JP6700029B2 - 糖取り込み促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、カテキン代謝物を有効成分とする筋肉細胞への糖取り込み促進剤、糖取り込みを促進するための医薬品および糖取り込みを促進するためのサプリメントに関する。

糖尿病は、国民の５人に１人以上がその患者か予備軍と言われる疾患であり、血糖を降下させるホルモンであるインスリンの作用不足によって起こる慢性的な高血糖を特徴とする疾患である。糖尿病には、膵β細胞が破壊されてインスリンが欠乏することによって発症する１型糖尿病と、インスリン分泌の低下と組織におけるインスリン感受性の低下によって発症する２型糖尿病がある。糖尿病と診断される人の９０〜９５％が２型糖尿病と言われており、２型糖尿病は体質以外にも肥満、運動不足、ストレス、飲酒、喫煙などの生活習慣の乱れや、食生活の欧米化による高カロリー食の摂取も発症の要因と考えられている。

通常、食後に血糖値が上昇すると、ただちに膵臓からインスリンの分泌が促進され、インスリンの作用により、血中のグルコースが筋肉、脂肪、肝臓組織等に取り込まれ、速やかに血糖値は下がる。しかしながら、食べ過ぎや運動不足によりエネルギーの過剰摂取が続くと、脂肪細胞を含む肝臓や骨格筋に中性脂肪が蓄積し、インスリン刺激に対して抵抗性を示す状態となる。このようなインスリン抵抗性を示す場合、各組織（細胞）に糖がうまく取り込まれず、糖尿病発症リスクが高くなる。

インスリンによる血糖値のコントロールには、各組織（細胞）へのグルコースの取り込みが深く関与していると考えられている。詳細には、インスリンは、膵臓から分泌された後、細胞膜表面にあるインスリン受容体に結合する。それがきっかけとなって、細胞内での情報伝達分子が順々に活性化され、最終的に血中グルコースは細胞内の輸送担体ＧＬＵＴ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）に伝達され、糖取り込みが生じる。現在ＧＬＵＴには、数種類のアイソフォームが報告されているが、特にＧＬＵＴ４は骨格筋、心筋、脂肪組織に特異的に発現し、インスリンに応答して細胞内から細胞膜上に移行して（トランスロケーション）グルコースの取り込みを担うことから、食後血糖値のコントロールに大きく関わっていることが知られている。

このような糖尿病発症のメカニズムから、細胞への糖取り込み作用を指標とした糖尿病治療薬のスクリーニングも行われており、筋肉細胞への糖の取り込み促進作用を有する因子は、糖尿病を改善・治療するために有効であると考えられている。

植物ポリフェノールの一種である茶由来のカテキン類には、抗酸化作用、抗菌、抗ウイルス、抗う蝕、抗突然変異、血小板凝集抑制、血中コレステロール低下、血糖上昇抑制、抗アレルギー、消臭作用など非常に広範な生理活性がある。カテキン類の糖取り込み促進作用についても、次のような報告が為されている。

特許文献１には、カテキン類からなるＧＬＵＴ４発現促進剤及び糖尿病予防・改善用容器詰飲料が開示され、特許文献２にはカテキンガレート、ガレートエステルを備えたカテキン、茶抽出物のいずれかを有効成分とする脂肪細胞におけるグルコース取込阻害剤、インスリン刺激応答性グルコース取込阻害剤、ＧＬＵＴ４トランスロケーション抑制剤及び脂肪軽減飲食物が開示されている。

カテキン類の優れた生理機能が数多く報告される一方で、カテキン類の生体内動態に関する研究も広く行われている。カテキン類は生体内への吸収量が非常に低く、経口摂取した大部分のカテキン類は腸内において腸内微生物（腸内細菌）の作用により分解され、代謝物として生体内へ吸収されることが示されている。腸内微生物によるカテキン類の代謝に関する報告は多く（非特許文献１−４参照）、主な代謝物として５−フェニル−γ−バレロラクトンや５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸などが挙げられる。また、５−フェニル吉草酸、３−フェニルプロピオン酸、フェニル酢酸、安息香酸など様々な代謝物が尿中から見出されている（非特許文献５−７参照）。

カテキン代謝物の生体内での機能性に関する知見としては、上記に示した５−フェニル−γ−バレロラクトン及び５−フェニル−４−ヒドロキシ吉草酸の血圧上昇抑制作用、５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの抗炎症作用、５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの食道扁平上皮がん細胞、ヒト結腸腺がん細胞に対する増殖抑制効果及び抗炎症作用などが報告されている（特許文献３、非特許文献８、９参照）。このように、カテキン代謝物にはいくつかの生理機能が知られているが、糖取り込み促進作用についての効果は知られていない。

特開２００３−８１８２５号公報 特開２００３−９５９４２号公報 特開２０１２−１４４５３２号公報

Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ４９， ４１０２−４１１２， ２００１ Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １３， １７７−１８４， ２０００ Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ５１， ５５６１−５５６６， ２００３ Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ５１， ６８９３−６８９８， ２００３ Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ５８， １３１３−１３２１， ２０１０ Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ５８， １２９６−１３０４， ２０１０ Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ４５， ８８８−８９３， １９９７ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ５３， ３０５−３１３， ２０１２ Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １５， ８７３−８７６， ２００５

本発明の課題は、カテキン代謝物を有効成分とする糖取り込み促進剤、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）トランスロケーション活性化剤、又は糖を取り込み促進するための医薬品を提供することにある。

本発明者らは、茶カテキン類の腸内細菌代謝物について、Ｌ６筋管細胞への２−デオキシグルコース（２ＤＧ）の細胞内取り込み量を、酵素法により測定し、糖取り込み促進作用を検討した。その結果、複数のカテキン代謝物に糖取り込み促進作用があることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の通りである。

［１］以下の式（Ｉ）〜（ＶＩ）：
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
（式中、Ｒ_３は水酸基又は水素を表す。）
（式中、Ｒ_４は水酸基又は水素を表す。）
（式中、Ｒ_５、Ｒ_６はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
（式中、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
で表される化合物群から選ばれる１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有する、筋肉細胞への糖取り込み促進剤、
［２］ 前記糖が、グルコースである、［１］に記載の糖取り込み促進剤、
［３］ 以下の式（Ｉ）〜（ＶＩ）：
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
（式中、Ｒ_３は水酸基又は水素を表す。）
（式中、Ｒ_４は水酸基又は水素を表す。）
（式中、Ｒ_５、Ｒ_６はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
（式中、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
で表される化合物群から選ばれる１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有する、筋肉細胞へのグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）トランスロケーション活性化剤、
［４］ 以下の式（Ｉｃ）で表される５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを有効成分として含有する、［３］に記載の筋肉細胞へのグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤、
（式中、波線は立体構造がＲ配置又はＳ配置を表す）
［５］ ［１］又は［２］に記載の糖取り込み促進剤、及び［３］又は［４］に記載のグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤の少なくとも一種を有効成分として含有する医薬品、
［６］ ［１］又は［２］に記載の糖取り込み促進剤、及び［３］又は［４］に記載のグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤の少なくとも一種を有効成分として含有するサプリメント、である。

本発明の化合物は茶カテキン類を経口摂取したときに、茶カテキンが腸内細菌によって分解されて生成した化合物である。長年にわたる茶の飲用によって茶の安全性は経験的に確認されており、茶飲用後の生体内で生成している上記化合物（代謝物）も、茶と同様にその安全性は経験的に確認されていると言える。本発明は茶カテキン類が腸内細菌によって分解された化合物を有効成分とする新規な糖取り込み促進剤、又は糖を取り込み促進するための医薬品を提供するものである。
本発明によれば優れた糖取り込み促進作用により、高血糖を改善し、糖尿病の予防もしくは改善する機能性食品や医薬品を提供することが出来る。さらに本発明によればＧＬＵＴ４を活性化し、ＧＬＵＴ４のトランスロケーションを誘導するＧＬＵＴ４活性化剤を提供することが出来る。

図１は、実施例２の試験の測定原理を表す図である。 図２Ａは、ラット骨格筋由来Ｌ６筋管細胞に対して、エピガロカテキン代謝物を処理した場合の、２−デオキシグルコースの細胞内取り込み量を酵素法により測定した結果（実施例２の結果）を示す図である。グラフ（表１も参考）に示す化合物の活性の結果を示す。 図２Ｂは、ラット骨格筋由来Ｌ６筋管細胞に対して、エピカテキン代謝物を処理した場合の、２−デオキシグルコースの細胞内取り込み量を酵素法により測定した結果（実施例２の結果）を示す図である。グラフ（表１も参考）に示す化合物の活性の結果を示す。 図２Ｃは、ラット骨格筋由来Ｌ６筋管細胞に対して、カテキン代謝物を処理した場合の、２−デオキシグルコースの細胞内取り込み量を酵素法により測定した結果（実施例２の結果）を示す図である。グラフ（表１も参考）に示す化合物の活性の結果を示す。 図３は、実施例３で行ったＧＬＵＴ４及びＧＬＵＴ４細胞移行に関わるシグナル伝達系の発現量の結果を示す図である。 図４は、ＧＬＵＴ４トランスロケーションに関わるシグナル伝達経路を示す図である。

本発明において、糖は特に限定されるものではないが、グルコースであることが好ましい。本発明の糖取り込み促進剤として有効な化合物は、式（Ｉ）〜（ＶＩ）で示される化合物である。
（式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
（式中、Ｒ_３は水酸基又は水素を表す。）
（式中、Ｒ_４は水酸基又は水素を表す。）
（式中、Ｒ_５、Ｒ_６はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
（式中、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）

また、上記化合物は、筋肉細胞におけるグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤として有用であり、中でも、式（Ｉｃ）で示される化合物は、特に活性がある。
（波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）

上記式（Ｉ）乃至（Ｖ）に該当する化合物は、次の文献に示す公知の有機化学合成法（ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，９，１５１２−１５２０, ２０１０）などにより得ることができ、例えば、５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの場合は３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ）ブロモベンゼンを基質としてスワーン酸化、ウィッティヒ反応を含む７つの反応を用いることで調製することが可能である。

また、式（Ｉ）乃至（ＶＩ）の化合物は、上記非特許文献７−９に示す腸内微生物を用いた微生物変換法により製造することも可能である。微生物変換法によりカテキン代謝物である式（Ｉ）乃至（ＶＩ）の化合物を製造する場合、ラットやヒトの腸内微生物を含む糞や盲腸内容物を培養して腸内微生物を増殖させた後、培養菌体を緩衝液、生理食塩水、水などに懸濁させ、懸濁液に基質となるカテキン類を加えて嫌気条件下でインキュベーションする方法を挙げることができる。また、他の方法としては、「Ａｒｃｈｉｖｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.， １９６， ６８１−６９５， ２０１４」に記載の、カテキン類を変換する能力を持つ菌株を数種類組み合わせてインキュベーション処理を行ってもよい。

式（Ｉ）乃至（ＶＩ）で表される化合物の具体例としては、下記表１に記載の化合物が挙げられるが、本発明の範囲は、それらに限定されず、式（Ｉ）乃至（ＶＩ）で化合物の範囲内であれば、同様の効果が期待できる。

これらの方法において、基質として加えるカテキン類としては、非ガレート型カテキン類である（−）−エピカテキン、（＋）−カテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−ガロカテキンや、ガレート型カテキン類である（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピガロカテキンガレートを挙げることができ、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−カテキンを好適に挙げることができる。

好適な基質として挙げられた（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−カテキンは、主に緑茶に含まれており、茶の葉、茎、木部、樹皮、根、実、種子やこれらの混合物もしくはそれらの粉砕物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒あるいはこれらの混合物等により抽出することにより得られる。茶生葉あるいはその乾燥物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒、これらの混合物等を用いて抽出することにより得られ、抽出物自体の他に、その精製物等があり、形態的には液体、固体（粉末を含む）の別を問わない。

本発明の糖取り込み促進剤又はグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）トランスロケーション活性化剤を人体に投与する場合は、人体に悪影響がないように投与する。

式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物は、これらのうち少なくとも一種を含有する医薬品とすることもできる。また、式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物は、これらのうち少なくとも一種を含有する医薬部外品とすることもできる。人体に取り込む際には、液状、粉末状、顆粒状にして取り込むことができる。

具体的には、薬学的に許容される担体を添加して製剤とすることができ、投与目的や投与経路等に応じて、錠剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、顆粒剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、クリーム剤等にすることができる。

また、当該医薬品に、一般に製剤に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等の添加物を含有させることができる。

結合剤の好適な例としてはグアガム、アラビアゴム末などが挙げられる。

賦形剤の好適な例としては、デンプン、トレハロース、デキストリンなどが挙げられる。

滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤の好適な例としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチなどが挙げられる。

安定剤の好適な例としては、油脂、プロピレングリコール、シクロデキストリンなどが挙げられる。

乳化剤の好適な例としては、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。

緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液が挙げられる。

式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物の少なくとも一種は、飲食品に含有させることもでき、それを飲食した場合に、人体に悪影響がないように含有する。

さらに、式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物の少なくとも一種を飲食品に含ませることによってその食品を、糖取り込み促進を目的とした機能性食品にすることができる。

対象となる食品の種類は、ジュース、清涼飲料水、茶などの飲料、パンや餅などの加工食品、あめなどの菓子類、カップラーメンなどのインスタント食品、バター、サラダ油などの油脂類、ドレッシング、マヨネーズ、ソース、醤油やみりんなどの調味料、ふりかけ、みそなどの広範な飲食品に含ませることができる。また、サプリメントとして提供することができる。

以下に、化合物（Ｉ）乃至（ＶＩ）の化合物の製造例、試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

カテキン代謝物の製造例
カテキン代謝物として、上記式（Ｉ）〜（ＶＩ）で表される化合物を以下製造例１から１８の方法で製造した。表１にそれぞれの化合物の化合物名を示す。

［実施例１］
（化合物の製造例）
製造例１：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とフラボニフラクター・プラウティ（クロストリジウム・オルビスシンデンス）ＡＴＣＣ４９５３１株および大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｂ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株（理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室より購入）を３０ｍＬのＧＡＭブイヨン（（組成（１Ｌ中）：ペプトン１０ｇ、ダイズペプトン３ｇ、プロテオーゼペプトン１０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、溶性デンプン５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１、日水製薬株式会社製）に植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株（ＭＥ９０１２：ＮＢＲＰナショナルバイオリソースプロジェクトより購入）及びフラボニフラクター・プラウティ（クロストリジウム・オルビスシンデンス）ＡＴＣＣ４９５３１株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）は１０ｍＬのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（＋）−カテキン２５０ｍｇを含む３００ｍＬのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。無菌的に培養液１ｍＬをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ（高速液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＱＤｅｃａＸＰｐｌｕｓサーモフィッシャーサイエンティフィック社製）分析することで（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。その後、さらに上記ＡＴＣＣ４９５３１株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行い、（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールを（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンおよび（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸に変換を行った後、無菌的に培養液１ｍＬをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンおよび（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸の生成を確認した。ＬＣ／ＭＳ分析条件を以下に記載する。

機器：高速液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＱＤｅｃａＸＰｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧ（２．０ｉ．ｄ．×１００．０ｍｍ、５μｍ、（（株）資生堂社製）、流速：０．２ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；水：アセトニトリル：酢酸（１００：２．５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；水：アセトニトリル：メタノール：酢酸（３５：２．５：６５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）、グラジエント；０分：Ａ１００％ Ｂ０％、３分：Ａ１００％ Ｂ０％、２５分：Ａ０％ Ｂ１００％、２５．１分：Ａ１００％ Ｂ０％、３３分：Ａ１００％ Ｂ０％、検出：ＰＤＡ及び質量分析計、インターフェース：ＥＳＩ、ポラリティ：ネガティブとした。

（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの生成を確認した培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。上清に塩酸を加えｐＨ２．０に調整した後、３７℃で約一晩インキュベーションし、培養液中に含まれる５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸を（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンに変換した。培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。２００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した後、有機溶媒層をエバポレーターで減圧濃縮乾固した。約２０ｍＬの５％メタノール水溶液に溶解し、分取ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。

カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（（株）資生堂社製）、流速１５ｍＬ／分、溶媒Ａ；アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：５：９０：０．３ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：６５：３０：０．５ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ８０％ Ｂ２０％、５分：Ａ８０％ Ｂ２０％、２０分：Ａ１０％ Ｂ９０％、２５分：Ａ１０％ Ｂ９０％、２６分：Ａ８０％ Ｂ２０％、３５分：Ａ８０％ Ｂ２０％、検出：ＵＶ２７０ｎｍとした。

分取した画分を、上記のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析し、目的とする（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンが含まれる画分を確認した。エバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に含まれる酸を除去するために、５ｍＬの純水を加えて減圧下濃縮乾固する操作を３回繰り返し、溶液中の酸を完全除去した後、凍結乾燥に供した。その結果、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｂ）を１２０ｍｇ得た。

製造例２：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株、フラボニフラクター・プラウティ（ユウバクテリウム・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株、及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｃ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びフラボニフラクター・プラウティ（ユウバクテリウム・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株は１０ｍＬのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピガロカテキン２９０ｍｇを含む３００ｍＬのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍＬをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１記載の方法と同様にＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。

次に、上記のフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ２９８６３株の前培養液を、（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した前述の培養液に加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行った。その後、培養液１ｍＬをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）に供し、得られた上清を製造例１記載の方法と同様のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）―５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンおよび（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸の生成を確認した。

上記の（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの生成を確認した培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。得られた上清に塩酸を加えてｐＨ２．０に調整し、３７℃で約一晩インキュベートし、培養液中に含まれる（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸を（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンに変換した。２００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル層をエバポレーターにより濃縮後、得られた濃縮液を適量の５％メタノール水溶液に溶解し、製造例1記載の分取ＨＰＬＣ方法に準じて精製を行った。

分取後に分画した画分を、製造例1記載のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析し、目的とする（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンが含まれる画分を確認した。その後、分取液をエバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に５ｍＬの純水を加えて再度濃縮乾固する操作を３回繰り返して画分中の酸を完全除去した。乾固物に少量の純水を加えて溶解後、凍結乾燥し、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｃ）１４５.０ｍｇを得た。

製造例３：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とフラボニフラクター・プラウティ（クロストリジウム・オルビスシンデンス）ＡＴＣＣ４９５３１株の共存下での（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｄ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とフラボニフラクター・プラウティ（クロストリジウム・オルビスシンデンス）ＡＴＣＣ４９５３１株をそれぞれ３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。（−）−エピガロカテキン２２１．４ｍｇを含む同培地１００ｍＬに上記２菌株の培養液を加え、３７℃で３日間嫌気培養を行った。高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分間、１０℃）により菌体を除去した後、得られた上清にリン酸を添加してｐＨ１．５に調整した。この溶液に１００ｍＬの酢酸エチル：ブタノール（１：１、ｖ／ｖ）を加えてよく混合した。遠心分離機（５０００×ｇ、５分間）で２層に分けた後、有機溶媒層を回収した。この抽出操作を３回繰り返し行った。合一した有機溶媒層（３００ｍＬ）に等量（３００ｍＬ）の０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（０．１％アスコルビン酸ナトリウムを含む）を加えよく混合した後、遠心分離機（５０００×ｇ、５分間）で有機溶媒層と水層に分けた。有機溶媒層はエバポレーターで濃縮乾固後に約２０ｍｌの５％メタノール水溶液に溶解し、製造例１記載の方法と同条件で分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣで分画後に製造例1記載のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析し、目的とする（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｄ）３１ｍｇを得た。

製造例４：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とフラボニフラクター・プラウティ（クロストリジウム・オルビスシンデンス）ＡＴＣＣ４９５３１株の共存下での（−）−エピガロカテキンからの（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶｄ）の製造方法

製造例３記載の０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（０．１％アスコルビン酸ナトリウムを含む）に酸を加えてｐＨを７．０に調整後、約３０ｍＬになるまで減圧下で濃縮した。この濃縮液に５倍量のエタノールを添加し、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）で不溶物を除去した。得られた上清をさらに減圧下で約１ｍＬになるまで濃縮し、２Ｍ塩酸でｐＨ２.０−３．０に調整した。この溶液を分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。

カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（(株)資生堂社製）、流速９．５ｍＬ／分、温度４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：メタノール：水（５：５：９０ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：メタノール：水（５：６０：３５ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；Ａ８０％ Ｂ２０％のアイソクラティック、検出：ＵＶ２３０ｎｍとした。

分取後、（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸を含む画分はさらに陽イオン交換処理を行った。（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸を含む画分（５０ｍＬ）に、１／２量の純水（２５ｍＬ）を添加後、減圧下で濃縮し、溶液中の溶媒を除去して水溶液にした。この水溶液を純水で平衡化した陽イオン交換樹脂（ダイアイオンＳＫ１Ｂ ナトリウム型、１０×６５ｍｍ）に通液し、さらに純水で溶出した。得られた溶液を減圧濃縮し凍結乾燥した結果、（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶｄ）のナトリウム塩６５ｍｇを得た。

製造例５：有機合成方法による５−（３−ヒドロキシフェニル）吉草酸（化合物ＩＩａ）の製造方法

［３−（エトキシカルボニル）プロピル］−トリフェニルホスホニウムブロミド３．４ｇ（７．４ｍｍｏｌ）にテトラヒドロフランを２０ｍＬ加えて脱気し、氷冷下にて２０分間攪拌した。次に、１．９Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのテトラヒドロフラン溶液を５．０ｍＬ加えてアルゴン置換し、氷冷下にて１時間攪拌した。さらに、１．１ｇ（５．１８ｍｍｏｌ）のメタ−ベンジルオキシベンズアルデヒドを１０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、反応液に加えて室温にて３時間攪拌した。続いて、５％クエン酸水溶液を１０ｍＬ加えて反応停止させ、ジエチルエーテル５０ｍＬで３回抽出し、ジエチルエーテル層を水５０ｍＬ、飽和重曹水５０ｍＬ、飽和食塩水５０ｍＬの順で洗浄した。ジエチルエーテル層に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、硫酸ナトリウムをろ別し、得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮した。濃縮液にヘキサン／ジエチルエーテル＝１５０／５０（容量比、以下「ｖ／ｖ」と表記する。）混合溶液を加えて一晩放置し、生成した不溶物をろ過することにより得られたろ液を再度減圧濃縮し、濃縮残渣にヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０（ｖ／ｖ）混合溶液を加えてシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。最後に、分画液をエバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸エチルを１．０２ｇ（３．２８ｍｍｏｌ、収率６３．３％）得た。

得られた５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸エチルの全量（３．２８ｍｍｏｌ）をメタノール２ｍＬとテトラヒドロフラン２ｍＬに溶解させ、３Ｍ水酸化カリウム水溶液を２ｍＬ加えて室温にて８時間攪拌した。次に、２Ｍ塩酸を加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を加えて１０ｍＬにした後、酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出した。得られた酢酸エチル層を合一し、水１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬの順で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウムで脱水後、硫酸ナトリウムをろ別し、得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮することで５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸を９３７．２ｍｇ（３．２７ｍｍｏｌ、収率９９．０％）得た。

得られた５−（３−ベンジルオキシフェニル）−４−ペンテン酸の全量（３．２７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル８ｍＬに溶解させ、溶液にパラジウムカーボン（１０ｗｔ％含水品）［Ｐａｌｌａｄｉｕｍ，１０ｗｔ％（ｄｒｙ），ｏｎ ｃａｒｂｏｎ ｐｏｗｄｅｒ，ｗｅｔ］を３０１．０ｍｇ加えてアルゴン置換し、水素ガス供給下、室温で６．５時間攪拌させた。次に、反応液をろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧濃縮して得られた濃縮残渣をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。

使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（（株）資生堂社製）、流速：９．５ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ７０％ Ｂ３０％、３分：Ａ７０％ Ｂ３０％、１０分：Ａ０％ Ｂ１００％、１３分：Ａ０％ Ｂ１００％、１３．５分：Ａ７０％ Ｂ３０％、１８分：Ａ７０％ Ｂ３０％、検出：ＵＶ２８０ｎｍとした。

分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−ヒドロキシフェニル）吉草酸（化合物ＩＩａ）の精製物を４４５．２ｍｇ（２．２９ｍｍｏｌ、収率４４．３％）得た。

製造例６：有機合成方法による５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）吉草酸（化合物ＩＩｂ）の製造方法

［３−（エトキシカルボニル）プロピル］−トリフェニルホスホニウムブロミド３．４ｇ（７．４ｍｍｏｌ）にテトラヒドロフランを２０ｍＬ加えて脱気し、氷冷下にて２０分間攪拌した。次に、１．９Ｍナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのテトラヒドロフラン溶液を５．０ｍＬ加えてアルゴン置換し、氷冷下にて１時間攪拌した。さらに、０．８５ｇ（２．６８ｍｍｏｌ）の３，４−ジベンジルオキシベンズアルデヒドを１０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、反応液に加えて室温にて３時間攪拌した。以下製造例４と同様に調製し、５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）吉草酸（化合物ＩＩｂ）の精製物９２．１ｍｇ（０．４４ｍｍｏｌ、収率１６.４％）を得た。

製造例７：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とフラボニフラクター・プラウティ（クロストリジウム・オルビスシンデンス）ＡＴＣＣ４９５３１株および大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶａ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びフラボニフラクター・プラウティ（クロストリジウム・オルビスシンデンス）ＡＴＣＣ４９５３１株は１０ｍＬのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（＋）−カテキン２５０ｍｇを含む３００ｍＬのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。無菌的に培養液１ｍＬをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ分析することで（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。その後、さらに上記ＡＴＣＣ４９５３１株の前培養液を加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行い、（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールを（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンおよび（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸へ変換した。なお、無菌的に培養液１ｍＬをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して菌体を除去し、上清を製造例１記載のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析に供して（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンおよび（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸の生成を確認した。

（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンの生成を確認した培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。上清にリン酸を加えｐＨ３．５に調整し、１００ｍＬの酢酸エチルを加え、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを抽出した。有機溶媒層を回収し、水層に再度酢酸エチル１００ｍＬを加えて抽出を行った。この抽出を３回繰り返し行った。回収した酢酸エチル層を合一し、減圧下で濃縮乾固した。乾固物に５０ｍＬの純水を加えて溶解し、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液を適量加えてｐＨ１０.５に調整した。室温で２０時間放置し、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸に変換した。２Ｍ塩酸を適量加えてｐＨ７.０付近に調整した後、減圧下で濃縮を行った。５ｍＬ程度まで濃縮した後、塩酸で再度ｐＨを２〜５に調整した。この濃縮液を高速遠心分離（５０００×ｇ、１０分、４℃）後、上清を製造例４と同様の条件で分取ＨＰＬＣに供した。

得られた（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸画分（約５０ｍＬ）に１／２量の純水（２５ｍＬ）を添加後、減圧下で濃縮し、溶液中の溶媒を除去して水溶液にした。この水溶液を純水で平衡化した陽イオン交換樹脂（ダイアイオンＳＫ１Ｂナトリウム型、１０×６５ｍｍ）に通液し、さらに純水で溶出した。得られた溶液を減圧濃縮し凍結乾燥した結果、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶａ）のナトリウム塩９５ｍｇを得た。

製造例８：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株およびフラボニフラクター・プラウティ（ユウバクテリウム・プラウティ）ＭＴ４２（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株の共存下でのエピカテキンからの（Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶｂ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。またＭＴ４２株は１０ｍＬのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養した。（−）−エピカテキン２１５ｍｇを含む３００ｍＬのＧＡＭブイヨンに上記２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養して変換反応を行い、（Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸および（Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−γ―バレロラクトンを生成させた。培養液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、１０℃）して、菌体を除去後、上清に塩酸を加えｐＨ３．５に調整した。この上清液を３００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル層を減圧下で濃縮乾固した。

乾固物に３０ｍＬの純水を加えて溶解し、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液を適量加えてｐＨ１０．５に調整した。室温で２０時間放置し、（Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを（Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸に変換した。２Ｍ塩酸を適量加えてｐＨ７．０付近に調整した後、減圧下で濃縮を行った。１０ｍＬ程度まで濃縮した後、塩酸で再度ｐＨを２〜５に調整した。この濃縮液を高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、４℃）後、上清を製造例４記載の分取ＨＰＬＣに供した。

得られた（Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸画分（約５０ｍＬ）に１／２量の純水（２５ｍＬ）を添加後、減圧下で濃縮し、溶液中の溶媒を除去して水溶液にした。この水溶液を純水で平衡化した陽イオン交換樹脂（ダイアイオンＳＫ１Ｂ ナトリウム型、１０×６５ｍｍ）に通液し、さらに純水で溶出した。得られた溶液を減圧濃縮し凍結乾燥した結果、（Ｒ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶｂ）のナトリウム塩９５ｍｇを得た。

製造例９：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株およびフラボニフラクター・プラウティ（ユウバクテリウム・プラウティ）ＭＴ４２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７６５）株の共存下でのカテキンからの（Ｓ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶｃ）の製造方法

基質に（＋）−カテキンを用いて製造例８の方法に準じて調製及び分取精製を行い、（Ｓ）−５−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（化合物ＩＶｃ）のナトリウム塩９０ｍｇを得た。

製造例１０：有機合成方法による３−（３−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（化合物ＩＩＩａ）の製造方法

トランス−メタ−クマル酸５．５３ｇ（３３．７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル２ｍＬとメタノール２ｍＬに溶解させ、パラジウムカーボン（１０ｗｔ％含水品）を１．０ｇ加えてアルゴン置換した後、水素ガス供給下、室温で１８．５時間攪拌させた。攪拌後は反応液をろ過し、得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。

使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（株)資生堂社製）、流速：９．５ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ８０％ Ｂ２０％、３分：Ａ８０％ Ｂ２０％、１２分：Ａ０％ Ｂ１００％、１５分：Ａ０％ Ｂ１００％、１５．５分：Ａ８０％ Ｂ２０％、１８．５分：Ａ８０％ Ｂ２０％、検出：ＵＶ２８０ｎｍとした。

分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することにより、３−（３−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（化合物ＩＩＩａ）の精製物を５．３５ｇ（３２．２ｍｍｏｌ、収率９５．７％）得た。

製造例１１：有機合成方法による３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸（化合物ＩＩＩｂ）の製造方法

３，４−ジヒドロキシケイ皮酸５．５０ｇ（３０．５ｍｍｏｌ）を用いて製造例１０の方法に準じて調製及び分取精製を行い、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸（化合物ＩＩＩｂ）の精製物を５．２０ｇ（２８．６ｍｍｏｌ、収率９３．６％）得た。

製造例１２：アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８）存在下での（Ｓ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｃ）の製造方法

アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。（−）−エピカテキン２５０ｍｇを含む３００ｍＬのＧＡＭブイヨンに上記菌株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍＬを無菌的にサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去した。上清を製造例１に記載の条件でＬＣ／ＭＳ分析に供し、（Ｓ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。

上記の（Ｓ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。得られた上清に塩酸を加えてｐＨ３．０に調整し２００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル層をエバポレーターにより濃縮後、得られた濃縮液を適量の５％メタノール水溶液に溶解し、製造例1記載の分取ＨＰＬＣ方法に準じて精製を行った。
分取後に分画した画分を、製造例1記載のＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析し、目的とする（Ｓ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールが含まれる画分を確認した。その後、分取液をエバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に５ｍＬの純水を加えて再度濃縮乾固する操作を３回繰り返して画分中の酸を完全除去した。乾固物に少量の純水を加えて溶解後、凍結乾燥を行い、（Ｓ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｃ）を１１０ｍｇ得た。

製造例１３：アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８）存在下での（Ｒ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｄ）の製造方法

アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。（＋）−カテキン２５０ｍｇを含む３００ｍＬのＧＡＭブイヨンに上記菌株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍＬを無菌的にサンプリングし、製造例１２の記載の方法に準じて抽出及び分取精製を行い、（Ｒ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｄ）を１００ｍｇ得た。

製造例１４：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｅ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。大腸菌Ｋ１２株は、１０ｍＬのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養した。（−）−エピガロカテキン４２３ｍｇを含む４００ｍＬのＧＡＭブイヨンに上記２菌株の培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍＬをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１と同様の条件でＬＣ／ＭＳ分析することで（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。

培養液は製造例１２に記載の方法に準じて抽出及び分取精製を行い、（Ｓ）−１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｅ）１９５．２ｍｇを得た。

製造例１５：アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３８）及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｂ）の製造方法

アドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養した。大腸菌Ｋ１２株は１０ｍＬのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養した。（−）−エピカテキン３５０ｍｇを含む３００ｍＬのＧＡＭブイヨンに上記２菌株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍＬを無菌的にサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去した。上清を製造例１に記載の条件でＬＣ／ＭＳ分析に供し、（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。

培養液は製造例１２に記載の方法に準じて抽出及び分取精製を行い、（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩｂ）を１２０ｍｇ得た。

製造例１６：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株と大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩａ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株をそれぞれ２０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。（＋）−カテキン１５０ｍｇを含む２００ｍＬのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。無菌的に培養液１ｍＬをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して菌体を除去し、上清を製造例１記載の方法と同様にＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。

培養液は製造例１２に記載の方法に準じて抽出及び分取精製を行い、その結果、（Ｒ）−１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（化合物ＶＩａ）７５ｍｇを得た。

製造例１７：有機合成方法による５−（３−ヒドロキシフェニル）レブリン酸（化合物Ｖ）の製造方法

１．０ｍＬのアセトンに、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン４８．７ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム１０５ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌させた。次に、クロロメチルメチルエーテルを８０．４μＬ（１．００ｍｍｏｌ）加え、室温で２日間攪拌させた。攪拌後、５％クエン酸水溶液を加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を３ｍＬ加えた後、クロロホルム５ｍＬで３回抽出した。クロロホルム層を水５ｍＬと飽和食塩水５ｍＬで洗浄後、エバポレーターで減圧濃縮し、（Ｒ）−５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）−γ−バレロラクトンを６３．３ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、収率９６．０％）得た。

得られた（Ｒ）−５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）−γ−バレロラクトンの全量（０．２４ｍｍｏｌ）をメタノール１ｍＬに溶解させ、３Ｍ水酸化カリウム水溶液を１００μＬ加えて室温で１時間攪拌した。次に、１Ｍギ酸−ナトリウムバッファーを加えて溶液をｐＨ４．０に調整し、水を３ｍＬ加えた後、酢酸エチル４ｍＬで３回抽出した。さらに、酢酸エチル層にトリエチルアミンを１００μＬ加え、エバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）吉草酸のトリエチルアミン塩を５８．４ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ、収率９５．０％）得た。

ジクロロメタン３ｍＬに５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）吉草酸のトリエチルアミン塩５８．４ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）とピリジン８０μＬ、デス−マーチンペルヨージナン１７９．０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。次に、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液を３ｍＬ加えて３０分間攪拌し、５％クエン酸水溶液を加えて溶液をｐＨ３．０に調整し液量を１０ｍＬにした後、ジクロロメタン１０ｍＬで３回抽出した。抽出後、ジクロロメタン層を５％チオ硫酸ナトリウム水溶液１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬの順で洗浄し、ジクロロメタン層を硫酸ナトリウムで脱水した。脱水後、硫酸ナトリウムをろ別して得られたろ液をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣をアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件を以下に記載する。

使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（（株)資生堂社製）、流速：９．５ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ６０％ Ｂ４０％、３分：Ａ６０％ Ｂ４０％、１３分：Ａ０％ Ｂ１００％、１６分：Ａ０％ Ｂ１００％、１６．５分：Ａ６０％ Ｂ４０％、２０分：Ａ６０％ Ｂ４０％、検出：ＵＶ２８０ｎｍとした。

分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮し、５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）レブリン酸を３３．８ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ、収率５８．３％）得た。

得られた５−（３−メトキシメチルオキシフェニル）レブリン酸の全量（０．１３ｍｍｏｌ）にジクロロメタン１．５ｍＬと水０．５ｍＬ、トリフルオロ酢酸１ｍＬを加え、室温で１時間攪拌させた。攪拌後、反応液をエバポレーターで減圧濃縮し、得られた濃縮残渣を１ｍＬのアセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））で溶解して分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。

使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（（株)資生堂社製）、流速：９．５ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、溶媒Ａ；アセトニトリル：水：ギ酸（５：９５：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ；アセトニトリル：水：ギ酸（８０：２０：０．１ 容量比（ｖ／ｖ／ｖ））、グラジエント；０分：Ａ９０％ Ｂ１０％、３分：Ａ９０％ Ｂ１０％、１５分：Ａ０％ Ｂ１００％、１８分：Ａ０％ Ｂ１００％、１８．５分：Ａ９０％ Ｂ１０％、２２分：Ａ９０％ Ｂ１０％、検出：ＵＶ２８０ｎｍとした。

分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することにより、５−（３−ヒドロキシフェニル）レブリン酸（化合物Ｖ）の精製物を１１．６ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ、収率２２．０％）得た。

得られた精製物を^１Ｈ−ＮＭＲ（ｐｒｏｔｏｎ−ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）で分析したところ、以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ７．１４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），３．７０（２Ｈ，ｓ），２．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）

製造例１８：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株、ユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＭＴ４２株、及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉａ）の製造方法

エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株およびフラボニフラクター・プラウティ(ユウバクテリウム・プラウティ)ＭＴ４２株は１０ｍＬのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（−）−エピカテキン２００ｍｇを含む２００ｍＬのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍＬを無菌的にサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清を製造例１記載の条件でＬＣ／ＭＳ分析に供して１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オールの生成を確認した。その後、さらに上記ＭＴ４２株の前培養液を加えてさらに３７℃で４８時間嫌気培養を行い、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸及び（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンへの変換を行った。培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。得られた上清に塩酸を加えてｐＨ２．０に調整し、３７℃で約一晩インキュベートし、培養液中に含まれる（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸を（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンに変換した。製造例１記載の方法に準じて酢酸エチル抽出および分取ＨＰＬＣによる精製を行った。その結果、（Ｒ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉａ）を８７ｍｇ得た。

［実施例２］
試験例：ラット骨格筋由来Ｌ６筋管細胞を用いた２−デオキシグルコース細胞内取り込み量測定試験

（Ｌ６細胞培養）
まず、ラット骨格筋由来Ｌ６細胞（住友大日本製薬株式会社より購入）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチジャパン合同会社より購入）含有イーグル最小必須培地（ＭＥＭ培地、シグマアルドリッチジャパン合同会社より購入）中で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２条件下において培養した。つぎに、Ｌ６細胞を９６穴マルチプレートに播種し、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ＭＥＭ培地中で５〜６日間インキュベーションし、Ｌ６筋管細胞に分化誘導した。そして、培地を無血清ＭＥＭ培地に置き換え、１６〜１８時間脱感作させた。

（２−デオキシグルコースの細胞内取り込み量測定試験）
製造例１〜製造例１８で製造した各化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にそれぞれ溶解後、Ｌ６筋管細胞を培養した無血清ＭＥＭ培地に添加し（終濃度３μＭ）、Ｌ６筋管細胞に化合物を４時間作用させた。陰性対照としてＤＭＳＯ、陽性対照としての０．１μＭインスリンを同様に作用させた。Ｌ６筋管細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有Ｋｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＫＲＨ；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ_４）を用いて２回洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＫＲＨ緩衝液中に溶解した１ｍＭの２−デオキシグルコース(２ＤＧ)を加え、３７℃で２０分間加温した。

再びＬ６筋管細胞を０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＫＲＨ緩衝液で２回洗浄し、０．１Ｎ ＮａＯＨを５０μＬ加えた。プレートを６５℃で１０分間加温し、マイクロプレートシェイカー上で１分間混和し、Ｌ６筋管細胞を溶解させた。８５℃、２時間で風乾し、０．１Ｎ塩酸を５０μＬ加えて乾固物を溶解および中和した。さらに２００ｍＭ２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール塩酸塩（ＴＥＡ）緩衝液（ｐＨ８．１）５０μＬを加えることで細胞破砕液を調製した。細胞破砕液３０μＬに対し、アッセイカクテル（５０ｍＭのＴＥＡ５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．１、０．１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ、１００ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、０．２ｕｎｉｔｓ/ｍＬジアホラーゼ、２μＭレザズリンナトリウム塩、１５ｕｎｉｔｓ/ｍｌグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ））１０μＬを加え、３７℃で６０分間インキュベートした。レザズリンから生成したレゾルフィン量を、マルチプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ）にて励起波長（５３０ｎｍ）、蛍光波長（５７０ｎｍ）における蛍光強度として測定した。検量線は、細胞破砕液の代わりに２−デオキシグルコース−６−リン酸（２ＤＧ６Ｐ）溶液を用いて測定した値から作成し、これを用いてＬ６筋管細胞に取込まれた２ＤＧ量を算出した。測定原理の模式図を図１に示す。

実施例２の結果を図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃに示す。なお、使用したＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ緩衝液及びアッセイカクテルの詳細は、表２、表３に示す。また統計処理は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを利用した。
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃに示した様に、本発明の化合物で、Ｌ６筋管細胞のグルコース取り込み活性を有意に促進したことが確認できた。
図２Ａに記載した化合物の中では、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（Ｉｃ）、（Ｒ）−５−（３，４、５−トリヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（Ｉｄ）、５−（３−ヒドロキシフェニル）吉草酸（ＩＩａ）、（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（ＩＶｄ）において、コントロールと比較して特に高い糖取り込み活性が見られた（有意水準＊＊ｐ＜０．０１）。
また、図２Ｂに記載した化合物においては３−（３−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸（ＩＩＩａ）、（Ｓ）−１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）−プロパン−２−オール（ＶＩｃ）でコントロールと比較して、特に高い糖取り込み活性が見られた（有意水準＊＊ｐ＜０．０１）。
また、図２Ｃに記載した化合物においては（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（Ｉｂ）、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸（ＩＶａ）でコントロールと比較して、特に高い糖取り込み活性が見られた（有意水準＊＊ｐ＜０．０１）。

［実施例３］
ウエスタンブロット法による細胞膜におけるＧＬＵＴ４発現量の測定

（細胞培養）
ラット骨格筋由来Ｌ６細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＥＭ培地中で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２条件下において培養した。次に、Ｌ６細胞を６０ｍｍディッシュに播種し、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ＭＥＭ培地中で７〜８日間インキュベーションし、Ｌ６筋管細胞に分化誘導した。そして、培地を無血清ＭＥＭ培地に置き換え、１６〜１８時間脱感作させた。

（細胞膜タンパク質画分の調製）
上記無血清ＭＥＭ培地に、無血清ＭＥＭ培地に、終濃度０．３μＭ、１μＭ、３μＭとなるように（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｃ）、および比較として既に糖取り込み促進作用を有することが明らかとなっている(−)−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）１μＭ（終濃度）を添加し、Ｌ６筋管細胞に１５分作用させた。陰性対照として溶媒として使用したＤＭＳＯ、陽性対照としての０．１μＭインスリンも同様に添加し、Ｌ６筋管細胞に１５分作用させた。

Ｌ６筋管細胞をＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ_４）を用いて２回洗浄した後、０．１％ＮＰ−４０含有緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、１ｍＭバナジン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＶＯ_４）、５μｇ/ｍＬアプロチニン、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ)、５００μＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５μｇ/ｍＬロイペプチン)１２０μＬを加えてセルスクレーパーで剥ぎ、マイクロチューブに回収した。そして、これをマイクロチューブホモジナイザーで摩砕し、２７ゲージの注射針に３回通して、不溶物を除いて細胞溶解液を得た。

得られた細胞溶解液を３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離し、上清を除いた。沈殿にＫＲＨ緩衝液を２００μＬ加え、３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離した。
上清を除き、再び沈殿にＫＲＨ緩衝液を２００μＬ加え、３，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離した。さらに、上清を除き、１％ＮＰ−４０含有緩衝液Ａを４０μＬ加え、細胞膜画分とした。画分を１時間放置し、１５，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離し、得られた上清を細胞膜タンパク質画分として、下記するウエスタンブロッティングに供した。

（細胞全タンパク質画分）
Ｌ６筋管細胞を培養させた無血清ＭＥＭ培地に、終濃度０．３μＭ、１μＭ、３μＭとなるように（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｃ）、及び比較として１μＭ ＥＧＣｇをそれぞれ添加し、Ｌ６筋管細胞に上記物質を１５分作用させた。陰性対照として溶媒として使用したＤＭＳＯ、陽性対照としての０．１μＭ インスリンも同様に添加し、Ｌ６筋管細胞に１５分作用させた。Ｌ６筋管細胞を、ＫＲＨ緩衝液を用いて２回洗浄した後、ＲＩＰＡバッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、５ μｇ/ｍＬアプロチニン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５００μＭ ＤＴＴ、５μｇ/ｍＬロイペプチン）１２０μＬを加えてセルスクレーパーで剥ぎ、マイクロチューブに回収した。そしてこれをマイクロチューブホモジナイザーで摩砕し、１時間氷冷の後に、１５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離し、得られた上清を細胞全タンパク質画分として、下記のウエスタンブロッティングに供した。

（ウエスタンブロッティング）
上記の回収した画分を、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、１４０ｍＭＳＤＳ、４４％（ｖ／ｖ）グリセロール、７５０μＭブロモフェノールブルーを含む４×ＳＤＳバッファーにて希釈した後、タンパク質のＳＤＳ化及びタンパク質中のジスルフィド結合の還元処理を効率よく行わせるために１００℃で５分間加熱した。

ＳＤＳ化したサンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質を、セミドライ式の転写装置を用いて、２ｍＡ／ｃｍ^２となるよう９０分間Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰＶＤＦ膜、ＧＥヘルスケアジャパン株式会社）上に転写した。

０．０５％（ｖ/ｖ）のＴｗｅｅｎ２０及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ塩緩衝液、ｐＨ８．０（ＴＢＳＴ）でＰＶＤＦ膜を洗浄後、ＴＢＳＴとＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク株式会社）を１：１で混合したＢｌｏｃｋｉｎｇ液を用いて室温で１時間振とう処理した。

ＴＢＳＴで２０倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ液を用いて希釈した一次抗体希釈液を用いて１時間、室温でＰＶＤＦ膜を処理した。この膜を５分間ＴＢＳＴで洗浄した。なお、この操作洗浄操作を５回繰り返した。続いて、上記の処理膜を、一次抗体と同様に希釈した二次抗体希釈液を用いて１時間、室温で処理した。

二次抗体で処理した膜を、上記と同様ＴＢＳＴ洗浄５分間で５回繰り返した後、イムノスターＬＤ（和光純薬工業株式会社）を用いて５分間、室温で処理した。この処理によって得られた膜上の特異的なタンパク質の検出には、化学発光撮影装置（Ｌｉｇｈｔ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（ＡＴＴＯ株式会社、東京、日本））を用いた。

上記の方法により、（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（化合物Ｉｃ）の細胞膜タンパク質画分でのＧＬＵＴ４の発現量、及び細胞全タンパク質画分での、インスリンからのシグナル伝達に関わる非定形プロテインキナーゼＣ（ａＰＫＣ）、プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）及びＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ（ＡＭＰ：アデノシン一リン酸））のリン酸化に与える影響を調べた。

ＧＬＵＴ４の細胞膜移行をウエスタンブロット法により確認した結果を図３の左列に示した。本研究では細胞膜画分でのＧＬＵＴ４発現を評価するため、細胞膜で恒常的に発現するＧＬＵＴ１を内在性コントロールとして使用した。ＧＬＵＴ１のバンドの濃さが全てのサンプルにおいてほぼ同等であったことから、ウエスタンブロットにおける実験操作に問題がないことを確認し、各化合物処理区におけるＧＬＵＴ４のバンドの濃さから細胞膜画分でのＧＬＵＴ４発現量を評価した。

本試験の結果、細胞膜におけるＧＬＵＴ４の発現は、化合物（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（Ｉｃ）の添加によって増大していることが確認された。特に３μＭの濃度では、ポジティブコントロールとして用いたインスリンより弱い発現であったものの、ネガティブコントロールのＤＭＳＯと比較して強い発現を示しており、当該化合物が細胞膜へのＧＬＵＴ４のトランスロケーションを促進したと考えられた。

（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（Ｉｃ）におけるＧＬＵＴ４発現の作用機序を検討する目的で、ＧＬＵＴ４トランスロケーションに関わる伝達経路である、ａＰＫＣ、Ａｋｔ、ＡＭＰＫのリン酸化による活性型への変換の有無についてウエスタンブロット法により確認を行った。その結果を図３右列に示した。Ａｋｔのリン酸化により活性化したｐ−Ａｋｔの４７３位のセリン残基（ｐ−ＡｋｔＳｅｒ４７３）画分でのバンドはポジティブコントロールであるインスリン処理区では確認されたが、化合物（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（Ｉｃ）処理区では見られなかったことから、当該化合物はＡｋｔのリン酸化には作用しないと考えられた。

またａＰＫＣがリン酸化したリン酸化非定形プロテインキナーゼＣ（ｐ−ａＰＫＣ）のバンドは、ポジティブコントロールのインスリンと同様に、化合物Ｉｃの処理区においても確認できたことから、当該化合物はｐ−ａＰＫＣをリン酸化し、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ/ａＰＫＣ）シグナル伝達経路を活性化していることが明らかになった。

さらに、ＡＭＰＫがリン酸化したｐ−ＡＭＰＫのバンドも、ポジティブコントロールのＥＧＣｇと同程度の発現が化合物Ｉｃの処理区において確認されたことから、当該化合物はＡＭＰＫのリン酸化に作用することが確認され、ＡＭＰＫシグナル伝達経路の活性化にも関与していることが明らかになった。

図４にＧＬＵＴ４トランスロケーションに関わるシグナル伝達経路を示す。ＧＬＵＴ４は細胞内から膜上に移行してグルコースを取り込むが、この膜移行(トランスロケーション)にはインスリン依存性と非依存性のシグナル伝達経路が存在する。

インスリン依存型のシグナル伝達経路としては、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介したＡｒｔ活性化によるシグナル伝達経路および、ＰＩ３Ｋを介したａＰＫＣ活性化による経路などが挙げられる。インスリンが筋肉細胞や脂肪細胞表面に存在するインスリン受容体（ＩＲ）に結合すると、受容体のチロシンキナーゼがリン酸化され、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）などのチロシン残基がリン酸化される。リン酸化したＩＲＳはＰＩ３Ｋを活性化し、これによりＡｋｔのリン酸化及びａＰＫＣのリン酸化が起こり活性型に変換する。活性型となったＡｋｔ及びａＰＫＣは、種々のタンパクをリン酸化し、最終的に筋肉細胞（骨格筋、心筋）や脂肪細胞では細胞内のＧＬＵＴ４が細胞膜上へ移行し、エキソサイトーシスで細胞膜上に現れて、細胞への糖取り込みが促進される。

一方で、インスリン非依存型経路としてＡＭＰＫが提唱されている。骨格筋では、インスリン刺激を介さずに、運動などの刺激によってもＧＬＵＴ４の細胞膜移行は促進されてグルコースの取り込みが増加する。その作用機構としてＡＭＰＫリン酸化によるシグナル伝達経路が考えられており、活性型ＡＭＰＫは一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）のリン酸化により、細胞内のＮＯ上昇を招き、最終的にＧＬＵＴ４の細胞膜移行を誘導し、糖取り込みを促進する。

本試験の結果から、ＥＧＣｇやＥＧＣの腸内細菌分解物である化合物（Ｒ）−５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトン（Ｉｃ）はインスリン依存的シグナル伝達経路の一部であるＰＩ３Ｋ/ａＰＫＣシグナル伝達経路、およびインスリン非依存的シグナル伝達経路であるＡＭＰＫシグナル伝達経路の２つのシグナル伝達経路を活性化させることにより、筋肉細胞におけるＧＬＵＴ４のトランスロケーションを促進し、細胞内への糖の取り込みを増加させる可能性が示唆された。

Claims (6)

1. 以下の式（Ｉ）、（Ｖ）、（ＶＩ）：
   
   （式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
   
   
   （式中、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
   で表される化合物、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸、及び（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸から選ばれる１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有する、筋肉細胞への糖取り込み促進剤。
2. 前記糖が、グルコースである、請求項１に記載の糖取り込み促進剤。
3. 以下の式（Ｉ）、（Ｖ）、（ＶＩ）：
   
   （式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
   
   
   （式中、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれ独立に水酸基又は水素を表す。波線は立体配置がＲ配置又はＳ配置を表す。）
   で表される化合物、（Ｓ）−５−（３−ヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸、及び（Ｒ）−５−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４−ヒドロキシ吉草酸から選ばれる１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有する、筋肉細胞へのグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤。
4. 以下の式（Ｉｃ）で表される５−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−γ−バレロラクトンを有効成分として含有する、請求項３に記載の筋肉細胞へのグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤。
   
   （式中、波線は立体構造がＲ配置又はＳ配置を表す）
5. 請求項１又は請求項２に記載の糖取り込み促進剤、及び請求項３又は請求項４に記載のグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤の少なくとも一種を有効成分として含有する、糖尿病を治療、改善又は予防するための医薬品。
6. 請求項１又は請求項２に記載の糖取り込み促進剤、及び請求項３又は４に記載のグルコース輸送体４トランスロケーション活性化剤の少なくとも一種を有効成分として含有する、糖尿病を治療、改善又は予防するためのサプリメント。