CN117925532A - 一种car-nk细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CAR‑NK细胞及其制备方法和应用，涉及生物技术和免疫学领域。本发明通过在CAR‑NK细胞的基础上，进行PD‑1和TIGIT双基因敲除，有效阻断了肿瘤细胞对该细胞的免疫逃逸和免疫抑制作用，得到了靶向ROBO1的加强型CAR‑NK细胞，该CAR‑NK细胞在体外实验中展现出更强的抗肿瘤活性，显著提高了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和在肿瘤微环境下CAR‑NK细胞的持续增殖水平，有望被开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体而言，涉及一种CAR-NK细胞及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是危害人类健康的最重要疾病之一，发病率持续增高，现已成为严重的社会负担。迄今为止，肿瘤治疗从传统治疗方法(如手术切除、放射性疗法、化疗和靶向药物疗法)发展为目前的新型疗法——细胞免疫治疗。
细胞免疫疗法，又称过继细胞疗法，是一种旨在利用人体免疫系统消除癌症的创新治疗方法。近年来，基于嵌合抗原受体的T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen ReceptorT-cell immunotherapy,CAR-T)备受关注。CAR-T细胞作为一种“活”药，通过基因转导的方法使患者的T细胞表达嵌合抗原受体，使其既能够维持特异性识别并结合肿瘤抗原，又具备自我增殖和杀伤能力，从而达到治疗肿瘤的目的。但随着多种CAR-T药物获批上市，相关研究的深入以及临床治疗的应用不断增加，发现CAR-T细胞药物会产生一系列不良反应，比如CAR-T的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性、实体肿瘤对其的耐受性与抗性、肿瘤免疫抑制微环境等。如何抑制或避免CAR-T细胞药物产生的不良反应，找寻其他可替代的细胞免疫疗法成为亟待解决的问题之一。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种CAR-NK细胞及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种CAR-NK细胞，其为PD-1和TIGIT双基因敲除的CAR-NK细胞，所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的CAR-NK细胞的制备方法，其包括：敲除CAR-NK细胞中的PD-1基因和TIGIT基因；其中，所述CAR为前述实施例中所述的CAR。
第三方面，本发明实施例提供了一种药物组合物，其活性成分包括：前述实施例所述的CAR-NK细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞。
第四方面，本发明实施例提供了一种药物制剂，其活性成分包括：前述实施例所述的CAR-NK细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞。
第五方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的CAR-NK细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞在制备用于治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
第六方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的CAR-NK细胞或前述实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞在抑制肿瘤细胞的增殖和/或活性中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过在CAR-NK细胞的基础上，进行PD-1和TIGIT基因的双敲除，有效阻断了肿瘤细胞对该细胞的免疫逃逸和免疫抑制作用，得到靶向ROBO1的加强型CAR-NK细胞。相对于PD-1-KO ROBO1 CAR-NK以及ROBO1 CAR-NK细胞株，PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK细胞株在体外实验中展现出更强的抗肿瘤活性(针对CD155高表达的靶细胞株，高效靶比短时间杀伤过程中PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK杀伤效果明显强于PD-1-KO ROBO1 CAR-NK和ROBO1 CAR-NK；针对PD-L1高表达的靶细胞株，低效靶比长效杀伤过程中，PD-1&TIGIT-dKOROBO1 CAR-NK杀伤效果与PD-1-KO ROBO1 CAR-NK相当，且均好于ROBO1 CAR-NK细胞株)，明显提高了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和在肿瘤微环境下CAR-NK细胞的持续增殖水平。因此，PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK细胞将有望被开发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有很好的应用前景和临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的ROBO1 CAR结构示意图；
图2为本发明实施例2提供的PD-1-KO ROBO1 CAR-NK细胞流式检测CAR细胞阳性率的结果图；
图3为本发明实施例2提供的PD-1-KO ROBO1 CAR-NK细胞流式检测CD56分子阳性率的结果图；
图4为本发明实施例2提供的PD-1-KO ROBO1 CAR-NK细胞中PD-1基因敲除测序结果示意图；
图5为本发明实施例3提供的人TIGIT基因敲除靶点设计示意图；
图6为本发明实施例4提供的流式细胞仪对GFP阳性细胞进行分群分选示意图；
图7为本发明实施例4提供的GFP阳性PD1&TIGIT-dKO ROBO1CAR-NK cell pool流式细胞术检测TIGIT表达示意图；
图8为本发明实施例4提供的GFP阳性PD1&TIGIT-dKO ROBO1CAR-NK cell pool基因组DNA扩增TIGIT基因片段电泳示意图；
图9为本发明实施例4提供的流式细胞仪对TIGIT阴性细胞进行单克隆分选示意图；
图10为本发明实施例4提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK第25号单克隆细胞株流式检测TIGIT表达的示意图；
图11为本发明实施例4提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK第42号单克隆细胞株流式检测TIGIT表达的示意图；
图12为本发明实施例4提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK第25号细胞中TIGIT基因敲除的单克隆测序结果示意图；
图13为本发明实施例4提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK第42号细胞中TIGIT基因敲除的单克隆测序结果示意图；
图14为本发明实施例5提供的流式监测靶细胞T47D中CD155表达示意图；
图15为本发明实施例5提供的流式监测靶细胞MB231-ROBO1中CD155表达示意图；
图16为本发明实施例6提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株对T47D靶细胞2小时的杀伤率；
图17为本发明实施例6提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株对MDA-MB231-ROBO1靶细胞2小时的杀伤率；
图18为本发明实施例6提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株对T47D靶细胞过夜(16小时)的杀伤率；
图19为本发明实施例6提供的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株对MDA-MB231-ROBO1靶细胞过夜(16小时)的杀伤率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
程序性死亡-1(PD-1)是一种适应性和先天免疫反应的抑制剂，表达于多种免疫细胞上，其配体为程序性死亡配体1(PD-L1)。PD-1和PD-L1的结合可以激活下游信号通路，并且抑制免疫细胞激活。已有研究表明，免疫细胞分泌的IFN-gamma可导致癌细胞中PD-L1表达的上调。此外，肿瘤细胞和肿瘤微环境中抗原递呈细胞异常高表达的PD-L1介导了肿瘤免疫逃逸。
含免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)是肿瘤免疫治疗的一个有前途的新靶点，其高亲和力配体为CD155(也叫PVR、Necl5或Tage4)。当癌细胞表面高表达的CD155与免疫细胞表面的TIGIT结合后，免疫细胞对癌细胞的杀伤作用就会被抑制。PD-1和TIGIT双重阻断是一种很有前途的癌症组合免疫疗法。
NK细胞是机体固有的免疫系统组成部分，在机体抗肿瘤免疫监视过程中发挥着重要作用。和CAR-T细胞不同，CAR-NK细胞在循环中的寿命有限，对正常组织的靶向/非肿瘤毒性的风险相对较低。同时，异体CAR-NK细胞输注能降低移植物抗宿主病(GVHD)的风险。因为激活的NK细胞通常分泌IFN-gamma和GM-CSF，和CAR-T细胞药物诱导的细胞因子(比如IL-1a，IL-2，TNF-alpha和IL-15等)分泌的方式不同，所以随着CAR-T细胞药物治疗带来的细胞因子释放综合征和神经毒性在使用CAR-NK细胞药物时不太可能发生。CAR-NK细胞还可以通过CAR依赖和NK细胞受体依赖的机制有效地根除一些肿瘤细胞不表达CAR靶向抗原的其他种类的肿瘤。
本申请实施例提供的CAR-NK细胞以ROBO1(在80％以上的实体肿瘤中高表达)为靶点，通过建立稳定细胞株即单克隆细胞系(表型均一、质量可控)，从而成为“货架型(off-the-shelf)”异体细胞药物，能够满足随治随用的临床需求，使广谱抗癌药成为可能。并通过基因编辑技术(如CRISPR/Cas9)，在ROBO1 CAR-NK细胞的基础上，通过电转的方式导入Cas9蛋白与sgRNA形成的RNP蛋白复合物，相继敲除PD-1和TIGIT基因，解除肿瘤细胞对其的免疫抑制作用，并协同改善肿瘤免疫抑制微环境，增强其增殖和杀伤活性，使ROBO1-CAR NK细胞能够更加有效得识别和杀伤肿瘤细胞。
具体的技术方案
一方面，本发明实施例提供了一种CAR-NK细胞，其为PD-1和TIGIT双基因敲除的CAR-NK细胞，所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域为能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的任意一种或多种的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域。
在一些实施方式中，所述抗原结合片段选自：Fab和scFv中的任意一种。
在一些实施方式中，所述CAR还包含：跨膜结构域和/或共刺激信号传导区。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括CD8跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述共刺激信号传导区包含：4-1BB和CD3ζ胞内结构域。
在一些实施方式中，所述CAR是结构为scFV-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白。
本文中的“基因敲除”是指通过一定的途径使机体或细胞中的特定的基因失活或缺失。“PD-1和TIGIT双基因敲除的CAR-NK细胞”可以理解为CAR-NK细胞中的PD-1基因和TIGIT基因失活或生物学功能被抑制。
本文中的“NK细胞”可以来源于人体或细胞系(NKT细胞或NK细胞系)。包括NK-92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞系，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活CAR-NK细胞。本文中的(靶向ROBO1的)CAR-NK细胞可参照发明名称为“细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用”、专利文献号为“CN113462652A”的专利中的ROBO1 CAR-NK细胞。
另一方面，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的CAR-NK细胞的制备方法，其包括：敲除CAR-NK细胞中的PD-1基因和TIGIT基因；其中，所述CAR为前述任意实施例中所述的CAR。
在一些实施方式中，所述敲除的技术选自Cre-loxP敲除技术、CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术和转录激活因子样效应物核酸酶技术中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，当所述敲除的技术为CRISPR/Cas9技术时，所述制备方法包括：CRISPR/CAS9敲除TIGIT基因的表达载体的构建和CRISPR/CAS9敲除PD-1基因的表达载体的构建。
在一些实施方式中，所述CRISPR/CAS9敲除TIGIT基因的表达载体的构建包括：将靶向TIGIT基因的sgRNA插入CRISPR/CAS9表达载体中，以得到CRISPR/CAS9敲除TIGIT基因的表达载体。
在一些实施方式中，所述靶向TIGIT基因的sgRNA的靶点序列如SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示。
在一些实施方式中，所述CRISPR/CAS9敲除PD-1基因的表达载体的构建包括：将靶向PD-1基因的sgRNA插入CRISPR/CAS9表达载体中，以得到CRISPR/CAS9敲除PD-1基因的表达载体。
另一方面，本发明实施例提供了一种药物组合物，其活性成分包括：前述任意实施例所述的CAR-NK细胞或前述任意实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞。
另一方面，本发明实施例提供了一种药物制剂，其活性成分包括：前述任意实施例所述的CAR-NK细胞或前述任意实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞。
本文中，“药物制剂”和“药物组合物”可以进行等同替代。所述的药物组合物除了包括本发明中的活性成分，还包括药学上可接受的辅料。所述辅料包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的任意一种或多种。
另一方面，本发明实施例提供了前述任意实施例所述的CAR-NK细胞或前述任意实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞在制备用于治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述肿瘤包括：高表达ROBO1的相关肿瘤。
在一些实施方式中，所述肿瘤为肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤和肺癌中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述药物组合物和/或药物制剂可用于治疗细胞、组织和动物，所述动物包括哺乳动物，具体可以包括动物模型和人。
本文中的“治疗”包括预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。
对于肿瘤来说，“治疗”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长，繁殖，或转移，或以上的某些组合。对于肿瘤来说，“治疗”包括清除全部或部分的肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或以上的某些组合。
治疗性的药物制剂或药物组合物的配制及其随后的施用(给药)在本领域技术人员的能力范围内。给药依赖于待治疗的疾病状态的严重度和响应性，治疗的时期持续数天到数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。最佳给药计划可从患者体内药物积累的测量来计算。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据有效成分的相对效力而变化，通常可基于在有效的体外和体内动物模型中有效的EC50来估算。
此外，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的CAR-NK细胞或前述任意实施例所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞在抑制肿瘤细胞的增殖和/或活性中的应用。
在一些实施方式中，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
在一些实施方式中，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、神经胶质瘤细胞和肺癌细胞中的任意一种或多种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1ROBO1 CAR-NK细胞制备
具体制备过程可参照专利号为“CN109810995A”，发明名称为“编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用”的专利说明书中的实施例3(ROBO1CAR-NK细胞的制备)。
实施例1提供的ROBO1 CAR结构示意图见图1。
实施例2PD-1-KO ROBO1 CAR-NK细胞制备
具体制备过程可参照专利号为“CN113462652A”，发明名称为“细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用”的专利说明书中的实施例5(PD1基因敲除的ROBO1CARNK细胞的制备)。
实施例2提供的PD-1-KO ROBO1 CAR-NK细胞流式检测CAR细胞阳性率的结果见图2，流式检测CD56分子阳性率的结果见图3，PD-1-KO ROBO1 CAR-NK细胞中PD-1基因敲除测序结果见图4。
实施例3靶向TIGIT基因的sgRNA的设计
在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中找到人TIGIT基因序列(GeneID:201633)，人基因的ORF序列由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的人TIGIT基因的4个外显子组成，使用CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor网站(https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043)在人TIGIT基因的靶位点exon2(SEQ ID NO：2)内设计并挑选2个特异性位点作为sgRNA的靶序列进行化学合成(南京金斯瑞生物科技有限公司订购)，TIGIT基因敲除的靶位点设计如图5所示。合成获得sgRNA1(靶点序列如SEQ ID NO:5所示，对应Target 2)和sgRNA2(靶点序列如SEQ ID NO:6所示，对应Target1)。
实施例4PD-1&TIGITS基因双敲除的ROBO1 CAR-NK细胞的制备
1、电穿孔转染PD-1-KO ROBO1 CAR-NK细胞
(1)预先在T75培养瓶中加入20-25ml MEM-α-Full培养基，CO2恒温培养箱中预热，从4℃冰箱中取出电转缓冲液A液和B液(Celetrix，12-0104)至室温环境，并取60μl电转缓冲液A与60μl电转缓冲液B混合，将其标记为电转缓冲液C，室温放置；
(2)按照1：2的摩尔比例将Cas9蛋白(南京金斯瑞生物科技有限公司订购，NLS-Cas9-GFP、sgRNA(实施例3)混合，再添加60μl电转缓冲液C混匀；
(3)取适量ROBO1 CAR-NK PD-1KO细胞(实施例2PD-1-KO ROBO1CAR-NK细胞)至50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；
(4)加入20ml PBS重悬细胞沉淀，1000rpm离心5min，弃上清；
(5)加入适量PBS重悬细胞沉淀，吹打均匀后细胞计数；
(6)取适量细胞至1.5ml离心管中，1500rpm转离心5min，弃上清，加入60μl电转缓冲液C，吹打重悬；
(7)将步骤2和6中的溶液轻柔混合，并在室温条件下孵育10-15min；
(8)将步骤7中的细胞悬液转移至120μl电极管(Celetrix，12-0104)中，进行电转(Celetrix电转仪：CTX-1500A-LE)；
(9)电转结束后，转移所有样品至含预热培养基的T75培养瓶中，CO2恒温培养箱中培养。
2、PD1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK cell pool的流式分选
电转48h后进行细胞的流式分选，具体步骤如下：
(1)PBS+0.2％ FBS分选液配置：取10ml PBS至15ml离心管中，加入20μl FBS后混匀；
(2)转移待分选细胞至50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃上清；
(3)加入适量的PBS清洗细胞沉淀并细胞计数，1200rpm离心5min，弃上清；
(4)加入适量PBS+0.2％ FBS分选液重悬细胞沉淀，用40μm滤网过滤细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，冰上放置，等待分选；
(5)选取FITC通道进行多克隆细胞分选，分选结束后，转移细胞至T25培养瓶中，CO2恒温培养箱中培养，多克隆细胞流式分选结果如图6所示。收集GFP阳性细胞群。
3、PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK cell pool流式鉴定TIGIT表达情况
(1)待分选后的GFP阳性细胞群扩大培养后，取适量细胞于1.5ml离心管中，1500rpm离心5min；
(2)用PBS清洗一遍，1500rpm离心5min，弃上清，再以100μl PBS重悬，同时加入APCanti-human TIGIT(VSTM3)Antibody(Biolegend，372706)，避光，室温孵育20min；
(3)PBS清洗细胞两次后，用100μl PBS重悬细胞，在流式细胞仪上，采用APC通道检测TIGIT表达情况；
(4)结果如图7所示，PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK cell pool中TIGIT表达呈现明显的分群，表明该细胞群中部分细胞的TIGIT基因被敲除，而部分细胞TIGIT基因未被敲除。
4、PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK cell pool中TIGIT基因敲除效率鉴定
采用PCR+Sanger测序方法DNA水平检测TIGIT基因敲除效率，具体步骤如下：
(1)取适量培养的PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK cell pool细胞，参照细胞基因组抽提试剂盒说明书(天根生化，DP304-03)提取细胞基因组DNA；
(2)将提取的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，所用引物：TIGIT-F3:5’-GCTGGGCTGGAGTAGAGATGT-3’(SEQ ID NO:7)和TIGIT-R3:5’-GCTGTGCAGTGTTTCAGGATT-3’(SEQ ID NO:8),PCR扩增体系为：(全式金，AS211-02)2×Easypfu PCR Super Mix：25μl，TIGIT-F3：1.5μl，TIGIT-R3：1.5μl，基因组DNA：200-300ng，补充ddH2O至总体积50μl；PCR程序为：95℃，3min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃，5min；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若有清晰DNA条带，则取1μl PCR产物进行平末端克隆(全式金，CB101-01)。详细步骤如下：pEasy-Blunt vector：1μl；PCR产物：1μl；补充ddH2O至总体积4μl。配置好反应体系后置于室温反应10min，然后使用热激法转化大肠杆菌态细胞DH5α，涂布于具有卡那霉素抗性的固体LB培养基平板上，置于37℃生化培养箱过夜培养；
(4)第二天挑取个单克隆菌落PCR并进行菌落PCR，所用引物：TIGIT-F3:5’-GCTGGGCTGGAGTAGAGATGT-3’(SEQ ID NO:7)和TIGIT-R3:5’-GCTGTGCAGTGTTTCAGGATT-3’(SEQ ID NO:8),PCR扩增体系为：(全式金，AS211-02)2×Easypfu PCR Super Mix：12.5μl，TIGIT-F3：1.0μl，TIGIT-R3：1.0μl，菌液模板：2.5μl，补充ddH2O至总体积25μl；PCR程序为：95℃，3min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃，5min；
(5)琼脂糖凝胶电泳并挑取阳性克隆进行Sanger测序，电泳结果如图8所实，结果表明，7、23、25、30、33号单克隆为空载，3、9、19、35号可能为非单克隆菌落。挑取其中编号2、4、5、6、20、21、22、24、27、28、29、31、32、34、36号细菌单克隆进行Sanger测序。测序结果比对如表1所示。
表1测序结果
5、PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK cell pool流式分选获得TIGIT表达阴性单克隆细胞
(1)PBS+0.2％ FBS分选液配置：取10ml PBS至15ml离心管中，加入20μl FBS后混匀；
(2)转移待分选细胞至50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃上清；
(3)加入适量的PBS清洗细胞沉淀并细胞计数，1200rpm离心5min，弃上清；
(4)加入APC anti-human TIGIT(VSTM3)Antibody(Biolegend，372706)，避光，室温孵育20min；
(5)PBS清洗细胞两次后，用适量PBS+0.2％ FBS分选液重悬细胞沉淀，用40μm滤网过滤细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，冰上放置，等待分选；
(6)选取APC通道进行单克隆细胞分选，共分选10块96孔板，分选结束后，转移至CO2恒温培养箱中培养。阴性细胞流式分选结果如图9所示，对P4门阴性细胞群进行单克隆分选。
6、流式检测PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株TIGIT表达。
步骤同实施例4的3中的步骤。流式结果如图10：PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK第25号单克隆细胞株；图11：PD-1&TIGIT-dKO ROBO1CAR-NK第42号单克隆细胞株。结果表明，第25号单克隆细胞株TIGIT表达阴性；第42号单克隆细胞株TIGIT表达阴性。
7、PCR方法DNA水平检测PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株TIGIT基因敲除。
步骤同实施例4的4中的步骤。PCR产物转化大肠杆菌后，挑取8-10个阳性细菌单克隆进行Sanger测序。测序结果如图12：PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK第25号单克隆细胞株(PD-1&TIGIT-dKO-L25)；图13：PD-1&TIGIT-dKO ROBO1 CAR-NK第42号单克隆细胞株(PD-1&TIGIT-dKO-L42)。经过序列比对，其中第25号单克隆细胞株allele1缺失105个碱基，allele2缺失136个碱基；第42号单克隆细胞株allele1缺失142个碱基，allele2存在两处突变，共缺失44个碱基。
实施例5流式鉴定T47D和MB231-ROBO1靶细胞中CD155的表达
步骤同实施4的3中的步骤，染色所用的流式抗体为APC anti-human CD155(PVR)Antibody(Biolegend，337618)。流式结果如图14：T47D靶细胞中CD155呈阳性表达；图15：MB231-ROBO1靶细胞中CD155呈阳性表达。
实施例6细胞杀伤试验
将实施例4制得的PD-1&TIGIT基因双敲除的ROBO1 CAR-NK细胞培养一个月后，将其用于对乳腺癌(T47D、MDA-MB231-ROBO1)细胞的杀伤试验。
具体地，提前一天将不同的靶细胞以4.5万个/孔均匀铺在96孔板中，待细胞贴壁完全后。高效靶比按照1:1、0.5:1、0.25:1的效靶比例，将效应细胞ROBO1 CAR-NK、PD-1&TIGIT-dKO-L25和PD-1&TIGIT-dKO-L42铺于靶细胞上，2小时后，用CCK8检测OD值，结果如图16和图17所示。低效靶比按照0.05:1的效靶比例，将效应细胞ROBO1 CAR-NK、PD-1&TIGIT-dKO-L25和PD-1&TIGIT-dKO-L42铺于靶细胞上，过夜16h后，用CCK8检测OD值，结果如图18和19所示，从中可以看出，不管是高效靶比短时间杀伤还是低效靶比长效杀伤，本发明的PD-1&TIGIT基因双敲除的ROBO1 CAR-NK均表现出比ROBO1 CAR-NK更强的杀伤活性。
本申请所涉及的序列表如下：
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种CAR-NK细胞，其特征在于，其为PD-1和TIGIT双基因敲除的CAR-NK细胞，所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1。
2.根据权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域为能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的任意一种或多种的抗体或抗原结合片段；
可选地，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；
可选地，所述抗原结合片段选自：Fab和scFv中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR还包含：跨膜结构域和/或共刺激信号传导区；
可选地，所述跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的任意一种或多种；
可选地，所述跨膜结构域包括CD8跨膜结构域；
可选地，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的任意一种或多种；
可选地，所述共刺激信号传导区包含：4-1BB和CD3ζ胞内结构域；
可选地，所述CAR是结构为scFV-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白。
4.如权利要求1～3任一项所述的CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，其包括：敲除CAR-NK细胞中的PD-1基因和TIGIT基因；其中，所述CAR为权利要求1～3任一项中所述的CAR。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述敲除的技术选自Cre-loxP敲除技术、CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术和转录激活因子样效应物核酸酶技术中的任意一种或多种；
可选地，当所述敲除的技术为CRISPR/Cas9技术时，所述制备方法包括：CRISPR/CAS9敲除TIGIT基因的表达载体的构建和CRISPR/CAS9敲除PD-1基因的表达载体的构建；
可选地，所述CRISPR/CAS9敲除TIGIT基因的表达载体的构建包括：将靶向TIGIT基因的sgRNA插入CRISPR/CAS9表达载体中，以得到CRISPR/CAS9敲除TIGIT基因的表达载体；
可选地，所述靶向TIGIT基因的sgRNA的靶点序列如SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示；
可选地，所述CRISPR/CAS9敲除PD-1基因的表达载体的构建包括：将靶向PD-1基因的sgRNA插入CRISPR/CAS9表达载体中，以得到CRISPR/CAS9敲除PD-1基因的表达载体。
6.一种药物组合物，其特征在于，其活性成分包括：权利要求1～3任一项所述的CAR-NK细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞；
可选地，所述药物组合物还包括：医学上可接受的辅料。
7.一种药物制剂，其特征在于，其活性成分包括：权利要求1～3任一项所述的CAR-NK细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞。
8.权利要求1～3任一项所述的CAR-NK细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞在制备用于治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：高表达ROBO1的相关肿瘤；
可选地，所述肿瘤为肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤和肺癌中的任意一种或多种。
10.权利要求1～3任一项所述的CAR-NK细胞或权利要求4或5所述的制备方法制备获得的CAR-NK细胞在抑制肿瘤细胞的增殖和/或活性中的应用；
可选地，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的；
可选地，所述肿瘤包括：高表达ROBO1的相关肿瘤；
可选地，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、神经胶质瘤细胞和肺癌细胞中的任意一种或多种。
Priority Applications (1)
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