WO2021060926A1 - 면역신호의 변환이 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역세포 및 이의 항암 용도 - Google Patents

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성혜란
김민지
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Definitions

  • the present invention relates to chimeric cytokine receptors and uses thereof. More specifically, it relates to a chimeric cytokine receptor capable of converting an immunosuppressive signal into an immune activation signal, an immune cell expressing the same, and an anticancer use thereof.
  • NK Natural Killer cells are effector cells specialized in the innate immune system and play an important role in defense against cancer cells and viral infections. Natural cytotoxicity of NK cells responds rapidly by stimulation of appropriate cell membranes and is regulated by complex signaling of activating or inhibitory receptors. Similar to cytotoxic T cells, NK cells exhibit cytotoxicity through perforin and granzyme.
  • cytokines have been reported to have an effect on activating the differentiation, proliferation, survival, and function of NK cells, and according to research results, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, and IL-21 It has been reported that such cytokines increase the function and activity of NK cells.
  • Interleukin-2 IL-2
  • IL-15 Interleukin-15
  • IL-15 increases the cytotoxic ability of NK cells, affects the process of differentiation from T/NK progenitor cells into NK cells, and plays an important role in the survival and proliferation of NK cells.
  • IL-21 Interleukin-21
  • IL-21R IL-21 receptor
  • IL-21R lymphocytes
  • NK dendritic cells
  • B cells lymphocytes
  • IL-21R is structurally very similar to IL-2 and IL-15
  • IL-21R shares a ⁇ -chain with IL-2R, IL-15R, IL-7R, or IL-4R.
  • IL-21 has been reported to induce the maturation of NK cell precursors from bone marrow, in particular, has been reported to increase the effect function (effector functions), such as a cytokine producing ability and cell killing ability of NK cells, CD8 + T-cell It has been reported to promote the anticancer response of the intrinsic and adaptive immune systems by increasing the effect function. In addition, it has been reported that it activates NK cells isolated from human peripheral blood and plays an important role in inducing mature NK cells from hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood.
  • IL-4 As immunosuppressive cytokines, IL-4, IL-6, IL-10, TGF- ⁇ , and the like exist.
  • IL-4 is a member of the ⁇ c family of cytokines, well known for their pro-Th2 effect during T cell differentiation. The absence of IL-4 does not affect NK cell production and homeostasis. However, NK cells express the IL-4 receptor in vitro. Of note is the ability of IL-4 to inhibit key NK effector functions such as cytokine production or cytotoxicity. Indeed, it has been demonstrated that IL-4 inhibits the increased production of inflammatory cytokines (IFN- ⁇ , TNF ⁇ and GM-CSF) induced after IL-12 treatment in human NK cells.
  • IFN- ⁇ , TNF ⁇ and GM-CSF inflammatory cytokines
  • IL-4 Another measurable effect of IL-4 is to down-regulate the expression of NKG2D and other NK cell activity markers in vitro and in vivo, consequently reducing NKG2D dependent cell killing.
  • IL-4 also has an important effect on cancer development. It was found that IL-4R was significantly increased in breast cancer, prostate, lung cancer, and kidney cancer, and it was also found to be overexpressed in many types of cancer.
  • IL-4 is an immunosuppressive cytokine. In the case of pancreatic cancer, it uses an immune evasion strategy to produce an inhibitory cytokine, thereby limiting the persistence and function of NK and CAR-T cells.
  • IL-10 was first known to inhibit the synthesis of cytokines in Th1 cells by being expressed and secreted in Th2 cells (J. Exp. Med. 170,2081-2095), but now macrophages and dendritic cells ( Dendritic cells, DC), B cells, as well as several types of CD4+ and CD8+ T cells have been reported to be produced.
  • IL-10 mainly interferes with the expression of MHCII and B7-1/2, which are required for monocytes or macrophages to present antigens or stimulate T cells, as well as IL-1 ⁇ / ⁇ , IL- 6, Production of pro-inflammatory cytokines such as IL-12, IL-18, and TNF- ⁇ , and pro-inflammatory chemokines such as MCP1, MCP5, RANTES, and IL-8. By inhibiting, it ultimately interferes with the function of T cells and NK cells.
  • MHCII and B7-1/2 which are required for monocytes or macrophages to present antigens or stimulate T cells, as well as IL-1 ⁇ / ⁇ , IL- 6, Production of pro-inflammatory cytokines such as IL-12, IL-18, and TNF- ⁇ , and pro-inflammatory chemokines such as MCP1, MCP5, RANTES, and IL-8.
  • Patent Document 1 WO 2017/029512
  • Non-Patent Document 1 Vosshenrich CAJ, Ranson T, Samson SI, Corcuff E, Colucci F, Rosmaraki EE, et al. Roles for common cytokine receptor gamma-chain-dependent cytokines in the generation, differentiation, and maturation of NK cell precursors and peripheral NK cells in vivo. J Immunol (2005) 174:1213-21.
  • Non-Patent Document 2 2.
  • Non-Patent Document 3 Brady J, Carotta S, Thong RPL, Chan CJ, HayakawaY, Smyth MJ, et al. The inter*?*actions of multiple cytokines control NK cell maturation. J Immunol (2010) 185:6679-88. doi:10.4049/jimmunol.0903354.
  • Non-Patent Document 4 Kawakami K, Kawakami M, Puri RK (2001) Overexpressed cell surface interleukin-4 receptor molecules can be successfully targeted for antitumor cytotoxin therapy. Crit Rev Immunol 21: 299-310.
  • Non-Patent Document 5 Gooch JL, Christy B, Yee D (2002) STAT6 mediates interleukin-4 growth inhibition in human breast cancer cells. Neoplasia 4: 324-331.
  • the present inventors have made extensive research efforts to develop a chimeric cytokine receptor capable of converting an immunosuppressive signal into an immune activation signal in immune cells using gene recombination technology.
  • an inverted cytokine receptor having an extracellular domain of a cytokine receptor capable of reacting with an immunosuppressive cytokine and a transmembrane of an immunoactivating cytokine receptor-an intracellular domain (TM-cytoplasmic domain) (Inverted cytokine receptor, ICR) was prepared, and after successfully expressing it in natural killer (NK) cells, the present invention was completed by experimentally demonstrating its immune signal response and excellent immune activity.
  • an object of the present invention is to provide a chimeric cytokine receptor capable of converting an immunosuppressive signal into an immune activation signal.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the chimeric cytokine receptor.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a transformed cell expressing the chimeric cytokine receptor.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising the transformed cells as an active ingredient.
  • the present invention includes (i) a cytokine binding domain; (ii) a transmembrane domain; And (iii) an intracellular domain; wherein the cytokine binding domain specifically binds to IL-4, IL-6, IL-10, or TGF- ⁇ .
  • a cytokine binding domain specifically binds to IL-4, IL-6, IL-10, or TGF- ⁇ .
  • TGF- ⁇ Provides a meric cytokine receptor.
  • the present invention (i) cytokine binding domain; (ii) a transmembrane domain; And (iii) an intracellular domain; wherein the intracellular domain is a cytokine that induces an immune activation signal of NK cells, IL-7, IL-12, IL-2/15, IL It provides a chimeric cytokine receptor comprising -18, or an intracellular domain of the IL-21 receptor.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the chimeric cytokine receptor.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention provides a transformed cell expressing a chimeric cytokine receptor.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer comprising the transformed cells as an active ingredient.
  • cytokine binding domain (i) a cytokine binding domain; (ii) a transmembrane domain; And (iii) a chimeric cytokine receptor comprising an intracellular domain, wherein the cytokine binding domain specifically binds to IL-4, IL-6, IL-10, or TGF- ⁇ .
  • cytokine receptors Provides cytokine receptors.
  • chimeric cytokine receptor refers to (i) cytokine binding domains derived from different origins; (ii) a transmembrane domain; And (iii) a receptor in which the intracellular domains are combined and linked.
  • cytokine binding domain refers to a site that specifically binds to a specific cytokine outside of a cell, and may also be referred to as the term “exodomain” in the present specification. .
  • the cytokine binding domain specifically binds to IL-4, IL-6, IL-10, or TGF- ⁇ .
  • the cytokine binding domain may be used without limitation as long as it is a material site capable of specifically binding to IL-4, IL-6, IL-10, or TGF- ⁇ .
  • the cytokine binding domain includes an extracellular region of one or more receptors selected from the group consisting of IL-4, IL-6, IL-10, and TGF- ⁇ receptors.
  • the extracellular region of the IL-4 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the extracellular region of the IL-6 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the extracellular region of the IL-10 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the extracellular region of the TGF- ⁇ receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • transmembrane domain refers to a site that penetrates the cell membrane and connects the cytokine binding domain and the intracellular domain.
  • the transmembrane domain penetrates the cell membrane and connects the cytokine domain and the intracellular domain, and any material site capable of transmitting a signal by cytokine binding to the intracellular domain may be used without limitation.
  • the transmembrane domain is a transmembrane region of at least one receptor selected from the group consisting of IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, and IL-21 receptors. Includes.
  • the transmembrane region of the IL-7 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the transmembrane region of the IL-12 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the transmembrane region of the IL-2/15 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the transmembrane region of the IL-18 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the transmembrane region of the IL-21 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the term "endodomain” refers to a site that functions to convert a cytokine binding signal transmitted through the transmembrane domain into a signal located inside a cell.
  • the intracellular domain may be used without limitation, as long as the intracellular domain is a site that functions to convert and transmit a signal by cytokine binding into the cell.
  • the intracellular domain is an intracellular region of one or more receptors selected from the group consisting of IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, and IL-21 receptors. Includes.
  • the intracellular region of the IL-7 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the intracellular region of the IL-12 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • the intracellular region of the IL-2/15 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.
  • the intracellular region of the IL-18 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the intracellular region of the IL-21 receptor includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.
  • the chimeric cytokine receptor of the present invention may further include a signal peptide.
  • signal peptide refers to a peptide that functions to move and localize the expressed chimeric cytokine receptor to the cell membrane region, and another term known in the art “signal sequence ( signal sequence)”, “targeting signal”, and “localization signal”.
  • the signal peptide is linked to the cytokine binding domain of the chimeric cytokine receptor, and is preferably linked to the N-terminus of the cytokine binding domain.
  • the signal peptide may include a signal peptide of one or more receptors selected from the group consisting of IL-4, IL-6, IL-10, and TGF- ⁇ receptors.
  • the signal peptide of the IL-4 receptor may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the signal peptide of the IL-6 receptor may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the signal peptide of the IL-10 receptor may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the signal peptide of the TGF- ⁇ receptor may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the chimeric cytokine receptor of the present invention can convert a signal of an immunosuppressive cytokine into an immunoactivating signal, and in this sense, another term “inverted chimeric receptor” It may also be referred to as ".
  • a polynucleotide encoding the chimeric cytokine receptor of the present invention is provided.
  • coding means “coding a polypeptide” when it can be transcribed and/or translated to produce mRNA for a polypeptide and/or a fragment thereof in its natural state or when manipulated by methods well known to those skilled in the art Refers to a polynucleotide referred to as ".
  • polynucleotide refers to a polymer form of nucleotides of any length among ribonucleotides or deoxyribonucleotides.
  • polynucleotide refers to single, double, or multi-stranded DNA or RNA, genomic DNA, cDNA, DNA-RNA hybrid, or purine and pyrimidine bases or other natural, chemically or biochemically modified, unnatural, Or a polymer comprising a derivatized nucleotide base, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the chimeric cytokine receptor of the present invention is derived from the coding region due to the degeneracy of the codon or in consideration of the preferred codon in the organism to express the chimeric cytokine receptor.
  • Various modifications can be made to the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the expressed chimeric cytokine receptor, and various modifications can be made within the range that does not affect the expression of the gene even in parts excluding the coding region. , It will be well understood by those skilled in the art that such modified genes are also included in the scope of the present invention.
  • nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
  • a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric cytokine receptor of the present invention is provided.
  • the vector used in the present invention can be used in a variety of vectors known in the art, and according to the type of host cell to be produced the chimeric cytokine receptor promoter (promoter), terminator (terminator), enhancer (enhancer) ), and the like, sequences for membrane targeting or secretion, etc. may be appropriately selected and variously combined according to the purpose.
  • promoter promoter
  • terminator terminator
  • enhancer enhancer
  • the vector includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector.
  • a suitable recombinant vector may include a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal and enhancer, and can be prepared in various ways according to the purpose. I can.
  • the vector includes an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, There are genes for resistance to puromycin and tetracycline.
  • an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, There are genes for resistance to puromycin and tetracycline.
  • a transformed cell expressing the chimeric cytokine receptor of the present invention is provided.
  • the transformed cell expressing the chimeric cytokine receptor may be a cell transformed with the recombinant vector of the present invention.
  • a method of introducing a recombinant vector into a cell may use a known transfection method, for example, a microinjection method (Capecchi, MR, Cell 22, 479 (1980)), a calcium phosphate precipitation method ( Graham, FL et al., Virology 52, 456 (1973)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al. al., Gene, 10, 87 (1980)), DEAE-dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), and Gene Bombadment (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)) and the like, but are not limited thereto.
  • a microinjection method Capecchi, MR, Cell 22, 479 (1980)
  • a calcium phosphate precipitation method Graham,
  • the cell into which the recombinant vector can be introduced may be an immune cell, more preferably a natural killer (NK) cell, a T cell, a cytotoxic T cell, a regulatory T cell, or a B cell. , Or NK-T cells, more preferably NK cells or T cells.
  • the cells are human-derived immune cells, more preferably human-derived NK cells.
  • T cell refers to a type of lymphocyte that matures in the thymus. T cells play an important role in cell-mediated immunity and are distinguished from other lymphocytes such as B lymphocytes by the presence of T cell receptors on the cell surface. T cells can also be isolated or obtained from commercially available sources. T cells are all types of CD3 expressing CD3 including helper T cells (CD4+ cells), cytotoxic T cells (CD8+ cells), natural killer T cells, regulatory T cells (Treg) and gamma-delta T cells. Contains immune cells. “Cytotoxic cells” include CD8+ T cells, natural-killer (NK) cells, and neutrophils that are capable of mediating cytotoxic responses.
  • NK cell is also known as a natural killer cell, and refers to a type of lymphocyte derived from the bone marrow, which plays an important role in the innate immune system. Even in the absence of a major histocompatibility complex or antibody on the cell surface, NK cells provide a rapid immune response to virus-infected cells, tumor cells, or other stressed cells.
  • Non-limiting examples of commercial NK cell lines include NK-92 (ATCC® CRL-2407TM), NK-92MI (ATCC® CRL-2408TM). Additional examples include, but are not limited to, the NK cell lines HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, YT and NK101.
  • Non-limiting exemplary sources of such commercially available cell lines are the American Type Culture Collection, or ATCC, (http://www.atcc.org/) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz Includes .de/).
  • the step of selecting the transformed cells in the present invention can be easily performed using a phenotype expressed by the above-described vector selection label.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • transformed cells can be easily selected by culturing a transformant in a medium containing the antibiotic.
  • a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer comprising cells expressing the above-described chimeric cytokine receptor as an active ingredient.
  • treatment means (a) inhibition of the development of a disease or disease; (b) alleviation of the disease or disease; And (c) means the elimination of a disease or disorder.
  • prevention has not been diagnosed as possessing a disease or disease, but refers to suppressing the occurrence of a disease or disease in an animal prone to such a disease or disease.
  • the cancer is, as non-limiting examples, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, liver cancer, gallbladder cancer, hematologic cancer, Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic myelogenous Leukemia, acute myeloblastic leukemia, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin cancer, eye melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer, rectal cancer, anal cancer, colon cancer, fallopian tube cancer, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, It may be a cancer selected from the group consisting of small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer, bronchial cancer, bone marrow cancer, and multiple myeloma.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared as an injection, typically in the form of a suspension containing cells.
  • Pharmaceutical forms suitable for injection include sterile aqueous solutions or dispersions ready for immediate preparation of solutions or dispersions. In all cases, pharmaceuticals in the form of injection solutions must be sterile and must be fluid enough to facilitate injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable means that when administered to a human does not cause allergic reactions or similar adverse reactions.
  • Such carriers include specific solvents, dispersion media, coating agents, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like. It is known in the art to use such media and agents for pharmaceutically active substances.
  • the carrier of the pharmaceutical composition may be, for example, water, saline, ethanol, polyol (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), suitable mixtures thereof, and a solvent or dispersion medium containing vegetable oil. .
  • a coating agent such as lecithin.
  • various antibacterial and antifungal agents such as paraben, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, etc. may be included, and isotonic agents such as sugar or sodium chloride may also be included.
  • agents that delay absorption such as aluminum monostearate and gelatin, may be included in the composition in order to prolong the absorption effect upon administration to the body.
  • Sterile injectable solutions are prepared by mixing the required amount of the active compound in a suitable solvent having the various other ingredients mentioned above as needed, followed by sterilization by filtration.
  • composition of the present invention may be preferably administered by parenteral, intraperitoneal, intradermal, intramuscular, or intravenous route.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount in a manner compatible with the formulation.
  • the dosage may be adjusted according to the condition or condition of the subject to be treated.
  • parenteral administration as an aqueous injection solution, the solution must be suitably buffered as needed, and the liquid diluent is first made isotonic with sufficient saline or glucose.
  • aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal and intraperitoneal administration.
  • the present invention relates to a chimeric cytokine receptor capable of converting an immunosuppressive signal into an immune activation signal, an immune cell expressing the same, and a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising the immune cell as an active ingredient.
  • Immune cells expressing the chimeric cytokine receptor of the present invention can exert a stronger cytotoxic effect against cancer by converting an immunosuppressive signal into an immune activation signal in a microtumor environment in which an immunosuppressive cytokine is present. have.
  • the immune cells expressing the chimeric cytokine receptor of the present invention can be used as a cell therapy agent for cancer treatment.
  • FIG. 1A and 1B are the results of confirming the expression of each receptor in NK cells prepared to express the chimeric cytokine receptor in the present invention at the RNA level by RT-PCR (FIG. 1A), and the cell membrane of NK cells by flow cytometry It is the result of confirming the receptor expressed in (Fig. 1b).
  • Figure 2 is to confirm the immune activity of chimeric cytokine receptor-expressing NK cells in an environment in which an immunosuppressive signal exists, such as a microtumor environment, produced in NK cells after treatment with the immunosuppressive cytokine IL-4. This is the result of measuring the amount of interferon-gamma (IFN- ⁇ ) by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • 3A and 3B are results of confirming the changes in the expression of immunoactivating markers such as DNAM-1 and NKp46 in NK cells expressing chimeric cytokine receptors by IL-4, an immunosuppressive cytokine, respectively.
  • FIG. 4A Granzyme B
  • IFN- interferon-gamma
  • cytokine receptors The amino acid sequences of cytokine receptors that can be used to construct chimeric cytokine receptors or inverted cytokine receptors (ICRs) in the present invention are shown in Table 1 below.
  • ICR Inverted cytokine receptor
  • ICR_1 is composed of IL-4 receptor signal peptide (SEQ ID NO: 1) and extracellular domain (SEQ ID NO: 2), and IL-7 receptor transmembrane domain (SEQ ID NO: 14) and intracellular domain (SEQ ID NO: 15). .
  • ICR_2 is a control group of the present example, the IL-4 receptor signal peptide (SEQ ID NO: 1), the extracellular domain (SEQ ID NO: 2), the transmembrane domain (SEQ ID NO: 3) from which the intracellular domain of the IL-4 receptor has been deleted. was done.
  • ICR_3 was composed of IL-4 receptor signal peptide (SEQ ID NO: 1) and extracellular domain (SEQ ID NO: 2), and IL-21 receptor transmembrane domain (SEQ ID NO: 22) and intracellular domain (SEQ ID NO: 23). .
  • Each amino acid sequence composed of a combination of several cytokine receptors was converted into a nucleotide sequence having a codon sequence optimized for humans, synthesized, and cloned into a vector to obtain each inverted cytokine receptor (ICR) gene.
  • ICR inverted cytokine receptor
  • NK cells expressing chimeric cytokine receptors or inverted cytokine receptors (ICR) that can bind immunosuppressive cytokines and transmit immune activation signals into immune cells.
  • ICR inverted cytokine receptor
  • IL-2 recombinant interleukin-2
  • ICR inverted cytokine receptor
  • a primer set for confirming the expression of the receptor was used to confirm the expression of inverted cytokine receptor (ICR) in each NK cell by RT-PCR (FIG. 1A).
  • ICR inverted cytokine receptor
  • Each of the inverted cytokine receptor (ICR) expressing NK cells uses an antibody that binds to the extracellular domain of the IL-4 receptor, which is a site that binds to cytokines.
  • Inverted cytokine receptor (ICR) expression was confirmed by flow cytometry (NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences Inc.) (Fig. 1b).
  • Example 3 Confirmation of changes in characteristics of NK cells expressing inverted cytokine receptor (ICR) by immunosuppressive cytokines
  • NK cells were artificially treated with the immunosuppressive cytokine IL-4. Changes in properties and activity were confirmed.
  • NK cells there are activating receptors that transmit signals that activate NK cells by reacting with target cells, and inhibitory receptors that transmit signals that inhibit the activity of NK cells.
  • the balance of these receptors regulates the immune activity of NK cells.
  • the immune activation signal is strongly transmitted into the cell, thereby strongly inducing the immune activity of NK cells.
  • NK cell activating receptors To compare the expression changes of NK cell activating receptors according to the presence or absence of IL-4 cytokine in NK cells expressing inverted cytokine receptor (ICR), NKp30, NKp44, NKp46 and DNAM-1 on the surface of NK cells The expression level was confirmed using FACS (NovoCyte 3000, ACEA Bioscience Inc.). After incubating for 24 hours or 48 hours in an incubator at 5% CO 2 , 37°C with or without IL-4 cytokine treatment in NK cell culture medium, washing twice with PBS, each antibody was added to block light. After reacting for 30 minutes in the state, the cells were washed twice with PBS again. NK cells were suspended in 1% BSA/PBS and analyzed using FACS.
  • ICR_3 NK cells the cytotoxicity of ICR_3 NK cells was measured compared with C.V and ICR_2 NK cells as a control to confirm the cytotoxicity of NK cells introduced with the inverted cytokine receptor (ICR).
  • CFSE Carboxyfluorescein succinimidyl ester
  • NK cells were suspended in 1% BSA/PBS, and then cytotoxicity by NK cells was compared and analyzed using flow cytometry.
  • ICR_3 NK cells treated with IL-4 for 48 hours showed about 2.5 times cytotoxicity to K562 target cells compared to those without IL-4. Increased (Fig. 4a).
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • the NK cells expressing ICR_3 inverted cytokine receptor (ICR) produced in the present invention are immunosuppressive signals by immunosuppressive cytokines in a microtumor environment rich in immunosuppressive cytokines. It was confirmed that the anticancer efficacy can be exhibited far superior to that of conventional NK cells by transmitting an immune activation signal into cells by reverse use of.

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Abstract

본 발명은 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역 세포 및 이 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 면역억제성 사이토카인이 존재하는 미세종양환경하에서 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환함으로써 암에 대한 보다 강력한 세포독성효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 암 치료용 세포치료제로 사용할 수 있다.

Description

면역신호의 변환이 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역세포 및 이의 항암 용도
본 발명은 키메릭 사이토카인 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역 세포 및 이의 항암 용도에 관한 것이다.
최근 들어 면역세포들의 항암효과에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다. NK (Natural Killer) 세포는 선천성 면역체계(innate immune system)에 특화된 효과기 세포(effector cell) 이며 암세포 및 바이러스 감염에 대한 방어에 중요한 역할을 한다. NK 세포가 가지고 있는 자연 세포독성은 적절한 세포막의 자극에 의하여 빠르게 반응하며, 활성화 수용체 (activating receptor) 또는 억제 수용체 (inhibitory receptor)의 복잡한 신호전달에 의하여 조절된다. NK 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)와 유사하게 퍼포린(perforin)과 그랜자임(granzyme)을 통해 세포독성을 나타낸다.
NK 세포의 분화와 증식, 생존 그리고 기능을 활성화시키는 것에 있어서 다양한 사이토카인이 영향을 미치는 것으로 보고되어 있으며, 연구결과에 따르면 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등의 사이토카인이 NK 세포의 기능과 활성을 증가시킨다고 보고되어 있다. IL-2(Interleukin-2)는 휴지기 상태의 NK 세포에 직접적으로 작용하여 NK 세포의 증식에 영향을 미치고 세포독성 능력을 증가시키며, 퍼포린과 IFN-γ의 발현을 증가시킨다. IL-15(Interleukin-15)는 NK 세포의 세포독성 능력을 증가시키며, T/NK 전구 세포로부터 NK 세포로 분화되는 과정에 영향을 미치고, NK 세포의 생존과 증식에 중요한 역할을 한다.
IL-21 (Interleukin-21)은 활성화된 CD4+ T 세포에 의해 분비되는 사이토카인이며, IL-21 수용체 (IL-21R, IL-21 receptor)는 수지상세포, NK, T, B 세포와 같은 림프구에서 발현되어 있다. IL-21은 구조적으로 IL-2 및 IL-15와 매우 유사하며, IL-21R는 IL-2R, IL-15R, IL-7R 또는 IL-4R 등과 γ-사슬을 공유하고 있다. IL-21은 골수로부터의 NK 세포 전구체의 성숙을 유도하는 것으로 보고되었으며, 특히 NK 세포의 사이토카인 생성능과 세포사멸능과 같은 효과 기능(effector functions)을 증가시키는 것으로 보고되었으며, CD8+ T 세포의 효과 기능도 증가시킴으로써 내재, 적응면역계의 항암반응을 촉진시키는 것으로 보고되었다. 또한, 인간의 말초혈액에서 분리한 NK 세포를 활성화시키며, 제대혈에서 분리한 조혈 줄기세포로부터 성숙한 NK 세포를 유도하는데 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다.
면역억제성 사이토카인으로 IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β 등이 존재한다. IL-4는 T 세포 분화 동안 pro-Th2 효과로 잘 알려진 γc 계열의 사이토카인의 구성원이다. IL-4의 부재는 NK 세포 생성 및 항상성에 영향을 미치지 않는다. 그러나, NK 세포는 인 비트로(in vitro) 에서 IL-4 수용체를 발현한다. 주목할 것은 IL-4가 사이토카인 생산이나 세포독성과 같은 주요 NK 효과 기능(effector function)을 억제하는 능력이다. 실제로, IL-4는 인간 NK 세포에서 IL-12 처리 후에 유도된 염증성 사이토카인 (IFN-γ, TNFα 및 GM-CSF) 생산 증가를 억제한다는 것이 증명되었다. IL-4의 또 다른 측정 가능한 효과는 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 에서 NKG2D 및 다른 NK 세포 활성 마커 발현을 하향 조절하여, 결과적으로 NKG2D 의존성 세포 살상을 감소시키는 것이다. IL-4는 암 발병에도 중요한 영향을 미친다. 유방암, 전립선, 폐암, 신장암 등에서 IL-4R가 많이 증가된 것이 발견되었으며, 또한 많은 종류의 암에서 과발현됨이 발견되었다. IL-4는 면역억제성 사이토카인으로, 췌장암의 경우 면역회피 전략을 이용, 억제성 사이토카인을 생산하여 NK, CAR-T 세포의 지속성과 기능을 제한시킨다.
IL-10은 Th2 세포에서 발현 및 분비되어서 Th1 세포의 사이토카인 합성을 저해하는 것으로 처음에는 알려졌으나 (J.Exp.Med. 170,2081-2095), 지금은 대식세포(Macrophage), 수지상 세포(Dendritic cell, DC), B 세포는 물론 여러 종류의 CD4+ 및 CD8+ T 세포들에 의하여서도 생성되는 것으로 보고되고 있다. IL-10의 작용은 주로 단핵구(Monocyte) 또는 대식세포(Macrophage)가 항원을 제시하거나 T 세포를 자극하는데 필요한 MHCⅡ 및 B7-1/2의 발현을 방해함은 물론 IL-1α/β, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-α등과 같은 여러 염증유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 그리고 MCP1, MCP5, RANTES, IL-8 등의 염증유발 케모카인(pro-inflammatory chemokine) 들의 생성을 억제함으로서 궁극적으로는 T 세포 및 NK 세포의 기능을 방해하게 된다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) WO 2017/029512
(비특허문헌 1) 1. Vosshenrich CAJ, Ranson T, Samson SI, Corcuff E, Colucci F, Rosmaraki EE, et al. Roles for common cytokine receptor gamma-chain-dependent cytokines in the generation, differentiation, and maturation of NK cell precursors and peripheral NK cells in vivo. J Immunol (2005) 174:1213-21.
(비특허문헌 2) 2. Marcenaro E, Della Chiesa M, Bellora F, Parolini S, Millo R, Moretta L, et al. IL-12 or IL-4 prime human NK cells to mediate functionally divergent interactions with dendritic cells or tumors. J Immunol (2005) 1950(174):3992-8.
(비특허문헌 3) 3. Brady J, Carotta S, Thong RPL, Chan CJ, HayakawaY, Smyth MJ, et al. The inter*?*actions of multiple cytokines control NK cell maturation. J Immunol (2010) 185:6679-88. doi:10.4049/jimmunol.0903354.
(비특허문헌 4) 4. Kawakami K, Kawakami M, Puri RK (2001) Overexpressed cell surface interleukin-4 receptor molecules can be successfully targeted for antitumor cytotoxin therapy. Crit Rev Immunol 21: 299-310.
(비특허문헌 5) 5. Gooch JL, Christy B, Yee D (2002) STAT6 mediates interleukin-4 growth inhibition in human breast cancer cells. Neoplasia 4: 324-331.
본 발명자는 유전자 재조합 기술을 이용하여 면역세포에서 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환시킬 수 있는 키메릭 사이토카인 수용체를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 면역억제성 사이토카인과 반응할 수 있는 사이토카인 수용체의 세포외 도메인(extracellular domain)과 면역활성화 사이토카인 수용체의 막 관통―세포내 도메인(TM-cytoplasmic domain)을 가지는 인버티드 사이토카인 수용체(inverted cytokine receptor, ICR)을 제작하였고, 이를 NK (natural killer) 세포에서 성공적으로 발현시킨 후, 이의 면역신호 반응 및 우수한 면역 활성을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해,
본 발명은 (i) 사이토카인 결합 도메인; (ii) 막 관통 도메인; 및 (iii) 세포내 도메인;을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체로서, 상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 사이토카인 결합 도메인; (ii) 막 관통 도메인; 및 (iii) 세포내 도메인;을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체로서, 상기 세포내 도메인은 NK 세포의 면역활성화 신호를 유도하는 사이토카인인 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 또는 IL-21 수용체의 세포내 도메인을 포함하는, 키메릭 사이토카인 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, (i) 사이토카인 결합 도메인; (ii) 막 관통 도메인; 및 (iii) 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체로서, 상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 제공한다.
본 발명에서 용어 “키메릭 사이토카인 수용체(chimeric cytokine receptor)”는 서로 다른 기원(origin)에서 유래한 (i) 사이토카인 결합 도메인; (ii) 막 관통 도메인; 및 (iii) 세포내 도메인이 조합되어 연결된 수용체를 의미한다.
본 발명에서 용어 “사이토카인 결합 도메인 (cytokine binding domain)”은 세포외에서 특정 사이토카인에 특이적으로 결합하는 부위를 의미하여, 본 명세서에서 용어 “세포외 도메인(ectodomain)”으로도 지칭될 수 있다.
본 발명에서 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 부위이면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 및 TGF-β 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 세포외 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-4 수용체의 세포외 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-6 수용체의 세포외 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-10 수용체의 세포외 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TGF-β 수용체의 세포외 영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어 “막 관통 도메인 (transmembrane domain)”은 세포막을 관통하여 사이토카인 결합 도메인과 세포내 도메인을 연결하는 부위를 의미한다.
본 발명에서 막 관통 도메인은 세포막을 관통하여 사이토카인 도메인과 세포내 도메인을 연결하며, 사이토카인 결합에 의한 신호를 세포내 도메인으로 전달할 수 있는 물질 부위라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 막 관통 도메인은 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 및 IL-21 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 막 관통 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-7 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-12 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-2/15 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-18 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-21 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어 “세포내 도메인 (endodomain)”은 세포 내에 위치하여 상기 막 관통 도메인을 통해 전달되는 사이토카인 결합 신호를 세포 내부의 신호로 변환시키는 기능을 하는 부위를 의미한다.
본 발명에서 세포내 도메인은 사이토카인 결합에 의한 신호를 세포 내부로 변환 및 전달하는 기능을 하는 부위라면 어떠한 물질 부위도 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포내 도메인은 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 및 IL-21 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 세포내 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-7 수용체의 세포내 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-12 수용체의 세포내 영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-2/15 수용체의 세포내 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-18 수용체의 세포내 영역은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-21 수용체의 세포내 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체는 신호 펩타이드(signal peptide)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “신호 펩타이드(signal peptide)”는 발현된 키메릭 사이토카인 수용체를 세포막 부위로 이동 및 위치화(localization) 시키는 기능을 하는 펩타이드를 의미하며, 당업계에서 알려진 다른 용어 “신호 서열(signal sequence)”, “표적화 신호(targeting signal)”, 및 “위치화 신호(localization signal)” 등으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호 펩타이드는 키메릭 사이토카인 수용체의 사이토카인 결합 도메인에 연결되며, 바람직하게는 사이토카인 결합 도메인의 N-말단에 연결된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호 펩타이드는 IL-4, IL-6, IL-10, 및 TGF-β 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-4 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-6 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-10 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TGF-β 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체는 면역억제성 사이토카인의 신호를 면역활성화 신호로 변환시킬 수 있으며, 이러한 의미에서 다른 용어“인버티드 키메릭 수용체(inverted chimeric receptor)”로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명에서 용어 “코딩”은 천연 상태에서 또는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩티드 및/또는 그의 단편에 대한 mRNA를 제조하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 경우, 폴리펩티드를 “코딩”한다고 언급되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에서 용어 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 상호 교환적으로 사용되며 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머형태를 지칭한다. 상기 용어 폴리뉴클레오타이드는 단일, 이중, 또는 다중가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드(hybrid), 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적, 또는 유도체화된(derivatized) 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈(codon)의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 키메릭 사이토카인 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에서 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 재조합 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서와 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 푸로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포일 수 있다.
본 발명에서 재조합 벡터를 세포내로 도입하는 방법은 공지된 트랜스펙션(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell 22, 479 (1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology 52, 456 (1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10, 87 (1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터가 도입될 수 있는 세포는 면역 세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 NK (natural killer) 세포, T 세포, 세포독성 (cytotoxic) T 세포, 조절 (regulatory) T 세포, B 세포, 또는 NK-T 세포이며, 보다 바람직하게는 NK 세포 또는 T 세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 인간 유래 면역 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 NK 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 “T 세포”는 흉선에서 성숙하는 림프구의 종류를 지칭한다. T 세포는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 B 림프구와 같은 다른 림프구와 구별된다. T 세포는 또한 분리되거나 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(CD4+ 세포), 세포독성(cytotoxic) T 세포(CD8+ cells), 자연살해 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3을 발현하는 모든 종류의 면역세포를 포함한다. “세포독성 세포”는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, NK(natural-killer) 세포, 및 호중구를 포함한다.
본 발명에서 용어 “NK 세포”는 자연살해세포(natural killer cell)로도 알려져 있으며, 선천성 면역 체계(innate immune system)에서 중요한 역할을 하는, 골수에서 유래한 림프구의 종류를 지칭한다. 세포 표면에 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex) 또는 항체가 없어도, NK 세포는 바이러스 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스를 받은 세포(stressed cell)에 대한 빠른 면역 반응을 제공한다. 상업적 NK 세포주의 비제한적 예시는 NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)을 포함한다. 추가적인 예시는 NK 세포주 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, YT 및 NK101을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주의 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본 발명에서 형질전환된 세포를 선별하는 단계는 상술한 벡터의 선택표지에 의해 발현되는 표현형(phenotype)을 이용하여, 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선택표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환된 세포를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상술한 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 “치료”는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.
본 발명에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 비제한적 예로서, 유방암, 폐암, 위암, 간암, 담낭암, 혈액암, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 골수암, 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 세포를 포함하는 현탁액 형태의 주사제로 제조될 수 있다. 주사에 적합한 제약 형태는 용액 또는 분산액의 즉시 준비가 가능한 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 모든 경우에 주사액 형태의 제약제는 멸균되어야 하며, 주사가 용이할 정도로 유동성이 있어야 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 담체로는 특정 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다.
약학적 조성물의 담체는, 예를 들어 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 오염을 막기 위해 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제가 포함될 수 있으며, 당 또는 염화나트륨 등의 등장제도 포함될 수 있다. 또한, 체내 투여시 흡수작용을 연장시키기 위해 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴를 포함시킬 수 있다. 멸균 주사 용액은, 필요에 따라 상기 언급된 여러 다른 성분들을 가진 적합한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조된다.
본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 정맥내 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 또한, 치료될 대상의 상태 또는 조건에 따라 투여량을 조절할 수 있다. 수성의 주사 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 담체 및 제제, 매질에 대한 내용은 당업계에 공지되어 있다 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15판 참조).
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역 세포 및 이 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
(ii) 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 면역억제성 사이토카인이 존재하는 미세종양환경하에서 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환함으로써 암에 대한 보다 강력한 세포독성효과를 발휘할 수 있다.
(iii) 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 암 치료용 세포치료제로 사용할 수 있다.
도 1a 및 도 1b은 본 발명에서 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하도록 제작한 NK 세포들에서의 각 수용체 발현을 RT-PCR로 RNA 레벨에서 확인한 결과이고(도 1a), 유세포 분석으로 NK 세포의 세포막에서 발현되는 수용체를 확인한 결과이다(도 1b).
도 2는 미세종양환경과 같이 면역억제 신호가 존재하는 환경에서의 키메릭 사이토카인 수용체 발현 NK 세포의 면역활성을 확인하고자, 면역억제성 사이토카인인 IL-4를 처리한 후 NK 세포에서 생성하는 인터페론-감마(IFN-γ)의 양을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정한 결과이다.
도 3a 및 도 3b은 각각 면역억제성 사이토카인인 IL-4에 의한 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 NK 세포에서 DNAM-1, NKp46와 같은 면역활성화 마커들의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4a, 도 4b, 및 도 4c는 각각 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 NK 세포를 K562 암세포와 반응시켜 NK 세포에서 생성하는 그랜자임 B(Granzyme B)(도 4a), 인터페론-감마(IFN-γ)의 변화(도 4b) 및 암세포 살해능(도 4c) 확인함으로써 키메릭 사이토카인 수용체 발현 NK 세포의 세포독성을 확인한 결과이다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실시예 1. 인버티드 사이토카인 수용체(Inverted Cytokine Receptor, ICR) 발현 NK 세포의 제조
본 발명에서의 키메릭 사이토카인 수용체 또는 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)들 구성에 사용할 수 있는 사이토카인 수용체들의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
미세종양환경에서 면역억제성 사이토카인인 IL-4와 결합하여 NK 세포내에 면역활성화 신호를 전달할 수 있는 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 NK 세포를 제조하기 위하여, 사이토카인 수용체를 구성하는 펩타이드들의 조합으로 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)를 고안하였고, 이 ICR을 코딩하는 ICR_1, ICR_2, 그리고 ICR_3, 3 종의 유전자를 합성하였다. 각 유전자의 구조는 다음과 같고 각 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
ICR_1은 IL-4 수용체의 신호 펩타이드(서열번호 1)와 세포외 도메인(서열번호 2), 그리고 IL-7 수용체의 막관통 도메인(서열번호 14)과 세포내 도메인(서열번호 15)으로 이루어졌다.
ICR_2는 본 실시예의 대조군으로서 IL-4 수용체의 세포내 도메인이 삭제된, IL-4 수용체의 신호 펩타이드(서열번호 1)와 세포외 도메인(서열번호 2), 막관통 도메인(서열번호 3)으로 이루어졌다.
ICR_3는 IL-4 수용체의 신호 펩타이드(서열번호 1)와 세포외 도메인(서열번호 2), 그리고 IL-21 수용체의 막관통 도메인(서열번호 22)과 세포내 도메인(서열번호 23)으로 구성되었다.
여러 사이토카인 수용체들의 조합으로 구성된 각 아미노산 서열은 사람에 최적화된 코돈(codon) 서열을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 변환하여 합성하고 이를 벡터에 클로닝하여 각 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 유전자를 확보하였다.
면역억제성 사이토카인과 결합하여 면역세포 내부로 면역활성화 신호를 전달할 수 있는 키메릭 사이토카인 수용체 또는 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)를 발현하는 NK 세포를 제작하기 위하여 LONZA사의 Nucleofector Cell Line Nucleofector® Kit를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NK 세포에 각각의 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 유전자를 도입(transfection)하였다. 형질전환 후 세포는 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 100 U/ml의 재조합 인터루킨-2(IL-2)가 포함된 MEM alpha 배지에서 48시간 안정화시킨 후 푸로마이신(puromycin), 또는 게네티신(Geneticin, G418) 과 같은 항생제를 사용하여 형질 전환된 세포만을 선별(selection) 배양하여 세포주를 확립하였다.
Figure PCTKR2020013114-appb-T000001
Figure PCTKR2020013114-appb-I000001
실시예 2. 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 도입 NK 세포의 키메릭 수용체 발현 확인
본 실험에서 제작한 ICR이 도입된 NK 세포들에서 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)의 발현을 확인하고자 다음과 같이 mRNA 발현과 유세포분석을 수행하였다.
NK 세포로부터 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후 수용체의 발현을 확인하기위한 프라이머 세트인 정방향 프라이머(primer) 5'-GCCTCAGACAGTGGTTCAAAC-3' (서열번호 24)와 역방향 프라이머 5'-AGGCACAGTCGAGGCTGAT-3' (서열번호 25)를 사용하여 RT-PCR로 각 NK 세포에서의 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현을 확인하였다(도 1a). 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포들(ICR_1, ICR_2, ICR_3)에서 공통으로 가지고 있는, 사이토카인과 결합하는 부위인, IL-4 수용체의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 이용하여 각각의 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현을 유세포분석(NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences Inc.)으로 확인하였다(도 1b).
실시예 3. 면역억제성 사이토카인에 의한 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포의 특성 변화 확인
면역억제성 사이토카인이 다량 존재하는 종양미세환경과 유사한 환경 하에서 NK 세포와 ICR-NK 세포의 기능 및 활성을 비교하기 위하여, 인위적으로 면역억제성 사이토카인인 IL-4 을 처리하였을 때 NK 세포의 특성 및 활성 변화를 확인하였다.
먼저, 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현을 확인한 ICR_1, ICR_2, ICR_3, 3종의 NK 세포들의 면역억제성 사이토카인에 의한 면역 활성을 확인하기 위하여, 각 NK 세포에 5 ng/㎖ 의 IL-4 사이토카인을 24 시간 동안 처리한 후 인터페론-감마(IFN-γ)의 양을 측정하여 각 NK 세포의 면역 활성을 비교하였다. 그 결과, IL-21 수용체의 세포내 도메인을 가지고 있는 키메릭 수용체를 발현하는 ICR_3 NK 세포에서 다른 NK 세포들에 비해 인터페론-감마(IFN-γ) 생성량이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 2).
NK 세포의 수용체 중에는 표적 세포와 반응하여 NK 세포를 활성화하는 신호를 보내는 활성화 수용체(activating receptors)와 이와는 반대로 NK 세포의 활성을 억제하는 신호를 전달하는 억제 수용체(inhibitory receptors)가 존재하며 NK 세포에서 이 수용체들의 균형에 의해 NK 세포의 면역 활성이 조절된다. NK 세포 표면에 활성 수용체들의 발현이 증가하면 세포 내로 면역 활성화 신호를 강하게 전달해 줌으로써 NK 세포의 면역 활성을 강하게 유도할 수 있다.
인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포들에서 IL-4 사이토카인의 유무에 따른 NK 세포 활성화 수용체(activating receptors)들의 발현 변화를 비교하고자, NK 세포 표면의 NKp30, NKp44, NKp46와 DNAM-1 발현 정도를 FACS(NovoCyte 3000, ACEA Bioscience Inc.)를 사용하여 확인하였다. NK 세포 배양 배지에 IL-4 사이토카인을 처리하거나 처리하지 않은 채로 5％ CO2, 37℃의 배양기에서 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 세척하여 각 항체를 넣고 빛을 차단한 상태로 30분 반응시킨 후 다시 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였다. NK 세포를 1％ BSA/PBS 에 부유시킨 후 FACS를 사용하여 분석하였다. 면역억제성 사이토카인 IL-4를 24 h 또는 48 h 처리해 주었을 때, ICR_3의 세포에서 다른 활성 수용체의 발현은 약하게 증가되거나 오히려 감소함을 나타내었으나, NKp46, DNAM-1의 발현이 주요하게 증가되었다(도 3a 및 도 3b). 반면, CD158a(KIR2DL1), CD158b(KIR2DL2/ DL3), CD159a(NKG2A)와 같은 억제 수용체들의 발현량은 변화가 없었다(data not shown).
실시예 4. 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포의 세포독성
본 실험에서는 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)를 도입한 NK 세포의 세포독성을 확인하고자 대조군으로 C.V, ICR_2 NK 세포들과 비교하여 ICR_3 NK 세포의 세포독성을 측정하였다.
세포독성 분석 방법으로 K562 표적 세포(Target cell; T)에 1 x 106 세포(cells)당 최종 농도(final concentration) 0.5 μM이 되도록 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)을 넣어 5％ CO2, 37℃의 환경에서 30분 염색 후 PBS로 3회 세척한 후 96-웰 라운드 보텀 플레이트(96-well round bottom plate)에 4 X 104 개씩 분주하였다. IL-4 사이토카인을 처리하거나 처리하지 않은 채로 5％ CO2, 37℃의 배양기에서 48시간 동안 배양한 NK 세포(Effector cell; E)를 표적세포와 E:T ratio를 1:1 비율로 4 시간 반응시켜 NK 세포의 세포독성을 다음과 같이 측정하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후 1％ BSA/PBS 100㎕에 부유하고 각 웰에 7-AAD 5 ㎕를 첨가하여 빛을 차단한 상태로 4℃에서 30분 반응하여, 다시 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였다. 이후 NK 세포를 1％ BSA/PBS에 부유시킨 후 유세포분석기(Flow cytometry)를 사용하여 NK 세포에 의한 세포독성을 비교 분석하였다.
IL-4를 처리하지 않은 세포와 처리한 세포의 세포독성을 비교하였을 때, IL-4를 48시간 처리한 ICR_3 NK 세포는 IL-4가 없을 때에 비해 K562 표적세포에 대한 세포독성이 약 2.5배 증가하였다(도 4a). 이 때 NK 세포에서 생성된 그랜자임 B(Granzyme B)와 인터페론-감마(IFN-γ)의 양을 ELISA로 측정하였다. 그 결과, IL-4를 48시간 처리한 ICR_3 NK 세포에서 그랜자임과 인터페론-감마 역시 특이적으로 높게 분비되었음을 확인하였다(도 4b 및 도 4c).
상기의 실험결과들에 의해, 본 발명에서 제작한 ICR_3 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포는, 면역억제 사이토카인이 풍부하게 존재하는 미세종양환경에서의 면역억제 사이토카인에 의한 면역억제 신호를 역이용하여 세포 내로 면역활성화 신호를 전달함으로써 기존의 NK 세포보다 훨씬 뛰어난 항암 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. (i) 사이토카인 결합 도메인;
    (ii) 막 관통 도메인; 및
    (iii) 세포내 도메인;을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체로서,
    상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 및 TGF-β 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 세포외 영역을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 IL-4 수용체의 세포외 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-6 수용체의 세포외 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-10 수용체의 세포외 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고; 및
    상기 TGF-β 수용체의 세포외 영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 막 관통 도메인은 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 및 IL-21 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 막 관통 영역을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 IL-7 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-12 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-2/15 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-18 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; 및
    상기 IL-21 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포내 도메인은 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 및 IL-21 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 세포내 영역을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 IL-7 수용체의 세포내 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-12 수용체의 세포내 영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-2/15 수용체의 세포내 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-18 수용체의 세포내 영역은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; 및
    상기 IL-21 수용체의 세포내 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 사이토카인 결합 도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 신호 펩타이드는 IL-4, IL-6, IL-10, 및 TGF-β 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 신호 펩타이드를 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 IL-4 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-6 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 IL-10 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; 및
    상기 TGF-β 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제 11 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 세포는 NK 세포, T 세포, 세포 독성 T 세포 또는 조절 T 세포인 세포.
  15. 제 13 항에 기재된 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 담낭암, 혈액암, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 골수암, 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 암인, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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