서 하나의 메톡시 피크만이 관찰되고 δ152.04에서 하나의 산소결합 방향족 탄소 피크 (oxyganated aromatic carbon peak)만이 관찰되었다. 이상의 자료로부터 C-1 화합물은 C-2 화합물에서 8번 위치의 메톡시 기 빠진 4-메톡시-1-비닐-β-카르볼린으로 추정하였으며, 기존문헌(Ohmoto, T. and Koike, K., Studies on the constituents of Picrasma quassioides Bennet. Ⅱ. On the Alkaloidal Constituents, Chem. Pharm. Bull., 31 (9), 3198-3204, 1983)의 이화학적 성상 및 스펙트럼자료의 비교를 통해 그 구조를 확정하였다.

실험예 1 : iNOS 활성에 대한 억제효과

(1) 복강 대식세포의 제조

복강의 대식세포는 6~8주령의 ICR 마우스로부터 분리하였다. 얼음에 냉각한 5 ml의 인산완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS)를 마우스의 복강에 주사하여 세척한 액을 취하였다. 1,500rpm에서 원심분리하여 얻은 세포 펠릿에 RPMI-1640배양액을 가하여 부유시킨 다음 혈구계 (hemacytometer)를 이용하여 세포수와 생육성(viability)을 측정하였다. 96-웰 배양 플레이트에 일정수의 세포를 분주하여 37℃에서 5%-CO₂/ 95%-O₂으로 2시간 동안 배양한 후 배양액으로 2회 세척하여 미부착세포를 제거하여 비교적 순수한 대식세포를 얻는다. 얻은 대식세포의 순도는 통상 95% 이상임을 감별염색 (differential staning)으로 확인하였다.

(2) 시료의 처리 및 NO 생성량의 측정

복강내 대식세포가 부착된 각 웰에 배양액과 LPS/IFN-γ과 함께 실시예 6에서 제조한 화합물 C-1 및 C-2의 용액을 각각 가하고 16시간 동안 CO₂-인큐베이터에서 배양한 후, 그 배양액을 일정량 취한 다음 동량의 그리이스 시약 (Griess reagent)을 가하여 상온에서 10분간 방치여 발색시킨 뒤 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다.

(3) 시험결과

NO 생성억제정도는 NO 반응의 최종산물인 아질산염(nitrite, NO₂) 양을 측정하여 평가하였으며, 각 시료처치에 의한 NO 생성억제율은 다음 식과 같이 시험물질을 처리하지 않은 대조군에서 생성된 아질산염의 양을 기준으로 하여 산정하였다.

실시예 6에서 제조한 화합물 C-1 및 C-2의 대식세포의 iNOS에 의한 NO 생성억제효과를 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 C-1 및 C-2는 모두 우수한 iNOS 활성을 억제 효과를 나타내었으며 이 효과는 용량의존적인 것으로 관찰되었다.

iNOS 억제효과

시험물질	시료처치농도(μM)	억제율(%)
C-2 화합물	2	85
	1	72
	0.5	36
C-1 화합물	2	67
	1	44
	0.5	18

실험예 2 : bNOS 활성에 대한 억제효과

(1) 뇌추출물의 제조

본 발명에 따르는 항염증제 조성물 중의 유효물질인 베타-카르볼린 유도체가 체내 구성형 NOS의 하나인 bNOS (brain NOS)의 활성에 대한 억제작용이 없음을 확인하기 위하여 뇌추출물을 bNOS 재료로 하여 실험하였다. 뇌추출물은 마우스에서 다음과 같은 조작을 통하여 얻었다. 발브씨(BALB/c) 마우스에서 분리한 신선한 뇌조직을 5배량의 얼음에 냉각한 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) 에 넣어 미세하게 분쇄한 뒤, 15,000 rpm으로 4℃에서 원심분리하여 그 상등액을 취하고, 원심분리형 한외여과를 하여 농축시켰다. 이 농축액의 단백질 농도를 측정하고, bNOS 재료로서 실험에 사용하였다.

(2) 시료의 처리 및 bNOS 활성측정

bNOS 활성은 트리튬으로 표지된 시트룰린 형성능으로 측정하였다. 시험용 반응액은 1.5 mM 염화칼슘, 1 mM 니코틴아마이드 2인산-환원형 (NADPH), 20 M 테트라하이드로바이오프테린 (tetrahydrobiopterin), 20 M L-아르기닌, 5 M 플라빈모노뉴클레오티드(flavin mono nucleotide), 5 M 플라빈아데닌디뉴클레오티드(flavin adenin dinucleotide), 1 M 칼모듈린 및 [3H]-아르기닌을 2,000,000 cpm 함유한 50 mM 트리스 완충액 140 을 기본으로 하고, 여기에 마우스 뇌추출물 40 ℓ 및 실시예 6에서 제조한 화합물 C-1 및 C-2의 용액 20 ℓ를 첨가하였다. 공시험액에는 저해제 용액 대신에 동량의 트리스 완충액을 첨가하였다. 대조약으로는 NOS 저해제인 L-NMA (N^G-methyl-L-arginine)를 사용하였다. 이 용액을 37℃에서 10분간 반응시킨 후 20 mM 소듐아세테이트 완충액 1 ml를 가해 반응을 중지시키고, DOWEX 양이온교환수지 컬럼을 통과시켜 나온 용출액의 방사능을 베타-신틸레이션 카운터에서 측정하였다.

(3) 시험결과

bNOS 활성은 NOS의 기질인 [3H]-아르기닌이 NOS의 활성에 의하여 생성된 [3H]-시트룰린의 양을 측정하여 계산하였다. bNOS 활성은 단위시간 (1분)당 단위 단백질량 (1 mg)의 뇌추출물에 함유된 bNOS 효소에 의해 생성된 시트룰린의 양(pmole)으로 표시하였다. 다음 표 2에 제시한 바와 같이 bNOS 저해제를 처리하지 않은 공시험액에서는 7.08의 효소활성을 나타낸 반면, NOS 저해제인 NMA를 처리한 시험액에서는 농도의존적으로 그 활성이 억제되었다. 그러나 iNOS 저해작용을 보인 바 있는 C-1 및 C-2는 bNOS에 대해서는 유의성 있는 억제효과를 보이지 않았다. 따라서 화합물 C-1 및 C-2의 선택적인 iNOS 저해작용을 확인할 수 있었다.

bNOS 억제효과

시험물질	시료처치농도(μM)	bNOS 활성(시트룰린 pmole/mg 단백질/분)(평균 ± 표준편차)	억제율(%)
공시험액	-	7.08 ± 1.36	-
C-2	20	6.43 ± 1.65	-
C-2	100	6.88 ± 1.18	-
C-1	20	6.29 ± 1.73	-
C-1	100	6.15 ± 0.91	-
NMA	20	5.99 ± 0.20	15.40
NMA	100	2.73 ± 0.26	61.44

실험예 3 : COX-2 활성에 대한 억제효과

(1) 복강내 대식세포의 제조

복강내 대식세포는 상기 실험예 1에서와 같이 분리하였다.

(2) 시료의 처리

대식세포가 부착된 각 웰에 아스피린을 2시간 동안 처리하여 대식세포에 이미 존재하는 COX-1을 불활성화 시킨 뒤, PBS로 2회 세척하여 각 웰에 잔존하는 아스피린을 제거하였다. 각 웰에 새로운 RPMI-1640 배지와 LPS, 그리고 각 시료를 농도별로 처리한 뒤 CO₂인큐베이터에서 16시간 동안 배양한 다음, 각 웰의 배지를 취하여 RIA (radioimmuno assay) 방법을 이용하여 PEG₂생성량을 측정하였다.

(3) 시험결과

COX-2의 활성은 COX-2에 의한 반응생성물인 PEG₂생성량을 측정하여 평가하였다. LPS로 COX-2를 유도시키고 시료는 처치하지 않은 대조군에서 생성된 PGE₂의 양을 기준으로 하여 각 시료처치에 의한 COX-2 억제효과를 다음 식에 의하여 산정하였다.

실시예 6에서 제조한 화합물 C-1 및 C-2의 대식세포의 COX-2 억제효과를 표3에 나타내었다. 화합물 C-1 및 C-2는 모두 우수한 COX-2 활성을 저해 효과를 나타내었다.

COX-2 억제효과

시험물질	시료처치농도(μM)	억제율(%)
C-2 화합물	2	91
	1	85
	0.5	72
C-1 화합물	2	84
	1	71
	0.5	56

실험예 4 : COX-1 활성에 대한 억제효과

(1) 복강내 대식세포의 제조

복강내 대식세포는 상기 실험예 1 에서와 같이 분리하였다.

(2) 시료의 처리

대식세포가 부착된 각 웰을 완충액 (PBS)으로 세척한 뒤, 공시험액, 시험물질 및 대조약(아스피린)을 각각 정해진 농도로 가한 뒤 10분간 인큐베이터에서 배양하였다. 계속하여 각 웰에 아라키돈산 (arachidonic acid)을 10 M 농도로 가하여 다시 10분간 배양한 뒤, 생성된 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 생성량을 실험예 3에서와 같은 방법으로 측정하였다.

(3) 시험결과

표 4에 COX-1 활성억제시험 결과를 표시하였다. 표에서와 같이 대조액을 처리한 그룹에서 2210 pg의 PGE2 가 생성된 것에 반하여, 대표적인 COX 저해제인 아스피린을 100 M 처리한 군에서는 약 50% 정도로서 COX-1 활성이 크게 감소되었다. 그러나 COX-2에 대한 강력한 저해작용이 확인되었던 C-1 및 C-2 처리에 의해서는 COX-1의 활성에 유의한 차가 나타나지 않았다. 따라서 COX-2에 대하여 선택적인 저해활성을 갖음을 확인할 수 있었다.

COX-1 억제효과

시험물질	시료처치농도(μM)	PGE2 생성량 (pg)(평균 ± 표준편차)	억제율(%)
공시험액	-	2210 ± 156	-
C-2	20	2063 ± 276	-
C-2	100	1967 ± 238	-
C-1	20	2156 ± 174	-
C-1	100	2075 ± 319	-
아스피린	100	1059 ± 131	52.08

실험예 5 : 카라기난 유도 발바닥 부종 억제 작용

(1) 시험방법

체중이 150-200 g 인 웅성 스프라구-다우레이계 흰쥐의 발바닥에 1% 카라기난-식염수 (carrageenan-saline) 용액 0.1 ml를 주사하여 부종을 유발하였다. 카라기난에 의한 염증 유발 직후와 3시간 후에 플레티스모미터로 흰쥐의 발부피를 측정하여 부종율을 산출하였다. 약물은 카라기난 주사 1시간 전에 투여하였다. 저해 효능은 약물 대신에 부형제만을 투여한 대조군의 부종율과 비교하는 % 저해능으로 표현하였으며 다음 식을 이용하여 산정하였다.

위 식에서 V는 염증유발 직후와 3시간 후의 발용적의 변화율(%)을 표시한다.

(2) 시험결과

카라기난에 의해서 유발된 발부종에 대한 억제효과를 표 5에 나타내었다. 화합물 C-1 및 C-2은, 대조군으로 사용한 인도메타신과 거의 유사한 정도로서 매우 우수한 부종억제효과를 나타내었다.

카라기난 유도 발바닥 부종 억제 결과 (n = 5~7 마리)

시험물질	시료처치농도(㎍/ml)	억제율(%)
C-2 화합물	5	63
C-1 화합물	5	59
인도메타신	5	67

이하, 본 발명의 항염증제 조성물을 이용한 제제 제조예를 기술한다.

제제 제조예 1~3

본 발명의 항염증제 조성물을 이용한 경질캅셀제 제조예는 다음 표 6~8과 같다. 여기서 약효성분은 화합물 C-2를 적용한 것이다.

제제 제조예 1.

성분명	함량(mg/캅셀)	중량%
화합물 C-2	50	16.7
건조 전분	240	80.0
마그네슘 스테아레이트	10	3.3
계	300	100.0

제제 제조예 2.

성분명	함량(mg/캅셀)	중량%
화합물 C-2	20	6.7
건조 전분	270	90.0
마그네슘 스테아레이트	10	3.3
계	300	100.0

제제 제조예 3.

성분명	함량(mg/캅셀)	중량%
화합물 C-2	20	10.0
건조 전분	260	86.7
마그네슘 스테아레이트	10	3.3
계	300	100.0

제제 제조예 4~6

본 발명의 항염증제 조성물을 이용한 크림상 외용제의 제조예는 다음과 같다. 여기서 약효성분은 화합물 C-2를 적용한 것이다.

단위: 중량%
성분	제제 제조예 4	제제 제조예 5	제제 제조예 6
화합물 C-2	0.1	0.5	1.0
글리세린	3.0	3.0	3.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	9.0	9.0	9.0
스쿠알란	2.0	-	-
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	3.0	-
밀납	3.0	3.5	4.0
파라핀	2.0	1.5	1.5
바세린	3.0	3.5	3.0
세토스티아릴알코올	2.0	1.9	1.8
글리세릴모노스테아린산	2.0	2.5	2.0
모노스테아린산폴리에틸글리콜	2.2	2.3	2.5
세스키올레인산소르비탄	0.5	0.7	0.9
방부제	적량	적량	적량
향료	0.01	0.05	0.1
색소	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.0	100.0	100.0

제제 제조예 7~9

본 발명의 항염증제 조성물을 이용한 연고상 외용제의 제조예는 다음과 같다. 여기서 약효성분은 화합물 C-2를 적용한 것이다.

단위: 중량%
성분	제제 제조예 7	제제 제조예 8	제제 제조예 9
화합물 C-2	0.1	0.5	1.0
글리세린	3.0	3.0	3.0
부틸렌글리콜	3.0	2.0	1.0
프로필렌글리콜	3.0	1.0	2.0
유동파라핀	7.0	10.0	15.0
스쿠 알란	4.0	1.0	1.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	3.0	3.0	-
밀납	7.0	7.0	7.0
세토스테아릴알코올	1.1	1.1	1.1
바셀린	10.0	10.0	10.0
스테아린산	3.0	3.0	3.0
폴리솔베이트 80	5.0	5.0	5.0
모노스테아린산글리세린	4.0	4.0	4.0
모노스테아린산소르비탄	0.5	1.0	1.0
방부제	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.0	100.0	100.0

Claims

하기 식 1로 표시되는 베타-카르볼린유도체와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항염증제 조성물.

(식 1)

[상기 식에서 R은 수소 또는 탄소수 1~5의 알콕시기를 나타낸다.]
제 1항에 있어서, 베타-카르볼린유도체가 식 2 및 3으로 표시되는 4-메톡시-1-비닐-β-카르볼린 및 4,8-디메톡시-1-비닐-β-카르볼린인 항염증제 조성물.

(식 2)

(식 3)
제 1항에 있어서, 베타-카르볼린유도체가 고련피로부터 추출 정제하고 단리하여 얻은 것임을 특징으로 하는 항염증제 조성물.