JP2022526187A - 造血細胞の細胞傷害性を促進するための組成物及び方法 - Google Patents

造血細胞の細胞傷害性を促進するための組成物及び方法 Download PDF

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ジャクリーン ゾイネ，
ジャンナ ブラネラ，
ハリソン シー． ブラウン，
ハロルド トレント スペンサー，
クリストファー ドーリング，
シャンムガナタン チャンドラカサン，
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エモリー ユニバーシティー
チルドレンズ ヘルスケア オブ アトランタ， インコーポレイテッド
エクスプレッション セラピューティクス， エルエルシー
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Abstract

本明細書に提供するのは、造血細胞の細胞傷害性を促進するための組成物及び方法である。

Description

関連する先行出願
本出願は、２０１９年４月１２日に出願された米国仮出願第６２／８３３，０１１号、２０１９年４月２５日に出願された米国仮出願第６２／８３８，４６８号の利益を主張する。当該仮出願の両方は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
がんの治療のためのＴ細胞ベースの治療法の使用は、Ｔ細胞を操作して腫瘍特異的免疫応答を生成させ、患者のがんの寛解に至るまで進んだ。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍抗原に結合するように設計された組み換え受容体であり、それ故、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の認識及びプライミングを回避しながらＣＡＲ Ｔ細胞を活性化する。しかしながら、ＣＡＲの成功は多くの場合限定的である。
本明細書に提供するのは、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、該組み換えタンパク質は、受容体リガンド及び膜貫通ドメインを含む。任意に、該受容体リガンドは、非抗体リガンドであり、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞または分化がん細胞（例えば、造血起源のがん幹細胞または分化がん細胞）の表面で発現する受容体に結合する。ある特定の構築物では、該組み換えタンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
同様に提供するのは、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、該組み換えタンパク質は、受容体リガンド、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータを含む。任意に、該受容体リガンドは、非抗体リガンドであり、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞または分化がん細胞（例えば、造血起源のがん幹細胞または分化がん細胞）の表面で発現する受容体に結合する。任意に、該組み換えタンパク質は、共刺激ドメインを含まない。
さらに提供するのは、抗体断片及び膜貫通ドメインを含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物である。該抗体は、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞または分化がん細胞（例えば、造血起源のがん幹細胞または分化がん細胞）の表面で発現する受容体に結合する。任意に、該組み換えタンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いている。いくつかの実施形態では、該抗体は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、該受容体は、造血起源のがんに存在する抗原である（例えば、ＣＤ５またはＣＤ１９）。
いくつかの実施形態では、本開示の構築物の受容体リガンドは、該受容体の天然リガンドまたはその一部を含む。例えば、該受容体リガンドは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、ＣＲＫ様タンパク質（ＣＲＫＬ）、Ｌ－セレクチン、ＣＤ９、Ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＦＨＬ－２）、ガレクチン－８（ＬＧＡＬＳ８）、テトラスパニン－４（ＴＳＰＡＮ４）、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、及び白血球インテグリンＭａｃ１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）またはその結合断片からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、該膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、シトクロムｂ５尾部アンカー、ＣＤ１３７アンカー、及びダッフィ抗原／ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、（ａ）ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ－３、ＣＲＫＬ、Ｌ－セレクチン、ＣＤ９、ＦＨＬ－２、ＬＧＡＬＳ８、ＴＳＰＡＮ４、ＡＰＣ、及びＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８またはその結合断片からなる群から選択される受容体リガンド、（ｂ）膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＣＤ２８ポリペプチド、ならびに（ｃ）ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、該構築物の任意の２つの構成要素をヒンジ領域が分離する。任意に、該ヒンジ領域は、ＣＤ８αのヒンジ領域である。任意に、該構築物は、さらにシグナル配列を含む。任意に、該シグナル配列は、ＩＬ－２のシグナル配列である。任意に、該シグナル配列は、該受容体リガンドの天然のシグナル配列である。
該核酸配列は、細胞または組織を標的としたコドン最適化配列であり得る。
いくつかの実施形態では、該受容体リガンドは、配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＰＯ結合断片である。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも９０％同一である配列をコードする。
いくつかの実施形態では、該受容体リガンドは、配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む幹細胞因子結合断片である。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、配列番号８と少なくとも９０％同一である配列をコードする。
同様に提供するのは、本明細書に提供する核酸構築物または配列のいずれかを含むベクターである。いくつかの実施形態では、該ベクターは、組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）または組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
さらに提供するのは、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は、該細胞の表面で該組み換えタンパク質を発現する。該細胞は、アルファベータＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、リンホカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びマクロファージからなる群から選択される。
同様に提供するのは、本明細書に提供する核酸構築物またはベクターのいずれかで細胞を形質導入することを含む、改変細胞の作製方法である。いくつかの実施形態では、該細胞は、アルファベータＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、リンホカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＹ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びマクロファージからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該細胞は、形質導入の前に対象から採取される。
さらに提供するのは、本明細書に提供する方法のいずれかによって生成される細胞である。
同様に提供するのは、有効量の本明細書に記載の細胞のいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞、または分化がん細胞を枯渇させる方法である。いくつかの実施形態では、該造血幹細胞もしくは前駆細胞またはがん幹細胞は、ＭＰＬ＋、ｃ－ＫＩＴ＋、ＦＬＴ３＋、ＩＬ－３受容体＋、ＣＤ３４＋、インテグリンアルファ３／ベータ１＋、内皮プロテインＣ受容体＋またはＴｈｙ－１／ＣＤ９０＋である。いくつかの実施形態では、該対象は、がんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。他の実施形態では、該対象は、非悪性疾患のための造血幹細胞移植を必要とする。
同様に提供するのは、対象におけるがんの治療方法または対象への移植のための造血幹細胞の調整方法であり、該方法は、（ａ）第一の対象から採取される細胞に、本明細書に記載の核酸構築物またはベクターを導入すること、及び（ｂ）第二の対象に該細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該第一の対象及び該第二の対象は、異なる対象である。いくつかの実施形態では、該第一の対象及び該第二の対象は、同じ対象である。いくつかの実施形態では、該対象は、ＣＤ５＋、ＣＤ１９＋、ＭＰＬ＋、ｃ－ＫＩＴ＋、ＦＬＴ３＋、ＩＬ－３受容体＋、ＣＤ３４＋、インテグリンアルファ３／ベータ１＋、内皮プロテインＣ受容体＋またはＴｈｙ－１／ＣＤ９０＋の細胞を備えたがんを有する。いくつかの実施形態では、該がんは、急性骨髄性白血病である。いくつかの実施形態では、該がんは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、造血幹細胞及び／または前駆細胞を該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、化学療法または免疫療法を該対象に施すことを含む。
本出願は、以下の図を含む。これらの図は、当該組成物及び方法のある特定の実施形態及び／または特徴を説明し、該組成物及び方法の任意の説明（複数可）を補足することを意図している。これらの図は、記載された説明が明示的に該組成物及び方法の範囲を限定することを示さない限り、該組成物及び方法の範囲を限定しない。
ヒト－ＴＰＯキメラ抗原受容体（ｈＴＰＯ－ＣＡＲ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドの概略図である。 ＧＦＰ陽性のｈＴＰＯ－ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の代表的な画像及びフローサイトメトリーで測定したそれらの量である。 ｈＴＰＯ－ＣＡＲ（ＧＦＰ＋）Ｔ細胞とＭｏ７ｅ細胞の共培養におけるＴ細胞活性化マーカーの特異的な上方制御を、未形質導入Ｔ細胞（ＧＦＰ－）と比較して示す。 ｈＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞が、マウス造血幹前駆細胞（ＬＳＫ細胞）に対して特異的な細胞傷害活性を有することを示す。ｈＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した場合のマウスＬＳＫ（Ｌｉｎ－Ｓｃａ－１＋ｃ－ｋｉｔ＋）細胞のアポトーシス及び細胞死を示す代表的な蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）プロット（左のパネル）及びそれに対応するＣＦＵカウント（右のパネル）が示されている。 マウスの異なる造血コンパートメントにおけるＭＰＬがん原遺伝子（ＭＰＬ）の発現を示す。造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）及び造血細胞（ＨＰＣ）コンパートメントにおけるＭＰＬ発現の代表的なフローサイトメトリープロットが示されている。マウス骨髄前駆細胞におけるＭＰＬ発現の分析により、ＭＰＬ発現が、造血幹細胞（ＨＳＣ）で、造血前駆細胞（ＨＰＣ）と比較して濃縮されることが明らかになった。マウス造血幹細胞及び前駆細胞集団（多能性前駆細胞［ＭＰＰ］、短期［ＳＴ］再増殖ＨＳＣ、長期［ＬＴ］再増殖ＨＳＣ、顆粒球マクロファージ前駆細胞［ＧＭＰ］、骨髄球系共通前駆細胞［ＣＭＰ］、リンパ球系共通前駆細胞［ＣＬＰ］）を、表面マーカー、例えば、ｌｉｎｅａｇｅ陰性、ｓｃａ－１陽性、ｃ－ｋｉｔ陽性（ＬＳＫ）、ＣＤ４８及びＣＤ１５０を使用して区別した。 ヒトの異なる造血コンパートメントにおけるＭＰＬの発現を示す。ＨＳＰＣ及びＨＰＣコンパートメントにおけるＭＰＬ発現の代表的なフローサイトメトリープロットが示されている。ヒト骨髄前駆細胞におけるＭＰＬ発現の分析により、ＭＰＬ発現が、ＨＳＣで、ＨＰＣと比較して濃縮されることが明らかになった。 マウス及びヒトＨＳＰＣにおいてｐＳＴＡＴ５染色によって評価したＴＰＯに対する応答を示す。ＨＰＣ及びＨＳＰＣコンパートメントでのＴＰＯ刺激後のｐＳＴＡＴ５のフローサイトメトリーが示されている。ＴＰＯ曝露後のｐＳＴＡＴ５の分析により、マウス骨髄の２～３％がＴＰＯに応答し、ＴＰＯ応答細胞がＨＳＰＣコンパートメントで濃縮されていることが明らかになった。同様に、ＴＰＯ応答細胞は、ヒト骨髄のＨＳＰＣコンパートメントで濃縮されている。 Ｓｔ．Ｊｕｄｅ ＰｅＣａｎデータベースから取得したデータに基づくＭＰＬ発現を示す。ＭＰＬのＲＮＡ配列決定データを取得し、副腎皮質癌（ＡＣＴ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＢＡＬＬ）、脈絡叢癌（ＣＰＣ）、上衣腫（ＥＰＤ）、高悪性度神経膠腫（ＨＧＧ）、低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、髄芽腫（ＭＢ）、黒色腫（ＭＥＬ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、神経芽細胞腫（ＮＢＬ）、骨肉腫（ＯＳ）、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、横紋筋肉腫（ＲＨＢ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、及びウィルムス腫瘍（ＷＬＭ）を含めた複数の小児科亜集団にわたる発現を示すようにフォーマットした。箱ひげ図及びバイオリン図は、点線で示されるすべての腫瘍の発現の中央値とともに示されている。 急性巨核芽球性白血病（ＡＭＬＭ７、Ｎ＝１０２）及びコア結合因子（ＣＢＦ、Ｎ＝４４）白血病が、未同定のＡＭＬ集団（Ｎ＝１６０）と比較してＭＰＬの遺伝子発現が高いことを示す小児ＡＭＬ患者からのデータを示す。 ＭＰＬ発現のＳｔ．Ｊｕｄｅ ＰｅＣａｎデータポータルの発現及びＴＣＧＡの遺伝子発現のＡＭＬデータセットを示す。小児Ｎ＝３０６、成人Ｎ＝１７３。 幹細胞研究で一般に標的とされる受容体であるｃ－ｋｉｔのＳｔ．Ｊｕｄｅ ＰｅＣａｎデータポータルからの遺伝子発現分析を示す。これは、複数の組織及びがん型にわたって高発現を示し、問題のある標的になっている。 がん細胞株ＨＥＬ（Ｎ＝３）、ＣＭＫ（Ｎ＝３）、Ｍｏ７ｅ（Ｎ＝３）、及びＬｏｕｃｙ（Ｎ＝３）の表面ＭＰＬ発現ならびに対照細胞株Ｋ５６２及び６９７の代表的なフローサイトメトリー分析である。 ＭＰＬの表面発現分析の平均蛍光強度が、ＨＥＬ（１００８±３７８．４）及びＣＭＫ（１３３０±１６０．５）細胞株で、Ｍｏ７ｅ（３１６．７±６．６６）及びＬｏｕｃｙ（２３３±８．６６）株と比較して有意に高い発現を示したことを示す。 組み換えヒトＴＰＯで４５分間刺激し、固定し、透過処理し、ｐＳＴＡＴ５発現について評価した細胞の結果を示す。ＨＥＬ、ＣＭＫ、及びＭｏ７ｅ細胞株の代表的なフローサイトメトリーは、刺激後に、非刺激対照と比較してｐＳＴＡＴ５発現の増加を示した。 ＴＰＯによる刺激後のｐＳＴＡＴ５の平均蛍光強度を示す。すべての細胞株は反応性であり、ＴＰＯで刺激した場合、２元配置分散分析で分析すると、ｐＳＴＡＴ５に有意な増加を示した（Ｐ＜．０００１）のと比較して、対照細胞株Ｋ５６２及び６９７では、ＴＰＯによる違いを示さなかった。 前駆細胞及び幹様コンパートメントに分離した全マウス骨髄（Ｎ＝１３）を使用したＭＰＬの表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。代表的なフローサイトメトリー（ｙ軸：カウント、ｘ軸：ＭＰＬ）は、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）が、短期造血幹細胞（ＳＴ－ＨＳＣ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、及び前駆細胞と比較して、最も高いＭＰＬの表面発現を有することを示した。 各骨髄コンパートメントで評価したＭＰＬ発現の平均蛍光強度を示す。一元配置分散分析によるＭＦＩの有意差が、前駆細胞（１６５．２±２６．１、Ｐ＜０．０００１）、ＭＰＰ（５７０．６±１２２．５、Ｐ＜０．０００１）、ＳＴ－ＨＳＣ（１３７３±２３４．３、Ｐ＜０．０００１）、及びＬＴ－ＨＳＣ（２６８２±２５３．２）に存在した。 マウス及びヒトの組み換えＴＰＯの交差反応性についての試験の結果を示す。マウス骨髄をＴＰＯで４５分間刺激し、固定し、透過処理し、ｐＳＴＡＴ５を染色した。骨髄は、ｐＳＴＡＴ５発現を調べる際、ｌｉｎｅａｇｅ－ｃ－ｋｉｔ＋（ＬＫ）及びｌｉｎｅａｇｅ－ｃ－ｋｉｔ＋ｓｃａ－１＋（ＬＳＫ）でさらに描写した。分化の程度が小さいＬＳＫコンパートメントは、分化の程度が大きいＬＫコンパートメントと比較して、マウス及びヒトの両ＴＰＯに対して反応性であったことをデータが示唆している。 Ｐ２Ａ配列を使用した高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）及びＴＰＯ－ＣＡＲを発現するのに用いられる非コドン最適化（ＮＣＯ）ＴＰＯ－ＣＡＲバイシストロン性導入遺伝子構築物の概略図である。これは、５’の長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ｈＵＢＣ）、ｅＧＦＰ配列、Ｐ２Ａ配列、インターロイキン－２のシグナル配列（ＩＬ－２ｓｓ）、ＴＰＯ－ＣＡＲ、ｍｙｃエピトープタグ、ＣＤ２８領域、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン及び３’ＬＴＲを含む。 ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲコドン最適化導入遺伝子構築物の概略図である。ＮＣＯ－ＴＰＯ－ＣＡＲとは対照的に、この構築物は、ｍｙｃタグエピトープを含まず、ＩＬ２シグナル配列（シグナル配列）からＣＤ３ζ配列の終わりまで完全にコドン最適化されており、ＣＨ３ヒンジドメインを含む。 感染多重度（ＭＯＩ）５０での活性化による、単離の２４時間後に形質導入した健康な９ドナー由来の初代Ｔ細胞によるＧＦＰ発現を示す。表示されているＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ構築物のＧＦＰパーセンテージは、２２～４０％である。 ＲＴ－ＰＣＲ用にゲノムＤＮＡを単離した後のベクターコピー分析の結果を示す。ベクターコピー分析により、コドン最適化（ＣＯ）ＴＰＯ－ＣＡＲ構築物では、ベクターコピー数（ＶＣＮ）がＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ構築物と比較して有意に高いが、ＣＤ１９ＣＡＲ対照とは有意差がないことが示された。 ＧＦＰ＋／－集団の活性化を示す。ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＭｏ７ｅ標的細胞株を用いて４時間の共培養実験を設定し、ＧＦＰ＋／－集団の活性化を測定した。４時間後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析用に染色した。形質導入ＴＰＯ ＣＡＲ集団において、二元配置分散分析（Ｐ＜．００１）によるパーセンテージの有意な増加が、ＣＤ６９（１６．６７±４．１６対７４．０±７．５５、活性化の初期マーカー、Ｐ≦０．０００１）、ＣＤ３８（１７．３３±４．１６対７６．３３±１１．５、活性化の長期マーカー、Ｐ≦０．０００１）、及びＣＤ１０７ａ（５±１対２１．３±５．０３、脱顆粒、Ｐ≦０．０２７）で測定された。 検出用にＣＤ３ζ及びＨＲＰを使用したウエスタンブロット分析用のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにロードしたタンパク質細胞溶解物（４０μｇ）からのウエスタンブロットである。３１５秒間の露光後、ＣＤ３ζのバンドが、ナイーブＴ細胞（ＨＤ９）、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ（ＣＡＲバンド：４３．３５ｋＤａ）、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ（ＣＡＲバンド：５５．６４ｋＤａ）、及び対照ＣＤ１９ＣＡＲ（ＣＡＲバンド：５５．９７ｋＤａ）で検出された。これら細胞のベクターコピー数は、同様のコピー数を示すために右側に示されている。データは、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲにおいて、ＣＤ１９ＣＡＲ及び検出不能のＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲと比較してＣＡＲが多いことを示す。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。細胞をＨＥＬ細胞と共培養した場合の１２時間の共培養実験後の活性化を測定した。活性化は、ＣＤ６９単独またはＣＤ６９及びＣＤ３８の表面発現により測定した。データは、三連実験の１つのＴ細胞ドナーを示す。しかしながら、データは、全ドナーを代表するものである。非形質導入Ｔ細胞と比較して、活性化の有意な増加が、すべての細胞株及びすべての活性化測定において見られた。＊＊＊Ｐ＜．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。細胞をＣＭＫ細胞と共培養した場合の１２時間の共培養実験後の活性化を測定した。活性化は、ＣＤ６９単独またはＣＤ６９及びＣＤ３８の表面発現により測定した。データは、三連実験の１つのＴ細胞ドナーを示す。しかしながら、データは、全ドナーを代表するものである。非形質導入Ｔ細胞と比較して、活性化の有意な増加が、すべての細胞株及びすべての活性化測定において見られた。＊＊＊Ｐ＜．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。細胞をＭｏ７ｅ細胞と共培養した場合の１２時間の共培養実験後の活性化を測定した。活性化は、ＣＤ６９単独またはＣＤ６９及びＣＤ３８の表面発現により測定した。データは、三連実験の１つのＴ細胞ドナーを示す。しかしながら、データは、全ドナーを代表するものである。非形質導入Ｔ細胞と比較して、活性化の有意な増加が、すべての細胞株及びすべての活性化測定において見られた。＊＊＊Ｐ＜．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。ＴＰＯ ＣＡＲの細胞傷害能を、ＨＥＬ細胞に対して１２時間の共培養アッセイで測定した。０：１（染色標的細胞単独）、１：１、２：１、及び５：１（ｙ軸）を含めたエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）の増加を、非形質導入Ｔ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ、及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで検討した。ＣＤ１９ＣＡＲは、１：１のＥ：Ｔ比でのみ調べた。すべての標的細胞株において、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ共培養条件で、非形質導入及びＣＤ１９ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と比較して、有意な細胞死が見られた。＊＊＊ｐ＜０．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。ＴＰＯ ＣＡＲの細胞傷害能を、ＭＯ７ｅ細胞に対して１２時間の共培養アッセイで測定した。０：１（染色標的細胞単独）、１：１、２：１、及び５：１（ｙ軸）を含めたエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）の増加を、非形質導入Ｔ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ、及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで検討した。ＣＤ１９ＣＡＲは、１：１のＥ：Ｔ比でのみ調べた。すべての標的細胞株において、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ共培養条件で、非形質導入及びＣＤ１９ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と比較して、有意な細胞死が見られた。＊＊＊ｐ＜０．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。ＴＰＯ ＣＡＲの細胞傷害能を、ＣＭＫ細胞に対して１２時間の共培養アッセイで測定した。０：１（染色標的細胞単独）、１：１、２：１、及び５：１（ｙ軸）を含めたエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）の増加を、非形質導入Ｔ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ、及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで検討した。ＣＤ１９ＣＡＲは、１：１のＥ：Ｔ比でのみ調べた。すべての標的細胞株において、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ共培養条件で、非形質導入及びＣＤ１９ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と比較して、有意な細胞死が見られた。＊＊＊ｐ＜０．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。複数のドナーからの細胞傷害性アッセイをプールし、エフェクター対標的比１：１を、各細胞株内で比較した。ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲは、すべてのドナーにおいて、ＨＥＬを、非形質導入Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に多く殺傷した。＊＊Ｐ＜．０１ ＊＊＊Ｐ＜．００１。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。複数のドナーからの細胞傷害性アッセイをプールし、エフェクター対標的比１：１を、各細胞株内で比較した。ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲは、すべてのドナーにおいて、ＣＭＫを、非形質導入Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に多く殺傷した。＊＊Ｐ＜．０１ ＊＊＊Ｐ＜．００１。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。複数のドナーからの細胞傷害性アッセイをプールし、エフェクター対標的比１：１を、各細胞株内で比較した。ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲは、すべてのドナーにおいて、Ｍｏ７ｅを、非形質導入Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に多く殺傷した。＊＊Ｐ＜．０１ ＊＊＊Ｐ＜．００１。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。この共培養細胞傷害性実験後、残ったＨＥＬ細胞株の生標的細胞を、残存ＭＰＬ発現及びＭＦＩについて評価した。このＴＰＯ－ＣＡＲ条件では、細胞傷害性データにおける残りの標的での表面ＭＰＬ発現及びＭＦＩは、エフェクター：標的比が増加するにつれ、かなり減少した。また、ＭＰＬの表面発現は、ナイーブＴ細胞で処理した標的細胞と比較して低かった。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。この共培養細胞傷害性実験後、残ったＨＥＬ細胞株の生標的細胞を、残存ＭＰＬ発現及びＭＦＩについて評価した。このＴＰＯ－ＣＡＲ条件では、細胞傷害性データにおける残りの標的での表面ＭＰＬ発現及びＭＦＩは、エフェクター：標的比が増加するにつれ、かなり減少した。また、ＭＰＬの表面発現は、ナイーブＴ細胞で処理した標的細胞と比較して低かった。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。この共培養細胞傷害性実験後、残ったＣＭＫ細胞株の生標的細胞を、残存ＭＰＬ発現及びＭＦＩについて評価した。このＴＰＯ－ＣＡＲ条件では、細胞傷害性データにおける残りの標的での表面ＭＰＬ発現及びＭＦＩは、エフェクター：標的比が増加するにつれ、かなり減少した。また、ＭＰＬの表面発現は、ナイーブＴ細胞で処理した標的細胞と比較して低かった。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。この共培養細胞傷害性実験後、残ったＣＭＫ細胞株の生標的細胞を、残存ＭＰＬ発現及びＭＦＩについて評価した。このＴＰＯ－ＣＡＲ条件では、細胞傷害性データにおける残りの標的での表面ＭＰＬ発現及びＭＦＩは、エフェクター：標的比が増加するにつれ、かなり減少した。また、ＭＰＬの表面発現は、ナイーブＴ細胞で処理した標的細胞と比較して低かった。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。ＭＰＬ－細胞をＣＦＳＥで染色し、ＭＰＬ＋（ＨＥＬ（図９Ｎ）及びＣＭＫ（図９Ｏ））細胞をＶＰＤ４５０で染色した。各細胞株から１０万個の細胞を混合し、１００，０００個のＴＰＯ－ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞とともにインキュベートした。細胞傷害性を、ＭＰＬ－細胞、Ｋ５６２（１５．７％±１．６）及び６９７（２１．４％±０．５）で測定し、ＭＰＬ＋ＨＥＬ細胞は、それぞれ、５７．８％±１．３、Ｐ＜０．０００１及び４１．９±０．４、Ｐ＜０．０００１で細胞死を示した。ＨＥＬ細胞でこの実験を繰り返した場合、ＴＰＯ－ＣＡＲによるＫ５６２の細胞傷害性は１１．７％±０．６であり、６９７の細胞傷害性は２５．０％±５．７４であったのに対し、ＣＭＫの細胞傷害性は、８３．６±８．６、Ｐ≦０．０００１及び７６．１±１．０、Ｐ≦０．０００１であった。ＨＥＬ細胞及びＣＭＫ細胞は、ＭＰＬ－細胞６９７またはＫ５６２よりも有意に高い死を示した。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。ＭＰＬ－細胞をＣＦＳＥで染色し、ＭＰＬ＋（ＨＥＬ（図９Ｎ）及びＣＭＫ（図９Ｏ））細胞をＶＰＤ４５０で染色した。各細胞株から１０万個の細胞を混合し、１００，０００個のＴＰＯ－ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞とともにインキュベートした。細胞傷害性を、ＭＰＬ－細胞、Ｋ５６２（１５．７％±１．６）及び６９７（２１．４％±０．５）で測定し、ＭＰＬ＋ＨＥＬ細胞は、それぞれ、５７．８％±１．３、Ｐ＜０．０００１及び４１．９±０．４、Ｐ＜０．０００１で細胞死を示した。ＨＥＬ細胞でこの実験を繰り返した場合、ＴＰＯ－ＣＡＲによるＫ５６２の細胞傷害性は１１．７％±０．６であり、６９７の細胞傷害性は２５．０％±５．７４であったのに対し、ＣＭＫの細胞傷害性は、８３．６±８．６、Ｐ＜０．０００１及び７６．１±１．０、Ｐ＜０．０００１であった。ＨＥＬ細胞及びＣＭＫ細胞は、ＭＰＬ－細胞６９７またはＫ５６２よりも有意に高い死を示した。 ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。標的細胞ＨＥＬ（図９Ｐ）、ＣＭＫ（図９Ｑ）、及びＭｏ７ｅ（図９Ｒ）を、＋／－４００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯで、ナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と、１：１の比で１２時間共培養した。ＴＰＯの添加により、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲと共培養した場合、３種すべてのがん細胞株において、細胞傷害性が有意に低下した。ＴＰＯを含むＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲとともに培養したＣＭＫ細胞及びＭｏ７ｅ細胞は、ナイーブＴ細胞の殺傷と比較して、有意に高い細胞死を示した。通常の一元配置分散分析、＊＊＊＊Ｐ＜．０００１、＊＊＊Ｐ＜．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。標的細胞ＨＥＬ（図９Ｐ）、ＣＭＫ（図９Ｑ）、及びＭｏ７ｅ（図９Ｒ）を、＋／－４００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯで、ナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と、１：１の比で１２時間共培養した。ＴＰＯの添加により、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲと共培養した場合、３種すべてのがん細胞株において、細胞傷害性が有意に低下した。ＴＰＯを含むＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲとともに培養したＣＭＫ細胞及びＭｏ７ｅ細胞は、ナイーブＴ細胞の殺傷と比較して、有意に高い細胞死を示した。通常の一元配置分散分析、＊＊＊＊Ｐ＜．０００１、＊＊＊Ｐ＜．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲの活性化、細胞傷害性及び特異性を示す。標的細胞は、ＶＰＤ４５０増殖色素またはＣＦＳＥ色素で染色した。共培養を確立し、１２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー用にＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＭＰＬ、アネキシンＶ、及びＰＩ染色した。標的細胞ＨＥＬ（図９Ｐ）、ＣＭＫ（図９Ｑ）、及びＭｏ７ｅ（図９Ｒ）を、＋／－４００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯで、ナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と、１：１の比で１２時間共培養した。ＴＰＯの添加により、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲと共培養した場合、３種すべてのがん細胞株において、細胞傷害性が有意に低下した。ＴＰＯを含むＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲとともに培養したＣＭＫ細胞及びＭｏ７ｅ細胞は、ナイーブＴ細胞の殺傷と比較して、有意に高い細胞死を示した。通常の一元配置分散分析、＊＊＊＊Ｐ＜．０００１、＊＊＊Ｐ＜．００１ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞と比較して細胞傷害性であることを示す。標的細胞ＨＥＬ（Ａ）、ＣＭＫ（Ｂ）、及びＭｏ７ｅ（Ｃ）を、用量０、０．１、１、１０、１００、及び４００の組み換えＴＰＯにて、ナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と、１：１の比で１２時間共培養した。ＴＰＯの添加により、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲと共培養した場合、３種すべてのがん細胞株において、用量４００ｎｇ／ｍＬでの細胞傷害性が有意に低下した（Ｐ＜．０５）。ＴＰＯの生理学的用量（約１２０ｐｇ／ｍＬ）を含めたすべての場合において、ＴＰＯ－ＣＡＲは、ナイーブＴ細胞と比較して有意に細胞傷害性である。 白血病異種移植片における、ＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ有効性を示す。概略図は、非形質導入Ｔ細胞（ｎｏｎ－ｔｘｄ）及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞をＣＭＫ細胞株に対して試験するためのＮＳＧマウス実験の設計を示す。マウスに低線量の放射線を照射してＣＭＫ細胞の生着を促進し、ルシフェラーゼで改変した５ｘ１０６個のＣＭＫ細胞を投与した。１０日後、マウスに５×１０６個のＴ細胞を投与した。 白血病異種移植片における、ＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ有効性を示す。治療開始から４０日目までの生存曲線は、ＣＭＫ白血病モデルでは、非形質導入（ｎｏｎ－ｔｘｄ）Ｔ細胞（Ｎ＝４）またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ＝４）を投与した動物間で有意な延命効果を示さない。ＣＭＫ細胞株を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞＋／－ポリクローナルＴＰＯ抗体、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞＋／－ポリクローナルＴＰＯ抗体からの培地で４５分間刺激した。 白血病異種移植片における、ＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ有効性を示す。代表的なヒストグラムは、ｐＳＴＡＴ５染色が、条件培地の存在下では有意に増加したが、ＴＰＯ抗体によって遮断された可能性があることを示す。＊＊＊＊Ｐ＜．０００１、＊＊＊Ｐ＜．００１ 白血病異種移植片における、ＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ有効性を示す。ｐＳＴＡＴ５のパーセンテージは、ｐＳＴＡＴ５染色が、条件培地の存在下では有意に増加したが、ＴＰＯ抗体によって遮断された可能性があることを示す。＊＊＊＊Ｐ＜．０００１、＊＊＊Ｐ＜．００１ 白血病異種移植片における、ＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ有効性を示す。ＭＦＩは、ｐＳＴＡＴ５染色が、条件培地の存在下では有意に増加したが、ＴＰＯ抗体によって遮断された可能性があることを示す。＊＊＊＊Ｐ＜．０００１、＊＊＊Ｐ＜．００１ ＴＰＯによる刺激後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。Ｍｏ７ｅ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、代表的なヒストグラムを表す。データは、未刺激のがん細胞からのＭＦＩ及び％ｐＳＴＡＴパーセントの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。Ｍｏ７ｅ細胞は、ナイーブＴ細胞培地で刺激した。従って、ｐＳＴＡＴ５の増加は、ＮＣＯまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞では検出されなかった。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。Ｍｏ７ｅ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、ｐＳＴＡＴ５のＭＦＩを表す。データは、未刺激のがん細胞からのＭＦＩの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。Ｍｏ７ｅ細胞は、ナイーブＴ細胞培地で刺激した。従って、ｐＳＴＡＴ５の増加は、ＮＣＯまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞では検出されなかった。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。Ｍｏ７ｅ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、ｐＳＴＡＴ５のパーセントを表す。データは、未刺激のがん細胞からの％ｐＳＴＡＴパーセントの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。Ｍｏ７ｅ細胞は、ナイーブＴ細胞培地で刺激した。従って、ｐＳＴＡＴ５の増加は、ＮＣＯまたはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞では検出されなかった。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。ＨＥＬ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、代表的なヒストグラムを表す。データは、未刺激のがん細胞からのＭＦＩ及び％ｐＳＴＡＴパーセントの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。ＨＥＬ細胞は、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞で、ナイーブＴ細胞培地及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＭＦＩ及びｐＳＴＡＴ５パーセントにおける増加を示した。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。ＨＥＬ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、ｐＳＴＡＴ５のＭＦＩを表す。データは、未刺激のがん細胞からのＭＦＩの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。ＨＥＬ細胞は、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞で、ナイーブＴ細胞培地及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＭＦＩにおける増加を示した。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。ＨＥＬ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、ｐＳＴＡＴ５のパーセントを表す。データは、未刺激のがん細胞からの％ｐＳＴＡＴパーセントの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。ＨＥＬ細胞は、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞で、ナイーブＴ細胞培地及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ｐＳＴＡＴ５パーセントにおける増加を示した。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。ＣＭＫ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、代表的なヒストグラムを表す。データは、未刺激のがん細胞からのＭＦＩ及び％ｐＳＴＡＴパーセントの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。ＣＭＫ細胞株は、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ培地及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞培地で、ｐＳＴＡＴ５のＭＦＩ及びパーセントにおける有意な増加を示した。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。ＨＥＬ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、ｐＳＴＡＴ５のＭＦＩを表す。データは、未刺激のがん細胞からのＭＦＩの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。ＣＭＫ細胞株は、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ培地及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞培地で、ｐＳＴＡＴ５のＭＦＩにおける有意な増加を示した。 ＴＰＯで刺激した後の細胞におけるｐＳＴＡＴ５の測定を示す。ＨＥＬ細胞を含むがん細胞を、組み換えＴＰＯ、またはナイーブＴ細胞、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞、もしくはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞からの培地で刺激した。ｐＳＴＡＴ５発現をフローサイトメトリーで測定し、ｐＳＴＡＴ５のパーセントを表す。データは、未刺激のがん細胞からの％ｐＳＴＡＴパーセントの有意な増加が、組み換えＴＰＯで刺激した細胞と比較して存在したことを示す。ＣＭＫ細胞株は、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ培地及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞培地で、ｐＳＴＡＴ５のパーセントにおける有意な増加を示した。 末梢血で実施した全血球計算を示す。血液の内容及び血球数には、白血球（ＷＢＣ（Ａ））、リンパ球（ＬＹＭ（Ｂ））、単球（ＭＯＮＯ（Ｃ））、顆粒球（ＧＲＡＮ（Ｄ））、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ（Ｅ））、平均赤血球容積（ＭＣＶ（Ｆ））、ヘマトクリット（ＨＣＴ（Ｇ））、ヘモグロビン（ＨＧＢ（Ｈ））、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ（Ｉ））、血小板（ＰＬＴ（Ｊ））、赤血球分布幅（ＲＤＷａ（Ｋ））、平均血小板容積（ＭＰＶ（Ｌ））、及び赤血球（ＲＢＣ（Ｍ））を含めた。非形質導入（ｎｏｎ－ｔｘｄ）Ｔ細胞は、顆粒球において、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲと比較して有意差を示した（ｐ＝０．０４）。がん単独の動物（がん細胞を投与されたがＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞による処理を受けなかった陰性対照動物）は、平均赤血球容積（０．０４）及び平均赤血球ヘモグロビン濃度（ｐ＝０．０１９７）においてＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ処理動物とは差があった。ナイーブＮＳＧマウスは、がんマウスとは、ヘモグロビン（ｐ＝０．００３４）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ｐ＝０．０４３２）、及び赤血球（ｐ＝０．００５８）で有意に異なった。ナイーブマウスは、すべての処理群及びがん単独のマウスより高い血小板数を有し（ｐ＜０．０５）、平均血小板容積（ｐ＜０．０５）では、非形質導入Ｔ細胞処理動物が例外であった。 白血病異種移植片におけるＭＰＬに対するＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ特異性を示す。脾臓において有意な腫瘍組織量を示したものががんマウス及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲマウスの２群のみであったため、これらの脾臓細胞を、残存ＭＰＬ発現について評価した。 白血病異種移植片におけるＭＰＬに対するＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ特異性を示す。このＴＰＯ－ＣＡＲ条件では、残りのがんでの表面ＭＰＬ発現は、対照マウスと比較してかなり減少した（Ｆ、３０．３％±１０．７対７７．１％±４．３、ｐ＝０．００２）。 白血病異種移植片におけるＭＰＬに対するＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ特異性を示す。このＴＰＯ－ＣＡＲ条件では、残りのがんでのＭＰＬのＭＦＩは、対照マウスと比較して低下した（Ｇ、６４２１±１５１対３６０１±５３５、ｐ＝０．０００９）。 白血病異種移植片におけるＭＰＬに対するＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ特異性を示す。ＬＫ骨髄コンパートメントについて骨髄を分析した。このデータは、ＬＫコンパートメントにおいて、ナイーブマウスでは、がん単独のマウス、非形質導入Ｔ細胞、及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞に対して有意な差を示した（Ｐ＜．０００１）。さらに、非形質導入Ｔ細胞処理マウスは、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで処理したマウスと比較して、ＬＫコンパートメントにおいて有意に多くの細胞を有していた（ｐ＝０．０２）。 白血病異種移植片におけるＭＰＬに対するＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ特異性を示す。ＬＳＫ骨髄コンパートメントについて骨髄を分析した。ＬＳＫコンパートメントにおける有意差が、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ処理マウスにおいて、ナイーブＮＳＧマウス（Ｐ＜．０１）及び非形質導入Ｔ細胞処理マウス（Ｐ＜．０５）と比較して認められた。 幹細胞因子（ＳＣＦ）のＣＡＲ構築物の概略図である。このＳＣＦ ＣＡＲ構築物は、ヒンジ領域としての機能を果たすＣＤ８αの一部に融合した全マウス幹細胞因子（ＳＣＦ）リガンドを含む。これは次に、共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインに融合される。最後に、その生成物の末端が、ＴＣＲの主要なシグナル伝達ドメインであるＣＤ３ζに融合される。この生成物の全体が細胞の表面で発現され、そのＳＣＦ及びＣＤ８α領域が細胞外結合領域として機能し、そのＣＤ２８及びＣＤ３ζが細胞内シグナル伝達領域として機能する。 導入遺伝子構築物の概略図である。この導入遺伝子は、両端に５’の長い末端反復（５’ＬＴＲ）及び３’の長い末端反復（３’ＬＴＲ）の両方がΨ領域及びＲＲＥに加えて配置され、これらがレンチウイルスのパッケージング及び導入遺伝子の挿入を共同で支援する。ＵＢＣプロモーターは、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列によってｅＧＦＰ及びＳＣＦ ＣＡＲの両発現を可能にする。このＣＡＲは、その後細胞の表面にＩＬ－２のシグナル配列（ＩＬ－２ｓｓ）を介して運ばれ、これが適切な細胞内パッケージング後にこの構築物の上部から切断される。この構築物のゲノム表現（上のパネル）及びタンパク質表現（下のパネル）が示されている。 トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰ画像を示し、両ＳＣＦ ＣＡＲクローンの導入遺伝子発現を確認している。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン及び１４ｍｇの各プラスミドを使用して１８時間トランスフェクトし、翌日培地を交換した。３日目にＧＦＰ画像を撮影し、導入遺伝子の発現を確認した。 ＳＣＦ ＣＡＲクローン３ｃ１及び４ｃ２のウエスタンブロットであり、導入遺伝子のＣＡＲ発現をさらに確認している。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン及び１４ｍｇの各プラスミドを使用して１８時間トランスフェクトし、培地を翌日交換した。プロテアーゼ阻害剤を加えたＣＳＴ溶解緩衝液で細胞を溶解し、次いでウエスタンブロットで可視化した。４０ｍｇのタンパク質を各レーンにロードし、モック形質導入及びＣＤ１９ＣＡＲを対照とした。このブロットをｍαｈＣＤ３ζ抗体で染色し、２１秒間露光した。他のバンドはグリコシル化された生成物を表し、グリコシル化されていない生成物よりも高い分子量を有する。ＳＣＦ ＣＡＲ：４６．６ｋＤａ、ＣＤ１９ＣＡＲ：５５．７ｋＤａ。 Ａ～Ｂは、レンチウイルスベクターによる形質導入後３日目のＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＡＲ構築物の導入遺伝子発現を示す。Ｊｕｒｋａｔを、ＳＣＦ ＣＡＲまたはＣＤ１９ＣＡＲのいずれかでＭＯＩ０．５及び２．５にて形質導入した。ＧＦＰ画像（Ａ）及び溶解物を３日目に得、ｈＣＤ３ζのウエスタンブロット（Ｂ）で発現を確認した。ＳＣＦ ＣＡＲ：４６．６ｋＤａ、ＣＤ１９ＣＡＲ：５５．７ｋＤａ。Ｊｕｒｋａｔ細胞の内因性単量体ＣＤ３ζは、一番下の１６ｋＤａのバンドで分かり、二量体化ＣＤ３ｚは、３２ｋＤａで分かる。 ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラが、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔと比較して、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔを特異的に活性化することを示す。概略図は、どのようにしてｃ－ｋｉｔ ＦｃキメラがＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔに結合し、その後フローサイトメトリーによって二次抗体を介して検出されるかを示している。 ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラが、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔと比較して、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔを特異的に活性化することを示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔを、２０ｎｇの受容体ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラとともに４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に、細胞を二次ａｂＩｇＧで１５分間４℃にて染色し、その後３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄した。次に、細胞をＣＤ６９抗体で染色し、４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した。二次単独の対照を１００ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中でインキュベートし、他のすべての細胞をｃ－ｋｉｔ ＦＣキメラで染色した。代表的なフロープロットは、ＭＯＩ２．５で形質導入した細胞についてのみ示されている。ｎ＝１。 ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラが、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔと比較して、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔを特異的に活性化することを示す。Ｂからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。 ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔを、２０ｎｇの受容体ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラとともに４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に、細胞を二次ａｍＩｇＧで１５分間４℃にて染色し、その後３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄した。次に、細胞をＣＤ６９抗体で染色し、４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した。代表的なフロープロットは、ＭＯＩ２．５で形質導入した細胞についてのみ示されている（ｎ＝１）（A）。ＧＦＰ＋細胞に関するＡからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。（B）ＣＤ６９＋細胞に関するＡからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）（C）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ対照ではなくＳＣＦ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみでの受容体Ｆｃ結合の増加及びＣＤ６９発現の増加によって示されるように、ＳＣＦ ＣＡＲがｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。 ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔを、２０ｎｇの受容体ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラとともに４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に、細胞を二次ａｍＩｇＧで１５分間４℃にて染色し、その後３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄した。次に、細胞をＣＤ６９抗体で染色し、４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した。代表的なフロープロットは、ＭＯＩ２．５で形質導入した細胞についてのみ示されている（ｎ＝１）（A）。ＧＦＰ＋細胞に関するＡからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。（B）ＣＤ６９＋細胞に関するＡからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）（C）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ対照ではなくＳＣＦ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみでの受容体Ｆｃ結合の増加及びＣＤ６９発現の増加によって示されるように、ＳＣＦ ＣＡＲがｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。 ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔを、２０ｎｇの受容体ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラとともに４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に、細胞を二次ａｍＩｇＧで１５分間４℃にて染色し、その後３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄した。次に、細胞をＣＤ６９抗体で染色し、４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した。代表的なフロープロットは、ＭＯＩ２．５で形質導入した細胞についてのみ示されている（ｎ＝１）（A）。ＧＦＰ＋細胞に関するＡからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。（B）ＣＤ６９＋細胞に関するＡからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）（C）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ対照ではなくＳＣＦ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみでの受容体Ｆｃ結合の増加及びＣＤ６９発現の増加によって示されるように、ＳＣＦ ＣＡＲがｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。 ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ＋ＡＭＬ細胞株への結合後、Ｊｕｒｋａｔを特異的に活性化することを示す。Ｊｕｒｋａｔ活性化アッセイを示す概略図が示されている。 ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ＋ＡＭＬ細胞株への結合後、Ｊｕｒｋａｔを特異的に活性化することを示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲをＭＯＩ２．５で形質導入したＪｕｒｋａｔを、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１、１：５、または１：１０で、Ｋａｓｕｍｉ－１細胞（上のパネル）または６９７細胞（下のパネル）と４時間共培養した。次に、細胞を染色してＣＤ６９を検出し、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した。代表的なフロープロットは、１：１比で共培養した細胞についてのみ示されている（ｎ＝１）。 ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ＋ＡＭＬ細胞株への結合後、Ｊｕｒｋａｔを特異的に活性化することを示す。Ｂからの累積データが示されている（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。 初代Ｔ細胞における導入遺伝子の発現を示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＮＲＴＮ ＣＡＲを形質導入した初代Ｔ細胞のＧＦＰ画像は、形質導入後２４日目に撮影した。 初代Ｔ細胞における導入遺伝子の発現を示す。形質導入後２０日目に行ったフローサイトメトリーによるＧＦＰ含有量。 Ａ～Ｂは、ＳＣＦ ＣＡＲが、ヒト初代Ｔ細胞でｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。ＳＣＦ ＣＡＲを形質導入したＴ細胞及び非血縁腫瘍抗原（ＮＲＴＮ）ＣＡＲを形質導入した対照Ｔ細胞を、２０ｎｇの受容体ｃ－ｋｉｔ Ｆｃキメラとともに４℃で３０分間インキュベートした後、３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。次に、細胞を二次ａｍＩｇＧで１５分間４℃にて染色し、その後３倍量のＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄した。細胞を、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した（Ａ）（ｎ＝１）。Ａからの累積データが示されている（Ｂ）（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。これらのデータは、ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔキメラに特異的に結合するのに対し、対照ＮＲＴＮ ＣＡＲは結合しないことを示している。 Ａ～Ｂは、ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ＋ＡＭＬ細胞株Ｋａｓｕｍｉ－１に対して特異的に細胞傷害性であることを示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＮＲＴＮ ＣＡＲをＭＯＩ２５で形質導入した初代Ｔ細胞を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比５：１で、Ｋａｓｕｍｉ－１細胞と４時間共培養した。次に、細胞を染色してＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ及び７－ＡＡＤで細胞死を検出し、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した（Ａ）（ｎ＝１）。Ａからの累積データが示されている（Ｂ）（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。 Ａ～Ｂは、ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ＋巨核球細胞株ＣＭＫに対して特異的に細胞傷害性であることを示す。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＮＲＴＮ ＣＡＲをＭＯＩ２５で形質導入した初代Ｔ細胞を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比５：１で、Ｋａｓｕｍｉ－１細胞と４時間共培養した。次に、細胞を染色してＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ及び７－ＡＡＤで細胞死を検出し、Ｃｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａで分析した（Ａ）（ｎ＝１）。Ａからの累積データが示されている（Ｂ）（ｎ＝１、エラーバーは、１つの実験内での反復である）。 ＣＤ５抗原を標的とする非シグナル伝達ＣＡＲ（ＮＳＣＡＲ）の概略図である。このＮＳＣＡＲは、細胞外抗原標的化ドメイン及びＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、ＣＤ２８の細胞内ドメインのアミノ酸は２つのみである。ＮＳＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く。 ＣＤ６９が、活性化のマーカーであることを示し、これは、ＮＳＣＡＲ改変細胞で上方制御されず、ＮＳＣＡＲが無刺激性であることを示している。一番上の線は、ＮＳＣＡＲ細胞を表し、中間の線は、未改変細胞を表し、一番下の線は、モック改変細胞を表す。 標的抗原がＮＳＣＡＲによって下方制御されることを示しており、これは、ＣＡＲ（すなわち、シグナル伝達ＣＡＲ）を使用した場合に得られる結果と同様である。 ＮＳＣＡＲ改変ガンマデルタＴ細胞によるＣＤ５陽性Ｔ細胞の殺傷を示す。ガンマデルタＴ細胞の増殖には３ドナー（ドナーＡ～Ｃ）を使用し、これらの改変細胞をＣＤ５陽性白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を１：１～５：１比の改変細胞対標的細胞で）と混合した。ＧＦＰ及びＣＤ１９ＣＡＲ改変細胞を対照として使用した。 ＮＳＣＡＲ改変ガンマデルタＴ細胞が、ＧＦＰ改変細胞より著しく良好にＭｏｌｔ－４細胞を殺傷することを示す。 Ａ～Ｃは、ＣＤ５ベース及びＣＤ１９ベースのＮＳＣＡＲ構築物の概略図である。細胞内尾部の２つのアミノ酸後で切断されたＣＤ２８の膜貫通ドメインを備えたＮＳＣＡＲ構造が示されている（Ａ）。ｐ２ａ配列の介在により、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）及びＮＳＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター内のバイシストロン性ＮＳＣＡＲ導入遺伝子（Ｂ及びＣ）。両配列の発現は、インターロイキン－２シグナルペプチド（ＩＬ２－ＳＰ）を備えたヒトユビキチンＣプロモーター（ｈＵＢＣ）によって駆動される。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ（Ｂ）は、ｍｙｃエピトープタグを含む一方、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ（Ｃ）は、ＣＤ８αヒンジを含む。 ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ５発現を示す。フローサイトメトリーを行い、形質導入の５～６日後のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現を測定した。すべての図で、代表的なフローサイトメトリーのオーバーレイを右側に示す（黒い曲線：ナイーブ、灰色の曲線：ＭＯＩ０．５、薄い灰色の曲線：ＭＯＩ１）。ナイーブ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５発現が示されている（ナイーブ及びＭＯＩ１：ｎ＝４、ＭＯＩ０．５：ｎ＝３）。統計は、ダネットの方法による一元配置分散分析を使用して行い、ナイーブ対照群と比較した。 ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化を示す。フローサイトメトリーを行い、形質導入の５～６日後のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ６９発現を測定した。すべての図で、代表的なフローサイトメトリーのオーバーレイを右側に示す（黒い曲線：ナイーブ、灰色の曲線：ＭＯＩ０．５、薄い灰色の曲線：ＭＯＩ１）。ナイーブ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現が示されている（ナイーブ及びＭＯＩ１：ｎ＝５、ＭＯＩ０．５：ｎ＝３）。統計は、ダネットの方法による一元配置分散分析を使用して行い、ナイーブ対照群と比較した。 ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ５発現を示す。フローサイトメトリーを行い、形質導入の５～６日後のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現を測定した。すべての図で、代表的なフローサイトメトリーのオーバーレイを右側に示す（黒い曲線：ナイーブ、灰色の曲線：ＭＯＩ０．５、薄い灰色の曲線：ＭＯＩ１）。ナイーブ、ＣＤ１９－ＣＡＲ改変及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５発現が示されている（ｎ＝３）。統計は、ダネットの方法による一元配置分散分析を使用して行い、ナイーブ対照群と比較した。 ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性化を示す。フローサイトメトリーを行い、形質導入の５～６日後のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ６９発現を測定した。すべての図で、代表的なフローサイトメトリーのオーバーレイを右側に示す（黒い曲線：ナイーブ、灰色の曲線：ＭＯＩ０．５、薄い灰色の曲線：ＭＯＩ１）。ナイーブ、ＣＤ１９－ＣＡＲ改変及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現が示されている（ｎ＝３）。統計は、ダネットの方法による一元配置分散分析を使用して行い、ナイーブ対照群と比較した。 Ａ～Ｃは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現の効果を示す。形質導入の５日後の非編集（Ａ、左）またはＣＤ５編集（Ａ、右）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現。ＭＯＩ０．５：ｎ＝３、ナイーブ及びＭＯＩ１：ｎ＝６（非編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞）、ｎ＝５（ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞）。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ナイーブ（Ｂ、中実丸）またはＣＤ５編集（Ｂ、白抜き丸）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに、改変対非改変比１：１または１：３で培養した。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現を各比で示す。ＣＤ５の発現は、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と各比で共培養した後の非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞で示されている。フローサイトメトリーを行い、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５－Ｆｃ及びＣＤ５抗原の発現を測定した（Ｃ）。統計は、両側スチューデントｔ検定及びダネットの方法による一元配置分散分析を使用して行い、ナイーブ群と比較した。 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ及びＣＤ５抗原の発現のばらつきを示す。フローサイトメトリーを５日目（黒いバー）及び１５日目（白いバー）に行い、抗ＣＤ５及びＣＤ５－Ｆｃ結合を測定した。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（左）及びＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（右）の代表的なフローサイトメトリープロット。 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ及びＣＤ５抗原の発現のばらつきを示す。フローサイトメトリーを５日目（黒いバー）及び１５日目（白いバー）に行い、抗ＣＤ５及びＣＤ５－Ｆｃ結合を測定した。形質導入後５日目及び１５日目の細胞表面にＣＤ５－ＮＳＣＡＲを発現しているＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のパーセンテージ。実験は二連で行った。平均及び標準偏差を表す。 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ及びＣＤ５抗原の発現のばらつきを示す。フローサイトメトリーを５日目（黒いバー）及び１５日目（白いバー）に行い、抗ＣＤ５及びＣＤ５－Ｆｃ結合を測定した。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ形質導入後５日目及び１５日目のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現を、二連で行った実験について、平均及び標準偏差とともに示す。 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ及びＣＤ５抗原の発現のばらつきを示す。フローサイトメトリーを５日目（黒いバー）及び１５日目（白いバー）に行い、抗ＣＤ５及びＣＤ５－Ｆｃ結合を測定した。形質導入後１５日目のナイーブ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の全細胞溶解物のウエスタンブロット分析を示す。メンブレンを抗ＣＤ５抗体でブロットした。ＣＤ５は５４ｋＤａで検出される。デンシトメトリーは、ＩｍａｇｅＪを使用して行った。 Ａ～Ｂは、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変、ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と、改変対非改変細胞比０：１、１：３及び１：１で１４時間培養したものを示す。フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ５－Ｆｃ結合及びＣＤ５抗原発現を検出した。ナイーブＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（中実丸）またはＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（白抜き丸）のいずれかとともに培養したＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現が示されている（Ａ）。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変、ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに培養した場合の非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５の発現が示されている（Ｂ）。データは、４つの独立した複製の平均及び標準偏差を表す。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の増殖及びＣＤ５の下方制御を示す。γδＴ細胞増殖の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。７日目のγδＴ細胞のパーセンテージ（左）が、ナイーブ細胞（中央）及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞（右）の１２日目のγδＴ細胞のパーセンテージと比較されている。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の増殖及びＣＤ５の下方制御を示す。ナイーブ（中実丸）及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞（白抜き丸）の集団におけるγδＴ細胞のパーセンテージを、形質導入日（７～９）及び細胞傷害性アッセイ日（１２～１３）間で示す。ｎ＝３。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の増殖及びＣＤ５の下方制御を示す。ナイーブ、ＧＦＰ改変、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の増殖倍率が示されている（ナイーブ：ｎ＝５、ＧＦＰ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ：ｎ＝３、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ：ｎ＝２）。統計は、両側スチューデントｔ検定及びダネットの方法による一元配置分散分析を使用して行い、ナイーブ対照群と比較した。各複製は、独立したドナーを表す。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の増殖及びＣＤ５の下方制御を示す。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変（左）及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞（右）におけるＣＤ５発現の代表的なフローサイトメトリープロット（黒い曲線：ナイーブ、灰色の曲線：ＮＳＣＡＲ改変）。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の増殖及びＣＤ５の下方制御を示す。ナイーブ及び改変γδＴ細胞におけるＣＤ５発現のグラフ表示が示されている（ナイーブ：ｎ＝８、ＧＦＰ及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ：ｎ＝２、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ：ｎ＝５）。統計は、両側スチューデントｔ検定及びダネットの方法による一元配置分散分析を使用して行い、ナイーブ対照群と比較した。各複製は、独立したドナーを表す。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞のＴ－ＡＬＬ及びＢ－ＡＬＬ細胞株に対する細胞傷害性を示す。エフェクター細胞及び標的細胞を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比３：１（黒いバー）及び５：１（白いバー）で４時間培養した。ナイーブγδＴ細胞による細胞傷害性と比較した改変γδＴ細胞による細胞傷害性の増加パーセントをグラフにし、ベースラインの細胞傷害性におけるドナーのばらつきを説明している。このベースラインは、ナイーブγδＴ細胞の細胞傷害性として表される。フローサイトメトリーを使用して、ｅＦｌｕｏｒ７８０、ＶＰＤ４５０及びＧＦＰを測定した。ＣＤ５陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害性が示されている。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲで改変した異なる３ドナーを別々に示し、全平均細胞傷害性を含めている。１ドナーを反復した。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞のＴ－ＡＬＬ及びＢ－ＡＬＬ細胞株に対する細胞傷害性を示す。エフェクター細胞及び標的細胞を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比３：１（黒いバー）及び５：１（白いバー）で４時間培養した。ナイーブγδＴ細胞による細胞傷害性と比較した改変γδＴ細胞による細胞傷害性の増加パーセントをグラフにし、ベースラインの細胞傷害性におけるドナーのばらつきを説明している。このベースラインは、ナイーブγδＴ細胞の細胞傷害性として表される。ＣＤ５陽性Ｍｏｌｔ－４細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害性が示されている。２ドナー由来の細胞を、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲレンチウイルスベクターで改変した。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞のＴ－ＡＬＬ及びＢ－ＡＬＬ細胞株に対する細胞傷害性を示す。エフェクター細胞及び標的細胞を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比３：１（黒いバー）及び５：１（白いバー）で４時間培養した。ナイーブγδＴ細胞による細胞傷害性と比較した改変γδＴ細胞による細胞傷害性の増加パーセントをグラフにし、ベースラインの細胞傷害性におけるドナーのばらつきを説明している。このベースラインは、ナイーブγδＴ細胞の細胞傷害性として表される。ＣＤ１９陽性６９７細胞に対するＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の細胞傷害性が、２ドナー由来の細胞について示されている。１ドナーを反復した。ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞と６９７細胞の１２時間の共培養の結果を示している。 ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞のＴ－ＡＬＬ及びＢ－ＡＬＬ細胞株に対する細胞傷害性を示す。ＣＤ１０７ａの発現を、形質導入の６日後にフローサイトメトリーで測定した（左）。ＥＬＩＳＡを使用して、形質導入の６日後のＣＤ１９－ＣＡＲ改変及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞によるＩＦＮγ分泌を定量化した（右）。この実験は、三連で行った。統計は、６９７細胞との共培養におけるＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ脱顆粒またはＩＦＮγ分泌を、６９７細胞とともに培養したナイーブ細胞のものと比較するため、両側スチューデントｔ検定を使用して行った。 ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変及びＣＤ１９－ＣＡＲ改変γδＴ細胞の６９７細胞に対するＥ：Ｔ比３：１（黒いバー）及び５：１（白いバー）での細胞傷害性を示す。平均及び標準偏差が表されている。ＣＡＲ改変細胞の場合Ｎ＝３、ただし、１ドナーは、５：１比でも二連で評価した。ＮＳＣＡＲ改変細胞の場合Ｎ＝２、ただし、１ドナーは、５：１比でも二連で評価した。統計は、両側スチューデントｔ検定を使用して行った。 ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変αβＴ細胞の細胞傷害活性を示す。エフェクター細胞及び標的細胞を、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比３：１（黒いバー）及び５：１（白いバー）で１２時間培養した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞との培養におけるナイーブ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変αβＴ細胞の細胞傷害性を、ｅＦｌｕｏｒ７８０、ＶＰＤ４５０、及びＧＦＰを測定するフローサイトメトリーによって決定した。中実バーはドナー１を表し、スラッシュ入りバーはドナー２を表す。統計は、両側スチューデントｔ検定を使用して行い、各Ｅ：Ｔ比でのドナー間の細胞傷害性を比較した。 Ａ～Ｂは、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変及びＣＤ５－ＣＡＲ改変αβＴ細胞を示す。ＧＦＰ発現は、形質導入後６日目のドナー１（Ａ、左）及びドナー２（Ａ、中央）由来のＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変αβＴ細胞、ならびにドナー１（Ａ、右）由来のＣＤ５－ＣＡＲ改変αβＴ細胞で示されている。ＣＤ５－ＣＡＲ改変αβＴ細胞のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＥ：Ｔ比３：１での細胞傷害性アッセイの結果を示す（Ｂ）。 γδＴ細胞上清中で培養した場合のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現。γδＴ細胞は、上清の回収前に４８時間培養した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をγδＴ細胞上清中で４時間培養した。フローサイトメトリーを使用して抗原の発現を測定した。γδＴ細胞上清中で培養したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現を示す。群のサンプルサイズ：なし及びナイーブ：ｎ＝５、ＧＦＰ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ：ｎ＝４、ＣＤ１９－ＣＡＲ及びＣＤ５－ＣＡＲ：ｎ＝２。一元配置分散分析をＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの方法を使用して行い、ナイーブ対照群と比較した。各複製は、独立したドナーを表す。 γδＴ細胞上清中で培養した場合のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現。γδＴ細胞は、上清の回収前に４８時間培養した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をγδＴ細胞上清中で４時間培養した。フローサイトメトリーを使用して抗原の発現を測定した。上清中でのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞培養の前に、γδＴ細胞上清をＣＤ５－Ｆｃとプレインキュベートした場合のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現を示す。これらの実験は、２ドナー由来の細胞を使用して行った。一元配置分散分析をＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの方法を使用して行い、一対比較した。各複製は、独立したドナーを表す。 γδＴ細胞上清中で培養した場合の６９７細胞でのＣＤ１９発現。γδＴ細胞は、上清の回収前に４８時間培養した。続いて、６９７細胞をγδＴ細胞上清中で４時間培養した。フローサイトメトリーを使用して抗原の発現を測定した。γδＴ細胞上清中で培養した６９７細胞でのＣＤ１９発現を示す（ｎ＝２）。ダネットの方法による一元配置分散分析を使用し、ナイーブ対照群と比較した。各複製は、独立したドナーを表す。 γδＴ細胞上清中で培養した場合の６９７細胞でのＣＤ１９発現。γδＴ細胞は、上清の回収前に４８時間培養した。続いて、６９７細胞をγδＴ細胞上清中で４時間培養した。フローサイトメトリーを使用して抗原の発現を測定した。上清中での６９７細胞培養の前に、γδＴ細胞上清をＣＤ１９－Ｆｃとプレインキュベートした場合の６９７細胞でのＣＤ１９発現を示す（ｎ＝２）。ダネットの方法による一元配置分散分析を使用し、ナイーブ対照群と比較した。各複製は、独立したドナーを表す。 抗体ベースの条件付きレジメン及び標的細胞の構成要素の概略図である。ＣＤ１１７－サポリン免疫毒素は、ＨＳＣを特異的に標的として枯渇させ、移植細胞の生着のために骨髄を前処置する。Ｔ細胞を標的としたモノクローナル抗体は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を一時的に枯渇させ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を遮断することによりＴ細胞の共刺激を阻害する。同時に、この組み合わせは、移植片拒絶及び体液性免疫応答を防ぐことにより、遺伝子組み換え細胞の安定した生着を可能にする。 骨髄ＨＳＣ集団のＣＤ１１７－サポリン免疫毒素による枯渇を示す。代表的なフローサイトメトリープロットは、短期（ＬＳＫ ＣＤ４８－ＣＤ１５０－）及び長期（ＬＳＫ ＣＤ４８－ＣＤ１５０＋）ＪＳＣコンパートメントにおける、ＣＤ１１７－サポリンで前処置後の強力な枯渇を示している。 骨髄ＨＳＣ集団のＣＤ１１７－サポリン免疫毒素による枯渇を示す。ＣＤ１１７－サポリン処理後の対照と比較したＨＳＣ枯渇の定量化が示されている。 Ｔ細胞を標的としたモノクローナル抗体が、ｆＶＩＩＩ遺伝子組み換えＨＳＰＣの生着に必要であることを示す。ＣＤ１１７－サポリン単独では、遺伝子組み換え細胞の生着を可能にすることができなかった一方、Ｔ細胞ｍＡｂの添加により、血友病Ａ（ＨＡ）レシピエントのすべてで、移植後７週間で高レベルのドナー骨髄の生着が可能であった。 ｆＶＩＩＩ遺伝子組み換え細胞の多系統キメラ現象が、非遺伝毒性前処置レジメンを使用して達成されたことを示す。ＣＤ１１７－サポリン及びＴ細胞標的化ｍＡｂで前処置したマウスに移植したｆＶＩＩＩ遺伝子組み換えＨＳＰＣならびに再構成された多系統造血は、免疫反応の証拠を示さない。 非遺伝毒性レジメンで前処置したＨＡレシピエントにおけるｆＶＩＩＩ活性を示す。治療レベルのｆＶＩＩＩ活性は、ＣＤ１１７－サポリン及びＴ細胞標的化ｍＡｂで前処置した後、ｆＶＩＩＩ遺伝子組み換えＨＳＰＣを移植したマウスで達成された。
有効な腫瘍細胞標的は少なく、これらの標的に対する特徴がはっきりした既存の抗体は少ない。それ故、腫瘍細胞表面受容体に連結する代替的なメカニズムが検討された。本明細書に示すように、標的のレパートリーは、リガンドベースのＣＡＲアプローチを利用することによって拡大された。リガンドと受容体の相互作用の理解（例えば、抗体と抗原の相互作用と比較して）は、腫瘍抗原が発現している正常組織に対する副作用（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ）に対するより良好な予測をもたらし、これは、副作用を予測し、臨床的利益に利用するのに役立ち得る。
腫瘍細胞表面受容体とそれらの天然リガンドとの関係を利用することに加えて、腫瘍細胞に対する細胞毒性、例えば、ガンマデルタＴ細胞の細胞傷害性を高める非シグナル伝達ＣＡＲ（ＮＳ－ＣＡＲ）が開発された。これらのＮＳ－ＣＡＲとしては、非抗体受容体リガンドまたは腫瘍細胞の細胞表面受容体に結合する抗体を挙げることができる。
核酸配列
本明細書に提供するのは、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、該組み換えタンパク質は、受容体リガンド及び膜貫通ドメインを含み、該受容体リガンドは、非抗体リガンドであり、該受容体リガンドは、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞または分化がん細胞（例えば、造血起源のがん幹細胞または分化がん細胞）の表面で発現する受容体に結合し、該組み換えタンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
全体を通して使用される、該受容体リガンドは、完全長タンパク質であることができ、これは、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞または分化がん細胞（例えば、造血起源のがん幹細胞または分化がん細胞）またはその結合断片の表面で発現する細胞表面受容体に結合する。細胞内シグナル伝達ドメインをコードしない本明細書に記載の核酸構築物は、非シグナル伝達ＣＡＲ（ＮＳＣＡＲ）とも呼ばれる。任意に、該構築物は、非機能性細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１つ以上のＩＴＡＭドメインを変異させることによって改変されたまたは変異した、例えば、ＣＤ３ζポリペプチドを含む。任意に、本明細書に記載のＮＳＣＡＲのいずれかは、細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲと比較して、少なくとも９０％、９５％または９９％少ないシグナル伝達を示す。かかる構築物は、腫瘍細胞を標的とするためのシグナル伝達または活性化を必要としない細胞、例えば、ガンマデルタＴ細胞に形質導入することができる。
全体を通して使用される、がん幹細胞（ＣＳＣ）とは、腫瘍内または血液癌内に見られる細胞の小亜集団である。ＣＳＣは、正常な幹細胞に関連する特性、具体的には、特定のがんサンプルに見られるすべての細胞型を生じさせる能力を備える。ＣＳＣは、腫瘍活性であり、自己再生及び複数の細胞型への分化の幹細胞プロセスを通して腫瘍を生成することができる。ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ１３３等のいくつかの細胞表面マーカーを使用して、ＣＳＣを識別及び濃縮することができる。
全体を通して使用される、細胞型に関する造血起源という句は、さらなる細胞型に分化する可能性が限られている造血細胞に由来する細胞を意味する。かかる造血細胞としては、造血幹細胞、造血幹前駆細胞、多能性前駆細胞、系統限定前駆細胞、一般的な骨髄系前駆細胞、顆粒球マクロファージ前駆細胞、巨核球・赤血球前駆細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。造血細胞には、リンパ系及び骨髄系の細胞、例えば、リンパ球、赤血球、顆粒球、単球、及び血小板が含まれる。いくつかの実施形態では、選択される造血細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は、自然免疫細胞である。
同様に提供するのは、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、該組み換えタンパク質は、受容体リガンド及びＣＤ３－ゼータを含み、該受容体リガンドは、非抗体リガンドであり、該受容体リガンドは、がん幹細胞の表面で発現する受容体に結合し、該組み換えタンパク質は、共刺激ドメインを含まない。本明細書で使用される、共刺激ドメインとは、共刺激タンパク質、例えば、サイトカイン生成を高めるＴ細胞で発現する共刺激タンパク質に由来する細胞内シグナル伝達ドメインである。共刺激タンパク質としては、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ２７及びＣＤ４０Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。共刺激ドメインを含む例示的な配列のＣＤ２８（配列番号２１）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）（配列番号２２）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）（配列番号２３）、ＣＤ４０（配列番号２４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）（配列番号２５）、ＣＤ２７（配列番号２７）及びＣＤ４０Ｌ（配列番号２８）。任意に、該構築物は、非機能性共刺激タンパク質または断片、すなわち、共刺激活性を減少させるようにまたは排除するように改変されたまたは変異した共刺激タンパク質またはその断片を含む。
同様に提供するのは、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、該組み換えタンパク質は、受容体リガンド、共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータを含み、該受容体リガンドは、非抗体リガンドであり、該受容体リガンドは、がん幹細胞の表面で発現する受容体に結合する。
いくつかの実施形態では、該受容体リガンドは、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３リガンド、ＩＬ－３、ＣＲＫＬ、Ｌ－セレクチン、ＣＤ９、ＦＨＬ－２、ＬＧＡＬＳ８、ＴＳＰＡＮ４、ＡＰＣ、及びＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８またはその結合断片からなる群から選択される。各リガンドのＧｅｎｅ ＩＤ番号及びＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号を以下の表１に示す。Ｇｅｎｅ ＩＤ番号（Ｍａｇｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：ｇｅｎｅ ｃｅｎｔｅｒｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｔ ＮＣＢＩ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ５２－Ｄ５７（２０１１））、及びＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号で提供される、配列を含めたすべての情報は、この参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2022526187000001
Figure 2022526187000002
ＴＰＯは、ＭＰＬがん原遺伝子（ＭＰＬ）に結合し、ＳＣＦは、チロシンキナーゼＫＩＴ（ｃ－ｋｉｔ）に結合し、ＦＬＴ３リガンドは、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）に結合し、ＩＬ－３は、インターロイキン－３受容体に結合し、ＣＲＫＬは、ＣＤ３４に結合し、Ｌ－セレクチンは、ＣＤ３４に結合し、ＣＤ９は、インテグリンアルファ３に結合し、ＦＨＬ－２は、インテグリンアルファ３に結合し、ＬＧＡＬＳ８は、インテグリンアルファ３に結合し、ＴＳＰＡＮ４は、インテグリンアルファ３に結合し、ＡＰＣは、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ／ＣＤ２０１）に結合し、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、胸腺細胞抗原－１（Ｔｈｙ－１／ＣＤ９０）に結合する。さらなる受容体リガンドは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｕｉｄｅｔｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ＧＲＡＣ／ＬｉｇａｎｄＬｉｓｔＦｏｒｗａｒｄ？ｔｙｐｅ＝Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ－ｐｅｐｔｉｄｅで見出すことができる。任意に、該受容体リガンドまたはその結合断片は、ヒト受容体リガンドまたはその結合断片である。任意に、該受容体リガンドは、がん細胞表面受容体に特異的に結合する任意の天然リガンドまたはその断片である。
本明細書に記載の構築物のいずれかでは、該膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ＧＰＩ、シトクロムｂ５尾部アンカー（配列番号２８）、ＣＤ１３７アンカー（配列番号２９）、及びＤＡＲＣ（配列番号３０）からなる群から選択され得る。本明細書に記載のＮＳＣＡＲでは、該構築物に使用される膜貫通ドメインは、該ＮＳＣＡＲがシグナル伝達活性を有さない限り、該膜貫通ドメインが由来するタンパク質の細胞内ドメインの一部、例えば、１、２、３、またはそれ以上のアミノ酸を含み得ることが理解される。膜貫通領域またはドメインを識別するための方法は、当業者に既知である。例えば、Ｐｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．“ＩｇＴＭ：Ａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ９：Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ３６７（２００８）、及びＹｕ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，“Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｗａｖｅｌｅｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．９（１）：２２－３３（２０１３））を参照されたい。
本明細書で使用される、ＧＰＩとは、翻訳後修飾としてある特定のタンパク質のＣ末端に接続されているホスホグリセリドである。ＧＰＩアンカーは、小胞体のタンパク質にアミド基転移、すなわち、Ｃ末端のＧＰＩ接続シグナルが、ＧＰＩ部分の付加と同時に切断される反応によって接続される。ＧＰＩ接続シグナルは、配列レベルでは保存されにくいが、すべてが、ＧＰＩ接続部位（大きな太字残基、下記）を含む極性セグメントと、それに続く、該タンパク質のＣ末端そのものに位置する疎水性／膜貫通セグメント（下記の下線付きアミノ酸配列）からなる。
例示的なＣ末端ＧＰＩ配列：
Figure 2022526187000003
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、（ａ）ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ－３、ＣＲＫＬ、Ｌ－セレクチン、ＣＤ９、ＦＨＬ－２、ＬＧＡＬＳ８、ＴＳＰＡＮ４、ＡＰＣ、及びＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８またはその結合断片からなる群から選択される受容体リガンド、（ｂ）膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＣＤ２８ポリペプチド、ならびに（ｃ）ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む。任意に、該ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号９を含む。任意に、該ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号１０を含む。
本明細書に記載のシグナル伝達ＣＡＲでは、シグナル伝達に関与するＣＡＲの部分、すなわち、エンドメイン（ｅｎｄｏｍａｉｎ）は、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれに関連する。標的結合の認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるＴ細胞シグナル伝達構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ゼータのものである。これは、受容体リガンド、例えば、ＴＰＯが結合した後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３－ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要になり得る。
いくつかの実施形態では、該構築物は、さらなる共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ２７及びＣＤ４０Ｌの共刺激ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＣＤ２８ポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ２７またはＣＤ４０Ｌポリペプチドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０及びＣＤ３－ゼータ、またはそれらの一部を含むポリペプチドを使用して、増殖／生存シグナルを伝達することができる。
本明細書に記載の構築物のいずれかでは、リンカー、スペーサー及び／またはヒンジ領域が、該構築物の任意の２つの構成要素を分離する。任意に、該リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸を含む。任意に、該ヒンジ領域は、ＣＤ８αのヒンジ領域である。任意に、該ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号１１またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、該リンカーは、ＩｇＧ１のＦｃ領域、ＩｇＧ１のヒンジ（例えば、ＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ）、ＣＤ８のストーク（ｓｔａｌｋ）（またはヒンジ領域）（Ｃｌａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ８ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ｕｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４（２）：２１５－２２５（１９９２））、またはそれらの組み合わせを含む。該リンカーは、代替的に、ＩｇＧ１のＦｃ領域、ＩｇＧ１のヒンジまたはＣＤ８のストークと同様の長さ及び／またはドメイン間隔特性を有するリンカー配列を含み得る。任意に、ヒトＩｇＧ１スペーサーを、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更してもよい。配列番号１は、ＣＤ８のストークスペーサーを含むＴＰＯ－ＣＡＲの例示的なアミノ酸配列である。配列番号２は、Ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３ｐｖａａスペーサーを有するＴＰＯ－ＣＡＲの例示的なアミノ酸配列である。配列番号３は、ＩｇＧ１ヒンジスペーサーを有するＴＰＯ－ＣＡＲの例示的なアミノ酸配列である。いくつかの例では、該スペーサーは、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジドメイン及びＣＨ３ドメインを含むことができる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ８２５２７．１、アミノ酸９８～３２９参照）。任意に、該リンカーは、ｍｙｃタグを含むことができる。
任意に、該構築物は、さらに、該構築物、すなわち、ＣＡＲが、Ｔ細胞等の細胞内で発現された場合、該新生タンパク質が小胞体に向けられ、続いて細胞表面に向けられ、そこでそれが発現されるようなシグナル配列を含む。任意に、該シグナル配列は、ＩＬ－２のシグナル配列である。任意に、該ＩＬ－２のシグナル配列は、配列番号１２を含む。任意に、該シグナル配列は、該受容体リガンドの天然のシグナル配列、例えば、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ－３、ＣＲＫＬ、Ｌ－セレクチン、ＣＤ９、ＦＨＬ－２、ＬＧＡＬＳ８、ＴＳＰＡＮ４、ＡＰＣ、及びＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のシグナル配列である。
任意に、該核酸配列は、コドン最適化配列である。
いくつかの実施形態では、該受容体リガンドは、配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＰＯ結合断片である。配列番号４をコードする例示的な核酸配列は、本明細書では、配列番号１４及び配列番号１５として提供される。該完全長ＴＰＯ配列は、本明細書では、配列番号１３として提供される。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。
いくつかの実施形態では、該受容体リガンドは、配列番号７、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４または配列番号４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む幹細胞因子またはその結合断片である。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。
さらに提供するのは、抗体及び膜貫通ドメインを含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であり、該抗体は、がん幹細胞またはがん細胞（例えば、造血起源のがん幹細胞または分化がん細胞）の表面で発現する受容体に結合し、該組み換えタンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。この構築物は、ＮＳＣＡＲの例である。いくつかの実施形態では、該抗体は、モノクローナル抗体であるか、またはがん細胞の表面で発現する受容体を特異的に認識する抗体の部分に由来する単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、Ｇｕｅｄａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：１４５－１５６（２０１９））を参照されたい。いくつかの実施形態では、該受容体は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、該腫瘍抗原は、ＣＤ５またはＣＤ１９である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞及びＴ細胞白血病ならびにリンパ腫は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、またはＣＤ１９を使用して標的化される。
本明細書で使用される、抗体という用語は、任意のクラスの全免疫グロブリン（すなわち、インタクト抗体）を包含するが、これに限定されない。自然抗体は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖からなる、ヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合で重鎖に結合するが、ジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によって異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））を有し、その後にいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））及びその他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列され、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。任意の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖には、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（Κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの一方を割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在する。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、及びＩｇＧ－４、ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２に分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。可変という用語は、本明細書では、抗体間で配列の異なる抗体ドメインのある特定の部分を説明するために用いられ、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において用いられる。しかしながら、その可変性は通常、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布していない。これは通常、軽鎖及び重鎖の両可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々４つのＦＲ領域を含み、主にβシート配置を採用し、３つのＣＤＲにより接続され、これらは、βシート構造を接続する、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により近接近して一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存的細胞毒性における抗体の関与を示す。抗体またはその断片の意味に同様に含まれるのは、例えば、参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０４，６９２号に記載の、抗体断片及び抗原結合タンパク質のコンジュゲート（モノクローナル抗体由来の一本鎖抗体、例えば、ｓｃＦｖ）である。
任意に、該抗体は、腫瘍抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である。本明細書で使用される、モノクローナル抗体という用語は、実質的に均質な抗体集団の抗体を指し、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能性がある自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）、またはＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を使用して調製され得る。
全体を通して使用される、核酸またはヌクレオチドという用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態での、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、当該用語は、参照核酸と類似する特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。核酸配列は、デオキシリボ核酸とリボ核酸の組み合わせを含むことができる。かかるデオキシリボ核酸及びリボ核酸としては、天然に存在する分子及び合成アナログの両方が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムループ構造等を含むがこれらに限定されないすべての形態の配列も包含する。
別段の指示のない限り、特定の核酸配列は、明示的に指示された配列に加えて、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的な配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第三の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基により置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
本明細書に提供する核酸配列のいずれかを含む、それからなる、または本質的にそれからなる核酸配列もまた提供する。本明細書に提供するのは、配列番号１～配列番号６９のいずれかに対して、少なくとも６０％（例えば、８５％、９０％、９５％）の同一性を有する核酸配列及びアミノ酸配列である。本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈で使用される、同一性または実質的な同一性という用語は、参照配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。代替的に、同一性パーセントは、６０％～１００％の任意の整数であり得る。例示的な実施形態としては、本明細書に記載のプログラム、好ましくは、以下に記載の通り、標準パラメータを使用したＢＬＡＳＴを使用して参照配列と比較して、少なくとも、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が挙げられる。当業者には、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置調整等を考慮に入れることにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を特定するために適切に調整され得ることが認識されよう。
配列比較の場合、典型的には、一方の配列が参照配列として機能し、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよいし、別のパラメータを指定してもよい。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
本明細書で使用される、「比較ウィンドウ」は、２０～６００、通常は約５０～約２００、さらに通常は約１００～約１５０からなる群から選択される任意の１つの隣接位置数のセグメントへの言及を含み、この中で、ある配列が、２つの配列を最適に整列させた後で同数の隣接位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野では周知である。比較のための配列の最適アライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって、または手動でのアラインメント及び目視検査によって行われ得る。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで公開されている。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードと整列するときに何らかの正値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、検索配列における長さの短いＷｉｎを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記参照）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシード値として機能する。ワードヒットは次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコア行列を使用して累積スコアを算出する。ワードヒットの各方向への拡張は、次の場合に中止される：累積アライメントスコアがその最大の実績数値から量Ｘだけ減少する場合、累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積に起因してゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の終端に達した場合。これらのＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワードサイズ（Ｗ）２８、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワードサイズ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較した際の最小合計確率が約０．０１未満、より好ましくは、約１０－５未満、最も好ましくは、約１０－２０未満である場合に、参照配列に類似していると見なされる。
ポリペプチド
本明細書に記載の組み換え核酸のいずれかによってコードされるポリペプチドもまた提供する。ポリペプチド、ペプチド、及びタンパク質は、本明細書では同義で使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される該用語は、完全長タンパク質を含めた任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、該アミノ酸残基は、ペプチド共有結合で連結される。
本明細書に開示する特定のアミノ酸置換または変異を含めた修飾は、既知の方法で行われる。例として、修飾は、ポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチドの部位特異的変異によって行われ、それにより、該修飾をコードするＤＮＡを生成し、その後、組み換え細胞培養で該ＤＮＡを発現させ、コードされたポリペプチドを生成する。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位において置換変異を行う技術は周知である。例えばＭ１３プライマー突然変異生成及びＰＣＲベースの突然変異生成法を使用して、１つ以上の置換変異を行うことができる。本明細書に提供する核酸配列のいずれかをコドン最適化し、宿主細胞での発現を変更、例えば、最大化することができる。
本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸は、天然に存在する２０個のアミノ酸、天然に存在するアミノ酸のＤ－立体異性体、非天然アミノ酸及び化学的に修飾されたアミノ酸のいずれかであり得る。非天然アミノ酸（すなわち、タンパク質に天然に見出されないもの）もまた、当技術分野では既知であり、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２３（４）：５８１－５８７（２０１３）、Ｘｉｅ ｅｔ ｌａ．“Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，”９（６）：５４８－５４（２００５））、及びそこで引用されているすべての参考文献に記載の通りである。β及びγアミノ酸は、当技術分野では既知であり、本明細書では非天然アミノ酸として同様に企図される。
本明細書で使用される、化学的に修飾されたアミノ酸とは、側鎖が化学的に修飾されたアミノ酸を指す。例えば、側鎖は、シグナル伝達部分、例えば、フルオロフォアまたは放射性標識を含むように修飾され得る。側鎖はまた、新たな官能基、例えば、チオール、カルボン酸、またはアミノ基を含むように修飾され得る。翻訳後修飾されたアミノ酸もまた、化学的に修飾されたアミノ酸の定義に含まれる。
同様に企図されるのは、保存的アミノ酸置換である。例として、保存的アミノ酸置換は、該アミノ酸残基の１つ以上、例えば、本明細書に提供するポリペプチドのいずれかの１つ以上のリジン残基で行われ得る。当業者には、保存的置換が、１つのアミノ酸残基を生物学的に及び／または化学的に類似した別のアミノ酸残基で置き換えることであることが分かるであろう。次の８群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
例として、アルギニンからセリンが言及される場合、同様に企図されるのは、セリンに対する保存的置換（例えば、スレオニン）である。非保存的置換、例えば、リジンのアスパラギンでの置換もまた企図される。
同様に本明細書に提供するのは、本明細書に提供する受容体リガンドのいずれかのコンジュゲートである。例えば、該受容体リガンドは、検出可能な実体、毒素、または化学療法薬実体にコンジュゲートされ得る。該検出可能な実体は、蛍光部分、例えば、蛍光ペプチドであり得る。蛍光ペプチドとは、励起後、検出可能な波長の光を放出するポリペプチドを指す。蛍光タンパク質の例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される化学療法薬実体とは、細胞にとって有害な実体を指し、すなわち、該実体は、細胞の生存率を低下させる。該化学療法薬実体は、毒素または細胞毒性薬であり得る。該毒素は、サポリンであり得る。企図される化学療法剤としては、アルキル化剤、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、アルキルスルホネート、代謝拮抗剤、ピリミジンアナログ、エピポドフィロトキシン、酵素、例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ、生体応答修飾物質、例えば、ＩＦＮアルファ、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦ、白金配位化合物、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン、アントラセンジオン、置換尿素、例えば、ヒドロキシ尿素、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含めたメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド、副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含めたホルモン及びアンタゴニスト、例えば、プレドニゾン及び同等物、デキサメタゾンならびにアミノグルテチミド、プロゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール、エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール同等物、抗エストロゲン薬、例えば、タモキシフェン、プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／同等物を含めたアンドロゲン、抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ及びリュープロリド、ならびに非ステロイド抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミドが挙げられるが、これらに限定されない。
同様に提供するのは、本明細書に記載の受容体リガンドを含む二重特異性Ｔ細胞誘導抗体である。
２つの結合ドメインを有する多種多様な分子が開発されている。二重特異性Ｔ細胞誘導抗体分子は、主に抗がん剤として使用するために開発された二重特異性分子のクラスである。それらは、標的細胞に対して、宿主の免疫系、より具体的には、Ｔ細胞の細胞傷害活性を向ける。これらの分子では、一方の結合ドメインは、Ｔ細胞に、例えば、ＣＤ３受容体を介して結合し、他方は、標的細胞、例えば、造血幹細胞に結合する。
該二重特異性分子は、標的細胞とＴ細胞の両方に結合するため、標的細胞をＴ細胞に近接させ、Ｔ細胞がその効果、例えば、造血幹細胞に対する細胞傷害効果を発揮することができるようにする。Ｔ細胞：二重特異性薬剤：造血幹細胞複合体の形成は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達を誘導し、例えば、細胞傷害性メディエーターの放出をもたらす。理想的には、該薬剤は、標的細胞の存在下でのみ所望のシグナル伝達を誘導し、選択的殺傷をもたらす。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する方法で使用される薬剤は、（ｉ）第一のドメイン、例えば、受容体リガンド及び（ｉｉ）第二のドメイン、例えば、Ｔ細胞結合／活性化ドメインを含むポリペプチドである。該二重特異性分子は、その生成に役立つシグナル配列を含み得る。該シグナルペプチドは、該二重特異性分子を宿主細胞の上清から採取することができるように、該二重特異性分子を該宿主細胞が分泌するようにし得る。該二重特異性分子は、次の一般式で表すことができる：シグナルペプチド－－第一のドメイン－－第二のドメイン。該二重特異性分子は、該第一のドメインを該第二のドメインと接続し、これら２つのドメインを空間的に離すスペーサー配列を含み得る。該スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１のヒンジまたはＣＤ８のストークを含み得る。該リンカーは、代替的に、ＩｇＧ１のヒンジまたはＣＤ８のストーク（例えば、ＣＤ８αのヒンジ）と同様の長さ及び／またはドメイン間隔特性を有する別のリンカー配列を含む。本明細書に記載の二重特異性分子のいずれかをコードする核酸配列もまた提供する。
ベクター
本明細書に提供する核酸配列またはそれらを含む構築物は、ベクター内に含まれる場合もあれば、その一部を形成する場合もある。本明細書に提供するベクターのいずれかは、本明細書に記載の核酸配列、例えば、配列番号１～６９に記載の核酸配列のいずれかを含む、それからなるまたは本質的にそれからなる核酸配列を含むことができる。本明細書に提供するベクターのいずれかは、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか、例えば、配列番号１～６９に記載のアミノ酸配列のいずれかを含む、それからなるまたは本質的にそれからなるアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列を含むことができる。従って、本明細書に提供するのは、本明細書に記載の核酸配列または構築物を含むベクターである。任意に、該ベクターは、本明細書に記載の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、作動可能に連結される。本明細書に記載の構築物では、多数のプロモーターを使用することができる。プロモーターは、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ及び他のタンパク質の認識及び結合に関与する転写の開始から上流及び／または下流に位置する領域または配列である。該プロモーターは、真核生物のプロモーターの場合もあれば、原核生物のプロモーターの場合もある。該核酸を、目的の細胞または生物での発現のために、構成的、誘導、組織優先、または他のプロモーターと組み合わせることができる。例えば、Ｕｃｈｉｂｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．１２：１６－２５（２０１９）を参照されたい。１つ以上のプロモーターに加えて、該ベクターは、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、ならびにイントロンが挙げられるが、これらに限定されない他の調節領域を含むことができる。
適切なベクターとしては、原核生物で使用される発現ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ及びその派生体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥＩ、ｐＣＲＩが挙げられる。シャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３及びｐＡＴ２８も使用することができる。酵母発現ベクター、例えば、２ミクロンのプラスミド型ベクター、組み込みプラスミド、ＹＥＰベクター及びセントロメアプラスミドもまた使用され得る。昆虫細胞での発現用ベクター、例えば、ｐＡＣシリーズ及びｐＶＬシリーズのベクターならびに植物発現用ベクター（例えば、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズも使用され得る。真核生物発現ベクターならびにウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びレンチウイルス）も使用することができる。非ウイルスベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１－ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸＩ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－１、ｐＭＬ２ｄ及びｐＴＤＴＩもまた企図される。
本明細書に提供する任意のベクターを使用して、該ベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは感染を受けやすいまたはその傾向がある細胞を形質転換、トランスフェクトまたは感染させることができる。該細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。いくつかの例では、核酸構築物は、該細胞、例えば、Ｔ細胞に、プラスミドまたはベクターを使用して導入される。該プラスミドまたはベクターは、宿主細胞に導入されると、細胞のゲノムに統合し、それが統合された染色体（複数可）とともに複製する。任意に、該構築物によってコードされる組み換えタンパク質の発現は、一過性である。
本明細書に提供する核酸配列及びベクターは、このための当技術分野で既知の任意の方法によって、本明細書に記載の宿主細胞のいずれかに送達または導入され得る。本明細書で使用される、核酸配列またはベクターを導入するという文脈における導入とは、細胞の外側から細胞の内側への該核酸配列の移行を指す。場合によっては、導入とは、細胞の外側から細胞の核の内側への核酸配列の移行を指す。
本明細書に記載の核酸配列またはベクターの１つ以上は、裸の送達、プラスミド送達、ナノ粒子、例えば、該核酸配列またはベクターを含むリポソーム、ゲノム編集法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼ）（Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．“Ｍｅｇａｔａｌ，Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９，ａｎｄ Ｔａｌｅｎ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｂｌｏｏｄ １２６（２３）：２０４５（２０１５）、Ｗｅｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ．“Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔｌｉｐｌｅｘ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｈｉｔｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：５２２２２（２０１９））、部位特異的組み換え、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、またはＤＥＡＥ－デキストラン等の試薬を使用する試薬ベースの方法によって導入され得る。形質導入、トランスフェクション、及び機器ベースの方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、レーザーフェクション（ｌａｓｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）、ナノワイヤーまたはナノチューブとの接触、受容体を介した内在化、細胞透過性ペプチドを介した転位等もまた、単独で、または宿主細胞への核酸配列の導入のための他の方法のいずれかと組み合わせて使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９システムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼシステムであり、宿主細胞または生物のゲノムを編集するために使用され得る。該「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、外来核酸に対する防御のための広範なクラスの細菌システムを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、広範な真正細菌及び古細菌生物に見られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブタイプを含む。野生型タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、外来核酸を認識し及び切断するために、ガイド及び活性化ＲＮＡとの複合体を形成したＲＮＡ媒介ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を利用する。ガイドＲＮＡ及び活性化ＲＮＡの両方の活性を有するガイドＲＮＡもまた、当技術分野で既知である。場合によっては、かかる二重活性ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる。
本明細書で使用される、「Ｃａｓ９」という用語は、ＲＮＡ媒介ヌクレアーゼ（例えば、細菌または古細菌起源のもの、またはそれらに由来するもの）を指す。例示的なＲＮＡ媒介ヌクレアーゼとしては、前述のＣａｓ９タンパク質及びそのホモログが挙げられる。他のＲＮＡ媒介ヌクレアーゼとしては、Ｃｐｆ１（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １６３，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐ７５９－７７１，２２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５参照）及びそのホモログが挙げられる。
Ｃａｓ９ホモログは、以下の分類群の細菌を含むがこれらに限定されない広範な真正細菌に見出される：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ－Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｈｌｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質である。さらなるＣａｓ９タンパク質及びそのホモログは、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｋｓｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ１；１０（５）：７２６－７３７、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｊｕｎｅ；９（６）：４６７－４７７、Ｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ２４；１１０（３９）：１５６４４－９、Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ｍａｙ ９；４９７（７４４８）：２５４－７、及びＪｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１に記載されている。本明細書に提供するＣａｓ９ヌクレアーゼのいずれかのバリアントは、宿主細胞における効率的な活性または安定性向上のために最適化することができる。従って、改変Ｃａｓ９ヌクレアーゼもまた企図される。例えば、“Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８（２０１６））を参照されたい。核酸配列は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体を使用して送達することもできる（Ｆａｒｂｏｕｄ ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｃａｓ９ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｍｓｓ，”Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．１３５：５７３５０（２０１８）。
任意に、本明細書に記載の核酸構築物またはベクターのいずれかは、さらに、選択可能なマーカーを含む。本明細書で使用される、選択可能なマーカーとは、マーカーを含む宿主細胞、例えば、Ｔ細胞の選択を可能にする遺伝子を指す。該選択可能なマーカーとしては、蛍光マーカー、発光マーカー及び薬物選択可能なマーカー、細胞表面受容体等が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、該選択は、正の選択であり得る。すなわち、マーカーを発現する細胞を集団から単離し、例えば、該選択可能なマーカーを発現する細胞が濃縮された集団を創製する。分離は、使用する選択可能なマーカーに適した任意の利便性の高い分離技術によることができる。例えば、蛍光マーカーを使用する場合、細胞は、蛍光活性化細胞分類によって分離され得るが、細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、不均一集団から、アフィニティー分離技術、例えば、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに結合されたアフィニティー試薬での「パニング」、蛍光活性化細胞分類または他の利便性の高い技術によって分離され得る。
本明細書で使用される、細胞とは、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞等であり得る。任意に、該細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞である。場合によっては、該細胞は、ヒトＴ細胞であるか、またはＴ細胞受容体分子を発現するＴ細胞に分化することが可能な細胞である。これらとしては、造血幹細胞及び造血幹細胞由来の細胞が挙げられる。
細菌細胞としては、グラム陽性細菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種の細胞、ならびにグラム陰性細菌の細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真菌細胞としては、好ましくは、酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａが挙げられる。昆虫細胞としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの細胞及びＳｆ９細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞としては、とりわけ、作物、例えば、穀草、薬用植物もしくは観賞植物または球根由来の細胞が挙げられる。本開示に適した哺乳類細胞としては、上皮細胞株（ブタ等）、骨肉腫細胞株（ヒト等）、神経芽細胞腫細胞株（ヒト等）、上皮癌細胞（ヒト等）、グリア細胞（マウス等）、肝細胞株（サル等）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６、ヒトＥＣＣ ＮＴＥＲＡ－２細胞、ｍＥＳＣ系統のＤ３細胞、ヒト胚性幹細胞、例えば、ＨＳ２９３及びＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２及びＨＳ１８１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔ、ＲＥＨ及びＭＣＦ－７及びｈＭＳＣｓ細胞が挙げられる。
細胞を作製する方法
本明細書に提供する核酸構築物またはベクターのいずれかで細胞を形質導入することを含む、改変細胞の作製方法。任意に、該細胞は、形質導入の前に対象から採取される。本明細書に記載の核酸配列、構築物またはベクターのいずれかは、アルファベータＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、リンホカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、またはマクロファージで発現され得る。本明細書に提供する方法のいずれかによって作製される細胞もまた提供する。前述の細胞の１つ以上の変量を含む細胞集団もまた提供する。全体を通して使用される、本明細書に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列または構築物を含む細胞は、ＣＡＲ細胞と呼ばれ得る。
任意に、該細胞は、初代細胞であり得る。本明細書で使用される、初代細胞とは、形質転換または不死化されていない細胞である。かかる初代細胞は、限られた回数培養、二次培養、または継代され得る（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回培養される）。場合によっては、該初代細胞は、インビトロ培養条件に適合させられる。場合によっては、該初代細胞は、生物、系、器官、または組織から単離され、任意に分類され、培養することも二次培養することもなく直接使用される。場合によっては、該初代細胞は、刺激されるか、活性化されるか、または分化させられる。例えば、初代Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ２８アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、またはそれらの組み合わせとの接触（例えば、その存在下での培養）によって活性化され得る。
リンパ球を得るための適切な方法は当業者に既知であり、末梢血から、臍帯血から、及びリンパ球を含む組織からの単離を含むが、これらに限定されない。任意に、該リンパ球は、特定の疾患に苦しむ患者のリンパ節からの排液を介して単離される。
リンパ球が単離されると、それらは、リンパ球の増殖が生じるのに適切な条件下、それらが本明細書に提供する核酸構築物で形質導入されるように配置される。リンパ球増殖、例えば、ＣＴＬ増殖のための一般的な条件は、周知の方法（Ｃａｒｔｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７（１），１２３－１２９，（１９９６）参照）に従って確立することができ、当業者によって定期的に最適化され得る。通常、形質導入は、リンパ球を当該細胞に適した培地で培養することによって行われる。該細胞は、最小必須培地またはＲＰＭＩ１６４０培地を含めたリンパ球の増殖に適した培地中、従来の条件下で培養され得る。細胞増殖を促進する目的で、血清、例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清及び抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンを含めた必要な増殖因子及び生存率因子を添加してもよい。該リンパ球は、増殖を支援するために必要な条件にて、例えば、適温約３７℃及び雰囲気、例えば、空気に５％ＣＯ２を加えて維持される。
Ｔ細胞は、Ｔ細胞でもＴリンパ球でもよく、これは、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。Ｔ細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することによって、他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と区別され得る。以下に要約するように、様々なタイプのＴ細胞が存在する。
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞またはＣＤ４＋細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含めた免疫学的プロセスにおいて他の白血球を支援する。ＴＨ細胞は、その表面にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面にあるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示された場合に活性化される。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して異なるタイプの免疫応答を促進するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含めたいくつかのサブタイプの１つに分化することができる。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、またはＣＤ８＋細胞）は、ウイルス感染した細胞及び腫瘍細胞を破壊するとともに、移植片拒絶反応にも関与する。ＣＴＬは、その表面においてＣＤ８を発現する。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞から分泌されるＩＬ－１０、アデノシン及び他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞を不活化して、自己免疫疾患、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎を予防するアネルギー状態にすることができる。
メモリーＴ細胞は、感染が解消した後も長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、同種抗原に再曝露されると迅速に多数のエフェクターＴ細胞に増殖し、ひいては免疫系に過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）ならびに２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、通常、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に不可欠である。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに近づくにつれてＴ細胞性免疫を停止し、胸腺での陰性選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。２つの主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞、すなわち、天然に存在するＴｒｅｇ細胞及び適応Ｔｒｅｇ細胞が報告されている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞（別名ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞）は、胸腺で生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）及び形質細胞様樹状（ＣＤ１２３＋）の両方との相互作用に関連する。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、制御性Ｔ細胞の発達を防ぎ、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こす可能性がある。適応Ｔｒｅｇ細胞（別名Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞）は、正常な免疫応答の間に生じ得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供する細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）である。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣに依存しない方法で、ウイルス感染細胞からの生来のシグナルに迅速に応答する。ＮＫ細胞（自然リンパ系細胞群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂ及びＴリンパ球を生成するリンパ系共通前駆細胞から分化する第三の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺及び胸腺で分化及び成熟し、その後、循環系に入ることが知られている。
治療方法
本明細書に提供するのは、有効量の本明細書に記載の細胞のいずれかを投与することを含む、対象のがん幹細胞または分化がん細胞（例えば、造血起源のがん幹細胞または分化がん細胞）を枯渇させる方法である。いくつかの実施形態では、該対象は、がんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。全体を通して使用される、がんとは、当該細胞が、正常な組織の増殖より急速に増殖する任意の細胞障害を指す。増殖性疾患としては、腫瘍とも呼ばれる新生物が挙げられるが、これらに限定されない。新生物は、固形新生物（例えば、肉腫もしくは癌腫）の場合もあれば、造血系に影響を与えるがん性増殖の場合もある。
がんの例としては、リンパ腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。該リンパ腫または白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非特定型末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫・鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、皮膚原発ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄異形成・骨髄増殖性新生物、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性新生物、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、ならびに有毛細胞白血病からなる群から選択され得る。
他の例としては、固形腫瘍、例えば、膵臓癌、乳癌、脳癌（例えば、神経膠芽細胞腫）、肺癌、中枢神経系癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、甲状腺癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、横紋筋肉腫、骨癌肉腫、肛門癌、精巣癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、神経内分泌癌、子宮頸癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、胃癌、膀胱癌、副腎癌及び肝臓癌が挙げられるが、これらは一部に過ぎない。
いくつかの実施形態では、該がん幹細胞は、ＭＰＬ＋、ｃ－ＫＩＴ＋、ＦＬＴ３＋、ＩＬ－３受容体＋、ＣＤ３４＋、インテグリンアルファ３／ベータ１＋、内皮プロテインＣ受容体＋またはＴｈｙ－１／ＣＤ９０＋である。
本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、例えば、固形腫瘍を治療または予防することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法のいずれかを用いて、遺伝子治療の有無にかかわらず、非悪性造血幹細胞移植のために造血幹細胞を枯渇させることができる。非悪性疾患としては、サラセミア、鎌状細胞貧血、非形成性貧血、ファンコニ貧血、ファブリー病、ゴーシェ病、シスチン症、ポンペ病、ムコ多糖症、ダノン病、白血球接着不全症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、慢性肉芽腫性疾患、ウィスコット・アルドリッチ症候群、重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ及びＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、家族性血球貪食性リンパ組織球症、ならびに血友病Ａが挙げられるが、これらに限定されない。
同様に提供するのは、対象におけるがんの治療または予防方法であり、該方法は、（ａ）第一の対象から採取される細胞に、本明細書に記載の核酸構築物またはベクターを導入すること、及び（ｂ）第二の対象に該細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該第一の対象及び該第二の対象は、異なる対象である。いくつかの実施形態では、該第一の対象及び該第二の対象は、同じ対象である。いくつかの実施形態では、該対象は、ＭＰＬ＋、ｃ－ＫＩＴ＋、ＦＬＴ３＋、ＩＬ－３受容体＋、ＣＤ３４＋、インテグリンアルファ３／ベータ１＋、内皮プロテインＣ受容体＋またはＴｈｙ－１／ＣＤ９０＋細胞の増加に関連するがんを有する。いくつかの実施形態では、該がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非特定型末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫・鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、皮膚原発ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄異形成・骨髄増殖性新生物、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性新生物、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、及び有毛細胞白血病からなる群から選択され得る。
他のがんとしては、膵臓癌、乳癌、脳癌（例えば、神経膠芽細胞腫）、肺癌、中枢神経系癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、甲状腺癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、横紋筋肉腫、骨癌肉腫、肛門癌、精巣癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、神経内分泌癌、子宮頸癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、胃癌、膀胱癌、副腎癌及び肝臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、本明細書に提供する方法のいずれかは、さらに、該対象をがんと診断することを含む。
本明細書に提供する方法では、該細胞は、上記の細胞型の１つ以上であり得る。本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを発現する細胞は、患者自身の末梢血から、血縁ドナーの末梢血由来の造血幹細胞移植に伴って、または非血縁ドナー由来の末梢血のいずれかから、エキソビボで生成され得る。
代替的に、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボ分化に由来することができる。代替的に、その溶解機能を保持し、治療薬として作用する可能性のある不死化Ｔ細胞株を使用することができる。
任意に、該細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、本明細書に記載の核酸構築物の形質導入を受ける前または受けた後に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって、活性化及び／または増殖し得る。
いくつかの実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、（ｉ）対象または他の供給源からＴ細胞またはＮＫ細胞を含むサンプルを単離すること、及び（ｉｉ）該細胞を本明細書に記載の核酸構築物で形質導入またはトランスフェクトすることによって作製され得る。
該形質導入またはトランスフェクトされた細胞は、その後、対象に投与する前に、精製され、例えば、細胞表面タンパク質、例えば、ＭＰＬに選択的に結合する受容体リガンド、例えば、ＴＰＯの発現に基づいて選択され得る。
本明細書に提供する方法のいずれかは、さらに、放射線療法、免疫療法、化学療法または外科手術を含むことができるが、これらは一例に過ぎない。ある特定の実施形態では、該方法は、さらに、ＧＭ－ＣＳＦ、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ４０、抗ＩＬ－７、もしくは抗ＩＬ－６抗体またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、免疫チェックポイント阻害剤または免疫刺激性サイトカインと組み合わせて、本明細書に記載の細胞のいずれかを投与することを含む。
ある特定の実施形態では、該抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブであり、該抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びピディリズマブから選択され、該抗ＰＤ－Ｌ１は、（ＭＤＸ－１１０５）ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃから選択される。
いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、化学療法を該対象に施すことを含む。例えば、該方法は、さらに、本明細書に開示する組成物を、ベバシズマブ、エルロチニブ、イピリムマブ、ベバシズマブ及びエルロチニブ、ベバシズマブ及びエルロチニブ、ランブロリズマブ、ダサチニブ、ＩＬ－２、ペンブロリズマブ、シスプラチン及びペメトレキセド、カルボプラチン及びパクリタキセル、ペグ化ＩＦＮ－α２ｂ、アキシチニブ、レナリドマイド及びデキサメタゾン、トラメチニブ及びダブラフェニブ、ならびにＩＦＮ－γと組み合わせて投与することを含むことができる。
いくつかの実施形態では、該方法は、さらに、造血幹細胞を該対象に投与することを含む。本明細書に提供する１つ以上の細胞、組み換えタンパク質またはコンジュゲートを投与することにより、対象は、ＨＳＣ移植用に前処置され得る。例として、かかるコンジュゲートとしては、薬物または毒素（例えば、リボソーム不活性化タンパク質、サポリン）にコンジュゲートされた抗体断片またはリガンドを有する構築物が挙げられる。
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、骨髄もしくは免疫系が損傷しているまたはこれに欠陥がある患者の造血機能を復元するために、自己（患者自身の幹細胞が使用される）、同種異系（幹細胞はドナー由来）または同系（一卵性双生児の片方から）を静脈内（ＩＶ）注入することを含む。ＨＳＣＴは、通常、ある特定の血液または骨髄のがん、例えば、多発性骨髄腫または白血病の患者に行われる。これらの場合、レシピエントの免疫系は移植前に前処置、すなわち、放射線または化学療法で破壊される。感染症及び移植片対宿主病は、同種異系ＨＳＣＴの主な合併症である。
本明細書で使用される、造血幹細胞とは、血液細胞を生じさせることができる幹細胞のタイプを指す。造血幹細胞は、骨髄もしくはリンパ系の細胞、またはそれらの組み合わせを生じさせることができる。造血幹細胞は、主に骨髄に見出されるが、末梢血、またはその分画から分離することもできる。様々な細胞表面マーカーを使用して、造血幹細胞を識別することも、分類することも、精製することもできる。場合によっては、造血幹細胞は、ｃ－ｋｉｔ＋及びｌｉｎ－として識別される。場合によっては、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ｌｉｎ－として識別される。場合によっては、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４－、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ｌｉｎ－として識別される。場合によっては、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ１３３＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ｌｉｎ－として識別される。場合によっては、マウス造血幹細胞は、ＣＤ３４ｌｏ／－、ＳＣＡ－１＋、Ｔｈｙ１＋／ｌｏ、ＣＤ３８＋、Ｃ－ｋｉｔ＋、ｌｉｎ－として識別される。場合によっては、該造血幹細胞は、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ２４４－である。
自己ＨＳＣＴは、当該患者からの造血幹細胞（ＨＳＣ）の抽出（例えば、アフェレーシス）及び採取した細胞の保存を含む。該患者には、その後、前処置、例えば、放射線療法を伴うまたは伴わない化学療法が、該対象の悪性細胞集団を根絶することを意図して、部分的または完全な骨髄のアブレーション（新たな血液細胞を成長させるための患者の骨髄の破壊）により行われる。次に、保存された対象の幹細胞が輸液され、これらが破壊された組織に置き換わり、該対象の正常な血液細胞の生成を再開する。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する前処置、ＨＳＣＴ、及びまたはがん治療は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）（再発性、難治性）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（再発性、難治性）、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経膠腫、固形腫瘍、サラセミア、鎌状赤血球貧血、非形成性貧血、ファンコニ貧血、乳児性悪性大理石骨病、ムコ多糖症、または血友病Ａと診断された対象に使用され得る。
本明細書に提供するのは、ＨＳＣ移植を必要とする対象に対して、有効量の本明細書に記載の細胞、抗体断片またはリガンド薬物／毒素コンジュゲート（例えば、抗ｃ－Ｋｉｔ Ｍａｂ－サポリンまたはＴＰＯ－サポリン）を投与することによる、ＨＳＣ移植のための対象の前処置法である。例えば、本明細書に提供するのは、ＨＳＣ移植を必要とする対象に対して、有効量の本明細書に記載の細胞を含むＴＰＯ－ＣＡＲ、ＴＰＯコンジュゲート、または組み換えＴＰＯタンパク質を投与することによる、ＨＳＣ移植のための対象の前処置法である。
本明細書に記載の方法のいずれかは、さらに、ＨＳＣ移植のための該対象の前処置後に、第一のＨＳＣ集団を該対象に移植すること、及び任意に、該第一のＨＳＣ集団の移植後に、該対象に対して第二のＨＳＣ集団を移植することを含み得る。
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、該構築物を含む細胞、コンジュゲート、または組み換えタンパク質の量は、内因性ＨＳＣ及びＨＳＰＣのアポトーシスを誘導するのに、及び／または該対象に移植されたＨＳＣの生着を促進するのに有効であり得る。
いくつかの実施形態では、該第一のＨＳＣ集団は、該構築物を含む細胞、コンジュゲート、または組み換えタンパク質が、該対象の血清から実質的に除去された後に、該対象に移植され得る。いくつかの例では、該第一のＨＳＣ集団は、該構築物を含む細胞、コンジュゲート、または組み換え受容体リガンドタンパク質の投与後少なくとも２４時間で、該対象に移植され得る。他の例では、該第一のＨＳＣ集団は、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞、コンジュゲート、または組み換え受容体リガンドタンパク質の投与後少なくとも３日（例えば、少なくとも７日）で、該対象に移植され得る。
任意に、本明細書に記載の方法のいずれかによって治療される対象は、ＨＳＣの移植前に、さらなる前処置、例えば、照射処理またはＤＮＡ損傷剤の投与を受けなくてもよい。
本明細書に記載の任意の方法では、移植用の第一のＨＳＣ集団、第二のＨＳＣ集団、またはその両方は、適切な供給源（例えば、ヒト）の骨髄、末梢血細胞、及び／または臍帯血に由来し得る。該ＨＳＣは、同種異系ＨＳＣの場合もあれば、自己ＨＳＣの場合もある。いくつかの例では、該ＨＳＣは、対象に移植する前にエキソビボで培養され得る。
本明細書に提供する方法では、有効用量の構築物含有細胞及び／またはＨＳＣを当該対象に投与することができる。有効量及び有効用量という用語は、同義で用いられる。有効量という用語は、所望の生理反応を生じるために必要な任意の量として定義される。いくつかの方法では、約１Ｘ１０６～約１２Ｘ１０６個のＣＤ３４＋細胞／ｋｇが投与され得るが、この量は、関連障害に応じて変わり得る。該細胞を投与する場合の有効量及びスケジュールは、経験的に決定される場合があり、かかる決定を行うことは、当業者が備えている技能の範囲内である。該投与のための用量範囲は、所望の効果（例えば、疾患、例えば、がんの治療）を生み出すのに十分な範囲である。該用量は、実質的な副作用、例えば、不要な交差反応、アナフィラキシー反応等を引き起こすほど大量であるべきではない。一般に、該用量は、年齢、状態、性別、疾患のタイプ、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるか否かにより変動し、当業者によって決定され得る。該用量は、任意の禁忌事象においては、個々の医師により調整され得る。用量は変動する場合があり、該薬剤は、１日１回以上の投与で、必要に応じて１日または複数日投与され得る。本明細書に記載の障害を治療するための方法のいずれかは、さらに、該対象に１つ以上の免疫抑制剤を投与することを含むことができる。
全体を通して使用される、対象とは、脊椎動物、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）であり得る。該用語は、特定の年齢または性別を意味しない。従って、雌雄にかかわらず、成体及び新生対象が包含されることが意図される。本明細書で使用される、患者または対象は、同義で使用される場合があり、障害を有するまたは発症するリスクがある対象を指すことができる。患者または対象という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。
本明細書で使用される、治療、治療する、または治療することという用語は、当該対象の障害、例えば、がんの影響の１つ以上または該障害の症状の１つ以上を軽減する方法を指す。従って、本開示の方法での治療とは、がんの重症度の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を指すことができる。例えば、がんの治療方法とは、対象のがんの症状の１つ以上が、対照と比較して１０％減少する場合に治療であると見なされる。従って、該減少は、自然のレベルまたは対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の間の任意の減少率であり得る。治療とは、必ずしも、該障害または該障害の症状の治癒または完全な除去を指さないことが理解される。
本明細書で使用される、予防する、予防すること、または予防とは、疾患または障害の発症、出現、重症度、または再発を、起きないようにする、遅らせる、回避する、取り除く、未然に防ぐ、停止する、または妨害する方法を意味する。例えば、本開示の方法は、がんの影響を受けやすい対象におけるがんまたはがんの症状の１つ以上の発症、出現、重症度、または再発が、本明細書に記載の細胞、コンジュゲートまたは組み換えタンパク質を投与されなかった、がんの影響を受けやすい対照の対象と比較して減少または遅延される場合、予防であると見なされる。本開示の方法はまた、がんの影響を受けやすい対象におけるがんまたはがんの症状の１つ以上の発症、出現、重症度、または再発が、本明細書に記載の細胞、コンジュゲートまたは組み換えタンパク質を投与された後に、治療を受ける前の該対象の進行と比較して減少または遅延される場合、予防であると見なされる。従って、がんの発症、出現、重症度、または再発の減少または遅延は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％またはその間の任意の量の減少であり得る。
同様に本明細書に提供するのは、ＨＳＣ移植を必要とする対象におけるドナーのＨＳＣの生着を促進するのに、またはＨＳＣ移植のために対象を前処置するのに用いる細胞を、本明細書に記載の構築物、コンジュゲート、または組み換えタンパク質とともに含む医薬組成物である。該組成物は、さらに、本明細書に記載の任意の細胞表面受容体の阻害剤、例えば、ＭＰＬ、ｃ－ＫＩＴ、ＦＬＴ３、ＩＬ－３受容体、ＣＤ３４、インテグリンアルファ３／ベータ１、内皮プロテインＣ受容体、またはＴｈｙ－１／ＣＤ９０の阻害剤を含むことができる。
同様に本開示の範囲に含まれるのは、ＨＳＣ移植を必要とする対象におけるドナーのＨＳＣの生着を促進するのに、またはＨＳＣ移植のために対象を前処置するのに用いる薬剤の製造における、本明細書に記載の構築物を含む細胞、コンジュゲート、または組み換え核酸もしくはタンパク質のいずれかの使用である。これらの薬剤のいずれかは、本明細書に記載の任意の疾患の治療または予防に使用され得る。
開示するのは、本開示の方法及び組成物に使用することができる、それらと併せて使用することができる、それらの調製に使用することができる、またはそれらの生成物である材料、組成物、及び成分である。これら及び他の材料を本明細書に開示するとともに、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の様々な個々の及び集団的順列と組み合わせの各々の特異的言及が明確に開示されない場合があるが、各々は、明確に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び議論され、該方法に含まれる１つ以上の分子に行われ得るいくつかの修飾が議論される場合、該方法のありとあらゆる順列と組み合わせ、及び可能な修飾は、相反することが具体的に示されない限り、明確に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、明確に企図され、開示される。本概念を、本開示の組成物を用いる方法におけるステップが挙げられるが、これらに限定されない本開示のすべての態様に適用する。従って、行われ得る様々なさらなるステップが存在する場合、これらのさらなるステップの各々を、本開示の方法の任意の特定の方法ステップでまたは方法ステップと組み合わせて行うことができること、及びかかる組み合わせまたは組み合わせのサブセットの各々が、明確に企図されること、及び開示されると見なされるべきであることが理解される。
本明細書に引用される出版物及びそれらが引用される資料は、参照することにより全体として具体的に本明細書に組み込まれる。
実施例Ｉ
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄芽球からなるがんである。ＡＭＬは、小児悪性腫瘍の２０％を占め、成人では最も一般的な白血病である。造血と同様、白血病幹細胞（ＬＳＣ）は、白血病の自己複製及び増殖が可能である。ＬＳＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－発現を特徴とし、化学療法に対して耐性を示すことから、標的とすることが困難であることが報告されている。また、ＨＳＣ及びＬＳＣは、生存をｃ－ＭＰＬ／ＴＰＯ経路に依存する。さらに、白血病、例えば、巨核球性白血病及び赤血球形成性白血病は、ＭＰＬの発現が高いことが報告されている。さらに、ＭＰＬ＋ＬＳＣの患者は、患者転帰の予後が悪く、従来の化学療法に対して耐性を示す。総合すれば、この白血病のサブセット及びがん幹細胞を標的にするという、満たされていないニーズがある。これらの理由から、ＭＰＬ受容体を標的とするＣＡＲを設計した。
リガンドベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、ヒトＴＰＯ（ｈＴＰＯ）で開発した。ｈＴＰＯは、ＭＰＬの結合パートナーである。Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８及びＣＤ３ｚに連結した受容体リガンドとしてｈＴＰＯを組み合わせたＣＡＲ（図１Ａ）を作製した。この構築物には、遺伝子組み換え細胞を調べる方法としてＧＦＰも発現させた。このｈＴＰＯ－ＣＡＲをコードする組み換えレンチウイルスを生成した。それが効率的にＴ細胞を形質導入し、形質導入したＴ細胞が、ＭＰＬを発現する標的細胞に対して特異的に活性化されることが分かった（図１Ｂ、１Ｃ）。ＴＰＯ－ＣＡＲの特異性をさらに実証するため、ＭＰＬを発現する細胞の集団であるマウス造血幹細胞（ＬＳＫ細胞と呼ばれる）が、ｈＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞によって選択的に殺傷されることが示された（図２）。従って、ＭＰＬを標的とするためにこの構築物を使用することができる。
ＭＰＬを発現するがん細胞を標的とすることに加えて、ＭＰＬ及びそのリガンドＴＰＯは、いくつかの重要なＨＳＣ機能、例えば、生存、静止、及びＤＮＡ修復に重要である。ｃ－ＭＰＬを欠損したマウス及びヒトは、造血前駆細胞（ＨＰＣ）及びＨＳＣが非常に少ない。ヒトでは、ＭＰＬの不活性化変異は、進行性の骨髄不全を引き起こし、長期の造血を維持する上でのｃ－ＭＰＬの重要な役割を裏付ける。マウス及びヒト骨髄前駆体におけるＭＰＬ発現の分析により、ＭＰＬ発現が、ＨＰＣと比較した場合にＨＳＣで濃縮されていることが明らかになった（図３及び図４）。この受容体の発現の機能的意義を検証するため、ＴＰＯ曝露後のｐＳＴＡＴ５の分析により、マウス骨髄の２～３％がＴＰＯに応答し、ＴＰＯ応答細胞がＨＳＰＣコンパートメントで濃縮されていることが明らかになった（図５）。また、ＢＭ前駆体コンパートメント内でも、広く発現されているｃ－ＫＩＴまたはＣＤ４５と比較した場合、ＭＰＬ発現はＨＳＣコンパートメントで濃縮されている（図３及び図４）。さらに、非造血コンパートメントで非常に高い発現を有するｃ－ＫＩＴとは異なり、非造血コンパートメントでのＭＰＬの発現は最小限である（表２）。これらの特性により、ＭＰＬは、ＨＳＣに対する前処置レジメンの理想的な標的になる。
Figure 2022526187000004
実施例ＩＩ
細胞株及び細胞培養
ＨＥＬ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、及び６９７（ＡＴＣＣ，Ｏｌｄ Ｔｏｗｎ Ｍａｎａｓｓａｓｓ，ＶＡ）細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０中、Ｌ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＧｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓｓ，ＶＡ）及び１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンとともに培養した。ＣＭＫ細胞（Ｐｅｔｒｉｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）もまた、２０％ＦＢＳを用いる以外は先の条件下で培養した。Ｍｏ７ｅ（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えたＩＭＤＭ（１ｘ）中、Ｌ－グルタミン及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳとともに培養した。
初代細胞
全血白血球除去フィルターはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ．から入手した。健康なドナーのＴ細胞は、既述の通り、白血病除去フィルターから単離したドナーのＰＢＭＣから陰性選択により単離した。Ｗｅｇｅｈａｕｐｔ ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ＬＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｉｌｔｅｒｓ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．４９：１５－２２（２０１７）を参照されたい。細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ滅菌溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で単離した後、ＰＭＢＣを単離した。白血球をＰＢＳで洗浄し、Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して単離した。単離直後、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で２４時間活性化した。
ＣＡＲ構築物のクローニング
ＣＡＲ配列を、レンチウイルス生成に必要な成分を含むベクターにクローニングした。ＴＰＯの結合ドメインをＣＡＲの結合部分として使用した。Ｆｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＴＰＯ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０１（７）：１８１６－１８２１（２００４）を参照されたい。このＣＡＲは、ＧＦＰを共発現するバイシストロン性ベクターである。このコドン最適化構築物を、ＣＨ３ヒンジドメインを含むように再設計した。これはバイシストロン性ではなかったが、ＩＬ２のシグナル配列からＣＤ３ζまでの全ＣＡＲを、ヒト細胞発現用に最適化した。すべての遺伝子は、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）の遺伝子合成によって得た。
レンチウイルスの生成
ウイルスアクセサリープラスミド及びＣＡＲ発現プラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクション（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）法を使用して、２９３Ｔ－１７細胞に一過性にトランスフェクトし、ＶＳＶＧエンベロープシュードタイプ化ＬＶベクターを生成した。トランスフェクション後４８時間から３日間、馴化培地を回収し、０．４５μｍのフィルターに通した。ウイルスを、１０，０００×ｇで終夜遠心分離した後、０．２２μｍのフィルターを使用して濾過することにより濃縮した。ウイルス濃縮物の力価は、定量的リアルタイムＰＣＲ分析を使用して決定した。
レンチウイルス形質導入
組み換えＨＩＶレンチウイルス粒子の形質導入は、８μｇ／ｍｌのポリブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を加えた完全培地中、細胞をウイルスとともにインキュベートすることによって行った。形質導入の１８時間後、培地を交換した。この形質導入細胞を、実験に使用する前に少なくとも５日間培養した。
フローサイトメトリー
細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１００×Ｇで遠心分離した。上清をデカントし、適切な抗体カクテルを含むＰＢＳと交換した。使用したＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）製の抗体は、以下を含む：ＢＵＶ７３７マウス抗ヒトＣＤ３（クローンＳＰ３４－２）、ＢＵＶ４９６マウス抗ヒトＣＤ３８（クローンＨＩＴ２）、ＡＰＣ－Ｃｙ７マウス抗ヒトＣＤ６９（クローンＦＮ５０）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ４５、Ｖ４５０マウス抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＢＶ６０５ラット抗マウスＣＤ１６／３２（クローン２．４Ｇ２）、ＢＶ４２１ラット抗マウスＣＤ１５０（クローンＱ３８－４８０）、ＰＥ－Ｃｙ７ハムスター抗マウスＣＤ４８（クローンＨＭ４８－１）。使用したＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製の抗体は、以下を含む：ＡＰＣアネキシンＶ、ＰＥ抗ヒトＣＤ１１０（Ｓ１６０１７Ｅ）、ヨウ化プロピジウム溶液、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３８（ＨＩＴ２）、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ３／Ｇｒ－１／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）／Ｔｅｒ－１１９（「Ｌｉｎｅａｇｅ」）、ＰＥ抗マウスＬｙ－６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ－１）（クローンＤ７）、ＡＰＣ抗マウスＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）（クローンＡＣＫ２）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ３４（クローンＭＥＣ１４．７）。細胞を、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用したフローサイトメトリーで分析した。
ｐＳＴＡＴ５活性化アッセイ
がん細胞株を、組み換えＴＰＯ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＴ細胞培地で４５分間刺激した。Ｔ細胞を、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬで播種し、７２時間後、細胞を遠心分離し、培地を回収した。細胞を２５０μＬの馴化培地または４００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＴＰＯに再懸濁した。ｐＳＴＡＴ５の活性化を遮断するため、１０μｇのヒトＴＰＯ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、外因ＴＰＯに加えて細胞とともにインキュベートした。ＴＰＯとのインキュベーション後、細胞を固定し、フローサイトメトリー用に透過処理した。細胞を、抗ｈｕホスホ－ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）クローンＳＲＢＣＺＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色した。
細胞傷害性アッセイ
Ｔ細胞を、共培養実験による細胞傷害能に関して調べた。標的細胞（ＣＭＫ、Ｍｏ７ｅ、ＨＥＬ）を、Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｄｙｅ ４５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で標識し、フローサイトメトリーベースの細胞傷害性アッセイで評価した。混合細胞傷害性実験では、標的細胞であるＫ５６２及び６９７を、ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色し、ＭＰＬ＋／－標的細胞を分離した。競合細胞傷害性アッセイでは、０．１～４００ｎｇ／ｍＬの組み換えＴＰＯ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、細胞傷害性アッセイの開始時、エフェクター細胞と同時に加えた。標的細胞を、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比、０：１、１：２、１：１、２：１、５：１でＴ細胞とともに、３７℃で１２時間インキュベートした。標的細胞死を、死細胞染色アネキシンＶ及びＰＩを用いたフローサイトメトリーにより分析し、エフェクターを、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ３８について分析した。残りの標的を、ＭＰＬの表面発現についてさらに分析した。抗体を、室温で振とうしながら６０分間インキュベートし、１容量のＰＢＳでの洗浄後にデータを取得した。
リアルタイム定量的ＰＣＲ
ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用し、製造業者が推奨するプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して抽出した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）の１５０ｂｐアンプリコン用に設計した。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で行った。
インビボマウス実験
ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、無菌環境で維持した。マウスは、確立されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の原則に従って世話をし、すべての動物プロトコルは、ＩＡＣＵＣによって承認された。５週齢のマウスに、５ｘ１０６個のＣＭＫルシフェラーゼ細胞を尾静脈注射した。腫瘍の増殖及びマウスの健康状態は、週３回の体重測定、ＩＶＩＳ（Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）画像化、及び隔月の全血球計算によって観察した。ルシフェラーゼは、画像化の直前に作製した。ルシフェリンは、１０ｍＬ／グラムで腹腔内注射した。マウスを、注射の１０分後に撮像し、生物発光を定量化した。
統計分析
すべての統計分析及びグラフ化は、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔバージョン１３（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ，）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。正確な方法は、使用される各実験に対して記載する。
結果
ＬＴ－ＨＳＣ及び白血病細胞でのＭＰＬの検出
Ｓｔ．Ｊｕｄｅ ＰｅＣａｎ Ｄａｔａ Ｐｏｒｔａｌデータベースのデータでは、多くの小児悪性腫瘍がＭＰＬ発現を有することが示唆されている（Ｄｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４４（６）：６１９－６２２（２０１２））、しかしながら、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、高発現型として際立っている（図６Ａ）。急性巨核芽球性（Ｍ７またはＡＭＫＬ）及びコア結合因子（ＣＢＦ）ＡＭＬは、他のサブタイプよりも高レベルのＭＰＬを発現する傾向がある（図６Ｂ）。興味深いことに、成人のＡＭＬは、ＴＣＧＡデータによれば、同レベルのＭＰＬを発現しない（図６Ｃ）。さらに、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ ＰｅＣａｎ ｄａｔａ ｐｏｒｔａｌを、ＨＳＣで発現され、骨髄／幹細胞枯渇のメカニズムとして標的にされるｃ－ｋｉｔ受容体のデータに関して分析した。ＲＮＡ発現は、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ ＰｅＣａｎ ｄａｔａ ｐｏｒｔａｌで調査された複数の小児がんで高く（図６Ｄ）、同様に、健康な組織及び非造血組織でＭＰＬと比較して高発現され（表２）、恐らくは、リガンドべ－スのＣＡＲとしてのその有用性を制限している。様々なＡＭＬ細胞株におけるＭＰＬの存在を確認するために、フローサイトメトリーを使用してＭＰＬの表面発現を測定した（図６Ｅ～Ｆ）。さらに、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）（表３）から入手可能なＲＮＡ発現レベルは、ＨＥＬ（赤芽球性白血病）及びＣＭＫ細胞（ＡＭＫＬ）での高ＭＰＬ表面発現、ならびに別のＡＭＫＬ株であるＭｏ７ｅでの低／検出不能な発現を示している。
Figure 2022526187000005
Figure 2022526187000006
これらの細胞株がＴＰＯに応答することを確認するため、ｐＳＴＡＴ５の下流の上方制御を測定した。ＨＥＬ、ＣＭＫ、Ｍｏ７ｅ細胞ならびに対照細胞株Ｋ５６２及び６９７を、マウスまたはヒトＴＰＯで４５分間刺激した（図６Ｇ～Ｈ）。ＴＰＯで刺激すると、ｐＳＴＡＴ５の有意な増加がＨＥＬ、ＣＭＫ、及びＭｏ７ｅ細胞で観察され、各細胞株は、それらの未刺激対応物と比較して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の有意な増加を示した（図１Ｈ、Ｐ＜．００１、２元配置分散分析）。ＭＰＬの発現は最小限であるものの、ＭＯ７ｅ細胞はＴＰＯに応答する。特に、このシフトは、対照細胞株Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）及び６９７（Ｂ細胞白血病）では観察されなかった。ＭＰＬ及びｐＳＴＡＴ５の発現は、マウス及びヒトの両骨髄サンプルで調べた。本明細書に示すデータは、より幹様細胞／長期造血幹細胞が、より分化した短期造血幹細胞（ＳＴ－ＨＳＣ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、及び最も分化した前駆細胞と比較して、大きなＭＰＬの表面発現及び高いＭＦＩを有することを示す。（図６Ｉ～Ｊ）。ヒト及びマウスの両組み換えＴＰＯは、マウス骨髄、特にＬＳＫ（ｌｉｎｅａｇｅ陰性、ｃ－ｋｉｔ陽性、Ｓｃａ－１陽性）細胞においてｐＳＴＡＴ５発現を誘導した（図７Ａ）。
ＭＰＬを標的とするリガンドベースのＣＡＲの開発
ＴＰＯリガンドを、１７６位のアミノ酸で切断し、得られたｃＤＮＡを第二世代のレンチウイルスＣＡＲ構築物にクローニングした（図８Ａ）。ヒトＴ細胞をＰＢＭＣから単離し、２４時間活性化した。Ｔ細胞を次いで形質導入し、１８時間インキュベートした。形質導入の５日後、細胞は、２２～４３％のＧＦＰによる形質導入効率を示し（図８Ｃ）、ベクターコピー数は、０．２０～０．９６コピーの範囲であった（図８Ｄ）。ＴＰＯ－ＣＡＲを形質導入し、Ｍｏ７ｅ細胞株と共培養したＴ細胞は、ＣＤ６９（初期活性化マーカー）、ＣＤ３８（長期活性化マーカー）、及びＣＤ１０７ａ（脱顆粒）のパーセンテージの有意な増加を示した（図８Ｅ）。しかしながら、ＴＰＯ－ＣＡＲ溶解物を採取し、対照ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞及び非形質導入Ｔ細胞と比較した場合、ＣＡＲ発現は、ＣＤ１９ＣＡＲと比較して低かった（図８Ｆ）。さらなる分析により、ゲノムＤＮＡの適切な配列決定を示したところ、ＣＤ１９ＣＡＲとＴＰＯ－ＣＡＲ間で、ノーザンブロットによるｍＲＮＡに有意差はなかった。タンパク質配列及び構築物の設計に問題があるかどうかを分析するため、リンカー配列を、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインで置換し、そのＣＡＲ構築物を、カスタムコドン使用バイアス表を使用してコドン最適化した。商用アルゴリズムを使用したインシリコ最適化は、カスタム表から作成され、種特異的またはゲノムベースの表の代わりに、コドン最適化（ＣＯ）と呼ばれる。最適化パラメータには、シス作用性モチーフの除去、ＲＮＡ構造の不安定化、及びＧＣ含量の最小化を含めた（図８Ｂ）。新たな構築物を評価するため、Ｔ細胞を単離し、活性化し、感染多重度（ＭＯＩ）５０にて、レンチウイルス非コドン最適化（ＮＣＯ）バイシストロン性ベクターｅＧＦＰ Ｐ２Ａ ＴＰＯ ＣＡＲ（ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ）もしくはｅＧＦＰ Ｐ２Ａ ＣＤ１９ＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲ）、またはコドン最適化モノシストロン性ベクターＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで形質導入した。形質導入後５～７日の間に溶解物を採取し、ＣＤ３ζの発現をウエスタンブロットにより検出した（図８Ｆ）。複数のドナーでは、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲが、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲと比較して、タンパク質発現が高かった。
ＭＰＬ＋細胞の特異的活性化及び細胞傷害性標的化
ＨＥＬ、Ｍｏ７ｅ、及びＣＭＫ細胞によって誘導されるＣＡＲ活性化は、１２時間の共培養後、ＣＤ６９及びＣＤ３８表面発現のフローサイトメトリーによって測定した。ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで形質導入した細胞は、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ及び非形質導入Ｔ細胞と比較して、３つの細胞株のすべてとのインキュベーション後に有意に高い活性化を示した（Ｐ≦．００１）。さらに、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲを形質導入した細胞は、３つのすべての細胞株に対して、非形質導入Ｔ細胞と比較して、有意に活性化した（図９Ａ～Ｃ）。ＮＣＯ及びＣＯ ＴＰＯ ＣＡＲのインビトロ細胞傷害性を、３つのＭＰＬ発現白血病細胞株ならびにＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株、Ｌｏｕｃｙ、及びＢ細胞白血病細胞株、６９７に対して評価した。ＮＣＯ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔの両細胞が、エフェクター対標的比１：２、１：１、２：１、及び５：１で、非形質導入Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＨＥＬ、ＣＭＫ、及びＭｏ７ｅ細胞を有意に殺傷し、非ＭＰＬ発現白血病細胞株に対して有意な細胞傷害性がなかった（図９Ｄ～Ｆ）。複数ドナーからの１：１比の比較により、対照と比較したＣＡＲ改変細胞の一貫した殺傷が示された（図９Ｇ～Ｉ）。
特異性の試験として、細胞傷害性アッセイ後の残りの生ＨＥＬ（図９Ｊ～Ｋ）及びＣＭＫ（図９Ｌ～Ｍ）標的細胞を、細胞表面のＭＰＬ発現についてスクリーニングした。予想通り、ＮＣＯ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲの両方との共インキュベーション後の生ＭＰＬ陽性細胞のパーセンテージ及びＭＦＩは、非形質導入Ｔ細胞とインキュベートした標的と比較して明らかに減少し、ＴＰＯ－ＣＡＲが、白血病細胞株のＭＰＬ陽性分画を優先的に殺傷したことを示唆した。さらに、ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＨＥＬ標的細胞及び非ＭＰＬ発現細胞、例えば、Ｋ５６２または６９７細胞と１：１：１比で混合した。ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｋ５６２及び６９７に対して最小限の毒性を示した一方、ＨＥＬ細胞株に対しては、細胞傷害性をもたらした（図９Ｎ）。これをＣＭＫ標的細胞株で繰り返したところ、同様の結果が得られた（図９Ｏ）。この場合もやはり、これらのデータは、いずれかのＭＰＬ－細胞株と比較したＭＰＬ＋細胞の有意な殺傷を示した。
最後に、エフェクター細胞及び標的細胞株、ＨＥＬ、ＣＭＫ、及びＭｏ７ｅを、超生理学的レベルの組み換えヒトＴＰＯとともに／なしで培養した。ＴＰＯは、ＮＣＯ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞による細胞傷害性に有意に影響を及ぼし、ＭＰＬ受容体の連結をめぐる競合を示唆した（図９Ｐ～Ｒ）。しかしながら、ＴＰＯの存在下でのＭｏ７ｅ及びＣＭＫ細胞株に対するＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性は、ナイーブＴ細胞由来の細胞傷害性よりも有意に大きく（Ｐ≦０．００１）、生理学的レベルで開始する用量反応を使用したさらなる分析では、ＮＣＯ及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲが、ＴＰＯの存在下で有意に殺傷することが示される（図１０Ａ～Ｃ）。
インビボでＭＰＬを標的とするためのＴＰＯ－ＣＡＲの利用
ＣＯ ＴＰＯ ＣＡＲは、その高いタンパク質発現に起因して、ＣＭＫ細胞株（図１１Ａ）に対してインビボで試験した。ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに１００Ｒａｄ照射し、ルシフェラーゼ陽性ＣＭＫ細胞株を静脈内注射した。がん細胞注射の１０日後、５ｘ１０６個の非形質導入Ｔ細胞（Ｎ＝４）またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ＝４）を静脈内注射した。これらのマウスを定期的に撮像及び計量し、がんの進行及び健康全般を評価した。マウスは、改変Ｔ細胞の注入に耐え、体重減少や活動の変化の兆候を示さなかった。興味深いことに、非形質導入Ｔ細胞及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞で処理したマウスは、３４～３７日の間に病死した（図１１Ｂ）。これらの結果が、がん細胞における生存率の改善の機能を果たす膜結合ＣＡＲからのＴＰＯのシェディングに起因する可能性があるという仮説、またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲが、幹細胞コンパートメントに対して毒性が強すぎたため、延命効果が得られなかったという仮説を立てた。これらの仮説を検討するため、第一に、形質導入Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞から培地を採取し、ｐＳＴＡＴ５活性化アッセイを行い、切断されたＴＰＯが、がん細胞の活性化を引き起こすかどうかを示した（図１２Ａ～Ｉ）。これらのデータは、ＨＥＬ及びＣＭＫ細胞株におけるＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞ならびにＣＭＫ細胞株におけるＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞のＴ細胞培地によって、ｐＳＴＡＴ５が有意に活性化されたことを示しており、リガンドベースのＣＡＲを利用する際には、シェディングが重大な問題であることを示唆した。興味深いことに、ｐＳＴＡＴ５の誘導は、ＣＭＫ細胞株でＴＰＯに対する抗体を使用することによって遮断された（図１１Ｃ～Ｅ）。
骨髄抑制を分析するため、インビボ実験からの安楽死の際の、２本の大腿骨での骨髄細胞数は、非形質導入Ｔ細胞を投与したマウスとＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞を投与したマウスを比較して、ＬＫ（ｌｉｎｅａｇｅ－、ｃ－ｋｉｔ＋）コンパートメントでは、４．４６ｘ１０４±２．３ｘ１０４対１．９９ｘ１０４±１．８ｘ１０４であり、ＬＳＫ（ＬＫ、Ｓｃａ－１＋）では、３．２２ｘ１０４±９．２ｘ１０３対１．８５ｘ１０４±１．６ｘ１０４であった。さらに、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで処理したマウスは、骨髄中に１２．６±６．９％のＴ細胞を有し、７０．９±４．７％がＣＤ６９によって活性化された。これらの結果は、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲが、腫瘍抗原が発現している正常組織に対する毒性（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）が高いことを示すことを示唆する。従って、図１１Ａに概説した実験を新たなドナーで繰り返し、それらのマウスを３０日目にサクリファイスして、がんの組織量及び骨髄コンパートメントを評価した。
全血球数で健康全般を評価するために採血した後、３０日目にマウスを安楽死させた（図１３Ａ～Ｍ）。脾臓をフローサイトメトリー分析用に分離した。がん単独のマウス及びＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞を投与したマウスの脾臓を、残っているがん細胞でのＭＰＬ発現量について分析した。がん細胞は、ヒトＣＤ３－及びＣＤ３３＋によって定義した。ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲを投与した動物は、がん単独の動物と比較して、ＭＰＬの表面発現の有意な減少を示した（図１４Ａ～Ｃ）。これらの結果は、ＴＰＯ－ＣＡＲがＭＰＬ＋細胞に特異的であることを示す発明者らのインビトロデータを裏付けた。さらに、２本の大腿骨におけるＬＫ及びＬＳＫコンパートメントを測定することにより、骨髄の枯渇を調べた。このデータは、がん細胞を投与したすべてのマウスで、ＬＫコンパートメントにおいて、骨髄量が多少減少したことを示唆する（図１４Ｄ、Ｐ≦０．００１）。ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞を投与したマウスは、非形質導入Ｔ細胞を注射したマウスと比較して、ＬＫ及びＬＳＫコンパートメントにおいて有意な減少を示した（図１４Ｅ、Ｐ≦０．０５）。
白血病性がん幹細胞のクリアランスのためのＭＰＬ受容体を標的とするリガンドベースのＣＡＲを設計した。がん幹細胞集団を、それらの化学療法抵抗性及び自己複製能力のために追跡したところ、ＭＰＬが、白血病幹細胞を治療し、再発を予防するための理想的な候補になった。ＭＰＬは、健康な組織での発現が限られているため、腫瘍抗原が発現している正常組織に対する副作用（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ）の予測及び管理を容易にする。さらに、ＡＭＬは、本明細書に記載のＭＰＬを標的とするＴＰＯ－ＣＡＲを使用して良好に標的化された。これは、新規なリガンドベースのアプローチを使用してＭＰＬを標的とするように設計されたＣＡＲの最初の報告である。
最初のＣＡＲ設計は、有意な機能的生産にもかかわらず、対照のＣＤ１９ＣＡＲと比較して低レベルの発現を示した。コドン最適化を、ＣＡＲ発現を確実に高めるために使用した。最初のＣＡＲ及びコドン最適化ＣＡＲの両方を使用して、ＭＰＬ陽性細胞集団の特異的細胞傷害性及び活性化を追求した。インビトロ試験により、複数の指標による活性化及び複数の細胞株を用いた細胞傷害性実験を含め、ＣＡＲの機能性を検証した。このデータは、リガンドベースのＣＡＲが特異的にＭＰＬ＋集団を標的化するという結論を支持した。
ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲのインビボ試験は、免疫力が低下した巨核球性白血病モデルを使用して行った。ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲで処理した動物は、がんを投与した未治療の動物の直後に死亡していることがわかった。これは、腫瘍抗原が発現している正常組織に対する副作用（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ）によるものであるか、または、ＭＰＬ＋のがん細胞に対するＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲの特異的細胞傷害性により、ＭＰＬ－集団の増殖が可能になったためであるという仮説を立てた。ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲは、ＮＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲと比較してウエスタンブロットによって高度に発現されるため、ＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲのタンパク質発現が高いことで、骨髄をより迅速に除去し、造血を抑制することができるであろうと予測した。幹細胞コンパートメントにおけるＣＡＲの効果は、恐らくは、遺伝毒性の前処置を必要としない、同種異系ＨＳＣ移植への架け橋としての潜在的利益と考えられた。ＭＰＬ＋白血病におけるこのレベルの疾患を呈する多くの患者は、通常、予後が不良であり、初期治療後に、最終的には、骨髄移植が必要になる（Ｙｏｇａｒａｊａｈ ａｎｄ Ｔｅｆｆｅｒｉ，“Ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：Ａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｒｉｓｋ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ａｎｄ Ｏｕｔｃｏｍｅ，”Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ．９２（７）：１１１８－１１２８（２０１７））。
がん細胞単独、またはＣＯ ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞とともにがん細胞を投与したマウスを、ＭＰＬ＋白血病細胞のインビボ標的化について評価した。観察により、ＴＰＯ－ＣＡＲがＭＰＬ＋細胞を標的としていることが示され、それによってインビトロの結果が検証された。ＭＰＬ＋ＬＳＣが化学療法に耐性があることを示唆する以前の発見により、このＣＡＲを、がん細胞のＭＰＬ－集団を標的とする化学療法と組み合わせることができる可能性は十分にある。ＭＰＬ＋白血病を標的とすることに加えて、本明細書に提供するデータは、ＴＰＯ－ＣＡＲを投与したマウスの骨髄コンパートメントが抑制されることを示唆する。これは、一つには、ＣＡＲが骨髄のＨＳＰＣを除去することが原因である可能性があるが、マウス骨髄でのヒトＴ細胞の活性化及び増殖による炎症性の骨髄環境の影響で骨髄抑制につながる可能性もある。これに対処するために、自殺スイッチをＣＡＲに導入することもできるし、代替的な短命免疫細胞源、例えば、γδＴ細胞またはＮＫ細胞を利用することもできる（Ｚｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇａｍｍａ ｄｅｌｔａ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ，”Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８（８）：１５９３８０４（２０１９））、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｔｈ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．８（４）：２９９－３０８（２００８））、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．“Ｂｅｙｏｎｄ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ：Ｏｔｈｅｒ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，”Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．９：１９６（２０１９））、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｍｏｏｎ，“ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｆｉｎｄｉｎｇ，Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１２８（２０１９））。
要約すると、これらの分析は、レンチウイルスＴＰＯ－ＣＡＲ構築物を使用したナイーブＴ細胞の形質導入の成功を示した。さらに、ＴＰＯ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＰＬ陽性細胞株に結合することにより、特異的な活性化が可能であり、ＨＳＣを枯渇させ、ＭＰＬ＋がん細胞をインビトロ及びインビボで特異的に効果的に殺傷する。
健康な骨髄コンパートメントへの毒性を防ぐためにＣＡＲをオフにする方法はあるが、別の方法として、ＴＰＯ－ＣＡＲを非遺伝子毒性のＨＳＣＴ前処置レジメンとして機能させ、次いで健康なドナーＨＳＰＣの注入前にＣＡＲをオフにすることもできる。ＣＡＲ療法は、１つの細胞生産物の複数の抗原を標的とするように進んでいるため、この戦略を採用して、ＭＰＬ及び表面に高度に発現する別の抗原を標的にすることができる。任意に、これは、このＣＡＲの使用を、表面にＭＰＬ発現を有するすべての再発性造血癌に拡大することであり得る。
実施例ＩＩＩ
幹細胞因子キメラ抗原受容体（ＳＣＦ－ＣＡＲ）
設計
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞を活性化して、ＭＨＣに依存しない方法で、その表面に結合する受容体を有するある特定の細胞型を枯渇させる目的で開発されたキメラタンパク質である。いくつかの例では、ＣＡＲは、ｉ）目的の抗原に結合するための抗原結合ドメイン、及びｉｉ）膜貫通ドメインを含む。他の例では、ＣＡＲは、ｉ）目的の抗原に結合するための抗原結合ドメイン、ならびにｉｉ）Ｔ細胞関連の活性化及び細胞傷害性を誘導するための細胞内シグナル伝達ドメインを含む。該細胞内シグナル伝達ドメインは、１～２個の共刺激ドメイン、及び１つの主要なＴ細胞活性化ドメインＣＤ３ζからなる。任意に、該抗原結合ドメインと該細胞内シグナル伝達ドメインを接続するために使用され得る１つのさらなる部分が存在し、これは、ヒンジ領域として知られている。
本明細書に記載のＣＡＲ、ＳＣＦ ＣＡＲは、ｃ－ｋｉｔ（ＣＤ１１７）として知られる造血幹細胞上で発現することが知られている受容体を標的とすることを目的とした。従来のＣＡＲ設計とは対照的に、該ＳＣＦ ＣＡＲは、リガンドベースであり、抗体ベースのｓｃＦｖではなく天然リガンドがＣＡＲの細胞外結合ドメインとして利用される。このＣＡＲの設計は次の通りである：天然リガンド幹細胞因子（ＳＣＦ）またはその結合部分が、ＣＤ８αのヒンジ領域に融合され、続いて共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通部分及び細胞内部分、その後、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインに融合される（図１５）。マウスのＳＦＣ配列をヒト配列の代わりに使用して、マウスでの予備的な最適化を可能にした。ヒトＳＣＦは、マウスｃ－ｋｉｔと交差反応しないが、マウスｓｃｆは、ヒトｃ－ｋｉｔと交差反応する。しかしながら、この構築物の残りの部分（ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ）の配列は、すべてヒト由来とした。
このＳＣＦ ＣＡＲを、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）及び該ＳＦＣ ＣＡＲをコードするバイシストロン性ベクターに、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列の介在を通してクローニングした。この構築物には、このＣＡＲを適切にパッケージして表面発現を可能にする機能を果たすＩＬ－２のシグナル配列（ＩＬ－２ｓｓ）も含めた。このシグナル配列は、このプロセス中に、構築物の残りの部分から切断される。構築物全体がＵＢＣプロモーターの制御下にあり、レンチウイルスのパッケージング及び導入遺伝子挿入に適切な配列を含む（図１６）。
コドン最適化
このＳＣＦ ＣＡＲを、造血細胞での効率的な翻訳のためのカスタムコドン最適化表を使用してコドン最適化した。この最適化配列は、ＩＬ－２のシグナル配列（ｓｓ）の始まりから、ＣＤ３ζの終わりまでであり、カスタムコドン最適化表を使用して最適化した（最適化配列を概略的に図１６に示す）。太字及び下線付きの以下の配列は、元の配列であり、これをその後最適化した：
Figure 2022526187000007
太字でも下線付きでもない配列は、最適化されなかった部分である。これらの部分は、制限酵素ＸｂａＩ、ＡｓｃＩ、ＮｈｅＩ、及びＳａｌＩの配列を含む。コドン最適化からのこれらの制限酵素配列の除外は、この配列がレンチウイルス発現ベクター及び導入遺伝子の残りにクローニングされるようにするためである。２つのさらなる制限酵素部位を、幹細胞因子の配列の始まりの直前及び終わりの後に含めた。これにより、この構築物の抗原結合特異性を、構築物全体のさらなるコドン最適化を再度行う必要なく取り除いて別のものと交換することができる。最終的な最適化された生成物は、次の通りである：
Figure 2022526187000008
コドン最適化はすべて、カスタムコドン最適化表を使用して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により行った。この構築物を、次に、コンピテント細菌細胞でのクローニング用のｐＵＣ５７プラスミド内で順序付けた。それを４μｇで供給し、分子生物学グレードの水に再懸濁し、最終濃度を１００ｎｇ／μＬにし、これをＳＣＦリガンド＿ｐＵＣ５７と呼んだ。
配列決定を複数のフォワード及びリバースプライマーを使用して行い、構築物全体を確実に配列決定した。両構築物の配列決定は、予想された配列を有し、これら構築物は、ＵＢＣプロモーターの前から３’ＬＴＲの直前まで正しく配列決定され（図１６）、構築物ＳＣＦ ＣＡＲ－３ｃ１（ＳＣＦ ＣＡＲ）を最終的にさらなる試験に進めた。５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでのコドン最適化導入遺伝子全体のヌクレオチド配列は、次の通りである：
Figure 2022526187000009
Figure 2022526187000010
Figure 2022526187000011
Figure 2022526187000012
ｅＧＦＰの開始からＣＤ３ζの終わりまでのコドン最適化導入遺伝子全体のヌクレオチド配列は、次の通りである：
Figure 2022526187000013
Figure 2022526187000014
ｅＧＦＰの開始コドンで始まり、ＣＤ３ζの終止コドン（＊）で終わるコドン最適化導入遺伝子全体のアミノ酸配列は、次の通りである：
Figure 2022526187000015
２９３Ｔ試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．５×１０６）を、１４μｇのＳＣＦ ＣＡＲクローン３ｃ１及び４ｃ２プラスミドでリポフェクタミン２０００を使用して終夜１８時間トランスフェクトし、培地を翌日交換した。ＧＦＰ画像（図１７）で３日目のこれら細胞におけるＧＦＰの存在を確認し、これらの細胞をペレット化し、ＣＳＴ溶解緩衝液を使用し、プロテアーゼ阻害剤で溶解した。４０μｇのタンパク質のウエスタンブロットにより、導入遺伝子の発現をさらに確認し、構築物３ｃ１をレンチウイルス生成に進めること及びこれをＳＣＦ ＣＡＲと呼ぶことを決定した。（図１８）。
Ｊｕｒｋａｔ試験
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０６）を、ＳＣＦ ＣＡＲ及び対照としてのＣＤ１９ＣＡＲでＭＯＩ０．５及び２．５にて１８時間形質導入し、培地を翌日交換した。３日目のＧＦＰ画像（図１９Ａ）及びウエスタン（図１９Ｂ）により、導入遺伝子の発現を確認した。ＣＤ６９は、Ｔ細胞の既知の活性化マーカーであるため、Ｊｕｒｋａｔのベースラインの活性化レベルを検証した。標的受容体の構築物自体への結合を知ることも重要であった。そのため、形質導入Ｊｕｒｋａｔを、ＣＤ６９、及び受容体キメラタンパク質を検出する抗体で染色した。この受容体キメラタンパク質は、マウスＦｃに融合されたマウスｃ－ｋｉｔ受容体からなり、これは、その後、蛍光色素にコンジュゲートした二次抗Ｆｃ抗体で検出され得る（図２０Ａ）。ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ及びＣＤ１９ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔを、受容体キメラタンパク質及びαＣＤ６９抗体で染色し、次いでフローサイトメトリーによって視覚化した。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲを形質導入した両Ｊｕｒｋａｔ（ＧＦＰ＋象限）は、それらの非形質導入対応物（ＧＦＰ－象限）と比較して、ＣＤ６９レベルの増加による高い活性化を示し、これらの細胞に導入遺伝子を形質導入するとＣＤ６９が増加することを示している（図２０Ｂの上のパネル、図２０Ｃ）。これは、Ｊｕｒｋａｔを形質導入することにより、細胞内にかつてあったよりも多くのＣＤ３ζが追加され、自動活性化を引き起こすことができたからであると予想される。予想通り、ｃ－ｋｉｔ受容体Ｆｃとインキュベートした場合、ＣＤ６９のレベルはＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔで劇的に増加するが、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔでは同じままである（図２０Ｂ、下のパネル、図２０Ｃ）。これは、ｃ－ｋｉｔキメラＦｃは、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔの特異的活性化を導入するが、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔは導入しないことを示し、ひいては、ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であることを示す。
形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞へのｃ－ｋｉｔ受容体Ｆｃの結合を、二次抗体の結合によって、フローサイトメトリーを介して検出した。ｃ－ｋｉｔ受容体キメラで染色した場合、ＳＣＦ ＣＡＲ形質導入細胞（ＧＦＰ＋）のほぼ１００％がｃ－ｋｉｔに結合したが、ＣＤ１９ＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔの結合は２％未満であった（図２１Ａの上のパネル、図２１Ｂ）。さらに、ＣＤ６９＋細胞のほぼ１００％がＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔではｃ－ｋｉｔキメラに結合したのに対し、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔが結合したのは２０％未満であった（図２１Ａの下のパネル、２１Ｃ）。興味深いことに、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔでは、より多くのＧＦＰ＋細胞もまたより多くのｃ－ｋｉｔキメラに結合し（図２１Ａ、上の中央のパネル）、同様に、より多くのＣＤ６９＋細胞がより多くのキメラタンパク質に結合していることも分かった。（図２１Ａ、下の中央のパネル）。これは、ＧＦＰ及びＣＡＲ構築物の共発現を裏付けるだけでなく、ＳＣＦ ＣＡＲがｃ－ｋｉｔ受容体に特異的であるのに対し、ＣＤ１９ＣＡＲは特異的ではないことも示している。
最後に、Ｊｕｒｋａｔ活性化アッセイを行い、ｃ－ｋｉｔ＋ＡＭＬ細胞株でのＪｕｒｋａｔの活性化能を特定した（図２２Ａ）。ＳＣＦ ＣＡＲ及びＣＤ１９ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔを、Ｋａｓｕｍｉ－１細胞（ｃ－ｋｉｔ＋、ＡＭＬ細胞株）または６９７細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ－ＡＬＬ細胞株）とともに、エフェクター対標的比１：１、１：５、及び１：１０で４時間インキュベートした。次に、細胞を染色して、ＣＤ６９を、フローサイトメトリーを介して検出した。ＳＣＦ ＣＡＲ－ＪｕｒｋａｔとＫａｓｕｍｉ－１細胞の共培養により、ＪｕｒｋａｔでのＣＤ６９発現は、ＧＦＰ＋細胞の上方シフトによって分かるように増加したが、これはＣＤ１９ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔでは見られなかった（図２２Ｂ、上のパネル、図２２Ｃ）。さらに、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔと６９７細胞の共培養は、ＣＤ６９発現の増加をもたらさなかったが、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔとの共培養は、活性化の有意な増加を引き起こした（図２２Ｂ、下のパネル、図２２Ｃ）。これは、ＳＣＦ ＣＡＲは、ｃ－ｋｉｔ＋細胞株と共培養した場合にＪｕｒｋａｔの活性化を誘導することができるが、ｃ－ｋｉｔ陰性細胞株では誘導できないことを示す。さらに、Ｋａｓｕｍｉ－１細胞でのＳＣＦ ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔの活性化は、６９７細胞でのＣＤ１９ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔで見られる活性化と類似しており、これは、ＳＣＦ ＣＡＲが、ＣＤ１９ＣＡＲがＪｕｒｋａｔを活性化することができるレベルと同じレベルまで、Ｊｕｒｋａｔを活性化することができることを示すだけでなく、ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ陽性細胞株に特異的であることも示すことに留意することが重要である。
初代Ｔ細胞試験
ヒト初代Ｔ細胞を、凍結ＰＢＭＣから、ＳＴＥＭＣＥＬＬのＴ細胞単離キットを使用し、陰性選択法を介して単離し、ＸＶＩＶＯ－１５培地にて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ）、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を加えて増殖させた。次に、単離したＴ細胞を、完全培地にて、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓで２４時間刺激した。翌日、ＭＯＩ２５にて１８時間、Ｔ細胞（３．６×１０５）を、ＳＣＦ ＣＡＲ用のレンチウイルスベクターを使用して形質導入し、モック形質導入細胞及び無関係のＮＲＴＮ ＣＡＲ形質導入細胞を対照とした。その翌日、培地を交換し、細胞を３日ごとに培養した。ＧＦＰ画像及び細胞傷害性アッセイを５日後に行った。
形質導入後２８日目に撮影したＧＦＰ画像（図２３Ａ）及び２０日目のＧＦＰのフロー（図２３Ｂ）は、初代Ｔ細胞における導入遺伝子の発現を示す。次に、形質導入初代Ｔ細胞を、ｃ－ｋｉｔキメラＦｃタンパク質及び二次抗体で染色した。フローサイトメトリーによる分析では、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｔ細胞の３０％がｃ－ｋｉｔキメラに結合する一方、無関係のＮＲＴＮ ＣＡＲの結合は２％未満であることが示されている。（図２４Ａ、Ｂ）。
次に、細胞傷害性アッセイを、Ｋａｓｕｍｉ－１細胞（図２５）及びＣＭＫ細胞（図２６）の両方でＳＣＦ ＣＡＲ－Ｔ及びＮＲＴＮ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて行った。標的細胞株を最初に、フローサイトメトリーでの分析の２４時間前にＶＰＤ４５０で染色した。ＣＡＲ－Ｔエフェクター細胞及び標的細胞株を、エフェクター対標的比５：１で４時間共培養し、その後、標的細胞死をアネキシンＶ及び７－ＡＡＤ染色で可視化し、次いでフローサイトメトリーで可視化した。Ｋａｓｕｍｉ－１細胞をＳＣＦ ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した場合、それらの細胞死は、バックグラウンドを超えて約５０％に増加した（図２５Ａ、Ｂ）一方、これらの細胞をＮＲＴＮ ＣＡＲまたは未形質導入Ｔ細胞と共培養した場合には見られなかった。同様に、ＳＣＦ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＭＫ細胞と共培養した場合、標的細胞死は、バックグラウンドの細胞死を超えて約６０％に増加した（図２６Ａ、Ｂ）一方、これは、ＮＲＴＮ ＣＡＲ－Ｔまたは未形質導入Ｔ共培養のいずれにおいても見られなかった。ＮＲＴＮ ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した両標的細胞の標的細胞死が、未形質導入Ｔ細胞と共培養した場合に見られる細胞死と類似している一方、ＳＣＦ ＣＡＲと共培養した場合に細胞死が有意に上昇したことに留意することが重要である。これは、ＳＣＦ ＣＡＲが、ｃ－ｋｉｔ陽性細胞株に対して特異的な細胞傷害性を誘導することを示す。
実施例ＩＶ
本明細書に開示するのは、腫瘍細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害性を高めるための非シグナル伝達キメラ抗原受容体（ＮＳＣＡＲ）の開発及び有用性である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）戦略は、これらの構築物がＴ細胞、特に、アルファベータＴ細胞に導入される場合にがんの治療に有用であるが、多くの場合、Ｔ細胞悪性腫瘍の治療のためのＣＡＲ Ｔ細胞療法は、がんＴ細胞及び標的とされるがん細胞を殺傷するのに使用されるＴ細胞の両方に存在するタンパク質を標的とすることを含む。従って、問題は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞が、ＣＡＲ生成物の製造中にそれら自体を殺傷し得る場合（フラトリサイドとして知られている）に存在し、これは、その細胞生成物の有効性を劇的に減少させ得る。ＣＡＲと同じ細胞外成分を有するＮＳＣＡＲを設計したが、この構築物は、通常ＣＡＲの一部である細胞内シグナル伝達ドメインを欠いている（図２７）。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（ＣＤ５を発現する）におけるＣＤ５標的化ＮＳＣＡＲの発現は、その改変細胞を活性化せず、これは、隣接細胞中の標的抗原と相互作用することによって改変Ｔ細胞を活性化するＣＡＲとは異なる（図２８）。従って、ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞は、細胞表面のＣＤ５を認識するが、活性化はしない。
結果は、ガンマデルタＴ細胞におけるＮＳＣＡＲの発現が、標的細胞を殺傷するそれらの能力を高めることを示した。これは、γδＴ細胞は、αβＴ細胞とは異なり、ＭＨＣに依存せず、それらの殺傷は、腫瘍細胞標的を殺傷する本質的な能力であるストレスリガンドまたはＦａｓとの相互作用を通じたものであるためである可能性が高い。従って、ガンマデルタＴ細胞が、標的細胞と接触し、接触を続ける可能性が高くなるように改変された場合、それらは殺傷が強化される。ＰＢＭＣからのγδＴ細胞増殖のための無血清プロトコルが開発され、最大９０％のγδＴ細胞の集団が得られた。上記の通り、フラトリサイドを減らすために、ＣＡＲのｓｃＦｖ及び膜貫通部分を含むが、細胞内活性化ドメインを含まない抗ＣＤ５ＮＳＣＡＲを設計及び試験した。ＮＳＣＡＲの発現は、ＣＤ５の表面発現を実質的に排除し（図２９）、γδＴ細胞の発現には影響を与えなかった。
ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞は、ＣＤ５発現Ｔ－ＡＬＬ細胞株の細胞傷害性を、ナイーブ細胞のものと比較して高めた（図３０）。第二のＣＤ５陽性細胞株であるＭｏｌｔ－４細胞も試験した。ＮＳＣＡＲ対標的細胞３：１及び５：１では、細胞殺傷が劇的に増加したが、これは、ＧＦＰで改変した細胞では観察されなかった（図３１）。
これらの結果は、γδＴ細胞における抗ＣＤ５－ＮＳＣＡＲの発現が、γδＴ細胞がそれらの標的に近接近している時間を延長し、恐らくはＦａｓＬ／Ｆａｓ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦα及びＴＣＲが関与して、γδＴ細胞の本質的な細胞傷害性メカニズムとがん細胞との間の相互作用を可能にすることを示す。ＮＳＣＡＲは、エフェクター細胞の活性化を最小限に抑えながら内因性のＣＤ５発現を調節するメカニズムを提供することができ、それによってフラトリサイドの潜在的な問題を排除し、細胞傷害性の生来のメカニズムを促進する結合メカニズムを導入する。
実施例Ｖ
いくつかの治療法がＢ細胞悪性腫瘍の治療に成功しているが、Ｔ細胞悪性腫瘍の治療にＣＡＲ療法を変換するためにはさらなる課題がある。多くの前臨床試験により、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ３等の抗原を標的とするＣＡＲを含め、Ｔ細胞悪性腫瘍を治療するための戦略が開発されてきた。しかしながら、ＣＡＲ Ｔ細胞及びがん細胞でのこれら抗原の共通の発現により、フラトリサイドが生じる、すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞が他のＣＡＲ Ｔ細胞を殺傷する可能性がある。さらに、最近の報告では、ＣＤ１９－ＣＡＲで改変した単一の白血病性芽球のクローン性増殖をもたらす生成物汚染の証拠が示された。ＣＤ１９－ＣＡＲは、ＣＡＲ Ｔ細胞由来のＣＤ１９抗原をマスクし、治療への耐性を引き起こした。さらに、Ｔ細胞形成不全をもたらすＴ細胞抗原に対するメモリー応答は致死的であり、それ故、これは選択肢ではない。Ｂ細胞悪性腫瘍を標的とする治療法は、標的抗原に対するメモリー応答により生涯にわたるＢ細胞形成不全を引き起こす可能性があるが、これらの患者は、この状態を克服するため、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）で治療され得る。しかしながら、近年のＩＶＩＧに対する需要の増加により、米国では現在免疫グロブリンが不足している。
多くのグループが、ＣＡＲ療法を使用してＴ細胞悪性腫瘍を治療するためのこれらの課題を克服するための解決法を開発している。１つの選択肢は、正常なＴ細胞には存在しないかまたは低レベルで発現する抗原を標的にすることである。残念ながら、Ｔ細胞悪性腫瘍の大部分は、これら抗原の高発現がなく、そのためそれらの有用性が制限されている。代替的な戦略は、悪性のＴ細胞から正常なＴ細胞を単離することが重大な障害であるため、生成物汚染のリスクを排除するドナー由来細胞を利用することである。ＮＫ細胞及びγδＴ細胞は非アロ反応性であり、さらなる改変をすることなく同種異系の設定で使用することができる。さらに、ＮＫ由来のリンパ腫細胞株であるＮＫ－９２細胞は、ＣＡＲ療法のＴ細胞の代替として使用することができる。しかしながら、ＮＫまたはＮＫ－９２細胞の増殖には時間がかかり、遺伝子操作は困難な場合があり、それらは特に凍結保存に弱い。Ｔ細胞形成不全を回避するための戦略には、ＣＡＲ構築物に自殺遺伝子及びスイッチを組み込むことでそれらの発現を調節し、強い反応を制御し、メモリー細胞の形成を防ぐことを加えたが、それらは均一に効果があるというわけではなく、改変されたがんクローンのエスケープが問題になり得る。
３つの課題すべてに対処する戦略はほとんど評価されていない。本明細書に提供するのは、γδＴ細胞に導入された場合に、健康な改変細胞を温存しながら標的細胞の殺傷を高める非シグナル伝達ＣＡＲ（ＮＳＣＡＲ）である。ドナー由来のγδＴ細胞を使用して生成物汚染を防ぐことができるため、ＮＳＣＡＲをγδＴ細胞で発現させた。また、ＮＳＣＡＲは、シグナル伝達／活性化ドメインを欠いているが、抗原特異的腫瘍細胞標的化能力を保持している。
細胞株
Ｊｕｒｋａｔ細胞株クローンＥ６－１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。既述の通り、Ｍｏｌｔ－４及び６９７細胞株は、Ｄｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ Ｇｒａｈａｍ（Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を既述の通り生成した。すべての細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ）で培養した。
ＮＳＣＡＲ配列の操作
既述のＣＤ５－ＣＡＲ配列（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉ－ＣＤ５ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ＮＫ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－ｅｄｉｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，”Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８．７（３）：ｐ．ｅ１４０７８９８）を切断して、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８の細胞内部分を除去した。ＣＤ２８の全膜貫通ドメイン及び２つの細胞内アミノ酸が残っている。さらに、切断したＣＤ２８の細胞質端の固有の２１塩基対配列を、プロウイルス配列の遺伝的決定のために含めた。このベクターは、バイシストロン性レンチウイルス構築物であり、ｐ２ａペプチド配列を使用して高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）及びＮＳＣＡＲ導入遺伝子の二重発現を促進する。このＣＤ１９－ＮＳＣＡＲは、同様に、ＣＤ２８の最初の２つの細胞内アミノ酸の後のＣＤ１９－ＣＡＲの切断によって生成した。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲと同様に、このベクターはバイシストロン性レンチウイルス構築物であり、ｐ２ａペプチド配列を使用してｅＧＦＰ及びＮＳＣＡＲ導入遺伝子を発現する。しかしながら、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲは、ＣＤ８αのヒンジを有し、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲはそこにｍｙｃタグを有する。そのＣＤ１９－ｓｃＦｖ配列は、マウスハイブリドーマ細胞株で生成された公表済みのＣＤ１９－ｓｃＦｖ配列のコドン最適化から生成した。これら構築物の核酸配列を、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８及び６０として示す。これら構築物のアミノ酸配列を、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９及び６１として示す。コドン最適化ＣＤ５は、配列番号６２～６５として示す。コドン最適化ＣＤ１９構築物は、配列番号６６～６９として示す。
ＣＡＲ及びＮＳＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの生成
すべてのＣＡＲ及びＮＳＣＡＲ構築物用のＨＩＶ－１ベースの組み換えレンチウイルスベクターを、既述（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）の通り生成し、力価測定を行った。
細胞株のレンチウイルスベクターによる形質導入
レンチウイルスベクターによる形質導入は、既述の通り、６μｇ／ｍＬのポリブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）を使用して行った。その形質導入細胞を、下流の用途に使用する前に少なくとも５日間培養した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）０．５または１にて形質導入した。
健康なドナー血由来のγδＴ細胞の増殖
血液は、Ｅｍｏｒｙ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃｏｒｅの協力のもと、同意した健康な成人から採取した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配及び遠心分離を使用し、製造業者のプロトコルに従って、３０～５０ｍＬの健康なドナー血から単離した。ＰＢＭＣは、既述［５０］の通り無血清条件で最大１３日間、インビトロで増殖させた。０日目と３日目に、５μｇ／ｍＬのゾレドロン酸及び５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をこの培養に加えた。６日目から、１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を培地に加えた。細胞は、１．５ｘ１０６細胞／ｍＬで培養した。
健康なドナー血由来のαβＴ細胞の増殖
ＰＢＭＣを、既述の通り健康なドナー血から単離した。Ｐａｎ Ｔ細胞の単離は、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行い、そのＴ細胞を、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にて、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を加えて増殖させた。Ｔ細胞の単離後、細胞をＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で、１：１比にて２４時間刺激した。細胞は、１ｘ１０６細胞／ｍＬで培養した。
γδＴ細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入
レンチウイルスベクターによる形質導入は、増殖の７～９日目に行った。細胞を、６０％のベクターとともに、６μｇ／ｍＬのポリブレンを加えた培地にて１８～２４時間インキュベートし、この時点で培地を新鮮な培地と交換した。その形質導入細胞を、下流の用途に使用する前に３～５日間培養した。
αβＴ細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入
レンチウイルスベクターによる形質導入は、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓの除去の直後に行った。細胞を、６０％のベクターとともに、６μｇ／ｍＬのポリブレンを加えた培地にて１８～２４時間インキュベートし、この時点で培地を新鮮な培地と交換した。その形質導入細胞を、下流の用途に使用する前に６日間培養した。
フローサイトメトリー分析
分析は、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して行った。データは、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓ ６ソフトウェアを用いて分析した。使用した抗体には、抗ＣＤ５ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、抗ＣＤ３ＢＶ４２１、抗γδＴＣＲ ＰＥ及び抗ＣＤ６９ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を含めた。ＣＤ５－Ｆｃ融合タンパク質（Ｇ＆Ｐ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及びＣＤ１９－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）を使用して、それぞれ、抗ＣＤ５構築物及び抗ＣＤ１９構築物を二次抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で既述（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）の通り検出した。Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｄｙｅ４５０（ＶＰＤ４５０）を使用して、細胞傷害性及び共培養試験での標的細胞を標識し、細胞死は、ｅＦｌｕｏｒ７８０を使用して評価した（下記）。γδＴ細胞の脱顆粒は、抗ＣＤ１０７ａ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して検出した。
ウエスタンブロッティング
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して溶解した。タンパク質の定量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離、及びニトロセルロースメンブレンへの転写は、既述（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）の通りに行った。ブロックしたメンブレンを、既述（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）の通り、抗ＣＤ５ｍＡｂ及びＨＲＰ標識二次抗体とともにインキュベートした。デンシトメトリーは、ＩｍａｇｅＪを使用して行った。
ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞及びＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いた共培養アッセイ
ナイーブ及びＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲをコードするバイシストロン性レンチウイルスベクターをＭＯＩ１にて形質導入した。１８～２４時間後、培地を新鮮な培地で交換し、５日目にＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用したフローサイトメトリーで、ｅＧＦＰ及びＣＤ５－Ｆｃ結合の両方により形質導入を確認した。形質導入細胞を、ＶＰＤ４５０で予め標識したナイーブまたはＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに、改変対非改変比１：１及び１：３で培養した。非改変細胞は、製造業者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に従って標識した。細胞を、最終濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬで１４時間培養した。改変細胞でのＮＳＣＡＲ発現及び非改変細胞でのＣＤ５発現の変化を、フローサイトメトリーにより評価した。
細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイは、γδＴ細胞増殖の１２日目もしくは１３日目、またはαβＴ細胞の形質導入後６日目に行った。標的細胞を、製造業者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してＶＰＤ４５０で標識した。エフェクター細胞は未染色のままであった。エフェクター細胞（Ｅ）及び標的細胞（Ｔ）を、１２ｘ７５ｍｍのＦＡＣＳチューブに、Ｅ：Ｔ比３：１及び５：１にて、総量２５０μＬで混合した。γδＴ細胞の細胞傷害性アッセイは、３７℃にて５％ＣＯ２中で４時間インキュベートし、αβＴ細胞の細胞傷害性アッセイは、３７℃にて５％ＣＯ２中で１２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色した。二重陽性のｅＦｌｕｏｒ７８０及びＶＰＤ４５０細胞は、フローサイトメトリーを使用して評価した。
タンパク質シェディングアッセイ
形質導入後１日目に、γδＴ細胞の培地を交換し、それらを上記の通り標準条件下で４８時間培養した。４８時間後、上清を回収し、０．２２ミクロンの低タンパク質結合ＰＶＤＦフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を通して濾過した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞または６９７細胞を次いで、濾過したγδＴ細胞上清中で４時間培養した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞及び６９７細胞の完全ＲＰＭＩでのインキュベーションを含む条件を含めた。そのγδＴ細胞上清を用いて細胞株を培養する前に、ＣＤ５－ＦｃまたはＣＤ１９－Ｆｃとともに３０分間プレインキュベートしてさらなる実験を行った。４時間後、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞及び６９７細胞を洗浄して遊離タンパク質を除去し、フローサイトメトリー用に、それぞれ、抗ＣＤ５抗体または抗ＣＤ１９抗体で染色した。
脱顆粒アッセイ
ＣＤ１９－ＣＡＲ及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲで改変したγδＴ細胞を、６９７細胞とともに１２ｘ７５ｍｍＦＡＣＳチューブ内で、Ｅ：Ｔ比５：１にて、総量２５０ｕＬで培養し、３７℃にて５％ＣＯ２中で１２時間インキュベートした。６９７細胞は、ＶＰＤ４５０で、製造業者のプロトコルを使用して共培養の前に標識した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー用に染色し、ＣＤ１０７ａの細胞表面発現を、抗ＣＤ３ ＢＶ４２１、抗γδＴＣＲ ＰＥ、抗ＣＤ１０７ａ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）及び生存率色素ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含む抗体を使用して分析した。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ
ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞を、脱顆粒アッセイ用に、上記の通り６９７細胞とともに培養した。１２時間のインキュベーション後、細胞培養上清を回収し、－８０℃で４８時間保存した。ＩＦＮγの分泌は、製造業者のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により定量化した。
統計分析
統計的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定及び一元配置分散分析を使用して決定した。すべてのｐ値は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔバージョン１４．０（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で計算し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
結果
ＮＳＣＡＲは、ＣＡＲに通常存在する細胞内シグナル伝達ドメインを欠いている（図３２Ａ）。その結果、ＮＳＣＡＲは、非活性化型である。非シグナル伝達ＣＡＲの発現は、腫瘍細胞に対するαβＴ細胞の細胞傷害性に影響を与えることは予想されていないが、ＮＳＣＡＲは、γδＴ細胞の細胞傷害性を高めることができるという仮説を立てた。αβＴ細胞とは対照的に、γδＴ細胞は、細胞傷害性の代替メカニズムを有しており、標的細胞の殺傷を開始するためにＣＤ３ζを介した刺激を必要としない。さらに、エキソビボで増殖させたγδＴ細胞は、インビボでの増殖がほとんどなく比較的短命であり、これがサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及びＣＡＲ Ｔ細胞療法から生じる他の有害事象の制御を支援し得る。さらに、γδＴ細胞は、ＭＨＣ認識とは無関係に抗原と相互作用するため、ＧｖＨＤを引き起こす可能性が低く、同種異系設定での使用が可能である。ＮＳＣＡＲは、γδＴ細胞を、標的抗原を発現する腫瘍細胞につなぐアンカーとして機能することができるという仮説を立てた。これらの細胞が近接近している間、γδＴ細胞に対して内因性の細胞傷害性メカニズムが連結することができ、最終的に腫瘍細胞死を引き起こす。
２つの異なるＮＳＣＡＲ、すなわち、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ（図３２Ｂ）及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ（図３２Ｃ）を設計した。ナイーブ及びＮＳＣＡＲ改変集団でのγδＴ細胞の発現を比較し、ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞のＴ－ＡＬＬ及びＢ－ＡＬＬ細胞株に対する細胞傷害性を評価した。さらに、αβＴ細胞の細胞傷害性に対するＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現の影響を評価した。ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲを、より伝統的なＣＤ１９－ＣＡＲと比較した。本明細書に記載の結果は、γδＴ細胞におけるＮＳＣＡＲの発現が、抗原を標的とした殺傷を高め、それに関与するメカニズムは、根本的かつ生物学的にαβＴ細胞では異なるという概念実証を示す。
ＣＤ５抗原及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲは、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞で、活性化を変更することなく下方制御される
ＣＤ５－ＮＳＣＡＲの発現時にＣＤ５の下方制御が生じるかどうかを判断するために、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞にＣＤ５－ＮＳＣＡＲを、ＭＯＩ０．５及び１で形質導入し、ＣＤ５発現をフローサイトメトリーで測定した。恐らくは自己及び隣接細胞上のＣＤ５－ＮＳＣＡＲとの相互作用に起因して、ＣＤ５陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のパーセンテージに有意な減少が検出された。ＮＳＣＡＲは、シグナル伝達細胞質尾部を含まないため、ＣＤ５の下方制御を引き起こすこれらの相互作用は、細胞内シグナル伝達とは関連していないと判断した。低ＭＯＩでも、ＣＤ５発現の検出は、形質導入細胞で減少した（ＭＯＩ０．５及びＭＯＩ１：ｐ＜０．００１）。ＭＯＩ１では、これらの細胞の５％未満がＣＤ５陽性のままであった（図３３Ａ）。
ＣＤ５陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５－ＣＡＲの発現は、ＣＤ６９により測定されるように、ＣＡＲとＣＤ５抗原間の相互作用に起因して活性化の増加をもたらすことが示された（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）。しかしながら、ＮＳＣＡＲは、ＣＡＲ構築物に通常見られる細胞内シグナル伝達ドメインを欠いているため、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲが、これら細胞の活性化レベルに影響を与えることはないという仮説を立てた。フローサイトメトリーにより、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現には、ナイーブＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ６９のレベルと比較して変化がないと判断した（図３３Ｂ）。
ＣＤ１９－ＣＡＲ及びＣＤ１９－ＮＳＣＡＲで改変したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いて同様の実験を行った。ＣＤ１９－ＣＡＲまたはＣＤ１９－ＮＳＣＡＲで改変したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、ＣＤ５発現の検出に変化を示さず、９５％の細胞がＣＤ５を発現しており、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞で観察される下方制御が、ＮＳＣＡＲと同種抗原間の相互作用に起因することを示唆した（図３３Ｃ）。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞はＣＤ１９を発現せず、予想通り、ＣＤ１９－ＣＡＲまたはＣＤ１９－ＮＳＣＡＲのいずれかで改変した場合、フローサイトメトリーによってＣＤ６９で測定される、ジャーカットＴ細胞活性化に変化はない（図３３Ｄ）。
ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞及びＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、フローサイトメトリーを使用してＣＤ５－Ｆｃ表面発現について分析した。ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、発明者らの研究室で開発した。細胞のＣＤ５陰性分画を、ＦＡＣＳを使用して９８％超の純度で単離し、既述（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）の通り、標準的なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞培養条件下で増殖させた。ＭＯＩ０．５で形質導入したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、平均して２５％がＮＳＣＡＲ陽性であったが、ＭＯＩ１で形質導入したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、平均して７０％がＮＳＣＡＲ陽性であった。しかしながら、ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、同じＭＯＩでＣＤ５－ＮＳＣＡＲを形質導入した場合、フローサイトメトリーで検出されるＮＳＣＡＲ発現細胞のパーセンテージがはるかに高い。ＭＯＩ０．５及び１では、それぞれ、約６５％及び約９０％のＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞がＮＳＣＡＲ陽性であった（図３４Ａ）。ＧＦＰ陽性、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ陰性のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の集団の出現は、ＣＤ５発現細胞の形質導入後に見られたが、この集団は、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変、ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞では実質的に減少している（図３５Ａ）。これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現が、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲの発現を遮断するまたは減少させることを示唆する。これらの結果は、ＣＤ５－ＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を使用した先の発見（Ｒａｉｋａｒ ｅｔ ａｌ．）と一致する。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ及びＣＤ５抗原の発現が時間とともに変化するかどうかを判断するため、非編集及びＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＮＳＣＡＲ及びＣＤ５の発現を、形質導入後５日目及び１５日目にフローサイトメトリーで測定した。５日目に、ＭＯＩ０．５で約２０％のＮＳＣＡＲ陽性細胞及びＭＯＩ１で約５０％のＮＳＣＡＲ陽性細胞が観察された。しかしながら、１５日目までに、ＮＳＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のパーセンテージは、約５％（ＭＯＩ０．５）及び約２０％（ＭＯＩ１）に減少した。（図３５Ｂ）。それにもかかわらず、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは変化せず、形質導入細胞が、培養中で死んだり、希釈されたりしていないことを示唆している。さらに、形質導入後５日目のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５の発現レベルは非常に低かったが、かかる劇的な下方制御は、１０日後には観察されず、ＣＤ５発現とＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現とのバランスが時間とともにシフトすることを示唆している（図３５Ｃ）。ＣＤ５抗原発現の増加は、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現の減少と相関する。対照的に、ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５－ＮＳＣＡＲの発現は、５日目から１５日目までの変動がはるかに少なく、ＭＯＩ０．５及び１でそれぞれ、６５％及び８０％から６０％及び７７％に減少した。フローサイトメトリーデータを確認するため、ウエスタンブロット分析を、抗ＣＤ５抗体を使用し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＤ５－ＮＳＣＡＲで改変したＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞由来の全細胞溶解物で行った。全細胞溶解物を、形質導入後１５日目に回収した。ウエスタンブロット及びデンシトメトリーにより、ナイーブＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＤ５タンパク質レベルと比較して、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の全細胞溶解物では、わずかに低いＣＤ５タンパク質レベルのみを明らかにした（図３５Ｄ）。予想通り、非改変及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変、ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、ＣＤ５タンパク質発現の兆候を示さなかった。
ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を共培養すると、非改変細胞では、ＣＤ５抗原の下方制御が生じ、改変細胞では、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲの下方制御が生じる
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞で発現したＣＤ５－ＮＳＣＡＲは、自己及び隣接細胞のＣＤ５抗原と相互作用し、両タンパク質の下方制御を引き起こし得るという仮説を立てた。これをさらに検証するため、非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに培養した場合のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現の変化、及び非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＣＤ５抗原発現の変化を観察するための１４時間の共培養を確立した。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞及び非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、改変対非改変比１：１及び１：３で培養した。１４時間後、細胞を１：３の低比率でＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに培養した場合に、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現に有意な下方制御が観察された（ｐ＜０．００１）。１：１比では統計的有意性はないが、同じ傾向が観察された（ｐ＝０．０７８）。しかしながら、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変細胞を非改変ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに培養した場合、どちらの比でもＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現に変化はなかった（図３４Ｂ）。非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＣＤ５抗原は、改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＣＤ５－ＮＳＣＡＲと相互作用し、ＮＳＣＡＲの下方制御を引き起こし得る。従って、非改変ＣＤ５発現細胞のパーセンテージが高い培養では、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ発現が大幅に減少する。ＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＣＤ５－ＮＳＣＡＲで形質導入すると、非編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＤ５編集Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに培養した場合に上記と同様の結果が得られた（１：３ではｐ＜０．００１、１：１ではｐ＝０．０５８）（図３６Ａ）。
さらに、この共培養における非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現を測定した。データは、培養中のＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のパーセンテージが増加するにつれて、ＣＤ５発現の有意な減少を示し（１：３でｐ＝０．０９７、１：１でｐ＜０．００１）、１：１比では、２０％未満の細胞が、細胞表面でＣＤ５を発現した（図３４Ｃ）。これは、培養中にＣＤ５－ＮＳＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞が多い場合、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲとＣＤ５抗原間の相互作用が全体的に増加し、非改変細胞上のＣＤ５抗原の下方制御が大きくなることを示唆している。ＣＤ５編集、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに培養した場合に同様の結果が得られた。しかしながら、非改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＣＤ５は、ＣＤ５編集、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに培養した場合、それらを非編集、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と培養した場合（１：１比で８０％減少）と比較して、大幅に下方制御された（１：１比で９５％減少）（図３６Ｂ）。
ＮＳＣＡＲ改変は、γδＴ細胞の増殖を妨げず、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲの発現とは異なり、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲの発現は、ＣＤ５抗原の発現を下方制御する
γδＴ細胞は、ＩＬ－２及びゾレドロン酸を使用して、健康なドナー血から無血清条件で増殖させた。増殖の７～９日目に、フローサイトメトリーを行い、γδＴ細胞集団内のγδＴ細胞のパーセンテージ及びＣＤ５発現を測定した。各々の増殖のため、γδＴ細胞をレンチウイルスベクターによる形質導入用にプレーティングし、非形質導入ウェルを同時にプレーティングした。ナイーブ及びＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の増殖を１２日目まで観察した。集団内のγδＴ細胞のパーセンテージは、ナイーブ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変の両培養で一貫して拡大し、拡大に有意差はなかった（ｐ＝０．３５３）（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。両細胞集団は、形質導入後４～５日で、約２．５倍増殖し、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲの発現は、ＣＤ５抗原の存在にもかかわらず、γδＴ細胞の増殖も培養の全体的な増殖も妨げないことを示唆している（図３７Ｃ）。同様に、７～９日目にＣＤ１９－ＮＳＣＡＲまたはＧＦＰ対照レンチウイルスベクターで改変したγδＴ細胞の増殖を、形質導入後４～５日間評価した。この対照レンチウイルスベクターは、ＥＦ１αプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰをコードする。ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ及びＧＦＰで改変したγδＴ細胞は、ナイーブγδＴ細胞と同程度に増殖した（約２倍）（図３７Ｃ）。γδＴ細胞はＣＤ１９を発現しないが、これらのデータは、形質導入単独ではγδＴ細胞の増殖に影響を与えないという仮説の証拠を提供する。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞での試験が示すように、ＣＤ５抗原とＣＤ５－ＮＳＣＡＲの相互作用により、ＣＤ５の明らかな下方制御が生じる。これがγδＴ細胞で生じるかどうかを判断するため、ナイーブ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の細胞表面でのＣＤ５発現をフローサイトメトリーで測定した。ＣＤ５陽性ナイーブγδＴ細胞の検出と比較して、ＣＤ５を発現するＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の検出に有意な減少が観察され、細胞表面でＣＤ５を発現する細胞は、１０％未満であった。ｐ＜０．００１。しかしながら、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲまたはＧＦＰレンチウイルスベクターで改変したγδＴ細胞では、ＣＤ５発現の有意な下方制御はなかった（ｐ＞０．０５）（図３７Ｄ及び３７Ｅ）。
ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞は、抗原を標的とした細胞傷害性の向上を示す
ＣＤ５－ＮＳＣＡＲが、γδＴ細胞の細胞傷害性を高めるかどうかを判断するため、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞及びＭｏｌｔ－４Ｔ細胞、ならびに２つのＣＤ５陽性／ＣＤ１９陰性Ｔ細胞株での細胞傷害性アッセイを調製した。細胞傷害性アッセイは、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変細胞及び６９７標的細胞を用いても行った。これは、ＣＤ１９陽性／ＣＤ５陰性Ｂ－ＡＬＬ細胞株である。共培養は、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比３：１または５：１で確立し、３７℃で４時間インキュベートした。非改変γδＴ細胞と比較した細胞傷害性の増加パーセントを図５に示す。両ＣＤ５陽性標的細胞株に対するＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞による細胞傷害性の増加が、非改変細胞と比較して存在した（図３８Ａ及び図３８Ｂ）。さらに、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＧＦＰ改変γδＴ細胞の細胞傷害性を測定した。このデータは、ドナーのばらつきを示しており、半数のドナー由来の細胞が、ＧＦＰ改変による細胞傷害性の減少または不変を示し、残りの半数は、細胞傷害性の向上を示した。細胞傷害性の最大の変化は、７５％の増加であったが、死んだＪｕｒｋａｔのパーセンテージは、６％から１０．５％に増加したのみであった。平均して、Ｅ：Ｔ比５：１では、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＭｏｌｔ－４細胞とともに培養したＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞は、それぞれ、４０％及び３５％の標的細胞死をもたらし、どちらも、ナイーブγδＴ細胞と比較して、５０～６０％の細胞傷害性の増加に相当する。さらに、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲは、ナイーブγδＴ細胞と比較して、６９７細胞に対する細胞傷害性を高め、Ｅ：Ｔ比５：１で、標的細胞の平均３２％を殺傷した。これは、非改変細胞と比較して、４５０％の殺傷の増加であった（図３８Ｃ）。このデータは、異なる腫瘍細胞抗原を標的とする２つのＮＳＣＡＲが、インビトロでγδＴ細胞の抗腫瘍細胞傷害性を増加させることができることを示すことを実証する。さらに、γδＴ細胞で発現するＣＤ１９－ＮＳＣＡＲは、ＣＤ１９－ＣＡＲ改変γδＴ細胞と比較して、６９７細胞に対して同様の細胞傷害性を示す（Ｅ：Ｔ比３：１及び５：１でそれぞれ、ｐ＝０．９０５及びｐ＝０．８５７）（図３９）。先の発見と一致して、ベースラインの細胞傷害性ではドナーのばらつきが高度であったが、ＮＳＣＡＲ改変γδ細胞による細胞傷害性の増加は、常に観察された。
このＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞は、γδＴ細胞に内因性のメカニズムを通して、特に、パーフォリン及びグランザイムＢ、ならびにＩＦＮγの放出を通してそれらの細胞傷害活性を示すという仮説を立てた。これをさらに評価するために、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞を６９７標的細胞と、Ｅ：Ｔ比５：１で共培養し、それらの細胞を３７℃で１２時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、細胞を脱顆粒について評価し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγ分泌について分析した。ＣＤ１９を発現する標的細胞と共培養すると、ナイーブγδＴ細胞の脱顆粒と比較して、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の脱顆粒が大幅に増加する（ｐ＝０．０１８２）。ＩＦＮγのＥＬＩＳＡにより、対照細胞による分泌と比較して、６９７細胞と共培養したＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞によるＩＦＮγの分泌が増加する傾向が示されるが、このデータは、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１０１）（図３８Ｄ）。
ＮＳＣＡＲ改変αβＴ細胞は、高い抗腫瘍細胞傷害性を有さない
ＮＳＣＡＲ発現が、抗原特異的に細胞殺傷に影響を与えるためにＭＨＣ非依存性の細胞傷害性メカニズムを必要とするという仮説を検討するため、細胞傷害性アッセイを、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変αβＴ細胞をＪｕｒｋａｔ標的細胞とともに、Ｅ：Ｔ比３：１及び５：１で培養することにより行った。ＣＤ５－ＮＳＣＡＲは、αβＴ細胞の細胞傷害性に影響を与えないと予測した。他の研究者らは、ＮＳＣＡＲと同様の構築物を使用した試験を以前に公表しており、切断されたＣＡＲが、ＣＤ２５で測定されるＴ細胞の活性化を増加させず、細胞増殖や生存率にも影響を与えないことを示した。本明細書に提供するデータは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変αβＴ細胞の細胞障害性と比較して、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に対するナイーブαβＴ細胞の細胞傷害性に差がなく、両方が、各Ｅ：Ｔ比で、４０～４５％の標的死をもたらした（Ｅ：Ｔ比３：１：ｐ＝０．６１８、Ｅ：Ｔ比５：１：ｐ＝０．６３９）（ＦＩＧ．４０）。両ドナーを、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲレンチウイルスベクターによって等しく形質導入し、一方のドナーを、ＣＤ５－ＣＡＲでさらに改変した（図４１Ａ）。ＣＤ５－ＣＡＲ改変αβＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ標的細胞の８０％を殺傷し（図４１Ｂ）、ナイーブαβＴ細胞と比較して、細胞傷害性が７８％増加した。
細胞表面から上清に放出されたＮＳＣＡＲは、標的細胞と相互作用することができる
このＮＳＣＡＲの明らかな下方制御は、一つには、細胞表面のＮＳＣＡＲの低下をもたらす改変γδＴ細胞からのタンパク質のシェディングが原因であり得るという仮説を立てた。シェディングが生じたかどうかを判断するため、γδＴ細胞を、形質導入後１日目に新鮮な培地で培養した。非改変細胞を同じ条件下で培養し、４８時間後、それらの上清を回収し、濾過した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、γδＴ細胞上清中で４時間培養した。フローサイトメトリーを行い、γδＴ細胞上清中での培養後のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞でのＣＤ５発現レベルを測定した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞自体の培地、またはナイーブγδＴ細胞、ＧＦＰ形質導入γδＴ細胞、もしくはＣＤ１９－ＣＡＲ形質導入γδＴ細胞の上清中で培養したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞はすべて、フローサイトメトリーで測定して高レベルのＣＤ５を発現した。しかしながら、ＣＤ５－ＣＡＲまたはＣＤ５－ＮＳＣＡＲで改変したγδＴ細胞の上清中で培養したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、ＣＤ５抗原検出の約２５％までの有意な減少を示した。これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と相互作用したＣＤ５－ＣＡＲ及びＣＤ５－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の両上清に因子があり、ＣＤ５の下方制御またはＴ細胞表面のＣＤ５への抗ＣＤ５抗体の結合の遮断が生じたことを示唆している（ＣＡＲ及びＮＳＣＡＲ：ｐ＜０．００１）（図４２）。このＣＡＲ／ＮＳＣＡＲの細胞外部分が、細胞表面から切断され、その同種抗原と相互作用していたという仮説を立てた。これを検討するため、そのγδＴ細胞上清を、ＩｇＧのＦｃ部分に融合した可溶性ＣＤ５であるＣＤ５－Ｆｃとともに３０分間プレインキュベートし、その後、その上清中でＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を培養した。プレインキュベートしたＣＤ５－ＣＡＲまたはＣＤ５－ＮＳＣＡＲで改変したγδＴ細胞上清中で培養したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、ＣＤ５の検出の減少をこれ以上示さなかった（それぞれ、ｐ＝０．２４０及びｐ＝０．４０２）。ＣＤ５発現は、それぞれ、この集団の６０％及び７０％で測定された。さらに、このプレインキュベーションは、ナイーブγδＴ細胞上清中で培養したＣＤ５陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のパーセンテージに影響を与えなかった（ｐ＝０．９５６）。さらに、ＣＤ５－Ｆｃのプレインキュベーション後、ＣＤ５－ＣＡＲまたはＣＤ５－ＮＳＣＡＲで改変したγδＴ細胞の上清中で培養したＣＤ５発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のパーセンテージは、プレインキュベートしたナイーブγδＴ細胞上清中で培養した細胞のパーセンテージと有意差はなかった（それぞれ、ｐ＝０．４０７及びｐ＝０．５８４）（図４２Ｂ）。
この効果がＣＤ５－ＮＳＣＡＲ特異的であるかどうか、またはＣＤ１９－ＮＳＣＡＲが同様に振る舞うかどうかを判断するため、同様の実験を行った。ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲで形質導入したγδＴ細胞を、２４～４８時間培養し、その後その上清を使用して、６９７細胞を既述の通り４時間培養した。４時間のインキュベーション後、ＣＤ１９陽性６９７細胞をフローサイトメトリーで測定した。６９７細胞自体の培地、またはナイーブもしくはＧＦＰ改変γδＴ細胞の上清中で培養した６９７細胞は、ＣＤ１９検出に変化を示さなかった。しかしながら、６９７細胞をＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の上清中で培養した場合、ＣＤ１９検出が有意に減少し（ｐ＝０．０４８）、この効果が、ＣＤ５－ＮＳＣＡＲにもＴ細胞抗原にも特異的ではないことを示唆した。（図４２Ｃ）。記載の通り、ＣＤ１９検出の低下は、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲとＣＤ１９抗原との相互作用に起因する抗体結合の下方制御または遮断による可能性がある。ＣＤ１９の発現は、ＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の上清中で培養した６９７細胞の４０％まで減少していた。さらに、既述の条件下での可溶性ＣＤ１９－ＦｃとのγδＴ細胞上清のプレインキュベーションは、ＣＤ１９発現６９７細胞におけるこの減少を防いだ。ＣＤ１９は、ＣＤ１９－ＦｃをプレインキュベートしたＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞の上清中で培養した細胞の約８０％に検出された。プレインキュベートしたナイーブγδＴ細胞上清中で培養したＣＤ１９発現６９７細胞のパーセンテージと、プレインキュベートしたＣＤ１９－ＮＳＣＡＲ改変γδＴ細胞上清中で培養した６９７細胞のパーセンテージとの間に差はない（図４２Ｄ）。
ＮＳＣＡＲは、自己活性化することなくかつ細胞増殖を妨げることなく、γδＴ細胞の細胞傷害性を、抗原を標的とする方法で高めるそれらの能力に起因して、特に、ドナー由来細胞を使用するＴ細胞悪性腫瘍の状況で、ＣＡＲ療法の代替としての可能性がある。適切な臨床環境では、ＮＳＣＡＲは、実行可能な治療法としてＣＡＲを凌駕し、抗腫瘍効果を高め、正常組織に対する細胞傷害性（ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を最小限に抑える可能性がある。
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、単に例示目的用であり、その観点から、様々な修正または変更が当業者に示唆されるとともに、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。
実施例ＶＩ
自己遺伝子改変細胞または同種異系の健康なドナー細胞を用いた造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の対象を調製するために使用することができる抗体ベースの技術を使用した非遺伝毒性前処置レジメンを開発した。このレジメンは、従来の遺伝毒性ＨＳＣＴ調製レジメンに関連する急性毒性及び長期的な副作用を有さないため、現行の最新臨床技術より安全な代替手段を表す。非遺伝毒性ＨＳＣＴ前処置への併用療法アプローチを開発した。この治療法は、内因性造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）の枯渇、ならびに遺伝子改変または同種異系ドナー細胞の生着及び免疫寛容を促進するための一時的免疫抑制の両方を達成するように特別に設計した（図４３）。このレジメンは、ＣＤ１１７受容体の結合を通じてＨＳＣを選択的に標的として殺傷するサポリンベースの免疫毒素を、Ｔ細胞受容体ＣＤ４及びＣＤ８ならびにＴ細胞共刺激分子ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）に対する非結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と組み合わせる。ＣＤ４ｍＡｂ及びＣＤ８ｍＡｂは、宿主Ｔ細胞の一時的な枯渇を引き起こすが、抗ＣＤ４０Ｌは、重要な共刺激シグナルを遮断することにより、残存する宿主Ｔ細胞の活性化を防ぐ。このレジメンは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ｆＶＩＩＩ）を発現するように遺伝子組み換えされたＨＳＰＣの高レベルの生着を可能にし、ｆＶＩＩＩナイーブ血友病Ａ（ＨＡ）マウスにおける移植片拒絶反応及び導入遺伝子に対する体液性応答を防ぐのに効果的である。
この免疫毒素は、リボソーム不活性化タンパク質毒素のペイロードであるサポリンに結合したＣＤ１１７受容体を標的とするｍＡｂを含む。細胞傷害特異性は、ＨＳＰＣでのＣＤ１１７の造血発現の制限、及びエンドサイトーシスを促進する抗体部分の非存在下でのサポリンによる非効率的な細胞移入により達成される。従って、ＣＤ１１７－細胞の非特異的殺傷が排除される。ＣＤ１１７－サポリン（ＣＤ１１７－ｓａｐ）免疫毒素をＨＳＣＴの前に静脈内投与した場合、レシピエントの骨髄における短期及び長期造血幹細胞（ＨＳＣ）コンパートメントの強力かつ特異的な枯渇が達成された（図４４）。他のＨＳＣを標的とする免疫毒素は、同様の内因性幹細胞枯渇特性を有し得る。これらには、ＨＳＣ上の異なる抗原またはエピトープを標的とするｍＡｂまたは抗体断片（例えば、ＣＤ１１７、ＣＤ４５、ＣＤ１１０ｍＡｂの様々なクローン）が含まれる可能性があり、及び／またはこれらは、異なる細胞傷害性ペイロード部分（例えば、他の植物由来毒素、例えば、リシンＡ鎖もしくはゲロニン、細菌由来毒素、例えば、ジフテリア毒素もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、真菌由来毒素、例えば、アマトキシン、または海洋物由来毒素、例えば、オーリスタチン）を利用することができる。ＨＳＣを標的とする遺伝子治療は、レンチウイルスベクターの送達によるＨＳＣのエキソビボ遺伝子改変を含む。遺伝子改変ＨＳＣは、レシピエントの免疫系にとって異物であると認識され得るトランスジェニックタンパク質を発現し、遺伝子改変細胞の拒絶及び／またはトランスジェニックタンパク質産物に対する抗体の形成をもたらす可能性のある免疫応答を引き起こす。これらの発見は、一時的な免疫抑制なしでは、ｆＶＩＩＩ遺伝子改変ＨＳＰＣは、ＣＤ１１７－ｓａｐ免疫毒素単独で前処置を受けたＨＡマウスに生着しないことを示している（図４５）。ＣＤ１１７－ｓａｐを、移植後初期のＴ細胞応答を調節するように設計されたｍＡｂの組み合わせと併用することは、ｆＶＩＩＩ遺伝子改変細胞の生着を促進するのに効果的であり、ひいては、多系統造血ドナーのキメラ現象（図４６）及び治療レベルの循環ｆＶＩＩＩ活性の発現が可能になる（図４７）。このレジメンは、同種異系ＨＳＣＴの状況においても、ドナー細胞の生着ならびに同種異系細胞及び組織移植片に対する寛容を達成するのに有用である。ｍＡｂ、Ｆａｂ断片及び／または融合タンパク質の他の組み合わせもまた、ＣＤ３ｍＡｂ枯渇、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、またはＣＤ２８／Ｂ７遮断が挙げられるがこれらに限定されないＴ細胞活性を調節するために使用され得る。
配列
ＣＤ８ストークスペーサーを備えたＴＰＯ－ＣＡＲ
ＰＡＰＰＡＣＤＬＲＶＬＳＫＬＬＲＤＳＨＶＬＨＳＲＬＳＱＣＰＥＶＨＰＬＰＴＰＶＬＬＰＡＶＤＦＳＬＧＥＷＫＴＱＭＥＥＴＫＡＱＤＩＬＧＡＶＴＬＬＬＥＧＶＭＡＡＲＧＱＬＧＰＴＣＬＳＳＬＬＧＱＬＳＧＱＶＲＬＬＬＧＡＬＱＳＬＬＧＴＱＬＰＰＱＧＲＴＴＡＨＫＤＰＮＡＩＦＬＳＦＱＨＬＬＲＧＫＶＲＦＬＭＬＶＧＧＳＴＬＣＶＲＲＡＰＰＴＴＡＶＰＳＲＴＳＬＶＬＴＬＮＥＬＰＮＲＴＳＧＬＬＥＴＮＦＴＡＳＡＲＴＴＧＳＧＬＬＫＷＱＱＧＦＲＡＫＩＰＧＬＬＮＱＴＳＲＳＬＤＱＩＰＧＹＬＮＲＩＨＥＬＬＮＧＴＲＧＬＦＰＧＰＳＲＲＴＬＧＡＰＤＩＳＳＧＴＳＤＴＧＳＬＰＰＮＬＱＰＧＹＳＰＳＰＴＨＰＰＴＧＱＹＴＬＦＰＬＰＰＴＬＰＴＰＶＶＱＬＨＰＬＬＰＤＰＳＡＰＴＰＴＰＴＳＰＬＬＮＴＳＹＴＨＳＱＮＬＳＱＥＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＲＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＰＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＳＤＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１）
Ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３ｐｖａａスペーサーを備えたＴＰＯ－ＣＡＲ
ＰＡＰＰＡＣＤＬＲＶＬＳＫＬＬＲＤＳＨＶＬＨＳＲＬＳＱＣＰＥＶＨＰＬＰＴＰＶＬＬＰＡＶＤＦＳＬＧＥＷＫＴＱＭＥＥＴＫＡＱＤＩＬＧＡＶＴＬＬＬＥＧＶＭＡＡＲＧＱＬＧＰＴＣＬＳＳＬＬＧＱＬＳＧＱＶＲＬＬＬＧＡＬＱＳＬＬＧＴＱＬＰＰＱＧＲＴＴＡＨＫＤＰＮＡＩＦＬＳＦＱＨＬＬＲＧＫＶＲＦＬＭＬＶＧＧＳＴＬＣＶＲＲＡＰＰＴＴＡＶＰＳＲＴＳＬＶＬＴＬＮＥＬＰＮＲＴＳＧＬＬＥＴＮＦＴＡＳＡＲＴＴＧＳＧＬＬＫＷＱＱＧＦＲＡＫＩＰＧＬＬＮＱＴＳＲＳＬＤＱＩＰＧＹＬＮＲＩＨＥＬＬＮＧＴＲＧＬＦＰＧＰＳＲＲＴＬＧＡＰＤＩＳＳＧＴＳＤＴＧＳＬＰＰＮＬＱＰＧＹＳＰＳＰＴＨＰＰＴＧＱＹＴＬＦＰＬＰＰＴＬＰＴＰＶＶＱＬＨＰＬＬＰＤＰＳＡＰＴＰＴＰＴＳＰＬＬＮＴＳＹＴＨＳＱＮＬＳＱＥＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＲＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＰＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＳＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ（配列番号２）
ＩｇＧ１のヒンジスペーサーを備えたＴＰＯ－ＣＡＲ
ＰＡＰＰＡＣＤＬＲＶＬＳＫＬＬＲＤＳＨＶＬＨＳＲＬＳＱＣＰＥＶＨＰＬＰＴＰＶＬＬＰＡＶＤＦＳＬＧＥＷＫＴＱＭＥＥＴＫＡＱＤＩＬＧＡＶＴＬＬＬＥＧＶＭＡＡＲＧＱＬＧＰＴＣＬＳＳＬＬＧＱＬＳＧＱＶＲＬＬＬＧＡＬＱＳＬＬＧＴＱＬＰＰＱＧＲＴＴＡＨＫＤＰＮＡＩＦＬＳＦＱＨＬＬＲＧＫＶＲＦＬＭＬＶＧＧＳＴＬＣＶＲＲＡＰＰＴＴＡＶＰＳＲＴＳＬＶＬＴＬＮＥＬＰＮＲＴＳＧＬＬＥＴＮＦＴＡＳＡＲＴＴＧＳＧＬＬＫＷＱＱＧＦＲＡＫＩＰＧＬＬＮＱＴＳＲＳＬＤＱＩＰＧＹＬＮＲＩＨＥＬＬＮＧＴＲＧＬＦＰＧＰＳＲＲＴＬＧＡＰＤＩＳＳＧＴＳＤＴＧＳＬＰＰＮＬＱＰＧＹＳＰＳＰＴＨＰＰＴＧＱＹＴＬＦＰＬＰＰＴＬＰＴＰＶＶＱＬＨＰＬＬＰＤＰＳＡＰＴＰＴＰＴＳＰＬＬＮＴＳＹＴＨＳＱＮＬＳＱＥＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＲＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＰＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＳＤＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＫＤＰＫＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号３）
切断型ＴＰＯ
ＳＰＡＰＰＡＣＤＬＲＶＬＳＫＬＬＲＤＳＨＶＬＨＳＲＬＳＱＣＰＥＶＨＰＬＰＴＰＶＬＬＰＡＶＤＦＳＬＧＥＷＫＴＱＭＥＥＴＫＡＱＤＩＬＧＡＶＴＬＬＬＥＧＶＭＡＡＲＧＱＬＧＰＴＣＬＳＳＬＬＧＱＬＳＧＱＶＲＬＬＬＧＡＬＱＳＬＬＧＴＱＬＰＰＱＧＲＴＴＡＨＫＤＰＮＡＩＦＬＳＦＱＨＬＬＲＧＫＶＲＦＬＭＬＶＧＧＳＴＬＣＶＲＲＡＰＰＴＴＡＶＰＳＲＴＳＬＶＬＴＬＮＥＬ（配列番号４）
コドン最適化ＴＰＯ ＣＡＲのアミノ酸配列（＊＝終止コドン、太字＝非コドン最適化ＣＡＲ配列と唯一異なるａａ、ＣＨ３ヒンジ及びＭｓｃＩ部位に相当する）：
Figure 2022526187000016
 非コドン最適化ＴＰＯ ＣＡＲのアミノ酸配列（＊＝終止コドン、太字＝ＬＣＯと唯一異なるａａ、ＣＤ８ａヒンジ及びＮｈｅＩ部位に相当する）：
Figure 2022526187000017
 ヒトＳＣＦ（配列番号７）
斜体：シグナルペプチド、太字：受容体結合ドメイン、下線付き：膜貫通ドメイン、通常のテキスト：細胞質ドメイン
Figure 2022526187000018
 コドン最適化ＳＣＦ ＣＡＲのアミノ酸配列（＊＝終止コドン）：
ＫＥＩＣＧＮＰＶＴＤＮＶＫＤＩＴＫＬＶＡＮＬＰＮＤＹＭＩＴＬＮＹＶＡＧＭＤＶＬＰＳＨＣＷＬＲＤＭＶＩＱＬＳＬＳＬＴＴＬＬＤＫＦＳＮＩＳＥＧＬＳＮＹＳＩＩＤＫＬＧＫＩＶＤＤＬＶＬＣＭＥＥＮＡＰＫＮＩＫＥＳＰＫＲＰＥＴＲＳＦＴＰＥＥＦＦＳＩＦＮＲＳＩＤＡＦＫＤＦＭＶＡＳＤＴＳＤＣＶＬＳＳＴＬＧＰＥＫＤＳＲＶＳＶＴＫＰＦＭＬＰＰＶＡＡＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ＊（配列番号８）
切断型ＣＤ２８のアミノ酸配列：
ＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号９）
ＣＤ３ζのアミノ酸配列：
ＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１０）
ＣＤ８αのヒンジ配列（配列番号１１）
ＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
ＩＬ－２シグナルペプチドのアミノ酸配列：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１２）
完全長ｈＴＰＯのアミノ酸配列（コドン最適化及び非最適化核酸配列から）：
ＳＰＡＰＰＡＣＤＬＲＶＬＳＫＬＬＲＤＳＨＶＬＨＳＲＬＳＱＣＰＥＶＨＰＬＰＴＰＶＬＬＰＡＶＤＦＳＬＧＥＷＫＴＱＭＥＥＴＫＡＱＤＩＬＧＡＶＴＬＬＬＥＧＶＭＡＡＲＧＱＬＧＰＴＣＬＳＳＬＬＧＱＬＳＧＱＶＲＬＬＬＧＡＬＱＳＬＬＧＴＱＬＰＰＱＧＲＴＴＡＨＫＤＰＮＡＩＦＬＳＦＱＨＬＬＲＧＫＶＲＦＬＭＬＶＧＧＳＴＬＣＶＲＲＡＰＰＴＴＡＶＰＳＲＴＳＬＶＬＴＬＮＥＬＰＮＲＴＳＧＬＬＥＴＮＦＴＡＳＡＲＴＴＧＳＧＬＬＫＷＱＱＧＦＲＡＫＩＰＧＬＬＮＱＴＳＲＳＬＤＱＩＰＧＹＬＮＲＩＨＥＬＬＮＧＴＲＧＬＦＰＧＰＳＲＲＴＬＧＡＰＤＩＳＳＧＴＳＤＴＧＳＬＰＰＮＬＱＰＧＹＳＰＳＰＴＨＰＰＴＧＱＹＴＬＦＰＬＰＰＴＬＰＴＰＶＶＱＬＨＰＬＬＰＤＰＳＡＰＴＰＴＰＴＳＰＬＬＮＴＳＹＴＨＳＱＮＬＳＱＥＧ（配列番号１３）
非コドン最適化切断型ＴＰＯ配列
ＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＧＧＴＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＡＧＴＣＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＧＣＴＣ（配列番号１４）
コドン最適化切断型ＴＰＯ配列：
ＴＣＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＴＴＧＴＧＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＧＡＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＣＴＧ（配列番号１５）
共刺激配列（配列番号２１～２７）
ＣＤ２８（配列番号２１）
ＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
４－１ＢＢ（配列番号２２）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＯＸ４０（配列番号２３）
ＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
ＣＤ４０（配列番号２４）
ＫＫＶＡＫＫＰＴＮＫＡＰＨＰＫＱＥＰＱＥＩＮＦＰＤＤＬＰＧＳＮＴＡＡＰＶＱＥＴＬＨＧＣＱＰＶＴＱＥＤＧＫＥＳＲＩＳＶＱＥＲＱ
ＩＣＯＳ（配列番号２５）
ＷＬＴＫＫＫＹＳＳＳＶＨＤＰＮＧＥＹＭＦＭＲＡＶＮＴＡＫＫＳＲＬＴＤＶＴＬ
ＣＤ２７（配列番号２６）
ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ
ＣＤ４０Ｌ（配列番号２７）
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬ
シトクロムｂ５尾部アンカー（配列番号２８）
ＷＷＫＮＬＫＷＷＴＮＷＶＩＰＡＩＳＡＶＡＶＡＬＭＹＲＬＹＭＡＥＤＳＲＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＶＣ
ＣＤ１３７アンカー（配列番号２９）
ＰＧＥＳＧＴＳＧＷＲＧＧＤＴＰＳＰＬＣＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＲＬＬＲＩＬ
ダッフィ抗原／ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）（配列番号３０）
ＭＡＳＳＧＹＶＬＱＡ ＥＬＳＰＳＴＥＮＳＳ ＱＬＤＦＥＤＶＷＮＳ ＳＹＧＶＮＤＳＦＰＤ ＧＤＹＧＡＮＬＥＡＡＡＰＣＨＳＣＮＬＬＤ ＤＳＡＬＰＦＦＩＬＴ ＳＶＬＧＩＬＡＳＳＴ ＶＬＦＭＬＦＲＰＬＦ ＲＷＱＬＣＰＧＷＰＶＬＡＱＬＡＶＧＳＡＬ ＦＳＩＶＶＰＶＬＡＰ ＧＬＧＳＴＲＳＳＡＬ ＣＳＬＧＹＣＶＷＹＧ ＳＡＦＡＱＡＬＬＬＧＣＨＡＳＬＧＨＲＬＧ ＡＧＱＶＰＧＬＴＬＧ ＬＴＶＧＩＷＧＶＡＡ ＬＬＴＬＰＶＴＬＡＳ ＧＡＳＧＧＬＣＴＬＩＹＳＴＥＬＫＡＬＱＡ ＴＨＴＶＡＣＬＡＩＦ ＶＬＬＰＬＧＬＦＧＡ ＫＧＬＫＫＡＬＧＭＧ ＰＧＰＷＭＮＩＬＷＡＷＦＩＦＷＷＰＨＧＶ ＶＬＧＬＤＦＬＶＲＳ ＫＬＬＬＬＳＴＣＬＡ ＱＱＡＬＤＬＬＬＮＬ ＡＥＡＬＡＩＬＨＣＶＡＴＰＬＬＬＡＬＦＣ ＨＱＡＴＲＴＬＬＰＳ ＬＰＬＰＥＧＷＳＳＨ ＬＤＴＬＧＳＫＳ
ＧＰＩアンカー（配列番号３１～４１）
Figure 2022526187000019
 天然のマウスＳＣＦ（配列番号４２）
斜体：シグナルペプチド、太字：受容体結合ドメイン、下線付き：膜貫通ドメイン、通常のテキスト：細胞質ドメイン
Figure 2022526187000020
 実施例で使用したマウスＳＣＦ ＣＡＲ配列（配列番号４３）
斜体：ＩＬ－２シグナルペプチド、太字：ＳＣＦ受容体結合ドメイン、下線付き：ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ膜貫通及び細胞内共刺激及びシグナル伝達ドメイン
Figure 2022526187000021
 マウスＳＣＦ（ＳＣＦ受容体結合ドメイン）（配列番号４４）
ＫＥＩＣＧＮＰＶＴＤＮＶＫＤＩＴＫＬＶＡＮＬＰＮＤＹＭＩＴＬＮＹＶＡＧＭＤＶＬＰＳＨＣＷＬＲＤＭＶＩＱＬＳＬＳＬＴＴＬＬＤＫＦＳＮＩＳＥＧＬＳＮＹＳＩＩＤＫＬＧＫＩＶＤＤＬＶＬＣＭＥＥＮＡＰＫＮＩＫＥＳＰＫＲＰＥＴＲＳＦＴＰＥＥＦＦＳＩＦＮＲＳＩＤＡＦＫＤＦＭＶＡＳＤＴＳＤＣＶＬＳＳＴＬＧＰＥＫＤＳＲＶＳＶＴＫＰＦＭＬＰＰＶＡＡ
ヒトＳＣＦ（ＳＣＦ受容体結合ドメイン）（配列番号４５）
ＥＧＩＣＲＮＲＶＴＮＮＶＫＤＶＴＫＬＶＡＮＬＰＫＤＹＭＩＴＬＫＹＶＰＧＭＤＶＬＰＳＨＣＷＩＳＥＭＶＶＱＬＳＤＳＬＴＤＬＬＤＫＦＳＮＩＳＥＧＬＳＮＹＳＩＩＤＫＬＶＮＩＶＤＤＬＶＥＣＶＫＥＮＳＳＫＤＬＫＫＳＦＫＳＰＥＰＲＬＦＴＰＥＥＦＦＲＩＦＮＲＳＩＤＡＦＫＤＦＶＶＡＳＥＴＳＤＣＶＶＳＳＴＬＳＰＥＫＤＳＲＶＳＶＴＫＰＦＭＬＰＰＶＡＡ
ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号４６）
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ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号４７）
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ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号４８）
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧＡＡＴＴＡＧＴＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＧＧＧＣＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＴＴＴＡＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＣＧＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＧＧＣＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＴＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＧＴＡＧＧＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＴＴＡＴＣＧＧＧＣＣＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＧＧＧＡＣＧＧＡＣＴＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴＣＡＡＧＴＣＴＴＣＡＧＴＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＴＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＡ
ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号４９）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＳＲＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＧＡＰＥＩＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＥＰＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＲＧＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＹＥＤＦＧＩＹＹＣＱＱＹＤＥＳＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＡＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号５０）
ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧＡＡＴＴＡＧＴＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＡＴＡＣＧＧＧＣＧＡＡＣＣＧＡＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＴＴＴＡＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＣＧＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＧＧＣＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＴＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＧＴＡＧＧＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＴＴＡＴＣＧＧＧＣＣＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＣＧＧＧＡＣＧＧＡＣＴＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴＣＡＡＧＴＣＴＴＣＡＧＴＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＣＣＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＴＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡ
ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号５１）
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ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号５２）
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ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号５３）
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ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号５４）
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ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号５５）
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ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号５６）
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ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号５７）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＳＲＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＧＡＰＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＮＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号５８）
ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＧＴＣＧＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＡＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＴＡＴＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＴＴＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＣＧＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＡＣＧＣＧＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＴＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＡＡＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＣＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＴＡＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＧＣＧＧＧＣＴＧＡＣＧＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡ
ＣＤ１９ ＮＳＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号５９）
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ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲのヌクレオチド配列（配列番号６０）
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＧＴＣＧＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＡＧＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＴＡＴＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＴＴＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＧＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＣＧＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＡＣＧＣＧＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＧＡＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＴＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＡＡＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＣＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＡＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＴＡＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＧＣＧＧＧＣＴＧＡＣＧＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡ
ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１９ ＮＳＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号６１）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＳＲＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＧＡＰＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＮＡＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＥＷＰＧＫＶＲ
８ＴＣＯ－ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＣＡＲ（配列番号６２）
Figure 2022526187000022
 ＬＣＯ ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＣＡＲ（配列番号６３）
Figure 2022526187000023
Figure 2022526187000024
 ｇｄＴＣＯ ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲ（配列番号６４）
Figure 2022526187000025
 ＬＣＯ ＣＤ５ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲ（配列番号６５）
Figure 2022526187000026
 ８ＴＣＯ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ（配列番号６６）
Figure 2022526187000027
 ＬＣＯ－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲ（配列番号６７）
Figure 2022526187000028
 ｇｄＴＣＯ ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲ（配列番号６８）
Figure 2022526187000029
 ＬＣＯ ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＮＳＣＡＲ（配列番号６９）
Figure 2022526187000030
Figure 2022526187000031

Claims (64)

  1. 組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、前記組み換えタンパク質は、受容体リガンド及び膜貫通ドメインを含み、前記受容体リガンドは、非抗体リガンドであり、前記受容体リガンドは、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞、または分化がん細胞の表面で発現する受容体に結合し、前記組み換えタンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、前記核酸構築物。
  2. 組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、前記組み換えタンパク質は、受容体リガンド、膜貫通ドメイン及びＣＤ３－ゼータを含み、前記受容体リガンドは、非抗体リガンドであり、前記受容体リガンドは、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞、または分化がん細胞の表面で発現する受容体に結合し、前記組み換えタンパク質は、共刺激ドメインを含まない、前記核酸構築物。
  3. 前記受容体リガンドが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、ＣＲＫ様タンパク質（ＣＲＫＬ）、Ｌ－セレクチン、ＣＤ９、Ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＦＨＬ－２）、ガレクチン－８（ＬＧＡＬＳ８）、テトラスパニン－４（ＴＳＰＡＮ４）、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、及び白血球インテグリンＭａｃ １（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）またはその結合断片からなる群から選択される、請求項１または２に記載の核酸構築物。
  4. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、シトクロムｂ５尾部アンカー、ＣＤ１３７アンカー、及びダッフィ抗原／ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）からなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の核酸構築物。
  5. 以下を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、請求項３または請求項４のいずれかに記載の核酸構築物：
    ａ．トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、ＣＲＫ様タンパク質（ＣＲＫＬ）、Ｌ－セレクチン、ＣＤ９、Ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＦＨＬ－２）、ガレクチン－８（ＬＧＡＬＳ８）、テトラスパニン－４（ＴＳＰＡＮ４）、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、及び白血球インテグリンＭａｃ １（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）またはその結合断片からなる群から選択される受容体リガンド、
    ｂ．膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＣＤ２８ポリペプチド、ならびに
    ｃ．ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメイン。
  6. 前記構築物の任意の２つの構成要素をヒンジ領域が分離する、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  7. 前記ヒンジ領域が、ＣＤ８αのヒンジ領域である、請求項６に記載の核酸構築物。
  8. 前記構築物が、さらにシグナル配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  9. 前記シグナル配列が、ＩＬ－２のシグナル配列である、請求項８に記載の核酸構築物。
  10. 前記シグナル配列が、前記受容体リガンドのシグナル配列である、請求項８に記載の核酸構築物。
  11. 前記核酸配列が、コドン最適化配列である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  12. 前記受容体リガンドが、配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＰＯ結合断片である、請求項３～１１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  13. 前記核酸配列が、配列番号５または配列番号６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３～１２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  14. 前記受容体リガンドが、配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む幹細胞因子結合断片である、請求項３～１１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  15. 前記核酸配列が、配列番号８と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３～１１及び１４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  16. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むベクター。
  17. レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１６に記載のベクター。
  18. 請求項１６または１７に記載のベクターを含む細胞。
  19. 前記細胞の表面上で前記組み換えタンパク質を発現する、請求項１８に記載の細胞。
  20. アルファベータＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、リンホカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びマクロファージからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の細胞。
  21. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項１６もしくは１７に記載のベクターで細胞を形質導入することを含む、改変細胞の作製方法。
  22. 前記細胞が、アルファベータＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、Ｔヘルパー細胞、リンホカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びマクロファージからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記細胞が、形質導入前に対象から採取される、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法によって生成される細胞。
  25. 対象のがん幹細胞を枯渇させる方法であって、有効量の請求項１８～２０または２４のいずれか１項に記載の細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
  26. 前記がん幹細胞が、ＭＰＬ＋、ｃ－ＫＩＴ＋、ＦＬＴ３＋、ＩＬ－３受容体＋、ＣＤ３４＋、インテグリンアルファ３／ベータ１＋、内皮プロテインＣ受容体＋またはＴｈｙ－１／ＣＤ９０＋である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記対象が、がんを有する、請求項２５～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 対象におけるがんの治療方法であって、
    （ａ）第一の対象から採取される細胞に、請求項１～１５のいずれか１項に記載の核酸または請求項１６もしくは１７に記載のベクターを導入すること、及び
    （ｂ）第二の対象に前記細胞を投与することを含む、前記方法。
  29. 前記第一の対象及び前記第二の対象が、異なる対象である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第一の対象及び前記第二の対象が、同じ対象である、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記対象が、ＭＰＬ＋、ｃ－ＫＩＴ＋、ＦＬＴ３＋、ＩＬ－３受容体＋、ＣＤ３４＋、インテグリンアルファ３／ベータ１＋、内皮プロテインＣ受容体＋またはＴｈｙ－１／ＣＤ９０＋細胞の増加に関連するがんを有する、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記がんが、急性骨髄性白血病である、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。
  33. さらに、前記対象に造血幹細胞を投与することを含む、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. さらに、前記対象に化学療法を施すことを含む、請求項２５～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 抗体及び膜貫通ドメインを含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、前記抗体は、造血幹細胞もしくは前駆細胞、がん幹細胞または分化がん細胞の表面で発現する受容体に結合し、前記組み換えタンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、前記核酸構築物。
  36. 前記抗体が、単鎖可変領域断片である、請求項３５に記載の核酸構築物。
  37. 前記受容体が、腫瘍抗原である、請求項３５または３６に記載の核酸構築物。
  38. 前記腫瘍抗原が、ＣＤ５またはＣＤ１９である、請求項３７に記載の核酸構築物。
  39. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、シトクロムｂ５尾部アンカー、ＣＤ１３７アンカー、及びダッフィ抗原／ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）からなる群から選択される、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  40. 前記構築物の任意の２つの構成要素をヒンジ領域が分離する、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  41. 前記ヒンジ領域が、ＣＤ８αのヒンジ領域である、請求項４０に記載の核酸構築物。
  42. 前記構築物が、さらにシグナル配列を含む、請求項３５～４１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  43. 前記シグナル配列が、ＩＬ－２のシグナル配列である、請求項４２に記載の核酸構築物。
  44. 前記核酸配列が、コドン最適化配列である、請求項３５～４３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
  45. 請求項３５～４４のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むベクター
  46. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項４５に記載のベクター。
  47. 請求項４５または４６に記載のベクターを含む細胞。
  48. 前記細胞が、前記細胞の表面上で前記組み換えタンパク質を発現する、請求項４７に記載の細胞。
  49. 前記細胞が、ガンマデルタＴ細胞である、請求項４７または４８に記載の細胞。
  50. 請求項３５～４４のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求項４５もしくは４６に記載のベクターで細胞を形質導入することを含む、改変細胞の作製方法。
  51. 前記細胞が、ガンマデルタＴ細胞である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記細胞が、形質導入前に対象から採取される、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 請求項５０～５２のいずれか１項に記載の方法によって生成される細胞。
  54. 対象の造血幹細胞を枯渇させる方法であって、有効量の請求項４７～４９または５３のいずれか１項に記載の細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
  55. さらに、前記対象に、さらなる造血幹細胞を投与することを含む、請求項５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記さらなる造血幹細胞が、ドナーの造血幹細胞である、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. 前記さらなる造血幹細胞が、遺伝的に改変される、請求項５４または５５に記載の方法。
  58. 前記対象が、がんを有する、請求項５４～５７のいずれかに記載の方法。
  59. 対象におけるがんの治療方法であって、
    （ａ）第一の対象から採取される細胞に、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の核酸または請求項４５もしくは４６に記載のベクターを導入すること、及び
    （ｂ）第二の対象に前記細胞を投与することを含む、前記方法。
  60. 前記第一の対象及び前記第二の対象が、異なる対象である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記第一の対象及び前記第二の対象が、同じ対象である、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記がんが、急性骨髄性白血病である、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. さらに、前記対象に造血幹細胞を投与することを含む、請求項５９～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. さらに、前記対象に化学療法を施すことを含む、請求項５９～６３のいずれか１項に記載の方法。
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