KR20140088302A

KR20140088302A - 아단소니아 디지타타 추출물을 포함하는 항산화 활성 조성물

Info

Publication number: KR20140088302A
Application number: KR1020130000043A
Authority: KR
Inventors: 남궁우; 김희선; 박은희; 김예정
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-02
Filing date: 2013-01-02
Publication date: 2014-07-10

Abstract

본 발명은 Adansonia digitata L.의 추출물을 함유하는 항산화 및 항염증 활성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 Adansonia digitata L.의 물 또는 에탄올, 주정 출물이 항산화효과가 높으며 염증매개인자인 iNOS와 COX-2 발현을 억제하고, 이 효소에 의해 생성되는 NO와 proinflammatory cytokine의 생성을 억제하여 염증 관련 질병의 예방과 치료에 유용한 성분을 함유한 것을 특징으로 하는 Adansonia digitata L.의 추출물을 함유하는 항산화 및 항염증 활성 조성물을 제공한다.

Description

아단소니아 디지타타 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증 활성 조성물{Composition Comprising Extract of Adansonia digitata Having Anti-oxidantactivity and Anti-inflammatory Acitivity}

본 발명은 Adansonia digitata L.의 추출물을 함유하는 항산화 및 항염증 활성 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 생체에 물리적, 화학적 작용이나 세균감염 등의 원인에 대한 생체의 방어기전으로 외부 물질에 대한 제거와 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonine, bradykinin, prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), leukotriene과 같은 혈관활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다.

단구세포는 세균감염등으로 인해 활성화 되어 식세포작용이 뛰어난 대식세포로 변화되며, 대식세포는 NO, 프로스타글란딘 E2 및 전구염증성 cytokine 등을 분비함으로써 염증을 유발하고, 염증, 면역반응 모두에서 중요한 조절세포로 작용하는데, 이렇게 작용하기 위해서는 반드시 활성화과정을 거쳐야 한다. 그람 음성균의 세포벽 구성성분 중의 하나이며 내독소로 잘 알려진 LPS (lipopolysaccharide)는 대식 세포의 활성화에 관여하는 가장 잘 알려진 외부인자이다. 특히 RAW 264.7 세포와 같은 단구세포나 대식세포에서는 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha), IL-6 (interleukin-6), IL-1β (interleukin-1 beta)와 같은 전구염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)을 분비하여 염증부위에서 증가된다.

LPS가 대식세포를 자극하게 되면 iNOS (inducible nitric oxide synthase)라는 효소에 의해 L-arginine이 L-citrulline으로 변하는 과정에서 nitric oxide (NO)가 생성됨으로써 대식세포로부터 NO가 생성된다.

포유동물에서 NO는 세 가지 종류의 NO 합성효소 (NOS, nitric oxide synthase), 즉 nNOS (neuronal NOS), eNOS (endothelial NOS) 및 iNOS (inducible NOS)에 의해 합성된다. 이 중에서 nNOS와 eNOS에 의해 생성되는 NO는 정상적인 생체기능을 위해 생성되며, 조직내에서의 농도는 일정수준으로 낮게 유지된다. 그러나 iNOS에 의해 생성된 NO는 과도하게 생성되어 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직 손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.

염증인자인 프로스타글란딘 E2 (PGE2)는 세포막의 구성성분인 인지질이 LPS에 의해 자극을 받아 포스포리파제 A2 (phospholipase A2)라는 효소에 의해 유리된 아라키돈산이 COXs (cyclooxygenaes)라고 불리우는 효소의 촉매작용을 받아 형성되어 염증반응을 유도하게 된다. COX는 COX-1과 COX-2로 분류되는데, COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적이 생체기능에 작용하며 COX-2는 염증성 매개물질인 PGE2를 합성한다. PGE2는 염증반응(통증, 발열 등), 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

선택성 COX-2 억제제 (selective COX-2 inhibitors)를 포함하는 모든 비스테로이드성 항 염증제 (non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)는 항염증, 해열 및 진통 효과를 나타낸다. 하지만 이러한 약들의 장기간 복용은 심각한 부작용을 초래한다. 예를 들어, 위장관계의 소화성 궤양출혈로 인한 이차적 빈혈 초래, 혈소판 기능 억제, 분만 유도 억제, 신장에 대한 부작용, 간장 손상, 과민 반응 등이 있다. 이러한 약물의 부작용을 극복하기 위하여 보다 안전한 소재로 식물과 같은 천연에서 유래한 제품은 선호도가 높으며, 이와 관련하여 천연물에서 그 항염증 소재를 찾아 활용하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

Adansonia digitata는 아프리카 지역에서 서식하는 식물로서 식용이 가능한 식물이나 연구는 많이 되어있지 않았다. 본 식물에 대한 연구로는 일부 항산화 효능이 보고되어 있으나 항염증 효과에 대한 연구는 보고된 바 없다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, Adansonia digitata 로부터 분리된 알콜, 주정 또는 물 추출물이 염증인자 발현을 억제 효과를 규명하여, Adansonia digitata 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증 활성 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Adansonia digitata 의 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증 활성 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 Adansonia digitata 의 추출물은 에탄올, 주정, 물 중 어느 하나 이상으로 추출한 것으로서, 상기 추출물 중 핵산, 틸아세테이트 분획 또는 상기 분획의 부분획을 포함할 수 있다.

본 발명의 Adansonia digitata 로부터 분리된 알콜, 주정 또는 H₂O 추출물은 항산화 효과가 높았으며 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO와 proinflammatory cytokines 생성을 저해할 뿐만 아니라, iNOS와 COX-2 효소단백질의 발현을 효과적으로 저해시킴으로써 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 Adansonia digitata 의 알콜, 주정 추출물의 직접적인 항산화 효과를 ORAC assay(A) 와 DPPH assay (B)로 확인한 것이다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 iNOS의 단백질 발현과 NO형성억제에 대한 Adansonia digitata 추출물(AD)의 효과를 Western blot 결과(A)와 NO 형성(B)를 보여주는 도면이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 Adansonia digitata 의 알콜, 주정 추출물(AD)에 대한 독성검사 (MTT assay)를 실험한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Adansonia digitata 의 알콜, 주정 추출물(AD)에 의하여 염증성 사이토카인들(IL-1b, IL-6, TNF-α)의 생성 여부를 확인한 것이다.
도 5A는 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 시간별 NF-kB의 translocation에 대한 효과를 확인한 것이다. 도 5B는 Adansonia digitata 분획물(AD)을 2시간 전-처리한 후 LPS로 30분간 유도된 RAW 264.7 세포에서 NF-kB의 활성화에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Adansonia digitata 분획물(AD)을 2시간 전-처리한 후 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 IkB의 활성화에 영향을 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 Adansonia digitata로부터 물 또는 유기용매 특히 알콜, 주정으로 추출한 것을 포함한다. 본 발명의 Adansonia digitata 추출물은 Adansonia digitata를 음지에서 자연건조 후 파쇄하여 분말화한 후, 다시 건조 중량의 약 3 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 10배에 달하는 부피의 물, 주정과 같은 알코올 용매로, 바람직하게는 물 또는 주정으로 실온 또는 20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 70℃의 추출 온도에서 약 0.5 시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 가온 또는 환류 냉각 추출 혹은 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 연속 추출하여 수득한 후, 감압여과하고 여액을 진공회전농축기로 20내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 70℃에서 감압농축하여 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 것으로서 공시재료로 수득할 수 있다.

본 발명은 Adansonia digitata 추출물 또는 그로부터 분획된 활성성분의 염증반응에 대한 항염증 효능의 엑스로, 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈. 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로즈 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또, 단순한 상기 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용하여도 좋다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비 경구 투여를 위한 제제에는 멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 그로부터 분리한 활성성분의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 항염증 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 200 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 화합물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 하기에 제시된 실시예는 예시적인 것으로 이 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 제시된 실시예에 대한 다양한 변형 및 수정 발명을 만들 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 수정 발명에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.

[ 실시예 1] Adansonia digitata 알콜 추출물( AD )의 제조

본 발명에 사용한 Adansonia digitata는 아프리카 에티오피아에서 건조 후 분말로 가져온 식물을 사용하였다. Adansonia digitata는 음지에서 자연 건조한 후 파쇄하여 얻은 분말 100g과 에탄올 1 L를 넣고 냉침하여 일정 간격으로 3회 반복하여 추출한 후 여지 (와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 40℃에서 에탄올을 제거한 후 추출된 잔사로서 AD 12-20 g을 수득하였다(표 1). 이 중 10 mg을 취하여 항염증 활성검색을 위한 시료로 사용하였다. 실험 예에서 iNOS와 COX-2의 억제 (IC₅₀, 50% 억제농도)에 대한 AD 효과는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2에 대한 억제 효과를 나타낸다 (표 1).

구 분	효 과
주정 수율	12.4 (%)
폴리페놀함량 (탄닌산과 동량)	990.5 (μg)
iNOS activity (IC₅₀)*	28.6 (/mL)
COX2 (IC₅₀)	37.4 (/mL)
MTT assay (CC₅₀)**	>100 (/mL)

*IC₅₀: 50% 억제농도 **CC₅₀: 50% 독성농도

염증상태에서 활성화된 iNOS에 의해 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다. COX-2에 의한 프로스타글란딘의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다. RAW 264.7에 LPS를 처리하여 생성되는 NO와 proinfammatory cytokine에 대한 AD 효과를 살펴본 결과 강한 억제 효과를 보였다(도 2, 4).

[ 실시예 2] Adansonia digitata 의 항산화 효과

항-염증 효능에 영향을 주는 항산화 효능을 측정하기 위하여 1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl (DPPH)와 산소 급진적-흡광도 용량 (ORAC) assay의 두가지 방법을 사용하여 항산화 효능을 측정하여 평가하였다. ORAC assay 분석에서 Adansonia digitata 주정 추출물 (AD)은 peroxyl 래디칼 제거에 있어서 비타민 C보다 10.2 배 정도 더 강력했다. DPPH 분석에서 AD는 강력한 ROS 소거 효과를 보여 주었다. ORAC assay분석은 60 μM 2,2'-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulponic acid) (APPH) 60 mM 및 50 nM의 fluorescein을 이용하여 peroxyl radical 생성과 형광 프로브로 각각 사용되었다. 모든 시약은 75 mM 인산 완충액 (pH7.4)를 준비하여 사용하였다. 96-well plate에 fluorescein용액 190 μL(66 nM)과 30 μL의 시료 또는 양성 대조물질을 넣은 후 맨 마지막으로 30 μL의 APPH (500 mM)를 빠르게 멀티채널 피펫을 사용하여 혼합하였다. 감소되는 형광은 5시간 동안 매 5분마다 37도 온도에서 측정되었다. 분석은 Tecan F200 microplate 리더를 사용하여 각각 485과 530 nm의 입사, 방출 파장으로 하였다. 결과적으로 AD는 비타민 C보다 10.2 배 정도 더 높은 항산화 효과를 나타냈다 (표 1).

[ 실험예 3] NO 생성에 대한 Adansonia digitata 의 알콜 , 주정추출물 ( AD )의 영향

RAW 264.7 세포 (10×10⁴ cells/well)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 접종하고, 12시간 후 AD와 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylenediamine in 2.5% phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 24 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO2)를 serial dilution(연속 희석)하여 얻었고, 그 결과는 하기 도 2에 나타내었다. 도 2에서 볼 수 있듯이, Adansonia digitata의 알콜, 주정추출물(AD)은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 효과적으로 NO의 생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

NO는 산화질소 합성효소 (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 합성된다. 병리적인 조건 하에서 NO의 상당한 증가는 염증성 과정을 자극하고 다른 염증 매개체와 함께 상승효과를 나타내는 iNOS에 의해 합성된다. 또한, iNOS는 염증성 사이토카인과 박테리아성 endotoxin에 노출되었을 때 강하게 자극된다. 화합물들은 iNOS에 의한 NO 생성을 감소시킬 수 있고 항-염증제로서 매력이 있을 수도 있다. 이런 이유로 iNOS 활성에 대한 폴리페놀의 효과는 항염증제로 개발하기 위해서 많이 연구되고 있다. 도 2A는 LPS로 유도된 세포에서 NOS 효소에 대한 AD의 효과를 보여준다. 이 추출물은 LPS로 유도된 NOS 생성량을 농도 의존적으로 감소시켰다. 따라서 AD는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현의 억제효과 또는 iNOS발현 저해 효과를 가지고 있다는 것을 알 수 있다.

[ 실시예 4- 실험예 1] Adansonia digitata 의 알콜 , 주정추출물( AD )의 세포독성 효과

상기 실시예 1에서 얻은 AD로 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/ml)을 처리하여 적절한 농도내에서 항염증 활성을 확인하기 위하여 세포독성을 측정하였다. RAW 264.7 세포 (10×10⁴ cells/well)를 DMEM 배지에 시험 약물(AD)을 처리하여 24시간 배양하였다. 새로운 배지로 24 well plate에 배지 500 ㎕와 MTT 용액 5 ㎕를 넣고 4시간 더 반응시켰다. 배지를 제거한 후 200㎕ DMSO로 formazan을 녹여 microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타나듯이, RAW 264.7 세포에 대한 AD의 세포 독성은 200 μg/ml의 농도까지 유의성 있게 나타나지 않았다.

[ 실험예 5] Proinflammatory cytokine production 에 대한 Adansonia digitata 추출물( AD )의 영향

실험 3에 예시한 바와 같이 AD는 염증매개인자인 NO의 생성을 농도 의존적으로 저해하였다. 따라서 pro-inflammatory cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성 억제 효과를 AD를 대상으로 분석하였다. 세포배양액 내의 IL-1β, IL-6, TNF-α 농도 측정은 BD Biosciences (San Jose, USA)사의 ELISA kit를 사용하였다. 세포에 AD와 1 μg/ml의 LPS를 함께 처리하였다. 24시간 후 세포 배양액을 원심분리하여 상층액에서 IL-1β, IL-6, TNF-α을 측정하였다. Microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과는 도 4에 나타내었다.

IL-1β, IL-6, TNF-α는 proinflammatory cytokine 들로서 염증반응을 유발시켜 유해한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 도 4에 나타난 바와 같이 AD에 의하여 염증성 사이토카인의 일종인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 농도에 의존적으로 감소시킴을 알 수 있었다.

[ 실험예 6] Adansonia digitata 주정 추출물( AD )의 NF -κB에 미치는 영향

염증 관련 인자인 iNOS와 COX-2의 전사인자인 NF-κB는 일반적인 상태에서는 inhibitory κB-alpha (IκB-α)와 함께 결합하여 세포질에 존재한다. 하지만 LPS와 같은 외부자극에 의해 자극을 받으면 IκB-α가 분해되어 유리형의 NF-κB는 핵으로 이동하여 cytokine, cytokine receptor, cell adhesion molecule, growth factor 등의 발현에 관여하는 유전자의 promoter나 enhancer의 κB site에 결합함으로써 전사를 유도한다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 AD에 의한 NF-κB의 translocation을 immunoblot하여 Confocal 현미경으로 관찰하였다. 확인한 결과 LPS에 의해 핵으로 이동한 NF-κB가 AD를 처리함으로써 핵으로의 이동이 억제된다는 것을 알 수 있었다(도 5).

[ 실험예 7] Adansonia digitata 주정 추출물( AD )의 IκB에 미치는 영향

LPS에 자극을 받으면 IκB-α가 분해되어 유리형의 NF-κB는 핵으로 이동한다. 그러나 AD를 처리한 결과로 인해 IκB-α의 분해가 억제됨으로서 NF-κB의 핵으로의 이동을 감소시키는 것으로 나타났다 (도 6).

Claims

Adansonia digitata 의 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증 활성 조성물.
제1항에 있어서,
상기 Adansonia digitata 의 추출물은 에탄올, 주정, 물 중 어느 하나 이상으로 추출한 것으로서, 상기 추출물 중 핵산 또는 에틸아세테이트 분획 또는 상기 분획의 부분획을 포함하는 것을 특징으로 하는 Adansonia digitata 의 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증 활성 조성물.