CN118119709A

CN118119709A - Nr4a3缺陷型细胞及其用途

Info

Publication number: CN118119709A
Application number: CN202280050270.6A
Authority: CN
Inventors: 林子敏; R·C·林
Original assignee: Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2024-05-31

Abstract

本公开提供了促进免疫细胞的持久效应子功能的方法，其包括修饰所述细胞以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白。还提供了经修饰的细胞，例如免疫细胞，其已经被修饰以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白。降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的水平导致是凋亡抗性并且也是免疫检查点抗性的耗竭/功能障碍抗性细胞，并且还导致在肿瘤微环境中维持抗肿瘤功能。

Description

NR4A3缺陷型细胞及其用途

相关申请的交叉引用

本PCT申请要求2021年5月28日提交的美国临时申请第63/194,745号和2022年5月19日提交的美国临时申请第63/365,024号的优先权，这些临时申请各自以引用的方式整体并入本文。

对通过EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用

在本申请中提交的以电子方式提交的序列表的内容(名称：4385_075PC02_Seqlisting_ST25.txt，大小：97201字节；和创建日期：2022年5月27日)以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本公开涉及基于细胞(例如，T细胞)的癌症免疫疗法，其包括施用经修饰具有降低水平的NR4A3基因和/或降低水平的NR4A3蛋白表达的免疫细胞。

发明背景

癌症免疫疗法依赖于让T细胞(免疫系统感染和患病细胞的主要杀手)攻击和杀伤肿瘤细胞。然而，免疫疗法有一个重要的绊脚石：T细胞的杀伤能力会减弱，这种现象通常被称为耗竭。免疫检查点阻断、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和T细胞受体工程化(TCR)T细胞疗法是利用从患者中分离的功能活性T细胞的治疗，并且需要高功能T细胞才能有效。这些T细胞在离体被工程化和扩增以识别靶癌细胞上的特异性抗原。

当免疫系统被迫长时间具有活性时，诸如持续的病毒感染或癌症的进展，效应T细胞可能会耗竭。耗竭的T细胞的一个标志是免疫检查点蛋白(如PD-1和CTLA-4)的表达增加，这可以导致这些T细胞停止工作(即，变得无功能)。免疫检查点抑制剂阻断这些检查点蛋白，这样做可以增加针对肿瘤的免疫反应。一些研究表明，阻断耗竭T细胞中检查点蛋白的活性无法达到这一目的。这很重要，因为所谓的热肿瘤(即那些包含高水平免疫细胞并且因此应该是对免疫疗法有反应的理想候选物的肿瘤)通常含有主要由耗竭T细胞组成的群体。此外，肿瘤微环境可以诱导衰老和耗竭细胞表型。因此，设计逆转和/或预防这些耗竭状态的策略对于提高免疫治疗效果至关重要。

发明内容

在一些方面，本公开提供了治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用细胞组合物，所述细胞组合物包含经修饰的免疫细胞群体，所述经修饰的免疫细胞群体表达降低水平的核受体亚家族4A组成员3(“NR4A3”)基因和/或NR4A3蛋白和结合分子(例如，其特异性结合ROR1)，并且具有NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达。在一些方面，与参考细胞组合物(例如，其中细胞尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞组合物)相比，所述经修饰的免疫细胞群体中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一个方面，NR4A3基因和/或蛋白质的表达水平降低约90％至约99％。在一个方面，NR4A3基因和/或蛋白质的表达水平降低至低于检测水平。

在一些方面，经修饰的免疫细胞包括淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞及它们的任何组合。在一些方面，淋巴细胞包括T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤(NK)细胞及它们的任何组合。在一些方面，淋巴细胞是T细胞。

在一些方面，结合分子包含嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)，例如工程化TCR。在一些方面，结合分子包含CAR。在一些方面，经修饰的免疫细胞是离体细胞或体外细胞。在一些方面，经修饰的免疫细胞是体内细胞。

在一些方面，通过基因编辑工具对经修饰的免疫细胞进行修饰，以降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达。在一个方面，细胞被修饰以敲除NR4A3基因。在另一方面，细胞被修饰以使NR4A3基因突变，使得功能性NR4A3蛋白表达被消除。在一些方面，基因编辑工具包括shRNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、CRISPR、锌指核酸酶、TALEN、大范围核酸酶、限制性核酸内切酶或它们的任何组合。在一些方面，基因编辑工具是CRISPR。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3活性基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，经修饰的免疫细胞群体在受试者中表现出免疫细胞的一种或多种增强的特性。在一些方面，经修饰的免疫细胞的所述增强的特性包括(i)免疫细胞的增强的扩增，(ii)免疫细胞的增强的细胞毒性，(iii)增强的持久性，(iv)免疫细胞的增强的细胞因子表达，或它们的任何组合。

在一些方面，经修饰的免疫细胞表现出增强的细胞因子表达。在一些方面，细胞因子是白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或它们的任何组合。在一些方面，与参考免疫细胞群体中IL-2的表达水平相比，IL-2的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍。在一些方面，与参考免疫细胞群体中IL-γ的表达水平相比，IFN-γ的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍。在一些方面，与参考免疫细胞群体中TNF-α的表达水平相比，TNF-α的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3活性基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，经修饰的免疫细胞表现出减少的耗竭或功能障碍。在一些方面，其中经修饰的免疫细胞在连续刺激后表现出增强的细胞毒性。在一些方面，经修饰的免疫细胞在慢性刺激中表现出增强的细胞毒性。在一些方面，经修饰的免疫细胞在肿瘤微环境(TME)中维持抗肿瘤功能。

在一些方面，结合分子包含衍生自R12、R11、2A2或它们的任何组合的scFv。在一些方面，结合分子包含含有SEQ ID NO:17的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:21的轻链可变结构域。在一些方面，与参考肿瘤体积(例如，施用前受试者中的肿瘤体积和/或未接受施用的受试者中的肿瘤体积)相比，施用减小受试者中的肿瘤体积。在一些方面，与所述参考肿瘤体积(例如，施用前受试者中的肿瘤体积和/或未接受施用的受试者中的肿瘤体积)相比，肿瘤体积在施用后减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，与参考肿瘤重量(例如，施用前受试者中的肿瘤重量和/或未接受施用的受试者中的肿瘤重量)相比，施用减少受试者中的肿瘤重量。在一些方面，与所述参考肿瘤重量(例如，施用前受试者中的肿瘤重量和/或未接受施用的受试者中的肿瘤重量)相比，肿瘤重量在施用后减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。

在一些方面，与参考存活持续时间(例如，施用前受试者的存活持续时间和/或未接受施用的受试者的存活持续时间)相比，施用增加受试者的存活持续时间。在一些方面，与参考存活持续时间相比，存活持续时间增加至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约一年。

在一些方面，施用减少或防止免疫细胞的耗竭或功能障碍。在一些方面，免疫细胞在肿瘤微环境(TME)中维持抗肿瘤功能。在一些方面，肿瘤源自癌症，所述癌症包括乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃(胃部)癌、胃肠癌、卵巢癌、宫颈癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。

在一些方面，方法还包括向受试者施用另外的治疗剂。在一些方面，另外的治疗剂包括化疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子的活化剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或它们的任何组合。在一些方面，另外的治疗剂是免疫检查点抑制剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体及它们的任何组合。在一些方面，其中另外的治疗剂和细胞组合物同时施用。在一些方面，另外的治疗剂和细胞组合物依序施用。

在一些方面，细胞组合物经肠胃外、肌内、皮下、眼部、静脉内、腹膜内、皮内、眶内、脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、瘤内或它们的任何组合施用。

对于上述方法中的任一种，在一些方面，基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:94和SEQ ID NO:96。

在一些方面，本公开提供了一种产生具有降低水平的核受体亚家族4A组成员3(“NR4A3”)基因和/或NR4A3蛋白的细胞的方法，其包括用基因编辑工具修饰所述细胞，其中所述基因编辑工具降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达，其中所述基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96。

在一些方面，本公开还提供了一种增加免疫细胞响应于抗原刺激而产生细胞因子的方法，其包括用基因编辑工具修饰所述免疫细胞，其中所述基因编辑工具降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达，并且其中所述基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96。在一些方面，细胞因子包括IFN-γ、IL-2、TNF-α或它们的组合。在一些方面，与未用基因编辑工具修饰的对应免疫细胞相比，在修饰之后，响应于抗原刺激的细胞因子的产生增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。

在一些方面，本申请提供了一种增加免疫细胞响应于持续抗原刺激的效应子功能的方法，其包括用基因编辑工具修饰所述免疫细胞，其中所述基因编辑工具降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达，并且其中所述基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96。在一些方面，与参考免疫细胞相比，免疫细胞在至少一轮、至少两轮或至少三轮另外的抗原刺激测定中保持效应子功能。在一些方面，效应子功能包括以下能力：(i)杀伤靶细胞(例如，肿瘤细胞)，(ii)在进一步抗原刺激后产生细胞因子，或(iii)(i)和(ii)两者。

在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:30所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:52所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:53所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:54所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:55所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ IDNO:56所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:57所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:58所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:61所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:65所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:67所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:68所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:70所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:71所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ IDNO:75所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:76所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:82所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:83所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:86所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:94所示的序列、由其组成或基本由其组成。在一些方面，指导RNA包含SEQ ID NO:96所示的序列、由其组成或基本由其组成。

在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含细胞，其中所述细胞已通过如权利要求43所述的方法制备。在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞，其中所述细胞已经用能够靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中所述gRNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:94和SEQ ID NO:96。

在一些方面，本公开提供了通过本文描述的方法制备的细胞。在一些方面，细胞是体内细胞。在一些方面，细胞是离体细胞或体外细胞。

在一些方面，本公开提供了包含本文所述的细胞的药物组合物。

在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含(i)降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的基因编辑工具，(ii)包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的载体，以及用于根据本文所述方法治疗肿瘤的说明书。

在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含(i)降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的基因编辑工具，(ii)包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的载体，以及用于根据本文所述方法制备细胞组合物的说明书。

附图说明

图1A和图1B显示了在五个独立供体(Stim，黑色圆圈)中2小时CD3/CD28 Dynabead刺激后CAR T细胞产生的第7天，NR4A3编辑的(“NR4A3 KO”)和对照未编辑的CD4⁺(图1A)和CD8⁺(图1B)抗ROR1 CAR T细胞中NR4A3表达的百分比。Unstim细胞(白色圆圈，无Dynabead)用作阴性对照。刺激条件的非成对t检验用于统计分析。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，****p<0.0001。

图2显示了在CAR T细胞产生的第7天，来自五个供体的NR4A1编辑的(“NR4A1KO”)、NR4A2编辑的(“NR4A2 KO”)、NR4A3编辑的(“NR4A3 KO”)和对照未编辑的CD4⁺(白色圆圈)和CD8⁺(黑色圆圈)抗ROR1 CAR T细胞中EGFR⁺R12⁺ROR1 CAR表达的百分比。

图3显示了在依序刺激测定中，在五个独立供体中，通过NR4A编辑的或对照未编辑的抗ROR1 CAR T细胞(“x”符号)和模拟未转导的T细胞(正方形)对H1975-NLR NSCLC细胞的连续抗ROR1裂解。显示的NR4A编辑的细胞包括：NR4A1敲除(三角形)、NR4A2敲除(星形)和NR4A3敲除(圆圈)。通过测量总NLR强度来定量H1975-NLR靶细胞的裂解。NLR强度相对于每一轮刺激重新接种后的起始强度进行标准化。NLR-NucLight Red。

图4A至图4C显示了在对应于图3的H1975依序刺激测定期间，由NR4A编辑的、对照未编辑的抗ROR1 CAR(“x”符号)和模拟未转导的T细胞(正方形)产生的分泌型干扰素-γ(IFN-)(图4A)、白介素-2(IL-2)(图4B)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(图4C)。显示的NR4A编辑的细胞包括：NR4A1敲除(三角形)、NR4A2敲除(星形)和NR4A3敲除(圆圈)。每次重新接种后24小时收集上清液，并且通过MSD定量细胞因子。各列显示来自5个独立供体的数据。误差条代表三个孔的平均值+/-SD。非成对t检验用于统计分析。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，****p<0.0001。

图5A显示了在对应于图3的H1975依序刺激测定期间，在每次重新接种后，来自NR4A编辑的、对照未编辑的ROR1 CAR(“x”符号)和模拟未转导的(正方形)T细胞的CD4⁺(上)和CD8⁺(下)T细胞上的抗ROR1 CAR表达。显示的NR4A编辑的细胞包括：NR4A1敲除(三角形)、NR4A2敲除(星形)和NR4A3敲除(圆圈)。D0显示了测定开始时CAR表达的频率。图5B显示了在对应于图3的H1975依序刺激测定期间，来自NR4A编辑的和对照未编辑的抗ROR1 CAR T细胞的预计CD3⁺抗ROR1 CAR⁺T细胞数量的倍数变化。计算预计细胞数，以包括25％的细胞转移到下一次刺激。倍数变化计算为(来自刺激的预计细胞数/来自先前刺激的预计细胞数)。在图5B中，Stim1、Stim2和Stim3中的每一个的条对应于以下：(i)NR4A1敲除(三角形；第一条)；(ii)NR4A2敲除(星形；第二条)；(iii)NR4A3敲除(圆圈；第三条)；以及(iv)对照未编辑的ROR1 CAR(x符号；第四条)。每张图代表独立的供体。

图6显示了来自对应于图3中第二次刺激的H1975依序刺激测定的NR4A3编辑的(“NR4A3 KO”)和对照未编辑的抗ROR1 CAR细胞的ROR1 CAR⁺CD4⁺(上)和CD8⁺(下)T细胞上抑制性受体(LAG3、TIM3、CD39和PD-1)的表达。成对t检验用于统计分析。**p<0.005。n＝5名独立的供体。

图7A至图7C显示了在H1975慢性刺激测定中ROR1抗原刺激七天后，在五个独立供体中由与A549(顶行)或H1975(底行)肿瘤细胞共培养的NR4A编辑的和对照未编辑的抗ROR1CAR T细胞产生的分泌型干扰素-γ(IFN-)(图7A)、白介素-2(IL-2)(图7B)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(图7C)。在第七天建立新鲜共培养后24小时收集上清液，并且通过MSD定量细胞因子。每张图代表独立的供体。在每个图中，条对应于以下：(i)NR4A1敲除(三角形；第一条)；(ii)NR4A2敲除(星形；第二条)；(iii)NR4A3敲除(圆圈；第三条)；以及(iv)对照未编辑的抗ROR1 CAR(x符号；第四条)。各列显示来自5个独立供体的数据。误差条代表三个孔的平均值+/-SD。非成对t检验用于统计分析。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，****p<0.0001。

图8A显示在对应于图7的H1975慢性刺激测定期间，来自NR4A编辑的和对照未编辑的ROR1 CAR T细胞的CD4⁺(上)和CD8⁺(下)T细胞上的ROR1 CAR表达。显示的NR4A编辑的细胞包括：NR4A1敲除(三角形)、NR4A2敲除(星形)和NR4A3敲除(圆圈)。图8B显示了在对应于图7的七天H1975慢性刺激测定期间，来自NR4A编辑的和对照未编辑的ROR1 CAR T细胞的CD3⁺抗ROR1 CAR⁺T细胞数的倍数变化。倍数变化计算为(当前E:T重置的细胞数/先前E:T重置的细胞数)。每张图代表独立的供体。在图8B中，针对第2天、第4天和第7天中的每一天显示的条对应于以下：(i)NR4A1敲除(三角形；第一条)；(ii)NR4A2敲除(星形；第二条)；(iii)NR4A3敲除(圆圈；第三条)；以及(iv)控制未编辑的ROR1 CAR(x符号；第四条)。各列显示来自5个独立供体的数据。

图9显示在对应于图7的H1975慢性刺激测定的第七天，来自NR4A3编辑的(“NR4A3KO”)和对照未编辑的抗ROR1 CAR细胞的抗ROR1 CAR⁺CD4⁺(上)和CD8⁺(下)T细胞上抑制性受体(LAG3、TIM3、CD39和PD-1)的表达。n＝5名独立供体。

图10A和图10B显示NR4A3编辑的抗ROR1 CAR T细胞的改善的体内功效。图10A显示肿瘤体积，并且图10B显示移植有皮下侧翼H1975异种移植肿瘤的NSG小鼠的存活率。当平均肿瘤体积达到80-120mm³时，以每只小鼠0.6×10⁶(上图，低剂量)或2×10⁶(下图，高剂量)CAR⁺T细胞用NR4A编辑的或对照未编辑的抗ROR1 CAR T细胞i.v.处理小鼠。n＝5只小鼠/组。误差条代表平均值+/-SEM。通过对数秩(Manel-Cox)检验计算存活曲线统计数据。***p<0.001和***p<0.0001。显示的不同组包括：(i)NR4A1敲除(三角形)，(ii)NR4A2敲除(星形)，(iii)NR4A3敲除(圆圈)，(iv)对照未编辑抗ROR1CAR(x符号)，和模拟非转导T细胞(正方形)。

图11A和图11B显示了分别通过被修饰以具有降低水平的NR4A家族的以下多个成员的抗ROR1 CAR T细胞对A549-NLR和H1975-NLR细胞的连续裂解：(1)NR4A1和NR4A2两者(“NR4A 1+2DKO”)(空心圆圈)，(2)NR4A1和NR4A3两者(“NR4A 1+3DKO”)(三角形)，(3)NR4A2和NR4A3两者("NR4A 2+3DKO")(星形)，以及(4)NR4A1、NR4A2和NR4A3("NR4A TKO")(星号)。还显示了具有降低水平的仅NR4A3(实心圆圈)的抗ROR1 CAR T细胞以用于比较。模拟(未经ROR1 CAR或NR4A编辑的未转导T细胞)(正方形)显示为对照。通过测量总NLR强度来定量H1975-NLR靶细胞的裂解。NLR强度相对于每一轮刺激重新接种后的起始强度进行标准化。NLR-NucLight Red。

图12A至图12C显示了在使用A549靶细胞的连续刺激测定(参见图11A)期间，由具有降低水平的NR4A家族的多个成员的抗ROR1CAR T细胞产生的IFN-γ(图12A)、IL-2(图12B)和TNF-α(图12C)水平。NR4A编辑的抗ROR1 CAR T细胞和对照组与图11A和图11B中描述的相同。每次重新接种(即，stim 1、stim 2、stim 3、stim 4和stim 5)后24小时收集上清液，并且通过MSD定量细胞因子。

图13A至图13C显示了在使用H1975靶细胞的连续刺激测定(参见图11B)期间，由具有降低水平的NR4A家族的多个成员的抗ROR1CAR T细胞产生的IFN-γ(图13A)、IL-2(图13B)和TNF-α(图13C)水平。NR4A编辑的抗ROR1 CAR T细胞和对照组与图11A和图11B中描述的相同。每次重新接种(即，stim 1、stim 2、stim 3、stim 4和stim 5)后24小时收集上清液，并且通过MSD定量细胞因子。

图14显示了在依序刺激测定中，在三个独立供体中通过NR4A编辑的(KO)、对照未编辑的NY-ESO-1TCR T细胞和模拟未转导T细胞对NY-ESO-1+A375-NLR黑色素瘤细胞的连续裂解。通过测量总NLR计数来定量A375-NLR靶细胞的裂解。NLR计数相对于每一轮刺激重新接种后的起始计数进行标准化。NLR–NucLight Red。每个图显示了来自三个独立供体的数据。

图15A至图15C显示了在对应于图14的A375依序刺激测定期间，由NR4A编辑的、对照未编辑的NY-ESO-1TCR T细胞和模拟未诱导T细胞产生的分泌型干扰素-γ(IFN-)(图15A)、白介素-2(IL-2)(图15B)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(图15C)。每次重新接种后24小时收集上清液，并且通过MSD定量细胞因子。各图显示了来自3个独立供体的数据。在图15A至图15C中的每一个中，对于每一个刺激(即，Stim 1、Stim 2、Stim 3和Stim 4)，第一条(从左开始)是NR4A1编辑的NY-ESO-1TCR T细胞(NR4A1 KO；三角形)，第二条是NR4A2编辑的NY-ESO-1TCR T细胞(NR4A2 KO；星号)；第三条是NR4A3编辑的NY-ESO-1TCR T细胞(NR4A3 KO；实心圆圈)；第四条是未编辑的对照NY-ESO-1TCR T细胞(对照；x符号)；并且第五条是未转导的T细胞(模拟；正方形)。

具体实施方式

本公开涉及治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用包含经修饰的免疫细胞群体的组合物，所述经修饰的免疫细胞群体表达降低水平的核受体亚家族4A组成员3(NR4A3)基因和/或NR4A3蛋白，并且具有NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达。NR4A3基因水平的降低可以通过使用基因编辑技术，例如基因编辑技术(诸如CRISPR)来实现。从本公开内容将显而易见的是，在一些方面，具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的免疫细胞也可以表达降低水平的NR4A家族的其他成员。因此，在一些方面，可用于本公开的经修饰的免疫细胞具有：(i)降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，和(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白。在一些方面，可用于本公开的经修饰的免疫细胞具有：(i)降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，和(ii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，可用于本公开的经修饰的免疫细胞具有：(i)降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，和(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。

NR4A3基因和/或NR4A3蛋白表达水平的降低(单独或与NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白水平的降低组合)可导致一种或多种持续的效应子功能。持续的效应子功能的一个方面是增强的T细胞活化(例如，增强的扩增、增强的细胞毒性、增强的细胞因子表达)。降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的水平(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)可导致耗竭/功能障碍抗性细胞。此外，降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的水平(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)可导致在TME环境中维持抗肿瘤功能。

本公开还提供了例如产生经修饰的免疫细胞的方法，所述免疫细胞表达降低水平的核受体亚家族4A组成员3(NR4A3)基因和/或NR4A3蛋白以及内源水平的NR4A1和NR4A2基因和NR4A1和NR4A2蛋白；使用所述修饰的免疫细胞的方法；药物组合物；或试剂盒。如本文所述，在一些方面，可用于此类方法、药物组合物或试剂盒的经修饰的免疫细胞已被进一步修饰以具有：(i)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(ii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iii)(i)和(ii)两者。

在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定组合物或方法步骤，因此此类组合物或方法步骤当然可变化。本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所描述且说明的各个单独方面具有离散的组分和特征，所述组分和特征可容易地与任何另外的若干方面的特征分离或组合而不偏离本公开的范围或精神。任何叙述的方法均可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序进行。

本文提供的标题并非是对本公开的各个方面的限制，所述各个方面可通过参考说明书整体来限定。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且并不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附权利要求限制。

I.术语

为了能够更容易地理解本公开内容，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的含义。另外的定义在整个申请中阐述。

在整个公开中，术语“一个”或“一种”实体指的是所述实体中的一个或多个；例如，“免疫细胞”被理解为代表一种或多种免疫细胞。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。

此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个具有或不具有另一者的具体公开。因此，本文在短语中使用的术语“和/或”诸如“A和/或B”意图包括：“A和B”；“A或B”；“A”(单独)；和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用术语“和/或”意图包括以下方面的每一方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)；和C(单独的)。

应当理解，本文无论在何处用措辞“包含/包括(comprising)”来描述方面，都还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所相关领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。举例来说，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press对技术人员提供本公开中使用的许多术语的综合词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受形式表示。数值范围包括限定范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向自左至右书写。本文提供的标题并非是对本公开的各个方面的限制，所述各个方面可通过参考说明书整体而得到。因此，即将在下文定义的术语通过参考说明书全文来更充分地定义。

贯穿本公开定义了本文所用的缩写。在以下小节中更详细地描述了本公开的各个方面。

术语“约”或“基本上包括”是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分取决于如何测量或确定值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上包含”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上包含”可以意指高达10％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以指高达一个数量级或高达5倍的值。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包括”的含义在所述特定值或组成的可接受的误差范围内。

如本文所用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大约”是指类似于所阐述的参考值的值。在一些方面，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非这些数字将超过可能值的100％)，否则术语“约”是指落入陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的值的范围。

如本文所述，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当情况下，其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。

如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将治疗剂或包含治疗剂的组合物以物理方式引入至受试者。本文所述的治疗剂的不同施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注进行。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部(topical)施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心脏内、皮内、经气管、气管内、肺、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、心室内、玻璃体内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。替代地，本文所述的治疗剂可经由非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用还可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长时间段内进行。

如本文所用，术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，诸如蛋白质、肽或半抗原。如本文所用，术语“同源抗原”指免疫细胞(例如，T细胞)识别的抗原，从而诱导免疫细胞的活化(例如，触发诱导效应子功能，诸如细胞因子产生和/或细胞增殖)的细胞内信号。

核苷酸可以由其普遍接受的单字母码表示。除非另外指示，否则核酸以5'至3'取向从左至右书写。核苷酸在本文中以其由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的众所周知的单字母符号提及。因此，A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤，T表示胸腺嘧啶，U表示尿嘧啶。

应当理解，在所公开的序列中，T和U可以互换，这取决于所述序列是DNA还是RNA。例如，在本公开中，gRNA间隔序列以DNA(A/T/C/G)的形式出现，而gRNA嵌合框架以RNA(A/U/C/G)的形式出现。

氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。除非另外指明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向自左至右书写。

“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，诸如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。“蛋白质”可以包含一种或多种多肽。除非另外说明，否则术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。

如本文所用的术语“核酸分子”，旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。

如本文中所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物)的聚合物。所述术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括(例如通过烷基化和/或通过加帽)修饰的和未修饰的多核苷酸形式。具体而言，术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括mRNA和gRNA，无论是剪接的还是未剪接的，任何其他类型的多核苷酸(它是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷)，以及其他含有正核苷酸骨架的聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和多吗啉聚合物，以及其他合成序列特异性核酸聚合物(前提条件是聚合物含有核碱基，所述核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆积，诸如存在于DNA和RNA中)。除非另有说明，否则术语“多核苷酸”、“核酸”、“基因”、“cDNA”和“mRNA”可以互换使用。

术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA区段。其可以包括编码区之前和之后的区域(前导和尾部)以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将额外DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型(episomal)哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，还包括提供等效功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

“癌症”是指特征在于体内异常细胞不受控制地生长的各种各样的疾病。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织，并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。如本文所用，“癌症”是指原发性、转移性和复发性癌症。

如本文所用，术语“免疫反应”是指脊椎动物内针对外来剂的生物学反应，所述反应保护生物体免受这些剂和由它们引起的疾病的影响。免疫反应是由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或中性粒细胞)和由这些细胞中的任一种或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述免疫反应导致选择性靶向、结合、损伤、破坏侵入病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞或者(在自身免疫或病理性炎症的情况下)正常的人细胞或组织和/或将它们从脊椎动物体内消除。免疫反应包括例如T细胞的活化或抑制，例如效应T细胞或Th细胞，诸如CD4⁺或CD8⁺细胞，或T_reg细胞的抑制。如本文所用，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”可互换并且指胸腺产生或加工的任何淋巴细胞。在一些方面，T细胞是CD4⁺T细胞。在一些方面，T细胞是CD8⁺T细胞。在一些方面，T细胞是NKT细胞。

如本文所用，术语“抗肿瘤免疫反应”是指针对肿瘤抗原的免疫反应。刺激免疫反应或免疫系统的能力增强可能由T细胞共刺激受体的激动活性增强和/或抑制性受体的拮抗活性增强引起。刺激免疫反应或免疫系统的能力的增加可以通过EC₅₀的倍数增加或在测量免疫反应的测定(例如，测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(在靶细胞上直接测定或通过检测CD107a或颗粒酶间接测定)和增殖的变化的测定)中的最大活性水平来反映。在一些方面，刺激免疫反应或免疫系统活性的能力可增强例如至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。在一些方面，刺激免疫反应或免疫系统活性的能力可增强例如至少约1.2倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物(诸如非人灵长类动物、绵羊、狗)和啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)。在一些方面，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指提供期望的生物、治疗和/或预防结果的药剂(例如，本文公开的经修饰的免疫细胞)的量。结果可以是疾病的一种或多种体征、症状或病因的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解，或者生物系统的任何其他所需的改变。关于实体瘤，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(诸如抑制肿瘤生长)或者预防或延迟其他不需要的细胞增殖的量。在一些方面，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些方面，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。组合物的有效量可以例如(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、阻滞、减缓并能阻止癌细胞向外周器官的渗透；(iv)抑制(即，在一定程度上减缓并能阻止肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延缓肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解一种或多种与癌症相关的症状。

在一些方面，“治疗有效量”是在临床上被证明影响癌症的显著减少或癌症进展(消退)的减缓的经修饰细胞的量，诸如晚期实体瘤。治疗剂促进疾病消退的能力可使用熟练从业者已知的多种方法来评估，诸如在临床试验期间在人受试者中，在预测在人中的功效的动物模型系统中，或通过在体外测定中测定剂的活性。

如本文所用，术语“护理标准”是指被医学专家接受为对某种类型的疾病的适当治疗并且被医疗保健专业人员广泛使用的治疗。所述术语可以与以下术语中的任一者互换使用：“最佳实践”、“标准医疗护理”和“标准疗法”。

例如，“抗癌剂”促进受试者的癌症消退或预防进一步的肿瘤生长。在一些方面，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。

“促进癌症消退”意指单独或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或大小减少、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加或预防由疾病折磨引起的损伤或残疾。

关于治疗的术语“有效”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性。药理有效性是指药物促进患者的癌症消退的能力。生理安全性是指由药物施用引起的在细胞、器官和/或生物体水平上的毒性或其他不良生理反应(不良反应)的水平。

如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调控T细胞活化或功能。许多检查点蛋白是已知的，诸如CTLA-4及其配体CD80和CD86；和PD-1及其配体PD-L1和PD-L2。Pardoll,D.M.,NatRev Cancer 12(4):252-64(2012)。这些蛋白质负责T细胞反应的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调控并维持自身耐受性以及生理免疫反应的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或来源于抗体。

如本文所用，术语“氧化应激”是指以氧化剂过量和/或抗氧化剂水平降低为特征的条件。细胞氧化剂可包括但不限于氧自由基(超氧阴离子、羟基自由基和/或过氧自由基)；活性非自由基氧物质，诸如过氧化氢和单线态氧；碳自由基；氮自由基；硫自由基；和它们的组合。在一些方面，氧化应激条件可导致例如细胞损伤、细胞性能受损和/或细胞死亡。

如本文所用，术语“经修饰的细胞”是指细胞，例如T细胞，其经历了非天然发生的工程化，使得细胞的表型(即，NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平)不同于未经修饰的细胞(即，参考细胞)。从本公开内容中显而易见的是，与参考细胞(例如，尚未经修饰的对应细胞)相比，本文公开的经修饰的细胞表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白。如本文所述，在一些方面，经修饰的细胞可表达正常水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白以及NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，本公开的经修饰的细胞可以表达：(i)降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，和(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白。在一些方面，本文所述的经修饰的细胞可以表达：(i)降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，和(ii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，经修饰的细胞可以表达：(i)降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，和(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。如本文所用，术语“对应细胞”是指与经修饰的细胞属于相同免疫细胞分类的细胞。例如，如果经修饰的细胞是T细胞，那么对应细胞也将是T细胞。除非另有说明，否则“具有(表达)降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的细胞”(包括其变体)包括已经被修饰以具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞(例如，T细胞)，以及：(i)内源水平的NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白；(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白；(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白；或(iv)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白以及降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者。

如本文所用，术语“内源表达”或“内源表达水平”或“内源水平”(或其变体)是指基因和/或蛋白质表达(例如，量、动力学等)是天然存在的(例如，基因和/或蛋白质不是由非天然存在的工程化直接操纵的)。从本公开内容将显而易见的是，在一些方面，本文公开的经修饰的细胞(例如，NR4A3被敲除的ROR1 CAR T细胞)不表达内源水平的NR4A3基因或NR4A3蛋白，但是因为NR4A1和NR4A2基因没有被敲除(例如，通过CRISPR，例如，非天然存在的工程化)，经修饰的细胞内源表达NR4A1和NR4A2基因和/或NR4A1和NR4A2蛋白。如本文所述，在一些方面，表达降低水平的NR4A3基因或NR4A3蛋白的经修饰的细胞可被进一步修饰，以也表达降低水平的以下基因或蛋白：(i)NR4A1基因或NR4A1蛋白，(ii)NR4A2基因或NR4A2蛋白，或(iii)(i)和(ii)两者。

在一些方面，通过将外来或外源核酸引入细胞中来产生经修饰的细胞。在一些方面，外来或外源核酸可以编码本文公开的基因编辑工具。可以通过本领域已知的方法将核酸引入细胞中，诸如例如电穿孔(参见例如，Heiser W.C.Transcription FactorProtocols:Methods in Molecular Biology^TM2000；130:117-134)、化学(例如，磷酸钙或脂质)转染(参见例如，Lewis W.H.等人,Somatic Cell Genet.1980年5月；6(3):333-47；ChenC.等人,Mol Cell Biol.1987年8月；7(8):2745-2752)、与含有重组质粒的细菌原生质体融合(参见例如，Schaffner W.Proc Natl Acad Sci USA.1980年4月；77(4):2163-7)，或将纯化的DNA直接显微注射到细胞核中(参见例如，Capecchi M.R.Cell.1980年11月；22(2Pt2):479-88)。

应当理解，涉及“经修饰的细胞”或“细胞”的公开内容同样适用于这些细胞的群体，即多个这些细胞。

如本文所用，术语“升高的浓度”或“升高的水平”及其语法变体是指与适当的对照(例如，健康组织或细胞)相比高于正常水平的物质(例如，活性氧物质；ROS)。

如本文所用，术语“活性氧物质”和“ROS”是指含有氧的高活性化学物质，其容易与其他分子反应，导致潜在的破坏性改变。活性氧物质包括例如氧离子、自由基以及无机和有机过氧化物，诸如过氧化氢、过氧化物、羟基自由基、脂质氢过氧化物酶和单线态氧。它们通常是非常小的分子，并且由于存在不成对的价层电子而具有高活性。几乎所有的癌症都与活性氧物质浓度升高有关。Liou,G.等人,Free Radic Res 44(5):1-31(2010)。

如本文所用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指具有与细胞内结构域偶联的抗原特异性细胞外结构域的重组融合蛋白，所述细胞内结构域指导细胞在抗原与细胞外结构域结合后执行特化功能。术语“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”和“嵌合免疫受体”在本文中各自可与术语“嵌合抗原受体”互换使用。嵌合抗原受体与其他抗原结合剂的区别在于它们既能结合MHC非依赖性抗原，又能通过其细胞内结构域转导活化信号。

嵌合抗原受体的抗原特异性细胞外结构域识别并特异性地结合抗原，通常是恶性肿瘤的表面表达抗原。当抗原特异性细胞外结构域例如以在约0.1pM至约10μM之间(例如约0.1pM至约1μM或约0.1pM至约100nM)的亲和常数或相互作用亲和力(K_D)结合抗原时，其特异性地结合抗原。用于确定相互作用的亲和力的方法是本领域已知的。适用于本公开的CAR的抗原特异性细胞外结构域可以是任何抗原结合多肽，广泛多种所述多肽在本领域中是已知的。在一些方面，抗原结合结构域是单链Fv(scFv)。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼抗体可变结构域)及其人源化形式、lgNAR VH(鲨鱼抗体可变结构域)及其人源化形式、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼源化”抗体可变结构域是适用的。在一些方面，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域，诸如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双结构域TCR)也是适用的。

本文公开的嵌合抗原受体还可以包括细胞内结构域，其在抗原与抗原特异性细胞外结构域结合时向细胞(表达CAR)提供细胞内信号。在一些方面，CAR的细胞内信号传导结构域负责活化其中表达嵌合受体的T细胞的至少一种效应子功能。

术语“细胞内结构域”是指CAR的在抗原与细胞外结构域结合时转导效应子功能信号并指导T细胞执行特化功能的部分。合适的细胞内结构域的非限制性实例包括T细胞受体的ζ链或其任何同系物(例如，η、δ、γ或ε)、MB 1链、829、Fc RIII、Fc RI和信号传导分子的组合，诸如CD3.ζ.和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40及它们的组合，以及其他类似的分子和片段。可以使用活化蛋白家族其他成员的细胞内信号传导部分，诸如FcγRIII和FcεRI。虽然通常会使用完整的细胞内结构域，但在许多情况下没有必要使用完整的细胞内多肽。就细胞内信号传导结构域的截短部分可以找到用途而言，这种截短部分可以用来代替完整链，只要它仍然转导效应子功能信号。因此，术语细胞内结构域意味着包括足以转导效应子功能信号的细胞内结构域的任何截短部分。典型地，抗原特异性细胞外结构域通过跨膜结构域连接至嵌合抗原受体的细胞内结构域。跨膜结构域横穿细胞膜，将CAR锚定至T细胞表面，并将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接，从而影响CAR在T细胞表面的表达。嵌合抗原受体还可以还包含一个或多个共刺激结构域和/或一个或多个间隔区。共刺激结构域来源于增强细胞因子产生、增殖、细胞毒性和/或体内持久性的共刺激蛋白的细胞内信号传导结构域。

“肽铰链”或“间隔区”将抗原特异性细胞外结构域连接到跨膜结构域。跨膜结构域融合到共刺激结构域，任选地，共刺激结构域融合到第二共刺激结构域，并且共刺激结构域融合到信号传导结构域，不限于CD3ζ。例如，在抗原特异性细胞外结构域和跨膜结构域之间以及在串联CAR的情况下在多个scFvs之间包含间隔结构域可能影响抗原结合结构域的灵活性，从而影响CAR功能。合适的跨膜结构域、共刺激结构域和间隔区是本领域已知的。

如本文所用，术语“ug”和“uM”可分别与“μg”和“μΜ”互换使用。

如本文所用，术语“基因编辑”是指改变细胞基因组中存在的遗传信息的过程。这种基因编辑可以通过操控基因组DNA来进行，导致遗传信息的改变。在一些方面，这种基因编辑可能影响已被编辑的DNA的表达。在一些方面，这种基因编辑不影响已被编辑的DNA的表达。在一些方面，本文公开的经修饰的细胞的基因编辑可以使用本文描述的基因编辑工具来完成。基因编辑工具的非限制性实例包括RNA干扰分子(例如，shRNA、siRNA、miRNA)、反义寡核苷酸、CRISPR、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、限制性核酸内切酶或它们的任何组合。

如本文所用，术语“核酸酶”是指对DNA裂解具有催化活性的酶。可以在本文公开的方法和组合物中使用任何诱导缺口或双链断裂进入所需识别位点的核酸酶试剂。可以使用天然存在的或天然的核酸酶试剂，只要所述核酸酶试剂在期望的识别位点诱导缺口或双链断裂。可替代地，可以使用经修饰或工程化的核酸酶试剂。“工程化核酸酶试剂”包括从其天然形式工程化(修饰或衍生)的核酸酶，以特异性识别并诱导所需识别位点的缺口或双链断裂。因此，工程化核酸酶试剂可以衍生自天然的、天然存在的核酸酶试剂，或者其可以人工产生或合成。核酸酶试剂的修饰可以少至蛋白质裂解试剂中的一个氨基酸或核酸裂解试剂中的一个核苷酸。在一些方面，工程化核酸酶在识别位点中诱导缺口或双链断裂，其中识别位点不是通过天然(非工程化或非修饰)核酸酶试剂识别的序列。在识别位点或其他DNA中产生缺口或双链断裂在本文中可称为“切割”或“裂解”识别位点或其他DNA。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”是指包含核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)，所述核苷酸序列编码蛋白质，例如Cas9蛋白、CAR或TCR，或多核苷酸，例如gRNA。编码序列可以还包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，所述信号能够指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达。编码序列可以是密码子优化的。

如本文所用的“互补”或“互补的”是指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。“互补性”是指两个核酸序列共有的特性，当它们彼此反向平行排列时，每个位置的核苷酸碱基将是互补的。

本文所述的各个方面更详细描述于以下小节中。

II.经修饰的免疫细胞

由于肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的耗竭，实体瘤细胞免疫疗法的成功受到限制。持续暴露于肿瘤抗原会导致T细胞耗竭，其特征是细胞毒性和细胞因子产生的进行性丧失，以及抑制性标志物(诸如PD-1)的表达增加(Wherry等人,Nat.Rev.Immunol.15,486-499(2015))。此外，耗竭的TIL上调并可替代地地使用转录因子，特别是NR4A家族(Chen等人,Nature 567,530-534(2019))。

本公开提供了经修饰的免疫细胞，即例如通过基因编辑修饰的例如细胞，其表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，并且因此显示增强的功能，例如持久的效应子功能和/或减少的耗竭(例如，表达降低水平的NR4A3但表达内源水平的NR4A1和NR4A2的CAR T细胞，例如抗ROR1-CAR T细胞，其表达降低水平的NR4A3但表达内源水平的NR4A1和NR4A2，例如表达TCR的免疫细胞，其表达降低水平的NR4A3但表达内源水平的NR4A1和NR4A2)。在一些方面，这种经修饰的免疫细胞已经被进一步修饰以也表达降低水平的NR4A家族的其他成员。例如，如本文所述，在一些方面，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的免疫细胞也被修饰以表达降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的免疫细胞也被修饰以表达降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白。在一些方面，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的免疫细胞也被修饰以表达降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白以及NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者。

II.A.NR4A3

核受体亚家族4A组成员3(通常缩写为NR4A3并且也称为MINOR、CSMF、NOR1、CHN、有丝分裂原诱导的核孤儿受体、神经元衍生的孤儿受体、核激素受体NOR-1、“与EWS融合的骨外粘液样软骨肉瘤”以及TEC)是一种在人中由NR4A3基因编码的蛋白质。核孤儿受体NR4A家族包括NR4A1(Nur77)、NR4A2(Nurr1)和NR4A3(Nor-1)。它们以不依赖配体的方式作为转录因子发挥作用。它们的功能主要由各种细胞外信号对其表达的快速和瞬时诱导来控制，因此被认为是立即早期基因。NR4A参与各种细胞功能，包括凋亡、存活、增殖、血管生成、炎症、DNA修复和脂肪酸代谢。

NR4A3基因位于9号染色体上(碱基99,821,885至99,866,893；45,039个碱基；正链取向；NCBI参考序列：NC_000009.12)。NR4A3是一种转录活化因子，以细胞和反应元件(靶标)特异性方式与启动子区域中的调控元件结合。NR4A3通过作为单体结合到NR4A1反应元件(NBRE)5’-AAAAGGTCA-3’位点和作为同源二聚体结合到其调控的靶基因启动子中的Nur反应元件(NurRE)位点来诱导基因表达(通过相似性)，并且在许多不同细胞类型的增殖、存活和分化的调控中起作用。

NR4A3蛋白具有三种通过选择性剪接产生的同工型。序列如下表1中所示。

表1.NR4A3蛋白同工型。

II.B.NR4A2

除了降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白之外，在一些方面，本文所述的经修饰的细胞可被进一步修饰以具有降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。本领域已知的任何合适的方法可用于降低本文所述的经修饰的细胞中NR4A2基因和/或NR4A2蛋白的水平。例如，在一些方面，可以使用本文所述的任何基因编辑工具(例如，CRISPR/Cas系统)来降低NR4A2基因和/或NR4A2蛋白的水平。

核受体亚家族4A组成员2(通常缩写为NR4A2，也称为NOT、RNR1、HZF-3、NURR1、TINUR)是一种在人中由NR4A2基因编码的蛋白质。NR4A2基因位于2号染色体上(碱基156,324,432至156,332,724，NCBI参考序列：NC_000002.12)。除非另有说明，否则本文所用的术语“NR4A2基因”是指编码NR4A2蛋白(或其变体)的任何核酸序列。

NR4A2蛋白具有两种通过选择性剪接产生的同工型。序列如下表2中所示。除非另有说明并如本文进一步描述，否则在一些方面，本文描述的免疫细胞已被进一步修饰以具有降低水平的任何已知NR4A2蛋白(包括其任何同工型和变体)。降低NR4A2基因和/或NR4A2蛋白水平的合适方法描述于本公开的其他地方，并且也是本领域已知的。

表2.NR4A2蛋白同工型。

II.C.NR4A1

除了降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白之外，在一些方面，本文所述的经修饰的细胞可被进一步修饰以具有降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白。本领域已知的任何合适的方法可用于降低本文所述的经修饰的细胞中NR4A1基因和/或NR4A1蛋白的水平。例如，在一些方面，可以使用本文所述的任何基因编辑工具(例如，CRISPR/Cas系统)来降低NR4A1基因和/或NR4A1蛋白的水平。

核受体亚家族4A组成员1(通常缩写为NR4A1，并且也称为HMR、N10、TR3、NP10、GFRP1、NAK-1、NGFIB和NUR77)是一种在人中由NR4A1基因编码的蛋白质。NR4A1基因位于12号染色体上(碱基52022832至52059507；NCBI参考序列NC_000012.12)。除非另有说明，否则本文所用的术语“NR4A1基因”是指编码NR4A1蛋白(或其变体)的任何核酸序列。

NR4A1蛋白具有三种通过选择性剪接产生的同工型。序列如下表3中所示。

表3.NR4A1蛋白同工型。

在一些方面，用于本公开的细胞组合物包含经修饰的免疫细胞群体，其表达降低水平的NR4A3基因和/或降低水平的NR4A3蛋白和特异性结合ROR1的结合分子，并且具有：(i)NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达。在一些方面，经修饰的免疫细胞：(i)表达特异性结合ROR1的结合分子；(ii)具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白；和(iii)具有降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白。在一些方面，经修饰的免疫细胞：(i)表达特异性结合ROR1的结合分子；(ii)具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白；以及(iii)具有降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，经修饰的免疫细胞：(i)表达特异性结合ROR1的结合分子；(ii)具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白；(iii)具有降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白；以及(iv)具有降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。如本文所用，术语“NR4A3基因”指任何转录物、基因组DNA、前mRNA或mRNA。如本文所用，术语“NR4A3蛋白”指上文公开的同工型α、同工型β或同工型3，以及它们的变体和突变体。如本文所用，术语NR4A3蛋白还涵盖本文公开的任何同工型的任何片段或变体，其具有野生型NR4A3蛋白的至少一种功能。

如本文所用，术语“降低的水平”(或其变体)既指物理水平的降低(例如，由于来自基因组的编辑而减少基因序列，或由于蛋白质表达减少而减少蛋白质)，也指功能的降低。例如，NR4A3基因水平的降低可指基因功能的降低，例如由于引入终止密码子或移码的突变的引入，指改变转录的表观遗传修饰，或指启动子基因或调控NR4A3表达的另一种基因的突变或其他变化。在一些方面，经修饰的细胞中NR4A3基因水平的降低是指与参考细胞相比，能够编码功能性NR4A3蛋白(例如，野生型NR4A3蛋白)的基因组DNA、前mRNA和/或mRNA的量(例如，浓度)的降低。类似地，NR4A3蛋白的减少可指导致功能性NR4A3蛋白(例如，野生型NR4A3蛋白)表达的变化，包括但不限于导致功能丧失(部分或完全)的变化(例如，突变或翻译后修饰)，或指结合NR4A3功能位点的分子的活性改变，例如其与其他细胞信号传导配偶体的相互作用。

NR4A3基因水平(例如，完整基因或其部分的存在/不存在，或基因功能)可通过本领域已知的各种方法测量。NR4A3蛋白水平(例如，NR4A3蛋白或其片段的存在/不存在，或定量或蛋白功能)可通过本领域已知的各种方法测量。

在一些方面，与参考免疫细胞((例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞))群体相比，免疫细胞群体(例如，表达CAR或TCR的细胞)中NR4A3基因的表达水平和/或NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。在一些方面，在修饰后，免疫细胞群体(例如，表达CAR的细胞群体或表达TCR的细胞群体)中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白在蛋白质中的表达被完全抑制。

在一些方面，与参考免疫细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因的对应细胞)群体相比，免疫细胞群体中NR4A3基因的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

在一些方面，与参考免疫细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3蛋白的对应细胞)群体相比，免疫细胞群体中NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

在一些方面，与参考免疫细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和NR4A3蛋白的对应细胞)群体相比，免疫细胞群体中NR4A3基因和NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

类似地，在一些方面，与参考免疫细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白的对应细胞)群体相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞)也具有降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白水平。在一些方面，与参考免疫细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白的对应细胞)群体相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞)也具有降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白水平。在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞)还具有：(i)与参考免疫细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白的对应细胞)群体相比，降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白水平；和(ii)与参考免疫细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白的对应细胞)群体相比，降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白水平。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞)包括淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或它们的组合。在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞群体)包括淋巴细胞。如本文所用，“经修饰的免疫细胞”包括最初经修饰的免疫细胞的子代细胞，其中子代细胞也表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)。

在一些方面，免疫细胞群体是纯群体。在一些方面，纯群体包含属于相同免疫细胞类型的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少99％的细胞(例如，99％的免疫细胞是淋巴细胞)。在一些方面，免疫细胞群体包含一种、两种、三种、四种或五种不同的细胞类型，例如包含两种细胞类型的免疫细胞群体可包含淋巴细胞和树突细胞。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞群体包含淋巴细胞、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞群体包含淋巴细胞，其中淋巴细胞选自由以下组成的组：T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤(NK)T细胞及它们的任何组合。在一些具体方面，淋巴细胞是T细胞。在一些具体方面，淋巴细胞是NK细胞。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞是T细胞。在一些方面，T细胞包括CAR。在一些方面，可制备用于表达CAR的经修饰的T细胞(CAR T细胞)是例如CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞。在一些方面，本文所公开的CAR表达细胞是CAR T细胞，例如单CAR T细胞、基因组编辑的CAR T细胞、双CAR T细胞或串联CAR T细胞。在一些方面，本文公开的经修饰的细胞是NK细胞。在一些方面，NK细胞包括CAR。在一些方面，CAR NK细胞是单CAR NK细胞、双CAR NK细胞或串联CAR NKT细胞。在一些方面，本公开的经修饰的细胞包括T细胞和NK细胞。在一些方面，T细胞和NK细胞都包括CAR。这种CAR T细胞和CAR NK细胞的实例提供于国际申请第PCT/US2019/044195号(公开为WO2020028400A1)中，其以引用的方式整体并入本文。

在一些方面，经修饰的免疫细胞可以是任何免疫细胞类型。在一些方面，细胞是用于任何过继细胞转移(ACT)疗法(也称为过继细胞疗法)的经修饰的免疫细胞。ACT疗法可以是自体疗法或异体疗法。在一些方面，ACT疗法包括但不限于CAR T疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、NK细胞疗法或它们的任何组合。

在一些方面，经修饰的免疫细胞是用于TIL疗法的TIL。使用TIL作为过继细胞转移疗法来治疗癌症已经研究了超过二十年，使用TIL过继细胞疗法来治疗黑色素瘤。Rosenberg SA等人,(2011年7月).Clinical Cancer Research 17(13):4550–7(2011年7月)。在过继性T细胞转移疗法中，TIL从已经被切割成小片段的手术切除肿瘤或从肿瘤片段分离的单细胞悬浮液中离体扩增。建立多个单独的培养物，分别生长，并且对特异性肿瘤识别进行测定。TIL在几个星期的过程中被扩展。然后在“快速扩增方案”(REP)中进一步扩增呈现最佳肿瘤反应性的所选TIL系，所述方案使用抗CD3活化，通常持续两周。培养物中生长的TIL可在离体过程中的任何时间进行修饰，从而降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与NR4A家族的其他成员，例如NR4A1和/或NR4A2组合)的表达。最后一次REP后，TIL被输回患者体内。所述方法还可以包括初步的化疗方案，以减少内源性淋巴细胞，从而为过继转移的TIL提供足够的途径来包围肿瘤部位。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)包含T细胞受体(TCR)，例如工程化T细胞受体。在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)可包含特异性结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，经修饰的免疫细胞(例如，淋巴细胞)是具有T细胞受体的T细胞，例如工程化TCR。如本文所用，术语“工程化TCR”或“工程化T细胞受体”是指经工程化的T细胞受体(TCR)，其以期望的亲和力特异性结合于主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原，所述抗原被选择、克隆和/或随后引入T细胞群体。

在一些方面，可在本文公开的经修饰的细胞上表达的CAR或TCR特异性结合(即，靶向)在肿瘤细胞上表达的一种或多种抗原，所述肿瘤细胞诸如恶性B细胞、恶性T细胞或恶性浆细胞。

在一些方面，CAR特异性结合(即，靶向)选自由以下组成的组的抗原：CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、蛋白酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆荚蛋白(legumain)、HPV E6,E7、MAGEAl、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、特异性蛋白(prostein)、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突变体(例如，包括KRAS、HRAS、NRAS突变体蛋白)、hTERT、肉瘤移位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分以及它们的任何组合。

在一些方面，本公开的经修饰的细胞可以表达靶向抗原的T细胞受体(TCR)。T细胞受体是一种异二聚体，由2条不同的跨膜多肽链构成：一条α链和一条β链，各自由一个恒定区和一个可变区组成，恒定区将链锚定在T细胞表面膜内，可变区识别并结合由MHC呈递的抗原。TCR复合物与形成2种异二聚体CD3γε和CD3δε以及1种同二聚体CD3ζ的6种多肽缔合，它们一起形成CD3复合物。T细胞受体工程化T细胞疗法利用保留这些复合物的T细胞的修饰来特异性靶向由特定肿瘤细胞表达的抗原。

在一些方面，经修饰的TCR工程细胞可靶向主要类型：共享肿瘤相关抗原(共享TAA)和独特肿瘤相关抗原(独特TAA)，或肿瘤特异性抗原。前者可以包括但不限于睾丸癌(CT)抗原、过表达抗原和分化抗原，而后者可以包括但不限于新抗原和肿瘤病毒抗原。人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白和HPV E7蛋白属于肿瘤病毒抗原的范畴。

在一些方面，经修饰的TCR工程细胞可靶向CT抗原，例如黑色素瘤相关抗原(MAGE)，包括但不限于MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9.23、MAGE-A10和MAGE-A12。在一些方面，经修饰的TCR工程化细胞可靶向糖蛋白(gp100)、由T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)和/或酪氨酸酶，其主要存在于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。在一些方面，经修饰的TCR工程化细胞可靶向维尔姆斯瘤1(WT1)、即一种在大多数急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病、几乎每种类型的实体瘤和几种关键组织(诸如心脏组织)中高度表达的过表达抗原。在一些方面，经修饰的TCR工程化细胞可以靶向间皮素，间皮素是在间皮瘤中高度表达但也存在于包括气管在内的几种组织的间皮细胞上的另一种过表达抗原。

在一些方面，经修饰的TCR工程化细胞可靶向任何新抗原，其可通过对个体肿瘤具有特异性的随机体细胞突变形成。在一些方面，TCR特异性结合(即，靶向)选自由以下组成的组的癌症抗原：AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、蛋白酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆荚蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、特异性蛋白、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突变体(例如，包括KRAS、HRAS、NRAS突变体蛋白)、hTERT、肉瘤移位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分以及它们的任何组合。

在一些方面，本公开的经修饰的免疫细胞(例如，CAR T或NK细胞或TCR工程化的T细胞)可以靶向上文公开的任何一种肿瘤抗原或它们的组合。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)在大约57％的三阴性乳腺癌患者(TNBC)和42％的非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌患者(Balakrishnan 2017)中过表达并代表了嵌合抗原受体(CAR)T细胞的高度有吸引力的靶标。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1阳性(ROR1⁺)实体瘤可以安全地以抗ROR1 CAR T细胞为靶标(Specht 2020)；然而，功效有限，部分原因是CAR T细胞在实体瘤恶性肿瘤患者输注后表现出耗竭或功能障碍。此外，实体瘤具有免疫抑制屏障，其限制了免疫疗法的抗肿瘤活性，诸如CAR T细胞(Newick 2016，Srivastava2018，Martinez 2019)。不希望被任何理论所束缚，表达本文所述的抗ROR1嵌合结合蛋白的细胞已经被修饰以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，并且具有NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达。并且，如本文所述和所证明，在一些方面，表达抗ROR1嵌合结合蛋白和表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的这种细胞已被进一步修饰以表达降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白。在一些方面，此类细胞(即，表达抗ROR1嵌合结合蛋白并表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白)已被进一步修饰以表达降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，此类细胞(即，表达抗ROR1嵌合结合蛋白并表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白)已被进一步修饰以表达降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白以及降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。与本领域中可获得的其他抗ROR1细胞相比，这些经修饰的细胞更能抵抗耗竭并表现出改善的效应子功能

在一些方面，经修饰的免疫细胞包含ROR1结合嵌合抗原受体。示例性抗ROR1 CAR描述于Hudecek等人,Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64中，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，如Hudecek等人所述(例如，如Hudecek等人在第3155页，第一个完整段落中所述，其以引用的方式整体并入本文)产生包含抗ROR1CAR的本公开的CAR T细胞。在一些方面，本公开的抗ROR1 CAR包括抗体或其片段，其包含Hudecek等人在第3154-55页桥接段落；Baskar等人MAbs 4(2012):349-61；和Yang等人的PLoS ONE 6(2011):e21018(其以引用的方式整体并入本文)中描述的2A2、R11和R12抗ROR1单克隆抗体的VH和/或VL序列。

在一些方面，本公开的抗原结合结构域能够与抗ROR1抗体，例如R12抗体交叉竞争。R12抗体序列如表2中所示。在一些方面，用于本公开的抗原结合结构域结合R12抗体的相同表位。对本领域技术人员显而易见的是，本领域已知的任何抗ROR1抗体都可以用于本公开。这种抗体的非限制性实例包括描述于Hudecek等人Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64；Baskar等人MAbs 4(2012):349-61；和Yang等人PLoS ONE 6(2011):e21018；US 9,316,646 B2；和US 9,758,586 B2(其中的每一个都以引用的方式整体并入本文)中的2A2和R11抗体。

表2.R12抗体CDR和重链可变区/轻链可变区

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞的CAR的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域包含R12抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些方面，本公开的抗原结合结构域(例如，R12 scFv)包含R12抗体的VH和VL。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞的嵌合结合蛋白(例如，ROR1 CAR)的细胞内结构域包含信号传导结构域，诸如衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的信号传导结构域。在一些方面，CAR还包含共刺激结构域，诸如衍生自2B4、HVEM、ICOS、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、ICOS(CD278)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的共刺激结构域。在一些方面，CAR包含4-1BB共刺激结构域。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞的嵌合结合蛋白(例如，CAR)的跨膜结构域可至少包括例如以下的跨膜区：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R beta、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞的嵌合结合蛋白(例如，CAR)还包含编码共刺激结构域的序列，例如本文所述的共刺激结构域。在一些方面，共刺激结构域包含以下的共刺激结构域：白介素-2受体(IL-2R)、白介素-12受体(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、缺失Lck结合的CD28(ICA)、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受体γ链、Fc受体ε链、与CD83特异性结合的配体或它们的任何组合。

在一些方面，通过基因编辑工具修饰免疫细胞以降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)。NR4A3基因的表达降低可以例如通过编辑整个NR4A3基因、通过编辑NR4A3基因的一部分、通过编辑控制NR4A3基因的表达的调控区来进行。因此，为了降低表达CAR的细胞或表达TCR的细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达，可以使用本领域已知的用于降低细胞中基因和/或蛋白表达的任何方法。例如，在一些方面，表达CAR的细胞或表达TCR的细胞的NR4A3基因及其编码的NR4A3蛋白的表达可通过使细胞与能够降低NR4A3基因及其编码的NR4A3蛋白的表达水平的基因编辑工具接触来降低。基因编辑工具的非限制性实例如下所示。在一些具体的方面，基因编辑工具包括例如shRNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、CRISPR、锌指核酸酶、TALEN、大范围核酸酶、限制性核酸内切酶或它们的任何组合。在一个特定的方面，基因编辑工具是CRISPR。其中NR4A2基因和/或NR4A2蛋白的表达和/或NR4A1基因和/或NR4A1蛋白的表达也被降低，在一些方面，也可以使用这样的基因编辑工具(例如，特异性靶向NR4A2基因和/或NR4A1基因)。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3活性基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，通过本文公开的方法产生的免疫细胞群体(例如，表达CAR或TCR的细胞，即表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)在受试者中表现出免疫细胞的一种或多种增强或改善的特性。在一些方面，改善本文公开的免疫细胞的一种或多种特性可以帮助治疗肿瘤(例如，减少肿瘤体积和/或肿瘤重量)。可用本公开内容改善的一种或多种特性包括本文公开的可用于治疗癌症的免疫细胞的任何特性。例如，在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)相比，免疫细胞群体(例如，通过本文公开的方法产生的表达CAR或TCR的细胞，即表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)可表现出更大的效应子活性。

在一些方面，相对于参考细胞，经修饰的免疫细胞的增强特性包括

(i)免疫细胞的扩增和/或增殖增加，

(ii)免疫细胞的细胞毒性增加，

(iii)免疫细胞的细胞因子表达增加，或

(iv)它们的任何组合。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)是耗竭抗性和/或功能障碍抗性的。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)是凋亡抗性的，即与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，它们表现出减少的凋亡或没有凋亡。

在一些方面，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)是免疫检查点抗性的，即与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，它们表现出降低的免疫检查点活性或无免疫检查点活性。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)表现出增强的T细胞活化。在一些方面，这种增强的T细胞活化可以例如通过与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比表现出增强的扩增、增强的细胞毒性、增强的细胞因子表达或它们的任何组合的经修饰的免疫细胞来证明。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)在肿瘤微环境(TME)中维持抗肿瘤功能。

本公开还提供了包含本文公开的经修饰的免疫细胞群体和药学上可接受的载剂的药物组合物。

III.治疗方法

本文提供了用于治疗有需要的受试者的肿瘤(或癌症)的方法，其包括向受试者施用本公开的细胞组合物，例如表达降低水平的NR4A3基因和/或其编码的蛋白质(即NR4A3蛋白和特异性结合ROR1的结合分子)的细胞，并且所述细胞具有：(i)NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达，(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iv)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者，或本公开的药物组合物。

在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因的对应细胞)相比，NR4A3基因的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3蛋白的对应细胞)相比，NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞)相比，NR4A3基因和NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平的方法在本公开的其他地方提供。

在一些方面，与参考肿瘤体积相比，施用本公开的细胞组合物减小受试者的肿瘤体积。在一些方面，参考肿瘤体积是施用经修饰的细胞之前受试者的肿瘤体积。在一些方面，参考肿瘤体积是未接受施用的对应受试者的肿瘤体积。在一些方面，与参考肿瘤体积相比，施用后受试者的肿瘤体积减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。

在一些方面，治疗肿瘤包括减少受试者的肿瘤重量。在一些方面，当施用给受试者时，本文公开的经修饰的细胞可以减少受试者的肿瘤重量。在一些方面，与参考肿瘤重量相比，施用后肿瘤重量减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，参考肿瘤重量是施用经修饰的细胞之前受试者的肿瘤重量。在一些方面，参考肿瘤重量是未接受施用的对应受试者的肿瘤重量。

在一些方面，将本公开的细胞组合物施用给例如患有肿瘤的受试者可以增加受试者的肿瘤和/或TME中TIL(例如，CD4⁺或CD8⁺)的数量和/或百分比。在一些方面，与参考(例如，未接受经修饰的细胞的受试者或施用经修饰的细胞之前的同一受试者中的对应值)相比，肿瘤和/或TME中TIL的数量和/或百分比增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％或更多。

在一些方面，施用本公开的细胞组合物可以减少受试者的肿瘤和/或TME中调节性T细胞的数量和/或百分比。在一些方面，与参考(例如，即未接受经修饰的细胞的施用的受试者中的对应数量和/或百分比)相比，肿瘤和/或TME中的调节性T细胞的数量和/或百分比减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。

在一些方面，施用本公开的细胞组合物可以减少受试者的肿瘤和/或TME中的髓源性抑制细胞(MDSC)的数量和/或百分比。在一些方面，MDSC是单核细胞MDSC(M-MDSC)。在一些方面，MDSC是多形核MDSC(PMN-MDSC)。在一些方面，MDSC包括M-MDSC和PMN-MDSC。在一些方面，与参考值(例如，未接受经修饰的细胞的施用的对应受试者中的值)相比，肿瘤和/或TME中MDSC的数量和/或百分比减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。

除了上述之外，施用本公开的细胞组合物可以具有有益于肿瘤治疗的其他效果。这种效果将在下面进一步描述。

如本文所述，本公开的细胞组合物(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白以及特异性结合ROR1的结合分子，并且具有：(i)NR4A1和NR4A2基因和NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达，(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iv)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者)可用于治疗多种癌症类型，例如源自包括以下的癌症的肿瘤：乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃(胃部)癌、胃肠癌、卵巢癌、宫颈癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。在本申请的适应症部分中提供了癌症适应症的全面且非限制性列表。

在一些方面，本公开的细胞组合物可以与其他治疗剂(例如，抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。因此，在一些方面，本文公开的治疗肿瘤的方法包括与一种或多种另外的治疗剂组合施用本公开的细胞组合物。在一些方面，本公开的细胞组合物可以与一种或多种抗癌剂组合使用，使得可以靶向免疫途径的多个元件。在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂(即，阻断通过特定免疫检查点途径的信号传导)。可用于本方法中的免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4拮抗剂(例如，抗CTLA-4抗体)、PD-1拮抗剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)或它们的组合。在本申请的组合治疗部分详细公开了组合治疗的全面且非限制性列表。

在一些方面，在施用另外的治疗剂之前或之后，将本公开的细胞组合物施用给受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物与另外的治疗剂同时施用给受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物和另外的治疗剂可以作为在药学上可接受的载剂中的单一组合物同时施用。在一些方面，本公开的细胞组合物和另外的治疗剂作为单独的组合物同时施用。

在一些方面，可以用本公开内容治疗的受试者是非人动物，诸如大鼠或小鼠。在一些方面，可以治疗的受试者是人。

在一些方面，例如在本文公开的方法中治疗肿瘤包括增强T细胞(例如，肿瘤特异性T细胞)的活化。如本文所用，术语“增强T细胞的活化”是指在活化期间改变细胞信号传导以促进T细胞记忆的保持。

因此，在一些方面，本公开涉及通过降低细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)来增强T细胞的活化的方法。细胞的活化状态可以通过本领域已知的任何方法，例如通过分析细胞的一种或多种功能特性(例如，增殖、细胞毒性、细胞因子产生)或通过分析细胞的表型表达来确定。在一些方面，增强T细胞(例如，肿瘤特异性T细胞)的活化可导致细胞中一种或多种以下改善的特性：(i)增强的扩增，(ii)增强的细胞毒性，(iii)增强的细胞因子表达，或(iv)它们的任何组合。

在一些方面，增强T细胞(例如，肿瘤特异性T细胞)的活化导致细胞扩增增强。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞的扩增)相比，T细胞的扩增增强(即，增加)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％或更多。在一些方面，T细胞的扩增增加约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或增加约100倍。在一些方面，T细胞的扩增增加约2倍至约100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍或更多倍。在一些方面，免疫细胞的T扩增增加约10倍至约500倍、约20倍至约400倍、约25倍至约250倍、约10倍至约50倍、约20倍至约300倍。在一些方面，增强的扩增可导致例如受试者中经修饰的T细胞的数量增加(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白)。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞的数量)相比，经修饰的T细胞的数量增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％或更多。

在一些方面，增强T细胞(例如，肿瘤特异性T细胞)的活化导致细胞的细胞毒性增强。如本文所用，术语“细胞毒性”指本公开的细胞组合物(例如，肿瘤特异性T细胞)攻击肿瘤细胞并诱导其损伤的能力。本公开的细胞组合物(例如，肿瘤特异性T细胞)可以通过本领域已知的任何方法，诸如通过释放细胞毒性分子(例如，穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素)或通过Fas-Fas配体相互作用诱导肿瘤细胞中的凋亡来攻击肿瘤细胞并诱导其损伤。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞的细胞毒性)，T细胞的细胞毒性增强(即，增加)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％或更多。在一些方面，T细胞的细胞毒性(或杀伤活性)增加约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或增加约100倍。在一些方面，T细胞的细胞毒性增加约2倍至约100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍或更多倍。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞的细胞毒性)相比，T细胞的细胞毒性增加约10倍至约500倍、约20倍至约400倍、约25倍至约250倍、约10倍至约50倍、约20倍至约300倍或更多倍。

在一些方面，增强T细胞(例如，肿瘤特异性T细胞)的活化导致细胞中的细胞因子表达增强。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞中的细胞因子表达)相比，细胞因子表达增强(即，增加)至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。在一些方面，T细胞中的细胞因子表达增加约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或增加约100倍。在一些方面，T细胞中的细胞因子表达增加约2倍至约100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍或更多倍。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞的细胞因子表达)相比，T细胞中的细胞因子表达增加约10倍至约500倍、约20倍至约400倍、约25倍至约250倍、约10倍至约50倍、约20倍至约300倍或更多倍。如本文所用，术语“细胞因子”指可用于治疗癌症的任何细胞因子。这种细胞因子的非限制性实例包括IFN-γ、TNF-α、IL-2及它们的任何组合。

在一些方面，T细胞的扩增和/或增殖和/或细胞毒性(或杀伤活性)和/或细胞因子表达增加约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或约100倍。在一些方面，T细胞的扩增和/或增殖和/或细胞毒性(或杀伤活性)和/或细胞因子表达增加约2倍至约100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍或更多倍。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞的扩增和/或增殖和/或细胞毒性(或杀伤活性)和/或细胞因子表达)相比，T细胞的扩增和/或增殖和/或细胞毒性(或杀伤活性)和/或细胞因子表达增加约10倍至约500倍、约20倍至约400倍、约25倍至约250倍、约10倍至约50倍、约20倍至约300倍或更多倍。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应免疫细胞)相比，免疫细胞的扩增和/或增殖、免疫细胞的细胞毒性或免疫细胞的细胞因子表达增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，根据本公开的经修饰的免疫细胞相对于参考细胞表现出增加的细胞因子表达。在一些方面，细胞因子是白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或它们的任何组合。

在一些方面，与参考免疫细胞中IL-2的表达水平相比，经修饰的免疫细胞中IL-2的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，经修饰的免疫细胞中IFN-γ的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，经修饰的免疫细胞中TNF-α的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，本文公开的表达CAR或TCR的细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)在用抗原(诸如同源抗原(例如，肿瘤抗原))刺激(例如，依序刺激和/或慢性刺激)时产生增加量的IL-2。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)相比，在表达CAR或TCR的细胞中产生的IL-2的量增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，本文公开的表达CAR或TCR的细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)在用抗原(诸如同源抗原(例如，肿瘤抗原)刺激(例如，依序刺激和/或慢性刺激))时产生增加量的IFN-γ。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)相比，在表达CAR或TCR的细胞中产生的IFN-γ的量增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，本文公开的表达CAR或TCR的细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)在用抗原(诸如同源抗原(例如，肿瘤抗原)刺激(例如，依序刺激和/或慢性刺激))时产生增加量的TNF-α。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)相比，在表达CAR或TCR的细胞中产生的TNF-α的量增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3活性基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)表现出增加的细胞扩增和/或细胞增殖。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)，经修饰的免疫细胞中的细胞扩增和/或细胞增殖增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3活性基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)表现出增加的持久性和/或存活。在一些方面，T细胞的持久性增加约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或增加约100倍。在一些方面，T细胞的持久性增加约2倍至约100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍或更多倍。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应T细胞的持久性)相比，T细胞的持久性增加约10倍至约500倍、约20倍至约400倍、约25倍至约250倍、约10倍至约50倍、约20倍至约300倍或更多倍。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)相比，经修饰的免疫细胞中的持久性和/或存活增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)表现出增加的抗肿瘤活性。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)相比，经修饰的免疫细胞中的抗肿瘤活性增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，本文公开的经修饰的免疫细胞(例如，本文所述的表达CAR或TCR的细胞)表现出减少的耗竭或功能障碍。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达CAR或TCR的细胞)相比，经修饰的免疫细胞中的耗竭或功能障碍减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

在一些方面，本文公开的经修饰的细胞可以与其他治疗剂(例如，抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。因此，在一些方面，本文公开的治疗肿瘤的方法包括将本公开的经修饰的细胞与一种或多种另外的治疗剂组合施用给受试者。此类剂可以包括例如化疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子的活化剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或它们的任何组合。在一些方面，本文公开的经修饰的细胞(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)可与标准护理治疗(例如，手术、放射和化疗)组合使用。本文所述的方法还可用作维持疗法，例如，意图预防肿瘤发生或复发的疗法。

在一些方面，本公开的经修饰的细胞可以与一种或多种抗癌剂组合使用，使得可以靶向免疫途径的多个元件。这种组合的非限制性包括：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如，树突细胞疫苗、分泌GM-CSF的细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特(imiquimod))；例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或耗尽或阻断T_reg或其他免疫抑制细胞(例如，髓源性抑制细胞)来抑制负性免疫调节的疗法；例如用刺激CD-137、OX-40和/或CD40或GITR途径和/或刺激T细胞效应子功能的激动剂刺激正向免疫调控的疗法；系统性增加抗肿瘤T细胞的频率的疗法；例如使用CD25的拮抗剂(例如，达利珠单抗(daclizumab))或通过离体抗CD25珠耗竭来耗竭或抑制T_reg，诸如肿瘤中的T_reg的疗法；影响肿瘤中抑制性髓样细胞的功能的疗法；增强肿瘤细胞免疫原性的疗法(例如，蒽环类药物)；过继性T细胞或NK细胞转移，包括遗传修饰的细胞，例如由嵌合抗原受体修饰的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶，诸如吲哚胺二氧化酶(IDO)、二氧化酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶的疗法；逆转/预防T细胞无能或耗竭的疗法；在肿瘤部位处引发先天免疫活化和/或炎症的疗法；免疫刺激性细胞因子的施用；免疫抑制性细胞因子的阻断；或者它们的任何组合。

在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂(即，阻断通过特定免疫检查点途径的信号传导)。可用于本方法中的免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4拮抗剂(例如，抗CTLA-4抗体)、PD-1拮抗剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)或它们的组合。此类免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括以下：抗PD1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab)派姆单抗(pembrolizumab)(MK-3475)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、PDR001、MEDI0680(AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091、SHR-1210及它们的组合)；抗PD-L1抗体(例如，阿替利珠单抗(atezolizumab)(RG7446；MPDL3280A；RO5541267)、度伐利尤单抗(durvalumab)(MEDI4736、)、BMS-936559、阿维鲁单抗(avelumab)LY3300054、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035、MDX-1105及它们的组合)；和抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗(ipilimumab)曲美木单抗(tremelimumab)(替西木单抗(ticilimumab)；CP-675,206)、AGEN-1884、ATOR-1015及它们的组合)。

在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点活化剂(即，促进通过特定免疫检查点途径的信号传导)。在一些方面，免疫检查点活化剂包括OX40激动剂(例如，抗OX40抗体)、LAG-3激动剂(例如，抗LAG-3抗体)、4-1BB(CD137)激动剂(例如，抗CD137抗体)、GITR激动剂(例如，抗GITR抗体)、TIM3激动剂(例如，抗TIM3抗体)或它们的组合。

在一些方面，在施用另外的治疗剂之前或之后，将本文公开的经修饰的细胞施用给受试者。在一些方面，将经修饰的细胞与另外的治疗剂同时施用给受试者。在一些方面，经修饰的细胞和另外的治疗剂可以作为在药学上可接受的载剂中的单一组合物同时施用。在一些方面，经修饰的细胞和另外的治疗剂作为单独的组合物同时施用。在一些方面，另外的治疗剂和经修饰的免疫细胞被依序施用。

IV.制备经修饰的免疫细胞的方法

本公开提供了产生或制备具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的细胞的方法，其包括例如用基因编辑工具修饰细胞，其中基因编辑工具降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达。在一些方面，NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达减少减少或抑制了细胞的耗竭。在一些方面，经修饰的细胞可被进一步修饰以还具有：(i)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(ii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iii)(i)和(ii)两者。因此，本公开还提供了减少或抑制表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的细胞耗竭的方法，其包括修饰细胞以降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)。在一些方面，细胞是免疫细胞。此外，本公开提供了促进免疫细胞中的持久效应子功能的方法，其包括修饰细胞以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)。

基因编辑(例如，碱基编辑)可以使用本领域已知的任何编辑工具进行。例如，在一些方面，经修饰的细胞(例如，免疫细胞)可以使用诸如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、限制性核酸内切酶、干扰RNA(RNAi)或反义寡核苷酸的技术进行修饰。在一些方面，还可以使用shRNA、siRNA或miRNA来修饰NR4A3基因和/或表达。下面将更详细地讨论所有这些技术。在一些方面，用于降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白表达的方法包括使用一种或多种基因编辑工具(例如，两种、三种或更多种工具)。在一些方面，用于降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白表达的方法包括至少一种作用于NR4A3 DNA(例如，CRISPR)或RNA(例如，反义寡核苷酸)的方法和至少一种作用于NR4A3蛋白的方法(例如，抑制与细胞信号传导配偶体的结合或翻译后修饰)。

在一些方面，例如通过使用基因编辑工具来降低或消除NR4A3基因水平而如本文公开的那样修饰的细胞(例如，免疫细胞)可以被进一步修饰以表达CAR或TCR。在一些方面，根据本文公开的基因编辑方法修饰并表达CAR或TCR的免疫细胞可具有改善的抗癌特性。

虽然降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白表达的方法(例如，基因编辑)是在表达CAR或TCR的细胞的情形下提供的，但是本领域技术人员将认识到，本文公开的方法可用于任何细胞，其中需要降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达。例如，在一些方面，本文公开的用于降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的方法可应用于免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包括淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或它们的组合。在一些方面，淋巴细胞包括T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞、天然(NK)细胞或它们的组合。在一些方面，淋巴细胞是T细胞，例如CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞。在一些方面，淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些方面，TIL是CD8⁺TIL。在一些方面，TIL是CD4⁺TIL。因此，本公开提供了细胞组合物，其包含根据本文公开的用于降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的方法制备的经修饰的细胞(例如，经修饰的免疫细胞，其中亲代细胞是例如上文公开的任何细胞)，其中经修饰的细胞相对于参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞)表现出降低的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达。在一些方面，这些经修饰的细胞可用于制备药物组合物。

在一些方面，经修饰的细胞包括使细胞与能够降低细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平的基因编辑工具接触。在一些方面，基因编辑工具(或能够降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的任何其他工具)与待修饰的细胞的接触可以发生在体内、体外、离体或它们的组合。在一些方面，接触发生在体内(例如，基因疗法)。在一些方面，接触发生在体外。在一些方面，接触离体发生。在一些方面，细胞是自体细胞。在一些方面，细胞是异源细胞。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞)中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的水平相比，基因编辑工具(或能够降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的任何其他工具)的接触将细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

在一些方面，与基因编辑工具接触细胞包括不同的递送途径。通常，对于本文公开的用于降低细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的基因编辑工具，基因编辑工具必须能够进入细胞并结合感兴趣的基因。在一些方面，可以使用本领域已知的用于将感兴趣的分子递送至细胞的任何递送媒介物。参见例如美国专利第10,047,355B2号，所述专利通过引用并入本文。在本公开的其他地方提供了与可以使用的载体相关的其他公开内容。

在一些方面，基因编辑工具可以去除编码NR4A3蛋白的整个基因。在一些方面，基因编辑工具去除编码NR4A3蛋白的基因组的一部分(例如，一个或多个外显子)。在一些方面，基因编辑工具(例如，碱基编辑器)修饰特定的核苷酸碱基而不产生插入缺失(indel)。如本文所用，术语“插入缺失”指核酸内核苷酸碱基的插入或缺失，其可导致基因编码区内的移码突变。基础编辑器的非限制性实例在2017年5月4日公布的美国公开第2017/0121693号中公开，所述公开以引用的方式整体并入本文。

在一些方面，制备经修饰的免疫细胞的方法还包括修饰细胞以表达CAR或TCR。在一些方面，修饰细胞以表达CAR或TCR包括使细胞与编码CAR的核酸序列接触。在一些方面，编码CAR的核酸序列由载体(例如，表达载体)表达。

在一些方面，本文公开的基因编辑工具由包含编码基因编辑工具的核酸序列的载体表达。在一些方面，编码基因编辑工具的核酸序列和编码CAR或TCR的核酸序列在单独的载体上。在一些方面，编码基因编辑工具的核酸序列和编码CAR或TCR的核酸序列在同一载体上。

V.A.基因编辑工具

一种或多种基因编辑工具可用于修饰本公开的细胞。基因编辑工具的非限制性实例公开如下：

V.A.1.CRISPR/Cas系统

在一些方面，可以在本公开中使用的基因编辑工具包括CRISPR/Cas系统。这种系统可以使用例如编码Cas9核酸酶的核酸分子，在一些情况下，所述核酸分子对于其将在其中表达的所需细胞类型是密码子优化的(例如T细胞，例如表达CAR的T细胞)。如本文进一步描述的，在一些方面，这种系统可以包含Cas9核酸酶蛋白。

CRISPR/Cas系统使用Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶，其通过与指导RNA(例如，合成指导RNA)(gRNA)复合而靶向基因组位点，所述指导RNA与紧邻由Cas核酸酶(例如，Cas9)识别的NGG基序之前的靶DNA序列杂交。这导致NGG基序上游三个核苷酸的双链断裂。CRISPR/Cas9系统的独特能力是通过将单个Cas9蛋白与两个或更多个gRNA(例如，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个gRNA)共表达来同时靶向多个不同基因组基因座的能力。这种系统也可以使用包含两个单独分子的指导RNA。在一些方面，双分子gRNA包含crRNA样(“CRISPR RNA”或“靶向子RNA”或“crRNA”或“crRNA重复序列”)分子和对应的tracrRNA样(“反式作用CRISPR RNA”或“活化子RNA”或“tracrRNA”或“支架”)分子。

crRNA包含gRNA的DNA靶向区段(单链)和形成gRNA的蛋白结合区段的双链RNA(dsRNA)双链体的一半的一段核苷酸。对应的tracrRNA(活化子RNA)包含一段核苷酸，其形成gRNA的蛋白结合区段的dsRNA双链体的另一半。因此，crRNA的一段核苷酸与tracrRNA的一段核苷酸互补并杂交，以形成gRNA的蛋白结合结构域的dsRNA双链体。因此，可以说每个crRNA都有一个对应的tracrRNA。crRNA还提供了单链DNA靶向区段。因此，gRNA包含与靶序列(例如，NR4A3 mRNA)和tracrRNA杂交的序列。因此，crRNA和tracrRNA(作为对应的一对)杂交以形成gRNA。如果用于细胞内的修饰，给定crRNA或tracrRNA分子的确切序列和/或长度可以被设计成对将使用RNA分子的物种(例如，人)是特异性的。

编码三个元件(Cas9、tracrRNA和crRNA)的天然基因通常组织在操纵子中。天然存在的CRISPR RNA根据Cas9系统和生物体而不同，但通常包含长度为21个至72个核苷酸的靶向区段，侧翼是长度为21个至46个核苷酸的两个直接重复序列(DR)(参见例如，WO2014/131833)。在化脓性链球菌(S.pyogenes)的情况下，DR长36个核苷酸，并且靶向区段长30个核苷酸。位于3’的DR与对应的tracrRNA互补并杂交，tracrRNA又与Cas9蛋白结合。

可替代地，本文使用的CRISPR系统可进一步使用融合的crRNA-tracrRNA构建体(即，单一转录物)，其与密码子优化的Cas9一起发挥作用。这种单一的RNA通常被称为指导RNA或gRNA。在gRNA中，crRNA部分被鉴定为给定识别位点的“靶序列”，并且tracrRNA通常被称为“支架”简言之，将含有靶序列的短DNA片段插入指导RNA表达质粒中。gRNA表达质粒包含靶序列(在一些方面约20个核苷酸)，其是一种形式的tracrRNA序列(支架)以及在细胞中有活性的合适启动子和在真核细胞中正确加工所必需的元件。许多系统依赖于定制的互补寡聚物，其退火以形成双链DNA，然后克隆到gRNA表达质粒中。

然后将gRNA表达盒和Cas9表达盒引入细胞中。参见例如，Mali P等人,(2013)Science 2013年2月15日；339(6121):823-6；Jinek M等人,Science 2012年8月17日；337(6096):816-21；Hwang W Y等人,Nat Biotechnol 2013年3月；31(3):227-9；Jiang W等人,Nat Biotechnol 2013年3月；31(3):233-9；和Cong L等人,Science 2013年2月15日；339(6121):819-23，其中的每一者以引用的方式整体并入本文。参见例如，WO/2013/176772A1、WO/2014/065596A1、WO/2014/089290A1、WO/2014/093622A2、WO/2014/099750A2和WO/2013142578A1，其中的每一者以引用的方式整体并入本文。

在一些方面，Cas9核酸酶可以以蛋白质的形式提供。例如，在一些方面，可通过引入Cas9核酸酶蛋白和包含gRNA的核酸分子来修饰用于本公开的细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)(例如，以具有降低水平的NR4A基因和/或NR4A蛋白)。在一些方面，可以将Cas9核酸酶蛋白和包含gRNA的核酸分子依序引入细胞中。在一些方面，可以将Cas9核酸酶蛋白和包含gRNA的核酸分子同时引入细胞中。例如，在一些方面，同时施用包括同时但作为单独的组合物引入Cas9核酸酶蛋白和包含gRNA的核酸分子。在一些方面，Cas9蛋白可以以与包含gRNA的核酸分子的复合物的形式提供(即，作为单一组合物)。

在一些方面，Cas9核酸酶可以以编码蛋白质的核酸的形式提供。因此，在一些方面，可通过引入编码Cas9核酸酶蛋白的第一核酸分子和包含gRNA的第二核酸分子来修饰用于本公开的细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)(例如，以具有降低水平的NR4A基因和/或NR4A蛋白)。在一些方面，可以将第一核酸分子和第二核酸分子依序引入细胞中。在一些方面，可以将第一核酸分子和第二核酸分子同时引入细胞中。例如，在一些方面，第一核酸分子和第二核酸分子可以同时但作为单独的组合物引入细胞中。在一些方面，第一核酸分子和第二核酸分子可以是单个多核苷酸的一部分，并且细胞被修饰以包含单个多核苷酸。

编码Cas9核酸酶的核酸可以是RNA(例如，信使RNA(mRNA))或DNA。在一些方面，gRNA可以以RNA的形式提供。在一些方面，gRNA可以以编码RNA的DNA的形式提供。在一些方面，gRNA可以以单独的crRNA和tracrRNA分子的形式或分别编码crRNA和tracrRNA的单独的DNA分子的形式提供。

在一些方面，gRNA包含第三种核酸序列，其编码成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)。在一些方面，Cas蛋白是I型Cas蛋白。在一些方面，Cas蛋白是II型Cas蛋白。在一些方面，II型Cas蛋白是Cas9。在一些方面，II型Cas(例如，Cas9)是人密码子优化的Cas。

在一些方面，Cas蛋白是“缺口酶”，其可以在靶核酸序列中产生单链断裂(即，“缺口”)而不切割双链DNA(dsDNA)的两条链。例如，Cas9包含两个核酸酶结构域：RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域，它们负责裂解相对的DNA链。这两个结构域中的任何一个的突变可产生切口酶。产生切口酶的突变的实例可见于例如WO/2013/176772A1和WO/2013/142578A1中，其中的每一个通过引用并入本文。

在一些方面，对dsDNA的每条链上的靶位点具有特异性的两种单独的Cas蛋白(例如，切口酶)可以产生与另一核酸上的突出序列互补的突出序列，或同一核酸上的单独区域。通过使核酸与对dsDNA两条链上的靶位点具有特异性的两种切口酶接触而产生的突出末端可以是5’或3’突出末端。例如，第一切口酶可以在dsDNA的第一条链上产生单链断裂，而第二切口酶可以在dsDNA的第二条链上产生单链断裂，使得产生突出序列。可以选择产生单链断裂的每个切口酶的靶位点，使得产生的突出末端序列与不同核酸分子上的突出末端序列互补。两种不同核酸分子的互补突出末端可以通过本文公开的方法退火。在一些方面，第一条链上的切口酶的靶位点不同于第二条链上的切口酶的靶位点。

在一些方面，通过使细胞与例如对NR4A3基因具有特异性的CRISPR(例如，CRISPR-Cas9系统)接触来降低NR4A3基因及其编码的NR4A3蛋白的表达。在一些方面，CRISPR对NR4A1基因具有特异性。因此，在一些方面，在与CRISPR接触后，细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)具有：(i)降低水平的NR4A1基因和/或蛋白质，(ii)内源水平的NR4A2基因和/或蛋白质，和(iii)内源水平的NR4A3基因和/或蛋白质。在一些方面，CRISPR对NR4A2基因具有特异性。因此，在一些方面，在与CRISPR接触后，细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)具有：(i)内源水平的NR4A1基因和/或蛋白质，(ii)降低水平的NR4A2基因和/或蛋白质，和(iii)内源水平的NR4A3基因和/或蛋白质。在一些方面，CRISPR对NR4A3基因具有特异性。因此，在一些方面，在与CRISPR接触后，细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)具有：(i)内源水平的NR4A1基因和/或蛋白质，(ii)内源水平的NR4A2基因和/或蛋白质，和(iii)降低水平的NR4A3基因和/或蛋白质。

如本文所述，在一些方面，CRISPR靶向多个NR4A基因。例如，在一些方面，CRISPR能够靶向NR4A1基因和NR4A2基因。因此，在一些方面，在与CRISPR接触后，细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)具有：(i)降低水平的NR4A1基因和/或蛋白质，(ii)降低水平的NR4A2基因和/或蛋白质，和(iii)内源水平的NR4A3基因和/或蛋白质。在一些方面，CRISPR能够靶向NR4A1基因和NR4A3基因。因此，在一些方面，在与CRISPR接触后，细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)具有：(i)降低水平的NR4A1基因和/或蛋白质，(ii)NR4A2基因和/或蛋白质的内源表达，和(iii)降低水平的NR4A3基因和/或蛋白质。在一些方面，CRISPR能够靶向NR4A2基因和/或NR4A3基因。在一些方面，在与CRISPR接触后，细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)具有：(i)内源水平的NR4A1基因和/或蛋白质，(ii)降低水平的NR4A2基因和/或蛋白质，和(iii)降低水平的NR4A3基因和/或蛋白质。在一些方面，CRISPR能够靶向NR4A1基因、NR4A2基因和NR4A3基因。因此，在一些方面，在与CRISPR接触后，细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)具有：(i)降低水平的NR4A1基因和/或蛋白质，(ii)降低水平的NR4A2基因和/或蛋白质，和(iii)降低水平的NR4A3基因和/或蛋白质。

在一些方面，相对于在参考细胞(例如，未经历使用CRISPR的基因编辑的对应细胞)中观察到的NR4A3基因水平，使用CRISPR的基因编辑将NR4A3基因水平降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。在一些方面，NR4A3基因水平可以使用本领域已知的任何技术，例如通过数字液滴PCR来测量。

在一些方面，本文公开的编码gRNA和/或Cas9的核酸是RNA或DNA。在另一方面，本文公开的编码gRNA和/或Cas9的RNA或DNA分别是合成RNA或合成DNA。在一些方面，合成RNA或DNA包含至少一种非天然核碱基。在一些方面，某一类的所有核苷碱基已被非天然核苷碱基替换(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷均可被非天然核苷碱基(例如，5-甲氧基尿苷或假尿苷)替换)。在一些方面，多核苷酸(例如，合成RNA或合成DNA)仅包含天然核碱基，即在合成DNA的情况下包含A、C、T和U，或在合成RNA或合成DNA的情况下包含A、C、T和U。

一般而言，本文公开的CRISPR基因编辑方法包括使细胞(例如，免疫细胞)与以下在体内、体外或离体接触：

(i)Cas9或编码Cas9的核酸；以及

(ii)至少一种NR4A3基因指导RNA(gRNA)或编码gRNA的核酸，

其中gRNA靶向NR4A3基因中的序列(例如，内含子和/或外显子序列)，其中使细胞与Cas9和至少一种gRNA接触导致NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达降低。

在一些方面，可用于降低细胞(例如，免疫细胞)的NR4A3基因水平的gRNA包含表B和C中提供的任何gRNA。例如，在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:30、52-57、58、61、65、67、68、70、71、75、76、82、83、86、94和96所示序列中的任何一个或多个序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:30所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:30所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:30所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:30所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:52所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:52所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:52所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:52所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:53所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:53所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:53所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:53所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:54所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:54所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:54所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:54所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:55所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:55所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:55所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:55所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:53所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:56所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:56所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:56所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:57所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:57所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:57所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:57所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:58所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:58所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:58所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:58所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:59所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:59所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:59所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:59所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:60所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:60所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:60所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:60所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:61所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:61所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:61所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:61所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:62所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:62所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:62所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:62所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:63所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:63所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:63所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:63所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:64所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:64所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:64所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:64所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:65所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:65所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:65所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:65所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:66所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:66所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:66所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:66所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:67所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:67所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:67所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:67所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:68所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:68所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:68所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:68所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:69所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:69所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:69所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:69所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:70所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:70所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:70所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:70所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:71所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:71所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:71所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:71所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:72所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:72所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:72所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:72所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:73所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:73所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:73所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:73所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:74所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:74所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:74所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:74所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:75所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:75所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:75所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:75所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:76所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:76所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:76所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:76所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:77所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:77所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:77所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:77所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:78所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:78所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:78所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:78所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:79所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:79所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:79所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:79所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:80所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:80所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:80所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:80所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:81所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:81所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:81所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:81所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:82所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:82所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:82所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:82所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:83所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:83所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:83所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:83所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:84所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:84所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:84所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:84所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:85所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:85所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:85所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:85所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:86所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:86所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:86所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:86所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:87所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:87所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:87所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:87所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:88所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:88所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:88所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:88所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:89所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:89所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:89所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:89所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:90所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:90所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:90所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:90所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:91所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:91所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:91所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:91所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:92所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:92所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:92所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:92所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:93所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:93所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:93所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:93所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:94所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:94所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:94所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:94所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:95所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:95所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:95所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:95所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:96所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:96所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:96所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:96所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:97所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:97所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:97所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:97所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:98所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:98所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:98所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:98所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ IDNO:99所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA包含SEQ ID NO:99所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA由SEQ ID NO:99所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A3基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:99所示的序列组成。

如本文所述，在一些方面，基因编辑方法还可包括降低以下的水平：(i)NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(ii)NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iii)(i)和(ii)两者。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA包含SEQ ID NO:25所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA包含SEQ ID NO:25所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA由SEQ ID NO:25所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:25所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA包含SEQ ID NO:26所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA包含SEQ ID NO:26所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA由SEQ ID NO:26所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:26所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A2基因的gRNA包含SEQ ID NO:27所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A2基因的gRNA包含SEQ ID NO:27所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA由SEQ ID NO:27所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:27所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A2基因的gRNA包含SEQ ID NO:28所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A2基因的gRNA包含SEQ ID NO:28所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA由SEQ ID NO:28所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:28所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A2基因的gRNA包含SEQ ID NO:29所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于靶向NR4A2基因的gRNA包含SEQ ID NO:29所示的序列。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA由SEQ ID NO:29所示的序列组成。在一些方面，可用于靶向NR4A1基因的gRNA基本上由SEQ ID NO:29所示的序列组成。

如本文所用，术语“接触”(例如，使细胞(例如免疫细胞)与至少一种gRNA和至少一种Cas9接触)旨在包括在体外将细胞中的至少一种gRNA和至少一种Cas蛋白(例如Cas9)一起孵育(例如，向培养的细胞中添加gRNA和/或Cas蛋白，或编码gRNA和/或Cas9蛋白的核酸)或体内或离体接触细胞。

使NR4A3基因靶序列与如本文公开的至少一种gRNA和至少一种Cas蛋白(例如，Cas9)(或至少一种编码它们的核酸)接触的步骤可以以任何合适的方式进行。例如，可以在细胞培养条件下处理细胞(例如，免疫细胞)。应当理解，与本文公开的至少一种gRNA和至少一种Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)(或至少一种编码它们的核酸)接触的细胞也可以同时或随后与另一种试剂(例如，包含至少一种编码CAR或TCR的核酸序列的载体)接触。在一些方面，在体外或离体接触细胞后，所述方法还包括将细胞引入受试者中，从而治疗或改善疾病或疾患(例如，癌症)的症状。

对于离体方法，细胞可以包括自体细胞，即取自需要改变一个或多个细胞(即供体和受体是同一个体)中靶多核苷酸序列(例如，NR4A3基因)的受试者的一个或多个免疫细胞。自体细胞的优点是避免任何基于免疫的细胞排斥。可替代地，细胞可以是异源的，例如取自供体的。通常，当细胞来自供体时，它们将来自与受体在免疫上充分相容的供体，即不会受到移植排斥，以减少或消除对免疫抑制的需要。在一些方面，细胞取自异种来源，即已被基因工程化为与受体或受体物种在免疫上充分相容的非人哺乳动物。用于确定免疫相容性的方法是本领域已知的，并且包括组织分型以评估HLA和ABO决定簇的供体-受体相容性。参见例如，Transplantation Immunology,Bach和Auchincloss,编(Wiley,John&Sons,1994年并入)。

在一些方面，本公开提供了产生经修饰的免疫细胞的方法，其包括通过使细胞中的NR4A3基因序列与Cas9蛋白(或编码这种Cas9蛋白的核酸)和一种靶向NR4A3基因中的基序(例如基序，其中gRNA将Cas9蛋白导向靶基因并与靶基序杂交，其中NR4A3基因被部分或全部切割，并且其中裂解效率为约10％至约100％)的gRNA接触来离体改变细胞(例如，免疫细胞(例如T细胞))中的NR4A3基因序列。本文提供了此类gRNA的非限制性实例(参见例如，表A、C和D)。如本文所述，在一些方面，本文所述的产生经修饰的免疫细胞的方法包括通过使细胞与编码Cas9蛋白的第一核酸分子和包含靶向NR4A基因家族的一个或多个成员的gRNA的第二核酸分子接触来改变NR4A基因序列。在一些方面，第一和核酸分子依序与细胞接触。在一些方面，第一和核酸分子同时与细胞接触。例如，在一些方面，使细胞与包含编码Cas9蛋白的第一核酸分子和包含gRNA的第二核酸分子的单个多核苷酸接触。

在一些方面，在上述改变步骤之前、之后或同时，细胞已经用编码CAR或TCR的核酸(例如，载体)修饰(例如，转染)。

在一些方面，裂解效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

本公开的CRISPR/Cas系统可以使用不同长度的gRNA间隔序列，这取决于所用的Cas，例如Cas9。来自不同物种的Cas9必须与其对应的gRNA配对以形成功能性核糖核蛋白(RNP)复合物，换句话说，由于间隔序列和嵌合框架序列的差异，从不同细菌物种工程化的嵌合gRNA框架可以具有不同的长度。

在一些方面，gRNA间隔序列可以是至少18个核苷酸(例如，18个、19个、20个、21个或22个核苷酸)长。例如，gRNA中与化脓性链球菌Cas9结合的化脓性链球菌gRNA间隔序列的长度是20个核苷酸，而gRNA中与金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9结合的金黄色葡萄球菌gRNA间隔序列的长度是21个核苷酸。在一些方面，gRNA间隔序列可以包含10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个核苷酸。在具体的方面，gRNA包含由18个至22个连续核苷酸(例如，20个)组成的间隔序列，对应于NR4A3基因的外显子3的子序列。在一些方面，gRNA包含由18个至22个连续核苷酸(例如，20个)组成的间隔序列，对应于NR4A3基因的外显子4的子序列。在一些方面，gRNA包含由18个至22个连续核苷酸(例如，20个)组成的间隔序列，对应于NR4A3基因的外显子3或外显子4的子序列。

尽管gRNA间隔序列与其在NR4A3基因上结合的DNA链之间的完美匹配是优选的，但是gRNA间隔序列与NR4A3靶序列之间的错配也是允许的，只要其仍然导致NR4A3基因水平的降低或NR4A3基因功能的降低。与靶NR4A3序列完全互补的gRNA上的8-12个连续核苷酸的“种子”序列对于正确识别NR4A3基因上的靶序列是优选的。gRNA间隔序列的剩余部分可以包含一个或多个错配。

一般来说，gRNA活性与错配数量呈负相关。优选地，本公开的gRNA间隔序列包含少于7个错配。在一些方面，gRNA间隔序列包含与对应NR4A3基因靶序列的7个错配、6个错配、5个错配、4个错配、3个错配，更优选2个错配或更少，甚至更优选没有错配。gRNA中核苷酸的数量越少，容许的错配数量就越少。结合亲和力被认为取决于匹配的gRNA-DNA组合的总和。

可以选择本公开的gRNA间隔序列以最小化CRISPR/Cas编辑系统的脱靶效应。因此，在一些方面，选择gRNA间隔序列，使得当与细胞中所有其他基因组核苷酸序列相比时，其含有至少两个错配。在一些方面，选择gRNA间隔序列，使得当与细胞中所有其他基因组核苷酸序列相比时，其含有至少一个错配。本领域技术人员将会理解，可以使用多种技术来选择合适的gRNA间隔序列，以最小化脱靶效应(例如，生物信息学分析)。

在一些方面，gRNA间隔序列包含SEQ ID NO:31-42的间隔序列、由其组成或基本上由其组成。

在一些方面，gRNA间隔序列包含间隔序列、由其组成或基本上由其组成，与SEQ IDNO:31-42中的任一个的DNA序列相比，所述间隔序列包含至少一个、两个、三个、四个或五个核苷酸错配。

在一些方面，可以通过靶向多个位置来增加编辑效率。因此，在一些方面，本文公开的方法包括使用一个靶向NR4A3基因的外显子1上游位置的gRNA。在一些方面，本文公开的方法包括使用2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个靶向NR4A3基因的外显子1上游位置的gRNA。此外，在一些方面，本文公开的方法包括使用一个靶向NR4A3基因的外显子4下游位置的gRNA。在一些方面，本文公开的方法包括使用2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个靶向NR4A3基因的外显子4下游位置的gRNA。

在一些方面，两个gRNA与NR4A3基因的相同链上的序列互补和/或杂交。在一些方面，两个gRNA与NR4A3基因的相对链上的序列互补和/或杂交。在一些方面，两个gRNA与NR4A3基因的相对链上的序列不互补和/或不杂交。在一些方面，两个gRNA与NR4A3基因的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些方面，两个gRNA与NR4A3基因的偏移靶基序互补和/或杂交。

一般而言，本公开的gRNA可包含其序列或化学修饰的任何变体，只要其允许对应Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)与靶序列结合，并且随后切除(全部或部分)NR4A3基因。

本文公开的方法中使用的Cas蛋白(例如，Cas9)是裂解核酸的核酸内切酶并由许多细菌基因组的CRISPR基因座编码并参与II型CRISPR系统。Cas9蛋白由众多细菌物种产生，包括化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)等。因此，可用于本公开的Cas9蛋白可来源于本领域已知的任何合适的细菌。此类细菌的非限制性实例包括化脓性链球菌、变异链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、金黄色链球菌(Streptococcus aureus)、嗜热链球菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、脑膜炎奈瑟氏球菌、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、无害李斯特菌(Listeria innocua)和新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)。本文公开的方法可以用本领域已知的任何Cas9实施。在一些方面，Cas9是野生型Cas9。在一些方面，Cas9是具有增强的酶活性的突变Cas9或包含Cas9部分的融合蛋白。在一些方面，Cas9核酸酶蛋白是化脓性链球菌Cas9蛋白。

因为Cas9核酸酶蛋白通常在细菌中表达，所以当设计和制备Cas9重组蛋白时，为了在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)中最佳表达，修饰它们的核酸序列可能是有利的。因此，在一些方面，本文公开的方法中使用的编码Cas9的核酸已经密码子优化，以便在真核细胞中表达，例如以便在有需要的人受试者的细胞中表达。

在一些方面，本文公开的方法中使用的Cas9蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些方面，一个或多个氨基酸取代包括保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可以防止或减少蛋白水解降解和/或延长多肽在细胞中的半衰期。在一些方面，Cas9蛋白可以包含肽键替换(例如，脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲等)。在一些方面，Cas9蛋白可以包含天然存在的氨基酸。在一些方面，Cas9蛋白可包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些方面，Cas9蛋白可包含修饰以包括异源部分(例如，聚乙二醇化、糖基化、脂质化、乙酰化、封端等)。

尽管本文公开的方法通常使用Cas9蛋白来实施，但是可以预见，在一些方面，Cas蛋白可以是Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7或Cas8。在一些方面，Cas蛋白是来自任何细菌物种或其功能部分的Cas9蛋白。在一些具体方面，本文公开的方法中使用的Cas9蛋白是化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9蛋白或其功能部分，或编码这种Cas9或其功能部分的核酸。可使用的其他Cas核酸酶的非限制性实例是本领域已知的，并描述于例如US 9,970,001 B2、US 10,221,398B2和US2020/0190487 A1中，其中的每一者以引用的方式整体并入本文。在一些方面，可用于本公开的Cas核酸酶包含I型Cas蛋白。I型Cas蛋白的非限制性实例包括Cas3、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3及其变体。在一些方面，可用于本公开的Cas核酸酶包含II型Cas蛋白。II型Cas蛋白的非限制性实例包括Cas9、Csn2、Cas4及其变体。在一些方面，可用于本公开的Cas核酸酶包含III型Cas蛋白。非限制性实例包括Cas10、Csm2、Cmr5、Csx10、Csx11及其变体。在一些方面，可用于本公开的Cas核酸酶包含IV型Cas蛋白。这种Cas蛋白的非限制性实例包括Csf1。在一些方面，可用于本公开的Cas核酸酶包含V型Cas蛋白。非限制性实例包括Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(Cas14、C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、C2c4、C2c8、C2c9及其变体。在一些方面，可用于本公开的Cas核酸酶包含VI型Cas蛋白。VI型Cas蛋白的非限制性实例包括Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d及其变体。

在一些情况下，可用于本公开的Cas蛋白包含上述Cas蛋白的直向同源物或同源物。术语“直向同源物(orthologue)”(本文也称为“直向同源物(ortholog)”)和“同源物(homologue)”(本文也称为“同源物(homolog)”)是本领域众所周知的。通过进一步的指导，本文所用蛋白质的“同源物”是与其同源的蛋白质具有相同或相似功能的同一物种的蛋白质。同源蛋白质可以但不必须是结构相关的，或者只是部分结构相关的。如本文所用，蛋白质的“直向同源物”是不同物种的蛋白质，其执行与其为直向同源物的蛋白质相同或相似的功能。直向同源蛋白质可以但不必须是结构相关的，或者只是部分结构相关的。

如本文所用，“功能部分”是指肽的一部分，例如Cas9，其保留了与至少一个gRNA复合并裂解靶序列的能力，导致NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达降低。在一些方面，功能部分包含可操作连接的Cas9蛋白质功能结构域的组合，所述功能结构域选自由以下组成的组：DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域。在一些方面，功能结构域形成非共价复合物。在一些方面，功能结构域形成融合复合物(例如，融合蛋白)。在一些方面，功能结构域是化学连接的(例如，通过一个或多个间隔区或接头)。在一些方面，功能结构域是缀合的。

应当理解，本公开考虑了使NR4A3基因与至少一种gRNA和至少一种Cas蛋白(例如，Cas9)接触的各种方式。在一些方面，外源Cas蛋白(例如，Cas9)可以多肽形式引入细胞中。在一些方面，Cas蛋白(例如，Cas9)可以与细胞穿透多肽或细胞穿透肽缀合或融合。如本文所用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别指促进分子摄入细胞的多肽或肽。细胞穿透多肽可以含有可检测的标记。

在一些方面，Cas蛋白(例如，Cas9)可以与带电蛋白质(例如，携带正电荷、负电荷或全部中性电荷的蛋白质)缀合或融合。这种连接可以是共价的。在一些方面，Cas蛋白(例如，Cas9)可以与带叠加电荷的肽融合，以显著增加Cas蛋白(例如，Cas9)穿透细胞的能力。参见Cronican等人ACS Chem.Biol.5(8):747-52(2010)。在一些方面，Cas蛋白(例如，Cas9)可以与蛋白转导结构域(PTD)融合以促进其进入细胞。示例性的PTD包括但不限于Tat、寡精氨酸和穿透蛋白。因此，在一些具体方面，本文公开的方法可以使用Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)来实施，所述Cas蛋白包括与细胞穿透肽融合的Cas蛋白、与PTD融合的Cas蛋白、与tat结构域融合的Cas蛋白、与寡精氨酸结构域融合的Cas蛋白、与穿透蛋白结构域融合的Cas蛋白或它们的组合。

在一些方面，Cas蛋白(例如，Cas9)可以以编码Cas蛋白(例如，Cas9)的核酸的形式引入细胞中，所述细胞例如本文公开的免疫细胞，例如表达CAR或TCR的免疫细胞，其含有靶多核苷酸序列，即NR4A3基因。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体的转导或感染。在一些方面，核酸包含DNA。在一些方面，核酸包含如本文所述的经修饰的DNA。在一些方面，核酸包含mRNA。在一些方面，核酸包含如本文所述的经修饰的mRNA(例如，合成的经修饰的mRNA)。

本文公开的方法中使用的gRNA序列和/或编码Cas9的核酸序列可以被化学修饰以增强例如它们的稳定性(例如，以增加它们在施用给有需要的受试者后的血浆半衰期)。本文公开的gRNA和/或编码例如Cas9的核酸序列的可能的化学修饰将在本说明书下文中详细讨论。

在一些方面，整个gRNA被化学修饰。在一些方面，只有gRNA间隔区被化学修饰。在一些方面，gRNA间隔区和gRNA框架序列被化学修饰。具体化学修饰的非限制性实例在下面详细公开。

因此，在本文公开的方法的一些方面，通过来自一个或多个编码其的递送载体的表达，将Cas蛋白(例如，Cas9)和一个或多个gRNA提供给靶细胞。在一些方面，上述载体或用于在靶细胞中引入gRNA或gRNA和Cas9的载体是病毒载体。在一些方面，上述载体或用于在靶细胞中引入gRNA或gRNA和Cas9的载体是非病毒载体。在一些方面，病毒载体是腺相关载体(AAV)、慢病毒载体(LV)、逆转录病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体或它们的组合。AAV载体可以基于几种衣壳类型中的一种或多种，包括AAVI、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9。在一些方面，AAV载体是AAVDJ-8、AAV2DJ9或它们的组合。

除了上面公开的方法以外，本公开还提供了实施所公开的方法的组合物。因此，本公开提供了编码至少一种上述gRNA的核酸。

还提供了一种组合物和/或至少一种Cas9。在一些方面，编码Cas9的核酸编码(i)来自金黄色葡萄球菌的Cas9，(ii)来自化脓性链球菌的Cas9，(iii)衍生自来自金黄色葡萄球菌的Cas9或来自化脓性链球菌的Cas9的突变体Cas9，其中突变体蛋白保留了Cas9活性，(iv)包含Cas9部分的融合蛋白，或(v)它们的组合。

在一些方面，一种或多种基因编辑工具(例如，本文公开的工具)可用于修饰本公开的细胞。

V.A.2.TALEN

在一些方面，可用于编辑(例如，降低或抑制)NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的基因编辑工具是核酸酶试剂，诸如转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。TAL效应物核酸酶是一类序列特异性核酸酶，其可用于在原核或真核生物的基因组中的特定靶序列处产生双链断裂。通过将天然或工程化的转录活化因子样(TAL)效应物或其功能部分与核酸内切酶(诸如例如FokI)融合的催化结构域来产生TAL效应物核酸酶。

独特的模块化TAL效应物DNA结合结构域允许设计具有潜在的任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此，TAL效应物核酸酶的DNA结合结构域可以被工程化以识别特定的DNA靶位点，从而用于在所需的靶序列上产生双链断裂。参见WO 2010/079430；Morbitzer等人,(2010)PNAS10.1073/pnas.1013133107；Scholze&Boch(2010)Virulence 1:428-432；Christian等人,Genetics(2010)186:757-761；Li等人,(2010)Nuc.Acids Res.(2010)数位物件识别码：10.1093/nar/gkq704；和Miller等人,(2011)Nature Biotechnology29:143-148；所有都以引用的方式整体并入本文。

合适的TAL核酸酶的非限制性实例和用于制备合适的TAL核酸酶的方法公开于例如美国专利申请第2011/0239315A1号、第2011/0269234A1号、第2011/0145940A1号、第2003/0232410A1号、第2005/0208489A1号、第2005/0026157A1号、第2005/0064474A1号、第2006/0188987A1号和第2006/0063231A1号中(每个通过引用并入本文)。

在各个方面，TAL效应物核酸酶被工程化，其在例如感兴趣的基因组基因座中的靶核酸序列中或其附近切割，其中靶核酸序列在将被靶向载体修饰的序列处或其附近。适用于本文提供的各种方法和组合物的TAL核酸酶包括那些被特别设计来结合待由本文所述的靶向载体修饰的靶核酸序列或其附近的酶。

在一些方面，TALEN的每个单体包含12-25个TAL重复，其中每个TAL重复结合1bp亚位点。在一些方面，核酸酶试剂是嵌合蛋白，其包含与独立核酸酶可操作连接的基于TAL重复的DNA结合结构域。在一些方面，独立核酸酶是FokI核酸内切酶。在一些方面，核酸酶试剂包含第一个基于TAL重复的DNA结合结构域和第二个基于TAL重复的DNA结合结构域，其中第一个基于TAL重复的DNA结合结构域和第二个基于TAL重复的DNA结合结构域中的每一个都与FokI核酸酶可操作地连接，其中第一个基于TAL重复的DNA结合结构域和第二个基于TAL重复的DNA结合结构域识别靶DNA序列的每条链中由约6bp至约40bp裂解位点分开的两个连续的靶DNA序列，并且其中FokI核酸酶二聚化并在靶序列处产生双链断裂。

在一些方面，核酸酶试剂包含第一个基于TAL重复的DNA结合结构域和第二个基于TAL重复的DNA结合结构域，其中第一个基于TAL重复的DNA结合结构域和第二个基于TAL重复的DNA结合结构域中的每一个都与FokI核酸酶可操作地连接，其中第一个基于TAL重复的DNA结合结构域和第二个基于TAL重复的DNA结合结构域识别靶DNA序列的每条链中由5bp或6bp裂解位点分开的两个连续的靶DNA序列，并且其中FokI核酸酶二聚化并产生双链断裂。

V.A.3.锌指核酸酶(ZFN)

在一些方面，用于本公开的基因编辑工具包括核酸酶试剂，诸如锌指核酸酶(ZFN)系统。基于锌指的系统包含融合蛋白，所述融合蛋白包含两个蛋白结构域：锌指DNA结合结构域和酶结构域。“锌指DNA结合结构域”、“锌指蛋白”或ZFP是一种蛋白质或较大蛋白质内的结构域，其通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA，锌指是结合结构域内其结构通过锌离子的配位而稳定的氨基酸序列区域。通过与靶DNA序列(例如，NR4A3)结合，锌指结构域将酶结构域的活性导向序列附近，并且因此诱导靶序列附近的内源靶基因的修饰。锌指结构域可以被工程化以结合几乎任何期望的序列。如本文所公开，在一些方面，锌指结构域结合编码NR4A3蛋白的DNA序列。因此，在鉴定了含有期望裂解或重组的靶DNA序列的靶基因座(例如，表1中引用的靶基因中的靶基因座)后，可以将一个或多个锌指结合结构域工程化以结合靶基因座中的一个或多个靶DNA序列。包含锌指结合结构域和酶结构域的融合蛋白在细胞中的表达影响靶基因座的修饰。

在一些方面，锌指结合结构域包含一个或多个锌指。Miller等人,(1985)EMBOJ.4:1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American February:56-65；美国专利第6,453,242号。通常，单个锌指结构域的长度约为30个氨基酸。单个锌指与三核苷酸(即，三联体)序列结合(或可通过一个核苷酸与相邻锌指的四核苷酸结合位点重叠的四核苷酸序列)。因此，锌指结合结构域被工程化以结合的序列的长度(例如，靶序列)将决定工程化锌指结合结构域中锌指的数量。例如，对于指基序不与重叠亚位点结合的ZFP，六核苷酸靶序列被两指结合结构域结合；九核苷酸靶序列被三指结合结构域结合，等等。靶位点中单个锌指(即，亚位点)的结合位点不必是连续的，而是可以被一个或几个核苷酸分开，这取决于多指结合结构域中锌指(即，指间接头)之间的氨基酸序列的长度和性质。在一些方面，单个ZFN的DNA结合结构域包含三个至六个单个锌指重复序列，并且各自可识别9个至18个碱基对。

锌指结合结构域可以被工程化以结合选择的序列。参见例如，Beerli等人,(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人,(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人,(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人,(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人,(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化的锌指结合结构域可具有新颖的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。

通过锌指结构域结合的靶DNA序列的选择可以例如根据美国专利第6,453,242号中公开的方法来完成。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，核苷酸序列的简单目测也可用于选择靶DNA序列。因此，在本文描述的方法中可以使用任何用于靶DNA序列选择的手段。靶位点通常具有至少9个核苷酸的长度，并且因此被包含至少三个锌指的锌指结合结构域结合。然而，例如4指结合结构域与12个核苷酸的靶位点、5指结合结构域与15个核苷酸的靶位点或6指结合结构域与18个核苷酸的靶位点的结合也是可能的。显而易见的是，更大的结合结构域(例如，7指、8指、9指和更多指)与更长的靶位点的结合也是可能的。

锌指融合蛋白的酶结构域部分可以从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可从中得到酶结构域的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如，2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,Mass.；和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。裂解DNA的其他酶是已知的(例如，51核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；也可参见Linn等人,(编)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。一种或多种这些酶(或其功能片段)可用作裂解结构域的来源。

适于用作本文所述的ZFP的酶结构域的示例性限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够序列特异性结合DNA(在识别位点处)并在结合位点或其附近裂解DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在从识别位点去除的位点处裂解DNA，并具有可分开的结合结构域和裂解结构域。例如，IIS型酶FokI催化DNA的双链裂解，在一条链上距其识别位点9个核苷酸处，在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处。参见例如，美国专利第5,356,802号、第5,436,150号和第5,487,994号；以及Li等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人,(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人,(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一些方面，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的酶结构域和一个或多个锌指结合结构域。

示例性的IIS型限制酶是FokI，其的裂解结构域可与结合结构域分离。这种特定的酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。因此，对于使用锌指-FokI融合的靶向双链DNA裂解，两种融合蛋白(各自包含一个FokI酶结构域)可用于重建催化活性裂解结构域。可替代地，也可以使用含有锌指结合结构域和两个FokI酶结构域的单个多肽分子。包含FokI酶结构域的示例性ZFP描述于美国专利第9,782,437号中。

V.A.3.大范围核酸酶

在一些方面，用于调节细胞中NR4A3表达的基因编辑工具包括核酸酶试剂，诸如大范围核酸酶系统。基于保守的序列基序，大范围核酸酶被分为四个家族，即“LAGLIDADG”、“GIY-YIG”、“H-N-H”和“His-Cys box”家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。

导航核酸内切酶(HEases)以其长的识别位点和容许其DNA底物中的一些序列多态性而闻名。大范围核酸酶结构域、结构和功能是已知的，参见，例如，Guhan和Muniyappa(2003)Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248；Lucas等人,(2001)Nucleic Acids Res29:960-9；Jurica和Stoddard,(1999)Cell Mol Life Sci 55:1304-26；Stoddard,(2006)QRev Biophys 38:49-95；和Moure等人,(2002)Nat Struct Biol 9:764。

在一些实例中，使用天然存在的变体和/或工程化的衍生物大范围核酸酶。修饰动力学、辅因子相互作用、表达、最佳条件和/或识别位点特异性以及筛选活性的方法是已知的，参见例如，Epinat等人,(2003)Nucleic Acids Res 31:2952-62；Chevalier等人,(2002)Mol Cell10:895-905；Gimble等人,(2003)Mol Biol 334:993-1008；Seligman等人,(2002)Nucleic Acids Res 30:3870-9；Sussman等人,(2004)J Mol Biol 342:31-41；Rosen等人,(2006)Nucleic Acids Res 34:4791-800；Chames等人,(2005)Nucleic AcidsRes 33:e178；Smith等人,(2006)Nucleic Acids Res 34:e149；Gruen等人,(2002)NucleicAcids Res30:e29；Chen和Zhao,(2005)Nucleic Acids Res 33:e154；WO2005105989；WO2003078619；WO2006097854；WO2006097853；WO2006097784；和WO2004031346；其中的每一者以引用的方式整体并入本文。

本文可使用任何大范围核酸酶，包括但不限于I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SecVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NcIIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII或它们的任何活性变体或片段。

在一些方面，大范围核酸酶识别12个至40个碱基对的双链DNA序列。在一些方面，大范围核酸酶识别基因组中一个完全匹配的靶序列。在一些方面，大范围核酸酶是归巢核酸酶。在一些方面，归巢核酸酶是归巢核酸酶的“LAGLIDADG”家族。在一些方面，归巢核酸酶的“LAGLIDADG”家族选自I-SceI、I-CreI、I-Dmol或它们的组合。

V.A.4.限制性核酸内切酶

在一些方面，用于本公开的基因编辑工具包括核酸酶试剂，诸如限制性核酸内切酶，其包括I型、II型、III型和IV型核酸内切酶。I型和III型限制性核酸内切酶识别特定的识别位点，但通常在核酸酶结合位点的可变位置处进行裂解，所述位点可能距离裂解位点(识别位点)数百个碱基对。在II型系统中，限制活性不依赖于任何甲基化酶活性，并且裂解通常发生在结合位点内或附近的特定位点处。大多数II型酶切割回文序列，然而IIa型酶识别非回文识别位点并在识别位点之外裂解，IIb型酶切割序列两次，其中两个位点都在识别位点之外，并且IIs型酶识别不对称识别位点并在一侧和距识别位点约1-20个核苷酸的确定距离处裂解。IV型限制酶靶向甲基化的DNA。限制酶例如在REBASE数据库被进一步描述和分类(webpage at rebase.neb.com；Roberts等人,(2003)Nucleic Acids Res 31:418-20)，Roberts等人,(2003)Nucleic Acids Res 31:1805-12，和Belfort等人,(2002),Mobile DNA II,第761-783页,编者Craigie等人,(ASM Press,Washington,D.C.)。

如本文所述，在一些方面，基因编辑工具(例如，CRISPR、TALEN、大范围核酸酶、限制性核酸内切酶、RNAi、反义寡核苷酸)可以通过本领域已知的任何方式引入细胞中。在一些方面，编码特定基因编辑工具的多肽可以直接引入细胞中。可替代地，可将编码基因编辑工具的多核苷酸引入细胞中。在一些方面，当编码基因编辑工具的多核苷酸被引入细胞中时，基因编辑工具可以在细胞内瞬时、有条件或组成型表达。因此，编码基因编辑工具的多核苷酸可以包含在表达盒中，并且可操作地连接到条件启动子、诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。可替代地，基因编辑工具作为编码或包含基因编辑工具的mRNA被引入细胞中。

还提供了核酸酶试剂的活性变体和片段(即，工程化核酸酶试剂)。这种活性变体可包含与天然核酸酶试剂至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中活性变体保留在所需识别位点切割的能力，并且因此保留缺口或双链断裂诱导活性。例如，本文所述的任何核酸酶试剂可以从天然核酸内切酶序列进行修饰，并且设计成识别和诱导天然核酸酶试剂不识别的识别位点上的缺口或双链断裂。因此，在一些方面，工程化核酸酶具有在不同于对应天然核酸酶试剂识别位点的识别位点处诱导缺口或双链断裂的特异性。缺口或双链断裂诱导活性的测定是已知的，并且通常测量核酸内切酶对含有识别位点的DNA底物的总体活性和特异性。

当通过引入编码核酸酶试剂的多核苷酸向细胞提供核酸酶试剂时，与编码核酸酶试剂的天然存在的多核苷酸序列相比，编码核酸酶试剂的这种多核苷酸可以被修饰以取代在感兴趣的细胞中具有更高使用频率的密码子。例如，编码核酸酶试剂的多核苷酸可以被修饰以取代在给定的感兴趣细胞中具有较高使用频率的密码子。

V.A.5.干扰RNA(RNAi)

在一些方面，可用于减少细胞中NR4A3的表达的基因编辑工具包括RNA干扰分子(“RNAi”)。如本文所用，RNAi是RNA多核苷酸，其通过内源基因沉默途径(例如，Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC))降解靶mRNA来介导内源靶基因产物表达的降低。RNAi试剂的非限制性实例包括微RNA(本文也称为“miRNA”)、短发夹状RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、RNA适体或它们的组合。

在一些方面，用于本公开的基因编辑工具包含一种或多种miRNA。“miRNA”指天然存在的、长度约为21-25个核苷酸的非编码小RNA分子。在一些方面，用于本公开的miRNA至少部分与NR4A3mRNA分子互补。miRNA可以通过翻译阻遏、mRNA裂解和/或去腺苷化来下调(例如，降低)内源靶基因产物(即，NR4A3蛋白)的表达。

在一些方面，可用于本公开的基因编辑工具包括一个或多个shRNA。“shRNA”(或“短发夹RNA”分子)是指包含双链区和在一端形成发夹环的环区的RNA序列，其可用于减少和/或沉默基因表达。在茎的每一侧，双链区的长度通常为约19个核苷酸至约29个核苷酸，并且环区的长度通常为约三个至约十个核苷酸(并且3′末端或5’末端单链突出核苷酸是任选的)。shRNA可被克隆到质粒或非复制型重组病毒载体中以被引入细胞内，并且导致编码shRNA的序列整合到基因组中。因此，shRNA可以提供内源靶基因(即，NR4A3)翻译和表达的稳定和一致的抑制。

在一些方面，本文公开的基因编辑工具包含一种或多种siRNA。“siRNA”是指长度通常约为21-23个核苷酸的双链RNA分子。siRNA与称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物结合，在此期间，“乘客(passenger)”有义链被酶裂解。由于序列同源性，包含在活化RISC中的反义“指导”链随后将RISC引导至对应的mRNA，并且相同的核酸酶切割靶mRNA(即，NR4A3 mRNA)，导致特异性基因沉默。在一些方面，siRNA的长度为18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个核苷酸，并且在其3’末端具有2个碱基的突出端。siRNA可被引入单个细胞和/或培养系统，并且导致靶mRNA序列(即，NR4A3 mRNA)的降解。siRNA和shRNA进一步描述于Fire等人,Nature 391:19,1998和美国专利第7,732,417号；第8,202,846号；和第8,383,599号中；其中的每一者以引用的方式整体并入本文。

V.A.6.反义寡核苷酸(ASO)

在一些方面，可用于降低细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的基因编辑工具包括反义寡核苷酸。如本文所用，“反义寡核苷酸”或“ASO”是指能够通过与靶核酸，特别是靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因(即，NR4A3)的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，并且因此不是siRNA或shRNA。

在一些方面，用于本公开的ASO是单链的。应当理解，本公开的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要内或间自身互补的程度小于寡核苷酸全长的大约50％。在一些方面，用于本公开的ASO可以包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2’糖修饰的核苷。可对ASO进行的另外的修饰(例如，诸如可用于抑制或减少NR4A3基因表达的那些)提供于例如美国公开第2019/0275148A1号。

在一些方面，ASO可以通过核酸酶介导的NR4A3转录物(例如，mRNA)的降解来降低NR4A3蛋白的表达，其中ASO能够募集核酸酶，例如RNA酶H，诸如RNA酶H1。RNA酶H是一种普遍存在的酶，其水解RNA/DNA双链体的RNA链。因此，在一些方面，一旦与靶序列(例如，NR4A3mRNA)结合，ASO可以诱导NR4A3 mRNA的降解，从而降低NR4A3蛋白的表达。

如本文所公开，基因编辑工具的上述实例不旨在是限制性的，并且本领域可获得的任何基因编辑工具可用于降低或抑制NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达。此外，如本文所述，当(i)NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(ii)NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iii)(i)和(ii)两者的水平也降低时，在一些方面，也可以使用特异性靶向NR4A1和/或NR4A2基因的任何上述基因编辑工具。

IV.A.7.阻遏物

在一些方面，可用于本公开的基因编辑工具(例如，以降低NR4A1、NR4A2和/或NR4A3基因和/或蛋白质的表达)包含阻遏物。如本文所用，术语“阻遏物”指能够结合以下NR4A反应元件而不活化转录的任何试剂：(i)NGFI-B反应元件(NBRE)，(ii)Nur反应元件(NurRE)，或(iii)(i)和(ii)两者。因此，通过与NBRE和/或NurRE结合，本文所述的阻遏物能够阻遏(或降低或抑制)细胞(例如，表达CAR或TCR的免疫细胞)中一种或多种NR4A家族成员的水平。在一些方面，当细胞与阻遏物接触时，阻遏物与NBRE和/或NurRE的结合降低细胞中NR4A1基因和/或NR4A1蛋白的水平。在一些方面，当细胞与阻遏物接触时，阻遏物与NBRE和/或NurRE的结合降低细胞中NR4A2基因和/或NR4A2蛋白的水平。在一些方面，当细胞与阻遏物接触时，阻遏物与NBRE和/或NurRE的结合降低细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的水平。在一些方面，阻遏物与NBRE和/或NurRE的结合降低(i)NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和(ii)NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者的水平。在一些方面，阻遏物与NBRE和/或NurRE的结合降低(i)NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和(ii)NR4A3基因和/或NR4A3蛋白两者的水平。在一些方面，阻遏物与NBRE和/或NurRE的结合降低(i)NR4A2基因和/或NR4A2蛋白和(ii)NR4A3基因和/或NR4A3蛋白两者的水平。在一些方面，阻遏物与NBRE和/或NurRE的结合降低以下每一种的水平：(i)NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(ii)NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，和(iii)NR4A3基因和/或NR4A3蛋白。能够降低NR4A家族的所有成员水平的阻遏物(即，NR4A1、NR4A2和NR4A3)也被称为“NR4A超阻遏物”参见例如，WO2020237040A1，其以引用的方式整体并入本文。

至少从上述公开内容中显而易见，可用于本公开的阻遏物包含能够结合NBRE和/或NurRE反应元件的DNA结合结构域。在一些方面，这种阻遏物包含另外的结构域。这些另外的结构域的非限制性实例包括：NR4A配体结合结构域、FLAG结构域、Kruppel相关盒(KRAB)结构域、NCOR结构域、T2A结构域、自我裂解结构域、核定位信号、二聚化结构域(例如，diZIP二聚化结构域)、转录阻遏物结构域、染色质压缩结构域、表位标签或它们的任何组合。这些另外的结构域相关的另外的公开内容可见于例如WO2020237040A1中，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，另外的结构域不包含转录活化结构域。

如本文所述，在一些方面，在降低NR4A家族的一个或多个成员的水平时，细胞可以与本文所述的NR4A阻遏蛋白接触。在一些方面，细胞与编码NR4A阻遏物的核酸序列接触。

V.B.减少耗竭或功能障碍的方法

本公开提供了减少、改善或抑制细胞耗竭或功能障碍的方法，其包括修饰细胞以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，同时具有NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达。如本文所述，在一些方面，此类细胞(即，经修饰以具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白)可进一步经修饰以具有降低水平的(i)NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(ii)NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iii)(i)和(ii)两者。

肿瘤细胞逃避宿主免疫反应的各种方式中的一种是通过使肿瘤特异性免疫细胞(例如，T细胞)耗竭。如本文所用，术语“耗竭”，或更具体地“T细胞耗竭”是指T细胞功能的丧失，其可因感染或疾病(例如，癌症)而发生。在本公开中，T细胞耗竭可与“T细胞功能障碍”或“T细胞无能”互换使用。在一些方面，T细胞耗竭与各种免疫检查点抑制分子(例如，PD-1、TIM-3和LAG-3)、凋亡和效应子功能降低(例如，细胞因子产生和细胞毒性分子，诸如穿孔素和颗粒酶的表达)的表达增加有关。因此，术语“减少T细胞耗竭”、“改善T细胞耗竭”、“抑制T细胞耗竭”等是指T细胞功能恢复的状况，其特征在于以下一种或多种：(i)降低的一种或多种免疫检查点抑制分子(例如，PD-1、TIM-3和LAG-3)的表达，(ii)增加的记忆形成和/或记忆标志物(例如，CD45RO、CD62L和/或CCR7)的维持，(iii)防止凋亡，(iv)细胞因子产生(例如，IL-2、IFN-γ和/或TNF-α)增加，(v)增强的杀伤能力，(vi)增加的对具有低表面抗原的肿瘤靶标的识别，(vii)增强的对抗原的增殖反应，和(viii)它们的任何组合。

在一些方面，例如在本文公开的方法中，修饰细胞包含修饰免疫细胞(例如T细胞)以具有对耗竭的抗性或耐受性。因此，在一些方面，本公开涉及通过降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)来减少免疫细胞(例如，T细胞(例如，肿瘤特异性T细胞))中的耗竭的方法。在一些方面，减少免疫细胞(例如，T细胞)耗竭包括逆转已经在免疫细胞(例如，T细胞)中发生的功能障碍(即，使耗竭的T细胞变得不那么耗竭)。在一些方面，减少免疫细胞(例如，T细胞)耗竭包括防止新活化的免疫细胞(例如，T细胞)耗竭。从本公开内容显而易见的是，在一些方面，免疫细胞先前、同时或随后被修饰例如以表达配体结合蛋白(例如，CAR或TCR)。

在一些方面，减少免疫细胞(例如，T细胞)耗竭包括逆转和防止免疫细胞(例如，T细胞)中的耗竭。

免疫细胞(例如，T细胞)的耗竭状态可通过本领域已知的各种方法来确定。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞)的耗竭状态可通过评估免疫细胞(例如，T细胞)对凋亡的抗性来测量。因此，在一些方面，本公开的细胞组合物(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，以及(i)内源水平的NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白，(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iv)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白以及NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者)表现出增加的对凋亡的抗性。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞(例如，免疫细胞，诸如T细胞)的凋亡)相比，本公开的细胞组合物中的对凋亡的抗性增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。在一些方面，增加对凋亡的抗性可以促进T细胞的长期持续或存活。因此，在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)表现出增强的持久性或存活。

在一些方面，本公开的细胞组合物中的持久性或存活增加至少约2倍至约100倍。在某些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物中的持久性或存活增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞)的耗竭状态可以通过评估免疫细胞(例如，T细胞)对免疫检查点分子的抗性来测量。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞(例如，免疫细胞，诸如T细胞)的抗性)相比，对免疫检查点分子的抗性在本公开的细胞组合物中增加至少1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

不受任何理论的束缚，在一些方面，对免疫检查点分子的抗性增加是由于免疫细胞(例如，T细胞)上一种或多种免疫检查点分子的表达降低。因此，在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物表达降低水平的一种或多种免疫检查点分子。在一些方面，与参考细胞相比，免疫检查点分子的表达水平在本公开的细胞组合物中降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。免疫检查点分子的实例是本领域已知的，并且包括但不限于PD-1、TIM-3、LAG-3、BTLA、SIGLEC7、CD200R、TIGIT、VISTA及它们的任何组合。

在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞)的耗竭状态可通过评估免疫细胞(例如，T细胞)在刺激(例如，T细胞受体(TCR)刺激)时产生细胞因子的能力来测量。因此，在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞(例如，免疫细胞，诸如T细胞)中的细胞因子产生)相比，本公开的细胞组合物(即，表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)表现出增加的细胞因子产生。

在一些方面，本公开的细胞组合物中的细胞因子产生增加至少约2倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍或更多倍。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞(例如，免疫细胞，诸如T细胞)中的细胞因子产生)相比，本公开的细胞组合物中的细胞因子产生增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。细胞因子的非限制性实例包括IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、IL-17、IL-22、CCL2、CCL3及它们的任何组合。

在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞)的耗竭状态可通过评估免疫细胞(例如，T细胞)在重复肿瘤攻击后杀伤肿瘤细胞的能力来测量。在一些方面，在两次肿瘤攻击后，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物表现出增加的肿瘤细胞杀伤。在一些方面，在三次肿瘤攻击后，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物表现出增加的肿瘤细胞杀伤。在一些方面，在四次肿瘤攻击后，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物表现出增加的肿瘤细胞杀伤。在一些方面，在五次肿瘤攻击后，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物表现出增加的肿瘤细胞杀伤。在一些方面，杀伤肿瘤细胞包括防止肿瘤细胞向外生长。

在一些方面，在每次肿瘤攻击后，本公开的细胞组合物杀伤肿瘤细胞的能力增加约2倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍或更多倍。在一些方面，与参考(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞(例如，免疫细胞，诸如T细胞)中的肿瘤细胞杀伤)相比，杀伤肿瘤细胞的能力增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

V.C.维持肿瘤微环境中抗肿瘤功能的方法

肿瘤发生(即，肿瘤的产生或形成)是一个复杂和动态的过程，由三个阶段组成：起始、进展和转移。这些阶段中的每一个都受到肿瘤微环境(TME)的严格调控。参见Wang,M.等人,J Cancer 8(5):761-773(2017)。如本文所用，术语“肿瘤微环境”或“TME”是指肿瘤周围的环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、信号传导分子和细胞外基质。如下文进一步所述，肿瘤可通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响微环境，而微环境中的免疫细胞可影响肿瘤细胞的生长和进化。

肿瘤细胞通常以非常高的速度生长，导致肿瘤微环境的血液供应不足。参见Gouirand,V.等人,Front Oncol 8:117(2018)。这导致肿瘤微环境变得缺氧并增加活性氧物质(ROS)的产生。缺氧和ROS可负面影响免疫细胞功能，从而抑制受试者的抗肿瘤免疫反应。

在一些方面，例如在本文公开的方法中，修饰细胞导致在低氧环境中增强免疫细胞(例如，肿瘤特异性T细胞)的抗肿瘤功能，诸如在肿瘤微环境中发现的。如本文所用，术语“抗肿瘤功能”是指免疫细胞(例如，肿瘤特异性T细胞)产生免疫反应的能力，所述免疫反应导致肿瘤细胞的根除和/或控制。抗肿瘤功能的非限制性实例包括细胞因子产生、增殖、减少耗竭、长期存活、细胞毒性(例如，杀伤肿瘤细胞的能力)或它们的组合。

在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物(即，包含具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的细胞，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的抗肿瘤功能在低氧环境中增强(即，增加)。

肿瘤细胞的快速增殖也可导致肿瘤微环境中各种营养物质(例如，葡萄糖)的耗尽。参见Gouirand，同上。如本文所述，营养物(/诸如葡萄糖)对正常免疫细胞功能和发育是必需的。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物的抗肿瘤功能在低营养环境中增强(即，增加)。

如本文所述，肿瘤细胞抑制宿主免疫反应的机制中的一种是通过向肿瘤微环境中释放各种免疫抑制代谢物和/或细胞因子。这种代谢物和/或细胞因子在肿瘤微环境中的积累会抑制免疫细胞的正常功能(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)。这种免疫抑制代谢物和/或细胞因子的非限制性实例包括吲哚胺-2-3-双加氧酶(IDO)、精氨酸酶、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、乳酸脱氢酶(LDH)-A、TGF-β、IL-10、VEGF、活性氧物质(ROS)、腺苷、精氨酸酶、前列腺素E2及它们的组合。

在一些方面，本公开的细胞组合物(即，包含具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的细胞，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的抗肿瘤功能在免疫抑制代谢物和/或细胞因子的存在下增强(即，增加)至少约2倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍或更多倍。在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，抗肿瘤功能增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更多倍。

肿瘤微环境可以抑制抗肿瘤免疫反应的另一种机制是通过免疫抑制细胞，诸如骨髓源性抑制性细胞(MDSC)和调节性T(T_reg)细胞。

如本文所用，术语“髓源性抑制细胞”或“MDSC”是指免疫细胞的异质性群体，其由髓源性、未成熟状态和有效抑制T细胞反应的能力来定义。MDSC在骨髓中产生，并且在携带肿瘤的宿主中，迁移到外周淋巴器官和肿瘤以有助于形成肿瘤微环境。在一些方面，MDSC是单核细胞MDSC(M-MDSC)，其在形态学和表型上类似于单核细胞。在一些方面，MDSC是多形核MDSC(PMN-MDSC)，其在形态学和表型上类似于中性粒细胞。在一些方面，MDSC包括M-MDSC和PMN-MDSC。存在于肿瘤微环境中的MDSC通常表现出较差的吞噬活性，持续产生活性氧物质(ROS)、一氧化氮(NO)和大多数抗炎细胞因子(例如，IL-10和TGF-β)。

如本文所用，术语“调节性T细胞”或“T_reg细胞”是指具有抑制其他T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)的增殖和/或功能的特定T细胞群体。在一些方面，调节性T细胞是CD4⁺调节性T细胞。在一些方面，调节性T细胞是Foxp3⁺。调节性T细胞可以通过不同的接触依赖和独立机制发挥其免疫抑制活性。这种机制的非限制性实例包括：(i)产生抑制性细胞因子(例如，TGF-β、IL-10和IL-35)；(ii)免疫检查点和抑制性受体的表达(例如，CTLA-4、PD-L1、精氨酸酶、LAG-3、TIM-3、ICOS、TIGIT、IDO)；(iii)直接细胞毒性(穿孔素/颗粒酶介导的或FasL介导的)；(iv)效应T细胞活性的代谢破坏(例如，IL-2消耗)；(v)耐受性树突细胞的诱导，这可促进T细胞耗竭；(vi)腺苷生产，以及(vii)它们的任何组合。

在一些方面，与参考细胞(例如，尚未被修饰为表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞，例如免疫细胞，诸如T细胞)相比，本公开的细胞组合物(即，包含具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的经修饰的细胞，单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的抗肿瘤功能在抑制性细胞存在的情况下被增强(即，增加)。在一些方面，抑制性细胞是MDSC。在一些方面，抑制性细胞是T_reg细胞。在一些方面，抑制性细胞包括MDSC和T_reg细胞。

虽然上述公开内容主要是在T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)的情形下提供的，但是本领域技术人员将认识到，上述公开内容也可以应用于其他类型的免疫细胞。因此，在一些方面，本文公开的方法可用于增强对肿瘤治疗有用的任何免疫细胞的活化、减少耗竭/功能障碍或维持其抗肿瘤功能。这种免疫细胞的非限制性实例包括淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或它们的组合。在一些方面，淋巴细胞包括T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞、天然(NK)细胞或它们的组合。在一些方面，淋巴细胞是T细胞，例如CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞。在一些方面，淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些方面，TIL是CD8⁺TIL。在一些方面，TIL是CD4⁺TIL。如本文所述，在一些方面，本公开的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，诸如CAR T细胞或CAR NK细胞。

VI.核酸和载体

本公开还提供了一种或多种核酸分子(例如，多核苷酸)，其包含用于降低细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的表达的基因编辑工具，和/或其编码可在本公开的经修饰的细胞中表达的嵌合抗原受体或T细胞受体(例如，抗ROR1 CAR或抗ROR1TCR)。

如本文所述，本公开的一些方面涉及多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，其包含能够特异性结合NR4A3基因内的靶序列的核苷酸序列(即，靶向NR4A3的多核苷酸)。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，通过与NR4A3基因内的靶序列结合，本公开的多核苷酸能够降低细胞(例如，免疫细胞)中NR4A3基因和/或编码的蛋白质的水平。

如本文所述，本文所述的多核苷酸包含可特异性结合NR4A3基因内的核酸序列的核苷酸序列。这种核苷酸序列在本文中也被称为“结合序列”或“指导序列”或“指导RNA”(gRNA)。因此，如本文所用，术语“指导RNA”(gRNA)没有特别限制，只要它能特异性结合具有NR4A3基因的核酸序列，并且由此降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的水平。此类gRNA的非限制性实例在本公开全文中提供(参见例如，表A-D)。

在一些方面，gRNA的长度可以在约5个与约100个核苷酸之间。在一些方面，本文所述的多核苷酸的gRNA长度为约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或约100个核苷酸。在一些方面，gRNA的长度在约10个与约30个核苷酸之间(例如，约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24个、约25个、约26个、约27个、约28个、约29个或约30个核苷酸)。在一些方面，gRNA的长度约为20个核苷酸。对本公开有用的与gRNA相关的其他公开内容在本申请的其他地方提供(参见例如，第IV.A.1节CRISPR/Cas系统)。

在一些方面，本文描述的多核苷酸的gRNA被设计成与NR4A3基因内的核酸序列(本文也称为“靶序列”)互补或基本上互补。在一些方面，gRNA可掺入摆动或简并碱基以结合多个序列(例如，NR4A3基因内的多个靶序列；或NR4A3基因内的靶序列和NR4A家族的其他成员内的靶序列)。在一些情况下，可以改变gRNA以增加稳定性。例如，可以掺入非天然核苷酸以增加RNA对降解的抗性。在一些方面，可以改变或设计gRNA以避免或减少gRNA中的二级结构形成。在一些方面，可以设计gRNA来优化G-C含量。在一些方面，G-C含量在约40％与约60％之间(例如，约40％、约45％、约50％、约55％、约60％)。在一些方面，gRNA可以包含经修饰的核苷酸，诸如但不限于甲基化或磷酸化的核苷酸。修饰并由此改善本文所述的多核苷酸的一种或多种特性的其他方法是本领域已知的。可添加到本文所述的多核苷酸的此类经修饰的非限制性实例包括：5’帽、3’聚腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、发夹、亚细胞定位序列、检测或标记序列、一种或多种蛋白质的结合位点、非天然核苷酸或它们的组合。参见例如，美国公开第20210123046A1号，其全部内容通过引用并入本文。在本公开的其他地方提供了与此类修饰相关的其他公开内容。

如本文所述，在一些方面，包含基因编辑工具的核酸分子和包含指导RNA的核酸分子可以作为单独的核酸分子(同时或依序)引入细胞中。在一些方面，基因编辑工具和指导RNA可以是单个核酸分子的部分。例如，在一些方面，包含基因编辑工具的核酸分子还包含指导RNA(例如，本文公开的合成指导RNA)。在一些方面，包含基因编辑工具的核酸分子还包含指导RNA(例如，本文公开的合成指导RNA)和编码Cas核酸酶(例如，Cas9核酸酶)的核酸。

本文提供的任何核酸可以以完整细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本纯的形式存在。

当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl显带、柱色谱、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域熟知的方法)从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如，连接至自然界中分离的DNA的染色体DNA)或蛋白质中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈现为大致上纯的”。参见，F.Ausubel等人,编(1987)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在一些方面，核酸是cDNA分子。本文所述的核酸可以使用本领域已知的标准分子生物学技术获得。

在一些方面，本公开提供了包含分离的核酸分子的载体，所述核酸分子包含用于降低细胞中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白)的表达的基因编辑工具，和/或所述核酸分子编码可在本公开的经修饰的细胞中表达的嵌合抗原受体或T细胞受体。

如本文所述，此类载体可用于修饰细胞(例如，表达CAR的细胞)以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)，其中此类经修饰的细胞可用于治疗疾病或病症，诸如癌症。

用于本公开的合适的载体包括表达载体、病毒载体和质粒载体。在一些方面，载体是病毒载体。

如本文所用，术语“载体”和“表达载体”是指任何核酸构建体，其含有插入编码序列转录和翻译的必要元件，或在RNA病毒载体的情况下，当被引入合适的宿主细胞中时，含有复制和翻译的必要元件。表达载体可以包括质粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。

如本文所用，病毒载体包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，诸如莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒、哈维(Harvey)鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳氏(Rous)肉瘤病毒；慢病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；以及RNA病毒，诸如逆转录病毒。人们可以容易地使用本领域熟知的其他载体。某些病毒载体基于非致细胞病变的真核病毒，其中非必需基因已经被感兴趣的基因替换。非致细胞病变病毒包括逆转录病毒，其生命周期包括将基因组病毒RNA逆转录为DNA，随后将原病毒整合到宿主细胞DNA中。

在一些方面，载体来源于腺相关病毒。在一些方面，载体来源于慢病毒。慢病毒载体的实例公开于WO9931251、W09712622、W09817815、W09817816和WO9818934中，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。

其他载体包括质粒载体。质粒载体已在本领域中广泛描述，并且是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。在最近几年中，已经发现质粒载体由于其不能在宿主基因组内复制并整合到宿主基因组中而特别有利于在体内将基因递送至细胞。然而，这些具有与宿主细胞相容的启动子的质粒可以从在质粒内可操作地编码的基因表达肽。可从商业供应商处获得的一些常用质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、各种pcDNA质粒、pRC/CMV、各种pCMV质粒、pSV40和pBlueScript。特定质粒的另外的实例包括：pcDNA3.1，目录号V79020；pcDNA3.1/hygro，目录号V87020；pcDNA4/myc-His，目录号V86320；和pBudCE4.1，目录号V53220，其全部来自Invitrogen(Carlsbad,CA.)。其他质粒是本领域普通技术人员熟知的。另外，可以使用标准分子生物学技术来定制设计质粒，以去除和/或添加特定DNA片段。

本公开考虑使用技术人员可获得的任何核酸修饰来修饰本文公开的核酸，例如gRNA和编码gRNA的核酸、编码Cas9的核酸、包含编码至少一个gRNA或至少一个gRNA和Cas9的核酸的载体、编码CAR或TCR的核酸、编码本文公开的任何基因组编辑工具的核酸、编码RNAi的核酸或反义寡核苷酸。

如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核苷或核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在一些方面，合成的经修饰的gRNA包含至少一个核苷(“碱基”)修饰或取代。

本申请中公开的核酸(例如，gRNA和编码此类gRNA的核酸，以及编码Cas9的核酸)可以包含一个或多个修饰。在一些方面，本文公开的核苷酸序列包含至少一种核苷酸类似物。在一些方面，通过使用体外翻译(IVT)或化学合成引入的至少一种核苷酸类似物选自由以下组成的组：2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’-MOE-RNA)单体、2’-氟-DNA单体、2’-O-烷基-RNA单体、2’-氨基-DNA单体、锁核酸(LNA)单体、cEt单体、cMOE单体、5’-Me-LNA单体、2’-(3-羟基)丙基-RNA单体、阿拉伯糖核酸(ANA)单体、2'-氟-ANA单体、失水己糖醇(HNA)单体、嵌入核酸(INA)单体以及两种或多种所述核苷酸类似物的组合。在一些方面，优化的核酸分子(例如，gRNA)包含至少一个骨架修饰，例如硫代磷酸酯核苷酸间连接。

在一些方面，本申请公开的核酸(例如，gRNA和编码此类gRNA的核酸，以及编码Cas9的核酸)可以在末端位置进行化学修饰，例如通过在相对于5’和/或3’末端的位置1、2、3处引入M(2’-O-甲基)、MS(2’-O-甲基3’硫代磷酸酯)或MSP(2’-O-甲基3’硫代PACE，膦酰基乙酸酯)修饰或它们的组合。例如，在一个方面，本公开的gRNA可以包含在三个5’核苷酸处的三个M修饰和在三个3’核苷酸处的三个M修饰。在一些方面，本公开的gRNA可以包含在三个5’核苷酸处的三个MS修饰和在三个3’核苷酸处的三个MS修饰。在一些方面，本公开的gRNA可以包含在三个5’核苷酸处的三个MSP修饰和在三个3’核苷酸处的三个MSP修饰。

在一些方面，本文公开的核苷酸序列(例如，gRNA)中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或100％的尿苷、腺苷、鸟苷、胞苷核苷已经被核苷替换。

在一些方面，本申请中公开的核酸(例如，gRNA)包含通过IVT或化学合成产生的核苷酸序列，其中

(i)野生型核苷酸序列中的至少一个尿苷已被替换；和/或

(ii)野生型核苷酸序列中的至少一个腺苷已被替换；和/或

(iii)野生型核苷酸序列中的至少一个鸟苷已被替换；和/或

(iv)野生型核苷酸序列中的至少一个胞苷已被替换。

本公开的经修饰的核酸(例如，gRNA)不需要沿分子的整个长度进行均匀修饰。不同的核苷酸修饰和/或骨架结构可以存在于核酸中的不同位置处。本领域普通技术人员将会理解，核苷酸类似物或其他修饰可以位于核酸的任何位置处，使得核酸的功能不会显著降低。修饰也可以是5’或3’末端修饰。核酸可以含有最少一个且最多100％的经修饰的核苷酸，或任何介于其间的百分比，诸如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的经修饰的核苷酸。

在一些方面，本文提供的核酸是编码RNA(例如，gRNA)和/或多肽(例如，Cas9)的合成的经修饰的DNA分子，其中合成的经修饰的DNA分子包含一个或多个修饰。

本文所述的合成的经修饰的核酸(例如，gRNA)包括防止核酸内切酶和核酸外切酶快速降解的修饰。修饰包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5’末端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向连接等)、3’末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)，(b)碱基修饰、例如用经修饰的碱基、稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的配偶体库配对的碱基或缀合碱基进行替换，(c)糖修饰(例如，2’位置或4’位置处)或糖替换，以及(d)核苷间键修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。

可用于本文所述方法的合成的经修饰的核酸(例如，gRNA)组合物的具体实例包括但不限于含有经修饰或非天然核苷间键的经修饰的核酸(例如，gRNA)。具有经修饰的核苷间键的合成的经修饰的核酸(例如，gRNA)尤其包括那些在核苷间键中没有磷原子的核酸。在一些方面，合成的经修饰的核酸(例如，gRNA)在其核苷间键中具有磷原子。

经修饰的核苷间键的非限制性实例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其他烷基膦酸酯、次膦酸酯、包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼基磷酸酯、这些的T-5'连接的类似物和具有相反极性的那些，其中相邻的成对核苷单元连接在3’-5’到5’-3’或T-5’到5’-T。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

其中不包含磷原子的经修饰的核苷间键具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的核苷间键。这些包括具有吗啉键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他物。

本文所述的合成的经修饰的核酸(例如，gRNA)的一些方面包括具有硫代磷酸酯核苷间键的核酸和具有杂原子核苷间键的寡核苷，并且特别是美国专利第5,489,677号的-CH₂-NH-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI]、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-N(CH₃)-CH₂-CH₂-[其中天然磷酸二酯核苷间键表示为-O-P-O-CH₂-]以及美国专利第5,602,240号的酰胺骨架，这两个专利都以引用的方式整体并入本文。在一些方面，本文描述的核酸序列具有美国专利第5,034,506号的吗啉代骨架结构，其以引用的方式整体并入本文。

本文所述的合成的经修饰的核酸(例如，gRNA)也可以含有一个或多个取代的糖部分。本文描述的核酸可以在2'位置处包括下列中的一种：H(脱氧核糖)；OH(核糖)；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基。示例性的修饰包括O[(CH₂)nO]mCH₃、O(CH₂)nOCH₃、O(CH₂)nNH₂、O(CH₂)nCH₃、O(CH₂)nONH₂和O(CH₂)nON[(C H₂)nCH₃)]₂，其中n和m为1至约10。在一些方面，合成的经修饰的RNA在2’位置处包括以下中的一种：C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、N H₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、报道基团、嵌入剂、用于改善某些核酸(例如，gRNA)的药物动力学特性的基团或用于改善合成的经修饰的核酸(例如，gRNA)的药物动力学特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。在一些方面，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即烷氧基-烷氧基。另一个示例性修饰是2’-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也称为2’-DMAOE，和2’-二甲氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2’-O-二甲氨基乙氧基乙基或2'-DM AEOE)，即2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂。

其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH₃)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和2’-氟(2’-F)。也可以在核酸序列的其他位置处进行类似的修饰，特别是3’末端核苷酸上或2’-5’连接的核苷酸中的糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。合成的经修饰的gRNA也可以具有糖模拟物(诸如环丁基部分)来代替呋喃戊糖。

作为非限制性实例，本文所述的合成的经修饰的gRNA可包括至少一个经修饰的核苷(包括2’-O-甲基修饰的核苷)、包含5’硫代磷酸酯基团的核苷、2’-氨基修饰的核苷、2’-烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、包含氨基磷酸酯或非天然碱基的核苷或它们的任何组合。

在一些方面，至少一个经修饰的核苷选自由以下组成的组：5-甲基胞苷(5mC)、N6-甲基腺苷(m6A)、3,2'-O-二甲基尿苷(m4U)、2-硫代尿苷(s2U)、2’氟尿苷、假尿苷、2’-O-甲基尿苷(Um)、2’脱氧尿苷(2'dU)、4-硫代尿苷(s4U)、5-甲基尿苷(m5U)、2’-O-甲基腺苷(m6A)、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基腺苷(m62Am)、2'-O-甲基胞苷(Cm)、7-甲基鸟苷(m7G)、2'-O-甲基鸟苷(Gm)、N2,7-二甲基鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-三甲基鸟苷(m2,2,7G)和肌苷(I)。

可替代地，合成的经修饰的gRNA可以包含至少两个经修饰的核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个，直到核苷酸的全长。至少，包含至少一个经修饰核苷的合成的经修饰的gRNA分子包含具有本文所述的修饰的单一核苷。没有必要对给定的合成的经修饰的gRNA中的所有位置进行一致的修饰，并且事实上，可以在单个合成的经修饰的gRNA中或甚至在合成的经修饰的gRNA中的单个核苷上掺入一个以上的上述修饰。然而，优选但非绝对必要的是，分子中给定核苷的每次出现都被修饰(例如，每个胞嘧啶是经修饰的胞嘧啶，例如5mC)。然而，也考虑了在给定的合成的经修饰的gRNA分子中，相同核苷的不同出现可以以不同的方式被修饰(例如，一些胞嘧啶被修饰为5mC，其他被修饰为2’-O-甲基胞苷或其他胞嘧啶类似物)。对于合成的经修饰的gRNA中的多个修饰的核苷中的每一个，修饰不需要相同。此外，在本文所述方面的一些方面，合成的经修饰gRNA包含至少两个不同的经修饰的核苷。在本文描述的一些方面，至少两个不同的经修饰的核苷是5-甲基胞苷和假尿苷。合成的经修饰的gRNA也可以包含经修饰的和未经修饰的核苷的混合物。

本文公开的gRNA和其他核酸(例如用于CRISPR基因编辑的核酸，或编码CAR或TCR的多核苷酸或多核苷酸组)可以通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成、宿主细胞表达、体外翻译(IVT)或本领域已知的任何其他方法产生。天然存在的核苷、非天然存在的核苷或它们的组合完全或部分替代天然存在的核苷。多核苷酸或核酸合成反应可以利用聚合酶通过酶促方法进行。聚合酶催化多核苷酸或核酸链中核苷酸间磷酸二酯键的产生。

基因工程化中的各种工具都是基于作为模板的靶核酸的酶促扩增。为了研究单个基因或感兴趣的特定区域的序列以及其他研究需要，有必要从少量多核苷酸或核酸样品中产生靶核酸的多个拷贝。此类方法可应用于制造本文公开的gRNA和其他核酸(例如，RNAi、ASO、编码Cas的多核苷酸或编码CAR或TCR的多核苷酸或多核苷酸组)。

聚合酶链式反应(PCR)广泛应用于靶基因的快速扩增，以及基因组作图和测序。合成DNA的关键组分包括作为模板的靶DNA分子、与靶DNA链末端互补的引物、作为结构单元的脱氧核苷三磷酸(dNTP)和DNA聚合酶。随着PCR进行变性、退火和延伸步骤，新产生的DNA分子可以作为下一轮复制的模板，从而实现靶DNA的指数扩增。PCR需要变性和退火的加热和冷却循环。基本PCR的变体包括不对称PCR(Innis等人,PNAS 85,9436-9440(1988))、反向PCR(Ochman等人,Genetics 120(3),621-623,(1988))和逆转录PCR(RT-PCR)(Freeman等人,BioTechniques 26(1),112-22,124-5(1999))，其内容以引用的方式整体并入本文。在RT-PCR中，单链RNA是期望的靶，并且首先被逆转录酶转化为双链DNA。任何前述方法可用于制造本公开的多核苷酸的一个或多个区域(例如，gRNA、编码Cas的多核苷酸或编码CAR或TCR的多核苷酸或多核苷酸组)。

通过连接酶装配多核苷酸或核酸也被广泛使用。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键促进多核苷酸链的5和3末端的分子间连接。因此，RNA连接酶可用于例如通过gRNA间隔序列和gRNA框架序列的3’至5’分子间连接产生gRNA。

标准方法可用于合成编码分离的感兴趣多肽的分离的多核苷酸序列。例如，可以合成含有编码特定的分离多肽的密码子优化的核苷酸序列的单个DNA或RNA寡聚体。在一些方面，可以合成编码部分所需多肽的几个小寡核苷酸，然后连接。在一些方面，单个寡核苷酸通常含有用于互补装配的5’或3’突出端。

本文公开的多核苷酸(例如，gRNA、编码Cas的多核苷酸或编码CAR或TCR的多核苷酸或多核苷酸组)可以使用本领域已知的化学合成方法和潜在的核碱基取代进行化学合成。参见例如国际公开第W O2014093924号、第WO2013052523号、第WO2013039857号、第WO2012135805号、第WO2013151671号；美国公开第US20130115272号；或美国专利第US8999380号、第US8710200号，所有都以引用的方式整体并入本文。

VII.药物组合物

本公开提供了药物组合物，其包含(a)细胞，所述细胞已经被修饰以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，并且具有：(i)NR4A1和NR4A2基因和NR4A1和NR4A2蛋白质的内源表达，(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iv)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者(例如，诸如本文所述的那些细胞)。本公开提供了药物组合物，其包含(a)细胞，所述细胞已经被修饰以表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白和结合分子，并且具有：(i)NR4A1和NR4A2基因和NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达，(ii)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，(iii)降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白，或(iv)降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和NR4A2基因和/或NR4A2蛋白两者(例如，诸如本文所述的那些细胞)。更具体地，在一些方面，本文提供了包含经修饰的细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的组合物，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，(ii)具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，(iii)具有内源水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，和(iv)具有内源水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，本文提供的组合物包含经修饰的细胞(例如，经修饰的免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，(ii)具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，(iii)具有降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，和(iv)具有内源水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。在一些方面，本文提供的组合物包含经修饰的细胞(例如，经修饰的免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，(ii)具有降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，(iii)具有降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白，和(iv)具有降低水平的NR4A2基因和/或NR4A2蛋白。

在一些方面，对于上述任何组合物，可以使用本文所述的任何基因编辑工具来降低NR4A3基因的水平。例如，在一些方面，本文所述的可靶向NR4A3基因的任何gRNA可用于降低NR4A3基因的水平(并且从而降低编码的NR4A3蛋白的水平)。

因此，在一些方面，用于本公开的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，可用于本公开的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:30所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:52所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:53所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:54所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:55所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:56所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:57所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:58所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ IDNO:59所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:60所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:61所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:62所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:63所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:64所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:65所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:66所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:67所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:68所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:69所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ IDNO:70所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:71所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:72所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:73所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:74所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:75所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:76所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:77所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:78所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:79所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:80所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ IDNO:81所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:82所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:83所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:84所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:85所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:86所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:87所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:88所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:89所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:90所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:91所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ IDNO:92所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:93所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:94所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:95所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:96所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:97所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:98所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中gRNA包含SEQ ID NO:99所示的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一些方面，可用于本公开的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:30所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:52所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:53所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:54所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:55所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:56所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:57所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:58所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:59所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:60所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:61所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:62所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:63所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:64所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:65所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:66所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:67所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:68所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:69所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:70所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:71所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:72所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:73所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:74所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:75所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:76所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:77所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:78所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:79所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:80所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:81所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:82所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:83所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:84所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:85所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:86所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:87所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:88所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:89所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:90所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:91所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:92所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:93所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:94所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:95所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:96所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:97所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:98所示的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些方面，本文所述的组合物包含细胞(例如，免疫细胞)，所述细胞：(i)表达结合分子(例如，CAR或TCR)，和(ii)已经用可以靶向NR4A3基因的gRNA修饰，其中gRNA包含SEQ ID NO:99所示的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一些方面，任何上述组合物还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。对本领域技术人员显而易见的是，除非另有说明，否则术语“组合物”和“药物组合物”可以互换使用。因此，与药物组合物相关的任何合适的公开内容同样适用于组合物。类似地，与组合物相关的任何合适的公开内容同样适用于药物组合物。

如本文所述，本文所述的任何药物组合物可用于预防和/或治疗癌症。如本文所述，在一些方面，本文公开的药物组合物中存在的经修饰的细胞是免疫细胞，例如T细胞(例如，表达CAR或TCR的T细胞)或NK细胞(例如，表达CAR或TCR的NK细胞)。

可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如或聚乙二醇(PEG)。

药物组合物可以被配制用于向受试者的任何施用途径。施用途径的具体实例包括肌内、皮下、眼部、静脉内、腹膜内、皮内、眶内、脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内或瘤内。本文还预期了以皮下、肌内或静脉内注射为特征的肠胃外施用。可以制备呈常规形式的注射剂，作为液体溶液或混悬液、适合用于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式或作为乳剂。注射剂、溶液和乳剂还含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，如果需要，待施用的药物组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其他这样的试剂，诸如例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。

用于肠胃外制剂的药学上可接受的载剂包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequestering/chelating agent)和其他药学上可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏(Ringers)注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸林格氏注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂添加到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述多剂量容器包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)和苄索氯铵(benzethonium chloride)。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(80)。金属离子的多价螯合剂或螯合剂包括EDTA。药物载剂还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。

用于肠胃外施用的制剂包括准备注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂混合的无菌干燥可溶性产品(诸如冻干粉，包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与媒介物混合的无菌干燥不溶性产品和无菌乳剂。溶液可以是水性的或非水性的。

如果静脉内施用，则合适的载剂包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及含有增稠剂和增溶剂(诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物)的溶液。

本文提供的药物组合物也可以配制成靶向待治疗受试者身体的特定组织、受体或其他区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员熟知的。本文预期了用于本发明组合物的所有此类靶向方法。对于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利第6,316,652号、第6,274,552号、第6,271,359号、第6,253,872号、第6,139,865号、第6,131,570号、第6,120,751号、第6,071,495号、第6,060,082号、第6,048,736号、第6,039,975号、第6,004,534号、第5,985,307号、第5,972,366号、第5,900,252号、第5,840,674号、第5,759,542和5,709,874，其中的每一者以引用的方式整体并入本文。

待用于体内施用的组合物可以是无菌的。这易于通过例如无菌过滤膜的过滤来实现。

本公开还提供了细胞组合物，其包含用于本文所述的一种或多种方法的手段，例如促进免疫细胞群体中的持久记忆和/或效应子功能。在一些方面，本公开提供了一种细胞组合物，其包含用于减少、改善或抑制免疫细胞群体中的耗竭和/或功能障碍的手段。在一些方面，所述方法包括修饰免疫细胞群体中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的表达。在一些方面，所述方法包括修饰免疫细胞群体中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达。

VIII.试剂盒

本公开还提供了用于实施本公开的任何方法的试剂盒。在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含(i)基因编辑工具(例如，包含gRNA，其包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由组成)，以降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的表达，或(ii)它们的组合，以及任选地用于根据本文公开的任何方法治疗肿瘤的说明书。还提供了一种试剂盒，其包含(i)基因编辑工具(例如，包含gRNA，其包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成)以降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的表达，或(ii)它们的组合，以及任选地用于根据本文公开的方法制备细胞组合物的说明书。

本公开还提供了用于实施本公开的任何方法的试剂盒。在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含(i)基因编辑工具(例如，包含gRNA，其包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由组成)，以降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的表达，(ii)包含配体结合蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)(例如，ROR1 CAR)或T细胞受体(TCR))的载体，或(iii)它们的组合，以及任选地用于根据本文公开的任何方法治疗肿瘤的说明书。还提供了一种试剂盒，其包含其包含(i)基因编辑工具(例如，包含gRNA，其包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由组成)，以降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)的表达，(ii)包含配体结合蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))的载体，或(iii)它们的组合，以及任选地用于根据本文公开的方法制备细胞组合物的说明书。

在一些方面，本公开提供了包含本文公开的组合物的试剂盒，例如(i)表现出NR4A3基因和/或NR4A3蛋白(单独或与NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)表达降低的细胞，例如免疫细胞，(ii)至少一种靶向NR4A3基因的gRNA，(iii)编码至少一种gRNA(例如，载体)的核酸，(iv)至少一种gRNA和Cas蛋白(例如，Cas9)，(v)至少一种编码gRNA(例如，载体)和Cas蛋白(例如，Cas9)的核酸，(vi)至少一种编码gRNA(例如，第一载体)的核酸和编码Cas蛋白(诸如Cas9)(例如，第二载体)的核酸，(vii)包含编码至少一种gRNA和至少一种Cas蛋白(例如，Cas9)的核酸的单一载体，(vii)编码CAR或TCR的载体或载体组。在一些方面，试剂盒包含靶向NR4A3的Cas9 RNP(例如，Cas9 RNP，包括sgRNA GCUCGAGUAGCCCUCCACGA(SEQ ID NO:30))。靶向NR4A3基因的其他Cas9 RNP以及靶向NR4A1和/或NR4A2基因的那些的非限制性实例在本公开的其他地方提供(参见例如，表A、C和D)。在一些方面，试剂盒还包括它们的使用说明书。

本公开提供了用于治疗癌症的试剂盒，其包含本文公开的经修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中所述细胞表现出NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达降低(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)。本公开提供了用于治疗癌症的试剂盒，其包含本文公开的经修饰的细胞(例如，免疫细胞)，其中所述细胞表现出NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达降低(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)，并且其中所述细胞表达CAR和/或TCR。

在一些方面，所述试剂盒包含至少一种本文公开的gRNA(例如，包含gRNA，其包含SEQ ID NO:30和52-99中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成)、至少一种编码本文公开的gRNA的分离的多核苷酸、至少一种编码本文公开的gRNA的载体、包含至少一种编码本文公开的gRNA的载体的细胞或它们的组合。在一些方面，试剂盒还包含Cas9蛋白、编码Cas9蛋白的分离的多核苷酸或包含编码Cas9蛋白的多核苷酸的载体。

本公开还提供了一种试剂盒或包装，其包括至少一个容器装置，其中放置了至少一种上述gRNA、Cas9载体、细胞或它们的组合，以及用于降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的说明书(单独或与降低水平的NR4A1基因和/或NR4A1蛋白和/或NR4A2基因和/或NR4A2蛋白组合)。

在一些方面，试剂盒包括至少一个上游gRNA和下游gRNA。因此，在一些情况下，试剂盒包含(i)至少一个包含SEQ ID NO:31-38中的任一个的间隔序列的gRNA，和(ii)至少一个包含SEQ ID NO:41-42中的任一个的间隔序列的gRNA。

在具体的方面，试剂盒包含gRNA，其包含SEQ ID NO:31-38的化脓性链球菌间隔序列，所述间隔序列可操作地连接到金黄色葡萄球菌嵌合框架，例如SEQ ID NO:39的序列。

在一些方面，包含特定细菌物种Cas9(例如，化脓性链球菌Cas9)的gRNA的每个试剂盒还包含这样的Cas9。

在一些方面，试剂盒包含一种或多种表达靶向癌症抗原的CAR和/或TCR的细胞、培养物或细胞群体。

实施例

实施例1-指导RNA筛选和经修饰的T细胞的产生

为了研究每个NR4A成员在对抗人T细胞耗竭中的作用，使用了ROR1-R12嵌合抗原受体(CAR)T细胞和NY-ESO-1T细胞受体(TCR)T细胞模型。CRISPR-Cas9指导RNA(gRNA)被鉴定为特异性减少用ROR1 CAR或NY-ESO-1TCR转导的人T细胞中每个NR4A家族成员的蛋白表达。

NR4A1和NR4A2的CRISPR-Cas9指导RNA如表A中所示。在实施例2-7所述的实验中，NR4A1 sgRNA 5和6组合使用，并且NR4A2 sgRNA 1、2和3组合使用。

设计并筛选对NR4A3具有特异性的单个gRNA，以在三个独立实验(v0、v1和v2)中鉴定具有最大编辑效率和最大蛋白质减少的gRNA。对于所有gRNA筛查，从AllCells购买分离的供体CD4+和CD8+T细胞。将CD4+和CD8+T细胞解冻，并且以1:1的比率与1％(v/v)TransAct(Miltenyi)混合活化24小时。24小时后，用编码抗ROR1CAR的双顺反子(v0)或三顺反子(v2)慢病毒载体转导活化的T细胞或不转导(v1)。然后利用经修饰的指导RNA(Synthego；v0-表B、v1-表C和v2-表D)和Lonza 4D Nucleofector单元，用靶向人NR4A3的Cas9 RNP电穿孔T细胞。将电穿孔的T细胞转移到G-Rex培养板中以用于扩增，然后在第7天在CryoStor培养基中冷冻保存。在实验v0和v1中使用一个供体，而在实验v2中使用两个独立的供体。为了在第7天通过流式细胞术评估蛋白质减少的效率，在37℃下在96孔圆底板(Corning)中用CD3/CD28 Dynabeads(在v0和v1中)或PMA+离子霉素(在v2中)在200μL的RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素/链霉素刺激3×105NR4A3编辑的或对照(无RNP情况下电穿孔)T细胞两小时，以诱导最大NR4A3表达。在刺激后，如上所述用表面标志物对细胞进行染色。然后按照制造商的说明书，用FoxP3转录因子染色缓冲液试剂盒(eBiosciences)固定和透化细胞，并且使用定制的荧光染料缀合的NR4A3抗体(R&D Systems)进行细胞内染色。

与对照未编辑的细胞相比，v0中没有gRNA降低NR4A3蛋白表达(表B)。没有进行通过NGS证实基因组编辑效率。在v1中，与未编辑的对照相比，所有7个gRNA降低NR4A3蛋白的表达，并且进行了NGS编辑效率。两个指导(g4和g8)具有最高的基因组编辑(通过总百分比T细胞变异来测量)。尽管编辑效率高，基因组变异体的插入缺失特征显示g8导致高频率的不期望的框内缺失(表C)。在v2中，基于KO条件选择了前14个gRNA，其中NR4A3蛋白表达与未编辑的对照相比减少和/或与两个供体的基准g4相似/更好(表D)。进一步评估选定的条件以通过NGS分析确认基因组编辑效率。

如以下实施例中更详细描述，NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞(使用NR4A3 gRNA g4编辑，SEQ ID NO:30)显示出最大的功能益处，从而证实了与对照ROR1 CAR T细胞相比，在连续ROR1抗原暴露后显著延长的细胞毒性、细胞因子产生、T细胞持久性和改善的表型。NR4A3编辑的NY-ESO-1TCR T细胞也显示出最大的功能益处，从而证实了与对照NY-ESO-1TCR T细胞相比，在连续NY-ESO-1抗原暴露后延长的细胞毒性和细胞因子产生。

实施例2-降低的NR4A3表达

通过流式细胞术在NR4A编辑的ROR1 CAR T细胞(使用NR4A3sgRNA g4编辑，SEQ IDNO:30)中验证了NR4A蛋白表达的降低。用CD3/CD28 Dynabeads刺激用于诱导最大NR4A表达。对于流式细胞术分析，NR4A编辑的ROR1 CAR T细胞在室温(RT)下用活性死染料染色10分钟，在RT下用TruStain FcX(Biolegend)阻断5分钟，在37℃下用CCR7染色15分钟，然后在RT下用表面标志物抗体染色10分钟。所有染色均在Biolegend细胞染色缓冲液中进行。

3×10⁵个NR4A编辑的或对照的ROR1 CAR T细胞用CD3/CD28Dynabeads(ThermoFisher)在37℃下在96孔圆底板(Corning)中在200uL的RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素/链霉素中以3:1的珠与细胞比率刺激两小时，以诱导最大NR4A表达。在刺激后，去除Dynabeads，并且如上所述用表面标志物对细胞进行染色。然后按照制造商的说明书，用FoxP3转录因子染色缓冲液试剂盒(eBiosciences)固定和透化细胞。使用定制的荧光染料缀合的NR4A抗体(R&D Systems)进行染色。

与未编辑的对照相比，NR4A3编辑的ROR1 CD4⁺和CD8⁺CAR T细胞中NR4A3蛋白表达显著降低(图1A和图1B)。类似地，使用对NR4A1和NR4A2基因具有特异性的CRISPR-Cas9gRNA实现了高效率的NR4A1和NR4A2蛋白减少(数据未显示)。ROR1 CAR的表达(鉴定为EGFR⁺R12⁺)在测试的五个供体中相似，并且不受NR4A编辑的影响(图2)。

实施例3-依序刺激中持续的细胞毒性和细胞因子产生

在两个体外耗竭测定中评估NR4A编辑的ROR1 CAR T细胞的功能，其中CAR T细胞依序或长期暴露于抗原。

在依序刺激测定中，NR4A编辑的ROR1 CAR T细胞用表达H1975 NSCLC ROR1的肿瘤细胞系进行五次连续刺激。特别地，冷冻保存的NR4A编辑的或对照的ROR1 CAR T细胞被解冻，并且立即在平的24孔测定板(Eppendorf)中一式三份地与H1975-NLR肿瘤细胞以1:1E:T比率在RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素/链霉素中培养。在共培养3天后，将孔重新悬浮，并且将25％的培养物转移到新的板上，其中每个孔具有相同初始数量的新鲜肿瘤细胞。总共重复5次刺激。在测定期间在Incucyte中连续测量细胞毒性，并且在建立每个新刺激后24小时收集上清液以测量细胞因子水平。将来自一式三份共培养孔的剩余细胞合并以用于如上所述的表型流动分析。NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞对H1975肿瘤细胞保持更强的细胞毒性，从而证实与NR4A1、NR4A2或对照未编辑的ROR1CAR T细胞相比，在3-5轮刺激后具有持续裂解靶细胞的能力(图3)。

除了持续的细胞毒性外，当用表达H1975 NSCLC ROR1的肿瘤细胞刺激时，与NR4A1、NR4A2或对照未编辑的ROR1 CAR T细胞相比(图4A、图4B、图4C)，NR4A3编辑的ROR1CAR T细胞产生更高水平的IFN-、IL-2和TNF-α。按照制造商的说明书，使用中尺度发现V-Plex促炎小组1人试剂盒或定制的人IFN-g、IL-2和TNF-a细胞因子试剂盒测量细胞因子水平。

细胞因子产生的差异在随后几轮刺激后最为显著，从而表明NR4A3敲除有助于持续的功能活性和/或延长抗原刺激后CAR T细胞存活的改善。事实上，在几轮刺激后，来自依序刺激测定的NR4A3编辑的T细胞比NR4A1、NR4A2或对照未编辑的T细胞保持了更高频率的表达ROR1 CAR的T细胞(图5A)。因此，这与在第2-3轮刺激时总NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞数量的持久性增加相关(图5B)。在针对H1975肿瘤细胞的第二次依序刺激后，NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞也具有比NR4A1、NR4A2或对照未编辑的CAR T细胞显著更低的LAG3和CD39表达(图6)。

T细胞耗竭的体外依序刺激模型显示，NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞在五个独立供体中表现出针对表达ROR1的H1975肿瘤细胞的增强和持续的细胞毒性和细胞因子产生。在随后几轮刺激中功能活性的增加可能至少部分是由于NR4A3编辑的T细胞在整个测定中的持久性增加。

使用第二种ROR1⁺肿瘤细胞系A549确认了这些结果，其中NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞在后来的刺激中显示出持续的细胞毒性和细胞因子产生(数据未显示)。在建立测定之前，在RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素/链霉素中培养A549-NucLightRed(NLR)和H1975-NLR肿瘤细胞系持续2-3代。用TrypLE Express酶(Gibco)对细胞进行胰蛋白酶化。

实施例4-慢性刺激中持续的细胞毒性和细胞因子产生

为了更直接地测量NR4A3敲除对细胞内在功能能力的影响，开发了七天慢性刺激测定来研究NR4A编辑的ROR1 CAR T细胞对抗耗竭的能力。在这个测定中，在每个重置时间点和功能性测定之前，所有组的E:T比率被重新标准化，以消除CAR T细胞数量差异对功能读数的影响。

将冷冻保存的NR4A编辑或对照的ROR1 CAR T细胞解冻并在TCM中静置3天，然后在RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素/链霉素中与H1975-NLR肿瘤细胞以1:1的效应物对靶物(E:T)比率培养。回收存活的CAR T细胞，通过流式细胞术对回收的活性半胱天冬酶3^-CD3⁺EGFR⁺R12+细胞的数量进行定量，并且每2-3天用新鲜肿瘤细胞以1:1E:T比率重新铺板持续总共七天。NR4A编辑的ROR1 CAR T细胞在室温(RT)下用活性死染料染色10分钟，在RT下用TruStain FcX(Biolegend)阻断5分钟，在37℃下用CCR7染色15分钟，然后在RT下用表面标志物抗体染色10分钟。NR4A编辑的ROR1 CAR T细胞按照制造商的说明书用BD Cytofix/CytoPerm试剂盒进一步固定和透化，并且用活性半胱天冬酶3染色。所有染色均在Biolegend细胞染色缓冲液中进行。

在慢性刺激开始的第0天和慢性刺激结束的第7天评估功能性细胞毒性和细胞因子产生。在平的96孔测定板(Eppendorf)中使用Incucyte以1:1E:T比率对A549-NLR肿瘤细胞和1:5E:T比率对H1975-NLR肿瘤细胞测量细胞毒性持续72小时。在建立Incucyte测定板24小时后收集上清液以测量细胞因子水平。

与依序刺激测定类似，与NR4A1、NR4A2或对照未编辑的CAR T细胞相比，NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞在H1975肿瘤细胞的慢性ROR1抗原暴露七天后产生更高水平的IFN-、IL-2和TNF-α(图7)。在使用A549肿瘤细胞的七天慢性刺激测定中观察到类似的发现，其中与NR4A1、NR4A2或对照未编辑的CAR T细胞相比，NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞保持增加的细胞因子产生(数据未显示)。在H1975慢性刺激期间(图8A)，在NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞中观察到表达EGFR⁺R12⁺CAR的细胞的百分比与其他CAR T细胞相比有小幅增加，并且在第7天，在大多数供体中，NR4A3编辑的ROR1CAR T细胞总数略有提高(图8B)。此外，在慢性ROR1抗原暴露七天后，NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞倾向于比对照未编辑的ROR1CAR T细胞具有更低的抑制性标志物表达(无统计学意义)(图9)。

实施例5-抗肿瘤功效

最后，使用体内H1975异种移植模型来确定来自体外测定的NR4A3编辑的ROR1 CART细胞的表型和改善的功能是否重现。

将亲代H1975肿瘤细胞在RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)中培养持续三代，然后植入6-8周龄的NSG HLA双敲除小鼠(Jackson Labs)中。用TrypLE Select酶将细胞胰蛋白酶化，重悬于HBSS(Gibco)中，并且以1:1的比率与Matrigel(Corning)混合。五百万个H1975肿瘤细胞被植入每只小鼠的胁腹。当肿瘤大小达到80-120mm³时，将T细胞过继转移到随机的携带肿瘤的小鼠中。

每周两次测量肿瘤体积和体重，直到终点在肿瘤达到>2000mm³、>20％体重减轻、溃疡、呼吸困难、严重限制活动或不能直立时，或T细胞转移后60天。

为了制备用于过继转移的T细胞，冷冻保存的NR4A编辑的或对照的ROR1 CAR T细胞在过继转移到携带肿瘤的小鼠之前被解冻并用RPMI-1640(Gibco)+25mM HEPES(Gibco)洗涤。通过尾静脉给小鼠i.v.注射100uL的60万(低剂量)或200万(高剂量)活性半胱天冬酶3^-CD3⁺EGFR⁺R12⁺T细胞。n＝5只小鼠/每个治疗组。

使用GraphPad Prism非成对t检验、成对t检验和对数秩(Mantel-Cox)检验进行统计分析。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，****p<0.0001。

NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞在两种不同剂量水平的ROR1CAR T细胞下显示出有效且改善的抗肿瘤功效(图10A)。此外，与其他T细胞组相比，用NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞过继转移的小鼠在T细胞注射后六十天的存活增加(图10B)。

NR4A3编辑的ROR1 CAR T细胞表现出稳健的细胞毒性和细胞因子产生，ROR1 CART细胞更好的维持和持久性，并且表现出趋向于减少耗竭的表型，如两个体外测定(例如，依序和慢性刺激)和体内H1975异种移植模型所证实。因此，在ROR1-R12 CAR T细胞的情形下编辑NR4A3可以改善针对表达ROR1的实体瘤的细胞免疫疗法。

实施例6-依序刺激中持续的细胞毒性和细胞因子产生

为了进一步评估降低的NR4A水平对CAR T细胞功能的影响(特别是在慢性抗原刺激的情形下)，使用实施例1中提供的方法和sgRNA产生NR4A家族的多个成员水平降低的抗ROR1 CAR T细胞。具体地，产生了具有降低水平的以下NR4A家族成员的抗ROR1 CAR T细胞：(1)NR4A1和NR4A2(NR4A 1+2双重敲除)，(2)NR4A1和NR4A3(NR4A 1+3双重敲除)，(3)NR4A2和NR4A3(NR4A 2+3双重敲除)，和(4)NR4A1、NR4A2和NR4A3(NR4A三重敲除)。非NR4A编辑的抗ROR1 CAR T细胞和具有降低水平的单独NR4A1、单独NR4A2和单独NR4A3的抗ROR1 CAR T细胞(参见实施例1和2)也用于比较目的。在如实施例3所述的依序刺激测定中，用抗原(A549-NLR或H1975-NLR细胞)刺激不同的抗ROR1 CAR T细胞。在测定期间在Incucyte中连续测量细胞毒性，并且在建立每个新刺激后24小时收集上清液以测量细胞因子水平。

如图11A和图11B中所示，甚至在重复抗原刺激后，与模拟抗ROR1 CAR T细胞相比，不同的抗ROR1 NR4A双重和三重敲除CAR T细胞能够保持其有效裂解ROR1⁺肿瘤细胞的能力。除了持续的细胞毒性外，NR4A双重和三重KO抗ROR1 CAR T细胞在重复抗原刺激后还保持了产生不同细胞因子(IFN-、IL-2和TNF-α)的能力。特别地，含有NR4A3 KO(NR4A1/NR4A3DKO、NR4A2/NR4A3 DKO和TKO)的KO组合显示出最大的影响，从而确认了NR4A3 KO在经修饰的细胞的活性增强中的重要性。

这些结果进一步证实了降低免疫细胞(例如，CAR T细胞)中NR4A水平的治疗益处，特别是在慢性抗原刺激的情形下。

实施例7-在依序刺激中工程化TCR T细胞的持续细胞毒性和细胞因子产生

在体外耗竭测定中评估单个NR4A编辑的NY-ESO-1TCR T细胞(其中TCR T细胞在NR4A1、NR4A2或NR4A3处被编辑)的功能，其中TCR T细胞依序暴露于抗原。在建立测定之前，将A375-NucLight Red(NLR)肿瘤细胞系在RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素/链霉素中培养持续2-3代。用Accutase酶(StemCell Technologies)将细胞胰蛋白酶化。

在依序刺激测定中，用表达A375黑色素瘤NY-ESO-1/LAGE-1a的肿瘤细胞系对对照的和NR4A编辑的NY-ESO-1TCR T细胞进行四次连续刺激。特别地，将冷冻保存的NY-ESO-1TCR T细胞解冻，并且立即在平的96孔测定板中一式三份地与A375-NLR肿瘤细胞以cParp^-CD3⁺TCRvβ13.1⁺TCR细胞的1:1E:T比率在RPMI-1640(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素/链霉素中培养。在共培养3或4天后，将孔重新悬浮，并且将25％的培养物转移到新的板上，其中每个孔具有相同初始数量的新鲜肿瘤细胞。总共重复4次刺激。在测定期间在Incucyte中连续测量细胞毒性，并且在建立每个新刺激后24小时收集上清液以测量细胞因子水平。与ROR1-CAR-T细胞设置类似，NR4A3 KO NY-ESO-1TCR T细胞仍然对A375肿瘤细胞具有最强的细胞毒性，从而证实了与3个不同供体中的对照相比，在2或3轮刺激后具有更持久的裂解靶细胞的能力(图14)。

除了持续的细胞毒性外，当在大多数测量的时间点用表达A375黑色素瘤NY-ESO-1/LAGE-1a的肿瘤细胞刺激大多数供体时，NR4A3KO NY-ESO-1TCR T细胞还产生比未编辑的对照NY-ESO-1TCR T细胞更高的IFN-、IL-2和TNF-α(图15和表3-5)。当使用第二种表达NY-ESO-1/LAGE-1a的肿瘤细胞系H1703连续刺激T细胞时，观察到类似的结果(数据未显示)。按照制造商的说明书，使用中尺度发现V-Plex促炎小组1人试剂盒或定制的人IFN-、IL-2和TNF-α细胞因子试剂盒测量细胞因子水平。细胞因子产生的差异在随后几轮刺激中最为显著。

表3.在对应于图15的A375依序刺激测定期间，由NR4A编辑的和对照未编辑的NY-ESO-1TCR T细胞产生的分泌型干扰素-γ(IFN-)的非成对t检验统计分析。ns-不显著，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，****p<0.0001。

表4.在对应于图15的A375依序刺激测定期间，由NR4A编辑的和对照未编辑的NY-ESO-1TCR T细胞产生的分泌型白介素-2(IL-2)的非成对t检验统计分析。ns-不显著，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，****p<0.0001。

表5.在对应于图15的A375依序刺激测定期间，由NR4A编辑的和对照未编辑的NY-ESO-1TCR T细胞产生的分泌性肿瘤坏死因子α(TNF-α)的非成对t检验统计分析。ns-不显著，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001，****p<0.0001。

***

应当理解，意图使用具体实施方式部分而非发明内容以及摘要部分来对权利要求进行解释。发明内容和摘要部分可阐明如发明人所构想的本公开的一个或多个但非所有的示例性方面，并且因此，并不意图通过任何方式对本公开和所附权利要求进行限制。

本公开已经在上文中借助于说明特定功能的实施及其关系的功能性结构单元进行了描述。为便于描述，本文中已经任意地界定这些功能性结构单元的边界。也可限定替代边界，只要指定功能及其相互关系被适当地执行。

具体方面的前述描述将充分地揭示本公开的一般特性，以使得其他人通过应用本领域中的知识，在无过度实验且不背离本公开的一般概念的情况下，可容易地针对各种应用对此类具体方面进行修改和/或改变。因此，基于本文呈现的教义和指导，此类改变和修改意图在所公开方面的等效物的含义和范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由熟练的技术人员根据教义和指导进行解释。

本公开的广度和范围不应受任何上述示例性方面的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来限定。

本申请中引用的所有引用参考文献(包括文献参考文献、美国或外国专利或专利申请以及网站)的内容在此明确引入作为参考，如同出于任何目的将其全部写入本文一样，其中引用的参考文献也是如此。在出现任何不一致的情况下，以本文字面公开的材料为准。

序列表

<110> 莱尔免疫制药公司(LYELL IMMUNOPHARMA, INC.)

<120> NR4A3缺陷型细胞及其用途

<130> 4385.075PC02

<150> US 63/194,745

<151> 2021-05-28

<150> US 63/365,024

<151> 2022-05-19

<160> 123

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 626

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3同工型α

<400> 1

Met Pro Cys Val Gln Ala Gln Tyr Ser Pro Ser Pro Pro Gly Ser Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Gln Thr Tyr Ser Ser Glu Tyr Thr Thr Glu Ile Met Asn

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Tyr Ser Ser Asn Tyr Glu Leu Lys Pro Ser Cys Val Tyr Gln Met Gln

65 70 75 80

Arg Pro Leu Ile Lys Val Glu Glu Gly Arg Ala Pro Ser Tyr His His

85 90 95

His His His His His His His His His His His His Gln Gln Gln His

100 105 110

Gln Gln Pro Ser Ile Pro Pro Ala Ser Ser Pro Glu Asp Glu Val Leu

115 120 125

Pro Ser Thr Ser Met Tyr Phe Lys Gln Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr

130 135 140

Thr Pro Ala Phe Pro Pro Gln Ala Gly Ala Leu Trp Asp Glu Ala Leu

145 150 155 160

Pro Ser Ala Pro Gly Cys Ile Ala Pro Gly Pro Leu Leu Asp Pro Pro

165 170 175

Met Lys Ala Val Pro Thr Val Ala Gly Ala Arg Phe Pro Leu Phe His

180 185 190

Phe Lys Pro Ser Pro Pro His Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Gly Gly

195 200 205

His His Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ser Leu Pro

210 215 220

Leu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ala Leu Glu Ser

225 230 235 240

His Pro Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Lys Arg Ala Ala Pro Leu Ala Phe

245 250 255

Pro Pro Leu Gly Leu Thr Pro Ser Pro Thr Ala Ser Ser Leu Leu Gly

260 265 270

Glu Ser Pro Ser Leu Pro Ser Pro Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly

275 280 285

Glu Gly Thr Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His Tyr

290 295 300

Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val

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Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro Val

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Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys

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Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro Leu Gln Gln

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565 570 575

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Leu Val Ser Pro Pro Ser Ile Ile Asp Lys Leu Phe Leu Asp Thr Leu

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Pro Phe

625

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3同工型β

<400> 2

Met Pro Cys Val Gln Ala Gln Tyr Ser Pro Ser Pro Pro Gly Ser Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Gln Thr Tyr Ser Ser Glu Tyr Thr Thr Glu Ile Met Asn

20 25 30

Pro Asp Tyr Thr Lys Leu Thr Met Asp Leu Gly Ser Thr Glu Ile Thr

35 40 45

Ala Thr Ala Thr Thr Ser Leu Pro Ser Ile Ser Thr Phe Val Glu Gly

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Tyr Ser Ser Asn Tyr Glu Leu Lys Pro Ser Cys Val Tyr Gln Met Gln

65 70 75 80

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85 90 95

His His His His His His His His His His His His Gln Gln Gln His

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Gln Gln Pro Ser Ile Pro Pro Ala Ser Ser Pro Glu Asp Glu Val Leu

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Thr Pro Ala Phe Pro Pro Gln Ala Gly Ala Leu Trp Asp Glu Ala Leu

145 150 155 160

Pro Ser Ala Pro Gly Cys Ile Ala Pro Gly Pro Leu Leu Asp Pro Pro

165 170 175

Met Lys Ala Val Pro Thr Val Ala Gly Ala Arg Phe Pro Leu Phe His

180 185 190

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Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro Val

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Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys

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Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro Leu Gln Gln

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Ala Leu Val Arg Ala Leu Thr Asp Ser Thr Pro Arg Asp Leu Asp Tyr

405 410 415

Ser Arg Val Ser Phe Met Ile Ser Cys Phe Gln Met Asn Asp Gln Gly

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Leu Tyr Leu Trp Leu Leu Val Ile Arg Val Asp

435 440

<210> 3

<211> 637

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3同工型3

<400> 3

Met His Asp Ser Ile Arg Phe Gly Asn Val Asp Met Pro Cys Val Gln

1 5 10 15

Ala Gln Tyr Ser Pro Ser Pro Pro Gly Ser Ser Tyr Ala Ala Gln Thr

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His His His His His His His Gln Gln Gln His Gln Gln Pro Ser Ile

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Pro Gln Ala Gly Ala Leu Trp Asp Glu Ala Leu Pro Ser Ala Pro Gly

165 170 175

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180 185 190

Thr Val Ala Gly Ala Arg Phe Pro Leu Phe His Phe Lys Pro Ser Pro

195 200 205

Pro His Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Gly Gly His His Leu Gly Tyr

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Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ser Leu Pro Leu Gly Ala Ala Ala

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Ala Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ala Leu Glu Ser His Pro Tyr Gly Leu

245 250 255

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Pro Ser Pro Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Glu Gly Thr Cys Ala

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325 330 335

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340 345 350

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Leu Ala Cys Leu Ser Ala Leu Ser Met Ile Thr Glu Arg His Gly Leu

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Ser Ile Ile Asp Lys Leu Phe Leu Asp Thr Leu Pro Phe

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<210> 4

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 野生型人 c-Jun

<400> 4

Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys

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Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser

35 40 45

Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro

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Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu

100 105 110

Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro

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Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala

130 135 140

Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser

145 150 155 160

Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe

165 170 175

Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala

180 185 190

Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro

195 200 205

His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala

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Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro

225 230 235 240

Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu

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Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg

260 265 270

Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys

275 280 285

Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln

290 295 300

Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys

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Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe

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<210> 5

<211> 3257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 野生型人c-Jun

<400> 5

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ttattttctt ttcaccttct ctctaactgc ccagagctag cgcctgtggc tcccgggctg 180

gtgtttcggg agtgtccaga gagcctggtc tccagccgcc cccgggagga gagccctgct 240

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<210> 6

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 野生型人c-Jun (编码区)

<400> 6

atgactgcaa agatggaaac gaccttctat gacgatgccc tcaacgcctc gttcctcccg 60

tccgagagcg gaccttatgg ctacagtaac cccaagatcc tgaaacagag catgaccctg 120

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aagaacgtga cagatgagca ggagggcttc gccgagggct tcgtgcgcgc cctggccgaa 360

ctgcacagcc agaacacgct gcccagcgtc acgtcggcgg cgcagccggt caacggggca 420

ggcatggtgg ctcccgcggt agcctcggtg gcagggggca gcggcagcgg cggcttcagc 480

gccagcctgc acagcgagcc gccggtctac gcaaacctca gcaacttcaa cccaggcgcg 540

ctgagcagcg gcggcggggc gccctcctac ggcgcggccg gcctggcctt tcccgcgcaa 600

ccccagcagc agcagcagcc gccgcaccac ctgccccagc agatgcccgt gcagcacccg 660

cggctgcagg ccctgaagga ggagcctcag acagtgcccg agatgcccgg cgagacaccg 720

cccctgtccc ccatcgacat ggagtcccag gagcggatca aggcggagag gaagcgcatg 780

aggaaccgca tcgctgcctc caagtgccga aaaaggaagc tggagagaat cgcccggctg 840

gaggaaaaag tgaaaacctt gaaagctcag aactcggagc tggcgtccac ggccaacatg 900

ctcagggaac aggtggcaca gcttaaacag aaagtcatga accacgttaa cagtgggtgc 960

caactcatgc taacgcagca gttgcaaaca ttt 993

<210> 7

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#1

<400> 7

atgacagcca agatggaaac cacattctac gacgacgccc tgaacgcctc attcctgcct 60

tctgagagcg gaccttacgg ctacagcaat cctaagatcc tgaaacagag catgaccctt 120

aacctggctg atcctgttgg aagcctgaaa cctcacctga gagccaaaaa cagcgacctg 180

ctcaccagcc ctgatgtggg cctgctgaag ctggcctctc cagagctgga acggctgatc 240

atccagagca gcaacggcca catcacaacc acccctaccc ctacacaatt cctgtgccct 300

aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgaaggct ttgtgcgggc cctggcagaa 360

ctgcactctc agaacaccct gcctagcgtg acctccgccg cccagcctgt caacggcgcc 420

ggaatggtgg cccctgccgt ggcttctgtg gccggcggca gcggcagcgg cggattcagc 480

gcctctctgc actctgagcc tcctgtctac gccaatctgt ctaatttcaa ccccggagcc 540

ctgtccagcg gcggcggagc tcctagctac ggcgctgctg gactggcctt ccccgcccag 600

ccccagcaac agcagcagcc tccacaccac ctgccccagc agatgcccgt gcagcaccct 660

agactgcagg ccctgaagga agaaccccaa acagtgcctg agatgcctgg cgagacacct 720

ccactgagcc ccatcgacat ggaaagccag gagcggatca aggccgagag aaagagaatg 780

cggaacagaa tcgccgctag caagtgcaga aagcggaagc tggaaagaat cgccagactg 840

gaagagaagg tgaagaccct gaaagcccaa aatagcgagc tggccagcac cgccaacatg 900

ctgcgggaac aggtggccca gctgaagcag aaggtgatga accacgtgaa ctctggttgt 960

cagctgatgc tgacccagca gctccagacc ttc 993

<210> 8

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#2

<400> 8

atgacagcca agatggaaac caccttctac gacgacgccc tcaacgcctc cttcctgcct 60

tctgagagcg gtccttacgg ctacagcaac cccaagatcc tgaagcaaag catgaccctg 120

aacctggccg accccgttgg ctccctgaaa cctcacctga gagccaaaaa cagcgacctg 180

ctgaccagcc ctgatgtggg cctgctgaag ctggcctctc cagagctgga aagactgatt 240

atccagagca gcaacggcca catcaccaca acacctaccc ctacacagtt cctgtgccct 300

aagaacgtga ctgatgagca ggagggcttt gccgagggct tcgtgagagc cctggctgag 360

ctgcattctc agaacaccct gcctagcgtg acctctgccg cccagcctgt taatggcgcc 420

ggcatggtgg cccctgccgt ggcctctgtg gccggaggca gcggcagcgg cggattcagc 480

gcctctctgc acagcgagcc ccccgtctac gccaacctga gcaatttcaa ccctggcgcc 540

ctgtccagcg gcggcggcgc cccttcatat ggcgctgccg gcctggcctt ccccgctcag 600

ccccagcagc agcaacagcc tccacaccac ctgccccagc agatgcccgt gcagcacccc 660

agactgcagg ccctgaagga agaacctcag accgtgcccg agatgcctgg cgagacccct 720

cctctgagcc ctatcgacat ggaaagccag gagagaatca aggccgagag gaagcggatg 780

cggaacagaa tcgccgccag caagtgcaga aaaagaaagc tggaacggat cgccagactg 840

gaggagaagg tgaagacact gaaagcccaa aattctgaac tggcctctac cgccaatatg 900

ctgcgcgagc aggtggctca actgaagcag aaggtgatga accacgtgaa cagcggatgt 960

cagctgatgc tgacacagca gctgcagact ttt 993

<210> 9

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#3

<400> 9

atgaccgcca agatggaaac caccttctac gacgacgccc tgaacgccag ctttctgcct 60

tctgagtctg gcccctacgg ctacagcaac cccaagatcc tgaagcagag catgaccctg 120

aacctggccg atcctgtggg cagcctgaaa cctcacctga gagccaagaa cagcgacctg 180

ctgacaagcc ctgatgtggg cctgctgaaa ctggcctctc ctgagctgga acggctgatc 240

atccagagca gcaacggcca catcaccacc acacctacac caacacagtt tctgtgcccc 300

aagaacgtga ccgacgagca agagggattc gccgagggct ttgttagagc cctggccgaa 360

ctgcacagcc agaataccct gcctagcgtg acatctgccg ctcagcctgt taatggcgcc 420

ggaatggttg ctcctgccgt ggcttctgtt gctggcggat ctggatctgg cggctttagc 480

gcctctctgc actctgagcc tccagtgtac gccaacctga gcaacttcaa ccctggcgct 540

cttagctctg gtggcggagc accttcttat ggcgctgccg gattggcctt tcctgctcag 600

cctcagcagc agcaacagcc tcctcatcat ctgccccagc agatgcctgt gcagcaccct 660

agactgcagg ccctgaaaga ggaaccccag acagtccctg agatgcccgg cgaaacacct 720

cctctgagcc ccatcgacat ggaaagccaa gagcggatca aggccgagcg gaagcggatg 780

agaaatagaa tcgccgcctc caagtgccgg aagaggaagc tggaaagaat cgcccggctg 840

gaagagaaag tgaaaaccct gaaggcccag aactccgagc tggcctctac cgccaacatg 900

ctgagagaac aggtggccca gctgaaacag aaagtcatga accacgtgaa cagcggctgc 960

cagctgatgc tgacacagca gctgcagacc ttc 993

<210> 10

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#4

<400> 10

atgactgcca aaatggagac tacattctat gacgacgccc tcaatgccag ttttttgccg 60

agtgaatccg gcccctacgg ctattcaaac cctaagatcc tcaagcaatc aatgaccctc 120

aatcttgctg acccagttgg ctccctgaaa ccccatctca gagctaaaaa tagtgacctc 180

cttacttccc ctgatgttgg actcctcaaa cttgcttctc ccgaactcga acgcttgatc 240

attcaatctt ccaacggcca catcacaaca acacccacac ccacccagtt tctttgccca 300

aaaaatgtca ccgatgaaca ggaaggtttc gcggaaggat tcgtccgcgc gctggccgaa 360

ctgcactccc agaatacact tccttcagtt acgtcagccg cccagccagt gaatggtgcg 420

ggaatggttg ctcctgcggt cgcttctgtc gcagggggct ccggttctgg cggatttagc 480

gcctctctgc attccgagcc acctgtatat gctaatcttt ctaattttaa ccccggagcc 540

ttgtctagcg gcggtggtgc ccccagctac ggtgctgcag gactcgcctt cccagctcaa 600

cctcagcagc agcaacaacc cccccatcac cttccccaac agatgccagt acaacatcca 660

aggctccagg ccctcaaaga ggaaccacag acggtgcccg aaatgcctgg cgaaactcca 720

ccactttccc ctattgatat ggaatcccaa gagcgcatca aggccgaaag aaagcgaatg 780

cggaatagaa tagcagcttc aaaatgtaga aaacggaaat tggaacgaat cgcacggttg 840

gaagaaaagg tgaagacctt gaaagcccag aacagtgagc tcgcctctac cgctaacatg 900

ctgcgcgagc aagtcgcaca acttaagcag aaggtgatga accatgtgaa tagcggatgt 960

caacttatgc tgactcaaca gttgcaaacc ttt 993

<210> 11

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#5

<400> 11

atgaccgcga aaatggagac aacattttac gatgatgcac tgaacgcctc ttttctgcca 60

agtgaatccg gcccctacgg atactcaaac cctaagattc tgaaacagtc tatgactctc 120

aacctggccg acccagttgg cagtctgaag cctcatttgc gagccaagaa tagtgatctg 180

ctgacctccc cagacgtggg actgctgaaa ctcgcctcac ctgaacttga gcgcttgatt 240

atacagtcat ccaatgggca catcacaaca acacctactc ctacccagtt tctgtgcccc 300

aaaaacgtca ccgatgagca ggagggattc gcggaaggct ttgtgcgcgc cctggctgaa 360

ttgcatagtc agaacactct tcccagcgta accagcgccg cccaaccagt gaatggagcc 420

ggtatggtgg ctcccgcggt ggctagtgtt gcgggggggt caggctctgg tgggttcagt 480

gcttctcttc actctgaacc ccctgtgtat gccaatctgt ctaactttaa ccctggggcc 540

ctctcctctg gtgggggtgc ccccagctac ggagcggccg gcctggcctt tcctgcccag 600

cctcagcagc agcagcaacc ccctcatcat cttccgcagc agatgccagt acagcatcca 660

cgcctgcagg ctcttaagga ggagccccag acggtgcccg aaatgcccgg ggaaactcca 720

cccttgtccc ccattgacat ggagtcccag gagcggatca aggctgaaag aaagaggatg 780

cggaatcgca tcgcagcctc taaatgccgc aagcggaaac ttgagaggat cgcgcggttg 840

gaggaaaaag taaaaacctt gaaggcacag aactctgagc tggcgagtac tgccaacatg 900

ctcagagaac aagtcgcaca gctgaagcag aaagtgatga accatgtgaa cagcggttgt 960

cagctgatgc tgactcagca gctgcagacc ttc 993

<210> 12

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#6

<400> 12

atgaccgcca agatggagac cacattctac gatgacgctc tgaacgcttc ctttctgcct 60

tccgagtccg gcccctacgg ctactccaat cccaagattc tgaagcagag catgacactg 120

aatctggctg atcccgtggg atctctgaag cctcatctga gagccaagaa ttccgatctg 180

ctgacaagcc ccgacgtggg actgctcaaa ctggccagcc ccgaactgga gaggctcatt 240

atccagagct ccaacggcca catcaccaca acacctaccc ctacccagtt tctctgtccc 300

aagaacgtga cagacgagca agagggattt gccgaaggct tcgtgagagc cctcgccgaa 360

ctgcatagcc agaacacact gccttccgtg accagcgctg ctcaacccgt gaacggcgct 420

ggcatggtcg ctcccgccgt cgccagcgtg gctggaggaa gcggatccgg aggcttcagc 480

gcttccctcc acagcgaacc tcccgtgtac gctaatctga gcaacttcaa ccccggcgct 540

ctgagcagcg gaggaggagc tcctagctat ggagctgccg gactggcttt tcccgcccag 600

ccccagcagc agcagcagcc cccccatcat ctgcctcagc agatgcccgt gcagcatccc 660

agactccaag ctctgaagga ggagcctcag accgtccccg agatgcccgg cgaaaccccc 720

cctctgtccc ccatcgacat ggaaagccaa gagaggatca aggccgagag gaagaggatg 780

aggaatagaa tcgccgccag caagtgtaga aagaggaagc tggagaggat cgccagactg 840

gaggagaagg tgaagaccct caaggctcag aattccgagc tggccagcac agccaacatg 900

ctgagagagc aagtggccca gctcaagcag aaggtgatga accacgtcaa cagcggatgc 960

cagctgatgc tcacccagca gctgcagacc ttc 993

<210> 13

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#7

<400> 13

atgaccgcta aaatggaaac cactttctat gacgatgccc tgaacgcctc cttccttccg 60

tccgagtccg gaccctacgg atactcaaat cctaagatcc tcaaacagtc gatgaccctc 120

aacctggccg accccgtggg atccctgaag ccgcacttgc gcgccaagaa ctccgacctc 180

ctgacgagcc cagacgtggg cctgctgaag ctcgcatcac ccgaacttga gcggttgatc 240

attcagtcct ccaacggaca tatcaccacc actcccaccc caactcagtt tctgtgtccg 300

aagaacgtga ccgatgagca agagggattc gccgagggat tcgtgcgggc cctggccgag 360

ctgcatagcc agaacaccct tccatccgtg acctcggcgg ctcagcctgt gaacggcgcg 420

ggaatggtcg cgcccgccgt ggcctcggtg gccgggggca gcggcagcgg gggattttcc 480

gcgtcgctgc actccgagcc gccggtgtac gccaacctgt caaacttcaa ccctggggcc 540

ctgagctccg gcggtggagc accttcgtac ggcgccgctg gcctggcgtt ccccgcgcaa 600

ccacagcagc aacagcagcc ccctcaccac ctcccccaac aaatgcctgt gcagcacccg 660

aggctgcagg ccctcaagga agaaccccag actgtgccgg aaatgccggg ggagactccg 720

ccgctgtccc ctatcgacat ggaatcacag gaacgcatta aggcagagcg gaagcgcatg 780

cggaaccgga ttgccgcctc caagtgccgc aagagaaagc tcgaaagaat cgccagattg 840

gaagaaaagg tcaagactct gaaggcccag aactctgagc tggcatccac cgctaatatg 900

ctgagggaac aagtggccca gctgaaacag aaggtcatga accacgtcaa cagcggttgc 960

cagctgatgc tgacccagca actccagaca ttc 993

<210> 14

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#8

<400> 14

atgaccgcca agatggagac caccttctac gacgacgccc tgaacgccag cttcctgccc 60

agcgagagcg gaccctacgg ctactctaac cccaagatcc tgaaacagag catgacactg 120

aatctggccg accccgtggg cagcctgaag cctcacctta gagccaagaa cagcgacctg 180

ctgaccagcc ccgacgtggg cctgctgaag ctcgcctctc cagagttaga gagactgatc 240

atccagtcca gcaacggcca catcacaacc accccaaccc ctacccagtt cctgtgcccc 300

aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgagggct ttgtgagagc cctggccgag 360

ttgcactctc agaacaccct gccctccgtg accagcgccg ctcaacctgt gaacggcgca 420

ggaatggttg ctcctgccgt ggccagcgtt gcaggcggat ctggaagtgg aggcttctcc 480

gcctcccttc acagcgagcc tcccgtgtac gccaacctga gcaacttcaa ccccggcgcc 540

ctgagcagtg gaggaggcgc tcccagctat ggagcagctg gattagcctt ccccgcccag 600

ccacagcagc agcaacagcc tccccaccac ctgcctcagc aaatgcctgt gcagcaccct 660

cggctgcagg cccttaagga ggagccccag accgttcctg agatgcctgg cgagacccct 720

cccctgagcc ctatcgacat ggagtcccag gagcggatca aggccgagcg gaagcggatg 780

cggaaccgga tcgctgcttc caagtgccgg aagagaaagc tggagagaat cgcccggctg 840

gaggagaagg tgaagaccct gaaggcccag aactccgagc tggcctccac cgccaacatg 900

ctgcgggagc aggttgcaca gctgaagcag aaggtcatga accacgtgaa cagcggctgc 960

cagctgatgc tgacccagca gctgcagacc ttc 993

<210> 15

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#9

<400> 15

atgacagcga agatggagac aaccttctat gacgatgctc ttaacgcctc cttcctgcct 60

tccgaaagcg ggccctacgg gtactctaat cctaagatac ttaagcaatc gatgactctc 120

aacctcgctg acccggttgg ctcactgaaa ccacacctga gagctaagaa tagtgacctg 180

ctcactagtc ccgatgtcgg gcttctgaag ctggcctctc ccgagctgga gaggcttatc 240

atccaatcat caaatggcca catcaccact accccaacac caactcaatt cctttgccct 300

aaaaacgtga ccgacgaaca ggaaggcttc gccgagggtt ttgtccgggc cttggccgag 360

ctgcattctc aaaatacact gccaagcgtc acttctgcgg cgcagccggt taacggagca 420

gggatggtgg ctcccgccgt tgctagcgtg gccggcggtt ccggctccgg cggtttctct 480

gcctccttgc attctgagcc accagtctac gcgaacctgt ccaactttaa tccgggggcg 540

ctgagtagcg gaggcggcgc ccctagctat ggggcagctg gactggcctt cccggcacaa 600

ccccaacaac aacagcaacc gccacaccat cttcctcaac aaatgccagt gcaacatcca 660

cgcttacaag ccctcaagga ggaaccccag accgtgcctg agatgcccgg cgaaaccccg 720

ccattgagcc ctattgacat ggaaagtcaa gagagaatta aggcagagcg caagagaatg 780

aggaaccgga tcgcagcatc taagtgccgc aaacggaaat tggagcggat cgctcgcttg 840

gaggagaagg tcaagactct caaggcccag aactccgagc ttgcgagcac agctaatatg 900

ctgcgcgagc aggtggccca gttaaaacaa aaggtcatga accatgtgaa cagcggctgt 960

cagctgatgc ttacgcaaca gctgcaaacc tttggctccg gtgcaacgaa cttcagcctg 1020

ctgaagcagg ccggagatgt tgaggaaaat ccaggtccc 1059

<210> 16

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> c-Jun密码子优化#10

<400> 16

atgacggcca aaatggagac tacgttctac gatgacgcac tcaacgcgtc cttcctgccc 60

tctgagagtg gaccctatgg ctactccaat ccaaagatcc tgaagcagtc tatgaccctc 120

aacctggcgg acccggtggg ctcccttaag ccgcacttgc gcgccaagaa ctccgacctg 180

ctgacctccc ctgatgtggg cctcctcaag ctcgctagcc ctgaattgga gaggctgatc 240

atccagagct caaatggcca catcaccacc acacctaccc caacccagtt cctgtgccca 300

aaaaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gcggagggct tcgtcagagc tctggccgag 360

ctgcactcac agaacacgct cccttccgtg acctccgctg cccagccggt caatggcgct 420

ggaatggtgg ctccggctgt ggcctctgtt gccggcggct ccggctccgg aggcttttca 480

gcttctctgc attctgagcc cccagtgtac gctaacctga gcaacttcaa ccccggggcg 540

ctcagctccg gtggcggtgc cccgagctac ggcgcggctg ggctggcgtt ccccgctcag 600

cctcagcagc aacagcaacc tccccaccac ctgccacagc agatgcctgt gcagcaccca 660

cgcctgcagg ccttgaagga ggaacctcag actgtgccag agatgcccgg cgagacccca 720

cccctgtccc cgattgacat ggagagccag gagcgcatca aggcagagcg caagcgtatg 780

cgcaaccgca tcgcggcctc caagtgccga aagcgcaagc tggagcggat tgctcgcctg 840

gaggagaagg tgaagaccct gaaggcccag aattccgagc tggcctcgac cgccaacatg 900

ctacgagaac aggtcgcgca gctgaaacag aaggtcatga accatgtcaa cagcgggtgc 960

cagctgatgt tgacccagca gcttcagacc ttc 993

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VH

<400> 17

Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val

50 55 60

Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VH CDR1

<400> 18

Ala Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VH CDR2

<400> 19

Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VH CDR3

<400> 20

Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile

1 5 10

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VL

<400> 21

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser

1 5 10 15

Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr

20 25 30

Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro

65 70 75 80

Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr

85 90 95

Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly

100 105 110

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VL CDR1

<400> 22

Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VL CDR2

<400> 23

Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12 VL CDR3

<400> 24

Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val

1 5

<210> 25

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A1 sgRNA 5

<400> 25

gaaguccucg aacuugaagg 20

<210> 26

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A1 sgRNA 6

<400> 26

accuucaugg acggcuacac 20

<210> 27

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A2 sgRNA 1

<400> 27

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<220>

<223> 金黄色葡萄球菌嵌合框架

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Pro Ala Ser Gln Ser Tyr Ser Tyr His Ser Ser Gly Glu Tyr Ser Ser

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Ser Gln Leu Leu Asp Thr Gln Val Pro Ser Pro Pro Ser Arg Gly Ser

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Pro Ser Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys

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Asn Ile Asp Ile Ser Ala Phe Ser Cys Ile Ala Ala Leu Ala Met Val

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Leu Asp Thr Leu Pro Phe

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<212> PRT

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Gly Ser His His Val Val Asp Gly Gln Thr Phe Ala Val Pro Asn Pro

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Ile Ile Arg Gly Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Asp Leu Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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325 330 335

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Glu Gly Ser Gly Ile Leu Asp Thr Pro Val Thr Ser Thr Lys Ala Arg

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260 265 270

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275 280 285

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<210> 60

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gacgacgagc uccugcuggg 20

<210> 61

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 14

<400> 61

gucgggguuc augaucuccg 20

<210> 62

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 15

<400> 62

gagggcuuga aguggaagag 20

<210> 63

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 16

<400> 63

gaugaaggcg guccccacgg 20

<210> 64

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 17

<400> 64

gaagguacug augcugggca 20

<210> 65

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 18

<400> 65

uccuccagcc uccagcccgg 20

<210> 66

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 19

<400> 66

agcaucagua ccuucgugga 20

<210> 67

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 20

<400> 67

cgacuacacc aagcugacca 20

<210> 68

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 21

<400> 68

uggucagcuu gguguagucg 20

<210> 69

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 22

<400> 69

gcuggacccg ccgaugaagg 20

<210> 70

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 23

<400> 70

uugaaguaca uggaggugcu 20

<210> 71

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 24

<400> 71

guacgggugg cucucaagcg 20

<210> 72

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 25

<400> 72

ccgcauaacu ggaaccugga 20

<210> 73

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 26

<400> 73

gggcacgugu gccgugugcg 20

<210> 74

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 27

<400> 74

uacggcgugc gaaccugcga 20

<210> 75

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 28

<400> 75

uggggacugc uugaaguaca 20

<210> 76

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 29

<400> 76

ccuuggcagc acugagauca 20

<210> 77

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 30

<400> 77

ccuugaucaa aguggaggag 20

<210> 78

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 31

<400> 78

ugcauuuggu acacgcagga 20

<210> 79

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 32

<400> 79

ugaucaaagu ggaggagggg 20

<210> 80

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 33

<400> 80

guggggaccg ccuucaucgg 20

<210> 81

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 34

<400> 81

aggagcucgu cgucuggcga 20

<210> 82

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 35

<400> 82

ccaccucggc uacgacccga 20

<210> 83

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 36

<400> 83

gcggcggcga gggcuugaag 20

<210> 84

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 37

<400> 84

cagcaucagu accuucgugg 20

<210> 85

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 38

<400> 85

gccgaugaag gcggucccca 20

<210> 86

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 39

<400> 86

ccgucggguc guagccgagg 20

<210> 87

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 40

<400> 87

cuacggcgug cgaaccugcg 20

<210> 88

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 41

<400> 88

ccauaacgcc cccgccugcg 20

<210> 89

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 42

<400> 89

auaacgcccc cgccugcggg 20

<210> 90

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 43

<400> 90

gccgcauaac uggaaccugg 20

<210> 91

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 44

<400> 91

gaaaucgaca guacugacau 20

<210> 92

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 45

<400> 92

uuucagaagu gucucagugu 20

<210> 93

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 46

<400> 93

gaagugucuc aguguuggaa 20

<210> 94

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 47

<400> 94

aguguuggaa ugguaaaaga 20

<210> 95

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 48

<400> 95

guacagauag ucugaaaggg 20

<210> 96

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 49

<400> 96

guguugaguc uguuaaagcu 20

<210> 97

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 50

<400> 97

gauagucuga aagggaggag 20

<210> 98

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 51

<400> 98

agucuguuaa agcucggaca 20

<210> 99

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 sgRNA 52

<400> 99

guccguacag auagucugaa 20

<210> 100

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NBRE

<400> 100

aaaaggtca 9

<210> 101

<400> 101

000

<210> 102

<400> 102

000

<210> 103

<400> 103

000

<210> 104

<400> 104

000

<210> 105

<400> 105

000

<210> 106

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A1 DBD #1

<400> 106

Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ser Cys Gln His

1 5 10 15

Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr

20 25 30

Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu Ala Asn Lys Asp Cys Pro

35 40 45

Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg Phe Gln Lys

50 55 60

Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu

65 70 75 80

Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys

85 90

<210> 107

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A1 DBD #2

<400> 107

Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ser Cys Gln His

1 5 10 15

Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr

20 25 30

Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu Ala Asn Lys Asp Cys Pro

35 40 45

Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg Phe Gln Lys

50 55 60

Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu

65 70 75 80

Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Gln

85 90

<210> 108

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A2 DBD #1

<400> 108

Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His

1 5 10 15

Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr

20 25 30

Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro

35 40 45

Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys

50 55 60

Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu

65 70 75 80

Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys

85 90

<210> 109

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A2 DBD #2

<400> 109

Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His

1 5 10 15

Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr

20 25 30

Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro

35 40 45

Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys

50 55 60

Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu

65 70 75 80

Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser

85 90

<210> 110

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 DBD #1

<400> 110

Gly Glu Gly Thr Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His

1 5 10 15

Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr

20 25 30

Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro

35 40 45

Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys

50 55 60

Cys Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu

65 70 75 80

Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys

85 90

<210> 111

<211> 93

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A3 DBD #2

<400> 111

Gly Glu Gly Thr Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His

1 5 10 15

Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr

20 25 30

Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro

35 40 45

Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys

50 55 60

Cys Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu

65 70 75 80

Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser

85 90

<210> 112

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DBD与NBRE结合TAL

<400> 112

Met Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn His Gly Gly

1 5 10 15

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln

50 55 60

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

65 70 75 80

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys

85 90 95

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

100 105 110

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

115 120 125

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

130 135 140

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

145 150 155 160

Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

165 170 175

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

180 185 190

Pro Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile

195 200 205

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

210 215 220

Leu Pro Val Cys Gln Ala His Gly

225 230

<210> 113

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DBD与NurRE结合TAL #1

<400> 113

Met Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn His Gly Gly

1 5 10 15

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala

20 25 30

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

35 40 45

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln

50 55 60

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

65 70 75 80

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys

85 90 95

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

100 105 110

Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

115 120 125

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

130 135 140

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

145 150 155 160

Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

165 170 175

Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

180 185 190

Pro Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile

195 200 205

Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

210 215 220

Leu Pro Val Cys Gln Ala His Gly

225 230

<210> 114

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DBD与NurRE结合TAL #2

<400> 114

Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala His

20 25 30

Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly

35 40 45

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala

50 55 60

His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly

65 70 75 80

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln

85 90 95

Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly

100 105 110

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys

115 120 125

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

130 135 140

His Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

145 150 155 160

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

165 170 175

His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

180 185 190

Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala

195 200 205

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

210 215 220

Pro Val Cys Gln Ala His Gly

225 230

<210> 115

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ZFP结合序列#1

<400> 115

aaaggtcaa 9

<210> 116

<400> 116

000

<210> 117

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ZFP结合序列#3

<400> 117

gatatt 6

<210> 118

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ZFP结合序列#4

<400> 118

gccaat 6

<210> 119

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DBD与ZFP #1

<400> 119

Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser

1 5 10 15

Phe Ser Gln Ser Gly Asn Leu Thr Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly

20 25 30

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser

35 40 45

Gly His Leu Val Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr

50 55 60

Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Arg Ala Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ala His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser

85 90

<210> 120

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DBD与ZFP #2

<400> 120

Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser

1 5 10 15

Phe Ser His Lys Asn Ala Leu Gln Asn His Gln Arg Thr His Thr Gly

20 25 30

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser

35 40 45

Gly Asn Leu Val Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser

50 55 60

<210> 121

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DBD与ZFP #3

<400> 121

Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser

1 5 10 15

Phe Ser Asp Cys Arg Asp Leu Ala Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly

20 25 30

Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Thr

35 40 45

Gly Asn Leu Thr Val His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser

50 55 60

<210> 122

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A LBD #1

<400> 122

Pro Leu Gln Gln Glu Pro Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ile

1 5 10 15

Cys Met Met Asn Ala Leu Val Arg Ala Leu Thr Asp Ser Thr Pro Arg

20 25 30

Asp Leu Asp Tyr Ser Arg Tyr Cys Pro Thr Asp Gln Ala Ala Ala Gly

35 40 45

Thr Asp Ala Glu His Val Gln Gln Phe Tyr Asn Leu Leu Thr Ala Ser

50 55 60

Ile Asp Val Ser Arg Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Thr Asp

65 70 75 80

Leu Pro Lys Glu Asp Gln Thr Leu Leu Ile Glu Ser Ala Phe Leu Glu

85 90 95

Leu Phe Val Leu Arg Leu Ser Ile Arg Ser Asn Thr Ala Glu Asp Lys

100 105 110

Phe Val Phe Cys Asn Gly Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Leu Arg

115 120 125

Gly Phe Gly Glu Trp Leu Asp Ser Ile Lys Asp Phe Ser Leu Asn Leu

130 135 140

Gln Ser Leu Asn Leu Asp Ile Gln Ala Leu Ala Cys Leu Ser Ala Leu

145 150 155 160

Ser Met Ile Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu

165 170 175

Glu Leu Cys Asn Lys Ile Thr Ser Ser Leu Lys Asp His Gln Ser Lys

180 185 190

Gly Gln Ala Leu Glu Pro Thr Glu Ser Lys Val Leu Gly Ala Leu Val

195 200 205

Glu Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu

210 215 220

Lys Leu Glu Asp Leu Val Ser Pro Pro Ser Ile Ile Asp Lys Leu Phe

225 230 235 240

Leu Asp Thr Leu Pro Phe

245

<210> 123

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NR4A LBD #2

<400> 123

Ser Pro Leu Gln Gln Glu Pro Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro

1 5 10 15

Ile Cys Met Met Asn Ala Leu Val Arg Ala Leu Thr Asp Ser Thr Pro

20 25 30

Arg Asp Leu Asp Tyr Ser Arg Tyr Cys Pro Thr Asp Gln Ala Ala Ala

35 40 45

Gly Thr Asp Ala Glu His Val Gln Gln Phe Tyr Asn Leu Leu Thr Ala

50 55 60

Ser Ile Asp Val Ser Arg Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Thr

65 70 75 80

Asp Leu Pro Lys Glu Asp Gln Thr Leu Leu Ile Glu Ser Ala Phe Leu

85 90 95

Glu Leu Phe Val Leu Arg Leu Ser Ile Arg Ser Asn Thr Ala Glu Asp

100 105 110

Lys Phe Val Phe Cys Asn Gly Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Leu

115 120 125

Arg Gly Phe Gly Glu Trp Leu Asp Ser Ile Lys Asp Phe Ser Leu Asn

130 135 140

Leu Gln Ser Leu Asn Leu Asp Ile Gln Ala Leu Ala Cys Leu Ser Ala

145 150 155 160

Leu Ser Met Ile Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val

165 170 175

Glu Glu Leu Cys Asn Lys Ile Thr Ser Ser Leu Lys Asp His Gln Ser

180 185 190

Lys Gly Gln Ala Leu Glu Pro Thr Glu Ser Lys Val Leu Gly Ala Leu

195 200 205

Val Glu Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr

210 215 220

Leu Lys Leu Glu Asp Leu Val Ser Pro Pro Ser Ile Ile Asp Lys Leu

225 230 235 240

Phe Leu Asp Thr Leu Pro Phe

245

Claims

1.一种治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用细胞组合物，所述细胞组合物包含经修饰的免疫细胞群体，所述经修饰的免疫细胞群体表达降低水平的核受体亚家族4A组成员3(“NR4A3”)基因和/或NR4A3蛋白和结合分子，并且具有NR4A1和NR4A2基因以及NR4A1和NR4A2蛋白的内源表达。

2.如权利要求1所述的方法，其中与参考细胞组合物(例如，其中细胞尚未被修饰为表达较低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的对应细胞组合物)相比，所述经修饰的免疫细胞群体中NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达水平降低至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中经修饰的免疫细胞包括淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞及它们的任何组合。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述淋巴细胞包括T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤(NK)细胞及它们的任何组合。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述淋巴细胞是T细胞。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述结合分子包含嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)，例如工程化TCR。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述结合分子包含CAR。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞是离体细胞或体外细胞。

9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞是体内细胞。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞通过基因编辑工具进行修饰，以降低所述NR4A3基因和/或所述NR4A3蛋白的表达。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述基因编辑工具包括shRNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、CRISPR、锌指核酸酶、TALEN、大范围核酸酶、限制性核酸内切酶或它们的任何组合。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述基因编辑工具是CRISPR。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中与参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3活性基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，所述经修饰的免疫细胞群体在所述受试者中表现出免疫细胞的一种或多种增强的特性。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞的所述增强的特性包括(i)所述免疫细胞的增强的扩增，(ii)所述免疫细胞的增强的细胞毒性，(iii)增强的持久性，(iv)所述免疫细胞的增强的细胞因子表达，或它们的任何组合。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞表现出增强的细胞因子表达。

16.如权利要求15所述的方法，其中细胞因子为白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或它们的任何组合。

17.如权利要求16所述的方法，其中与参考免疫细胞群体中IL-2的表达水平相比，IL-2的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍。

18.如权利要求16或17所述的方法，其中与参考免疫细胞群体中IL-γ的表达水平相比，IFN-γ的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍。

19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中与参考免疫细胞群体中TNF-α的表达水平相比，TNF-α的表达水平增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中与所述参考免疫细胞(即，尚未被修饰为具有降低的NR4A3活性基因水平和/或降低的NR4A3蛋白表达水平的免疫细胞)相比，所述经修饰的免疫细胞表现出减少的耗竭或功能障碍。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在连续刺激后表现出增强的细胞毒性。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在慢性刺激中表现出增强的细胞毒性。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述经修饰的免疫细胞在肿瘤微环境(TME)中维持抗肿瘤功能。

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述结合分子包含衍生自R12、R11、2A2或它们的任何组合的scFv。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述结合分子包含含有SEQ ID NO:17的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:21的轻链可变结构域。

26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中与参考肿瘤体积(例如，所述施用前所述受试者中的肿瘤体积和/或未接受所述施用的受试者中的肿瘤体积)相比，所述施用减小所述受试者中的肿瘤体积。

27.如权利要求26所述的方法，其中与所述参考肿瘤体积(例如，所述施用前所述受试者中的肿瘤体积和/或未接受所述施用的受试者中的肿瘤体积)相比，所述肿瘤体积在所述施用后减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与参考肿瘤重量(例如，所述施用前所述受试者中的肿瘤重量和/或未接受所述施用的受试者中的肿瘤重量)相比，所述施用减少所述受试者中的肿瘤重量。

29.如权利要求28所述的方法，其中与所述参考肿瘤重量(例如，所述施用前所述受试者中的肿瘤重量和/或未接受所述施用的受试者中的肿瘤重量)相比，所述肿瘤重量在所述施用后减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。

30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中与参考存活持续时间(例如，所述施用前所述受试者的存活持续时间和/或未接受所述施用的受试者的存活持续时间)相比，所述施用增加所述受试者的存活持续时间。

31.如权利要求30所述的方法，其中与所述参考存活持续时间相比，所述存活持续时间增加至少约一周、至少约两周、至少约三周、至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月、至少约四个月、至少约五个月、至少约六个月、至少约七个月、至少约八个月、至少约九个月、至少约10个月、至少约11个月或至少约一年。

32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述施用减少或防止所述免疫细胞的耗竭或功能障碍。

33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在肿瘤微环境(TME)中维持抗肿瘤功能。

34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述肿瘤源自癌症，所述癌症包括乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃(胃部)癌、胃肠癌、卵巢癌、宫颈癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。

35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用另外的治疗剂。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述另外的治疗剂包括化疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子的活化剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或它们的任何组合。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述另外的治疗剂是免疫检查点抑制剂。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体及它们的任何组合。

39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述另外的治疗剂和所述细胞组合物同时施用。

40.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述另外的治疗剂和所述细胞组合物依序施用。

41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物经肠胃外、肌内、皮下、眼部、静脉内、腹膜内、皮内、眶内、脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、瘤内或它们的任何组合施用。

42.如权利要求10至41中任一项所述的方法，其中所述基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96。

43.一种产生具有降低水平的核受体亚家族4A组成员3(“NR4A3”)基因和/或NR4A3蛋白的细胞的方法，其包括用基因编辑工具修饰所述细胞，其中所述基因编辑工具降低所述NR4A3基因和/或所述NR4A3蛋白的表达，其中所述基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:94和SEQ ID NO:96。

44.一种增加免疫细胞响应于抗原刺激而产生细胞因子的方法，其包括用基因编辑工具修饰所述免疫细胞，其中所述基因编辑工具降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达，并且其中所述基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述细胞因子包括IFN-γ、IL-2、TNF-α或它们的组合。

46.如权利要求44或45所述的方法，其中与未用基因编辑工具修饰的对应免疫细胞相比，在所述修饰之后，响应于所述抗原刺激的所述细胞因子的产生增加至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。

47.一种增加免疫细胞响应于持续抗原刺激的效应子功能的方法，其包括用基因编辑工具修饰所述免疫细胞，其中所述基因编辑工具降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达，并且其中所述基因编辑工具包含指导RNA，所述指导RNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96。

48.如权利要求47所述的方法，其中与参考免疫细胞相比，所述免疫细胞在至少一轮、至少两轮或至少三轮另外的抗原刺激测定中保持效应子功能。

49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述效应子功能包括以下能力：(i)杀伤靶细胞(例如，肿瘤细胞)，(ii)在进一步抗原刺激后产生细胞因子，或(iii)(i)和(ii)两者。

50.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:30所示的序列、由其组成或基本由其组成。

51.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:52所示的序列、由其组成或基本由其组成。

52.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:53所示的序列、由其组成或基本由其组成。

53.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:54所示的序列、由其组成或基本由其组成。

54.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:55所示的序列、由其组成或基本由其组成。

55.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:56所示的序列、由其组成或基本由其组成。

56.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:57所示的序列、由其组成或基本由其组成。

57.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:58所示的序列、由其组成或基本由其组成。

58.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:61所示的序列、由其组成或基本由其组成。

59.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:65所示的序列、由其组成或基本由其组成。

60.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:67所示的序列、由其组成或基本由其组成。

61.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:68所示的序列、由其组成或基本由其组成。

62.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:70所示的序列、由其组成或基本由其组成。

63.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:71所示的序列、由其组成或基本由其组成。

64.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:75所示的序列、由其组成或基本由其组成。

65.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:76所示的序列、由其组成或基本由其组成。

66.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:82所示的序列、由其组成或基本由其组成。

67.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:83所示的序列、由其组成或基本由其组成。

68.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:86所示的序列、由其组成或基本由其组成。

69.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:94所示的序列、由其组成或基本由其组成。

70.如权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:96所示的序列、由其组成或基本由其组成。

71.一种包含细胞的组合物，其中所述细胞已通过权利要求43所述的方法制备。

72.一种包含细胞的组合物，所述细胞表达降低水平的NR4A3基因和/或NR4A3蛋白，其中所述细胞已经用能够靶向所述NR4A3基因的gRNA修饰，其中所述gRNA包含下列中的任一者所示的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:96。

73.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:30所示的序列、由其组成或基本由其组成。

74.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:52所示的序列、由其组成或基本由其组成。

75.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:53所示的序列、由其组成或基本由其组成。

76.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:54所示的序列、由其组成或基本由其组成。

77.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:55所示的序列、由其组成或基本由其组成。

78.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:56所示的序列、由其组成或基本由其组成。

79.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:57所示的序列、由其组成或基本由其组成。

80.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:58所示的序列、由其组成或基本由其组成。

81.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:61所示的序列、由其组成或基本由其组成。

82.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:65所示的序列、由其组成或基本由其组成。

83.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:67所示的序列、由其组成或基本由其组成。

84.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:68所示的序列、由其组成或基本由其组成。

85.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:70所示的序列、由其组成或基本由其组成。

86.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:71所示的序列、由其组成或基本由其组成。

87.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ IDNO:75所示的序列、由其组成或基本由其组成。

88.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:76所示的序列、由其组成或基本由其组成。

89.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:82所示的序列、由其组成或基本由其组成。

90.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:83所示的序列、由其组成或基本由其组成。

91.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:86所示的序列、由其组成或基本由其组成。

92.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:94所示的序列、由其组成或基本由其组成。

93.如权利要求72所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:96所示的序列、由其组成或基本由其组成。

94.如权利要求71至93中任一项所述的组合物，其中所述细胞包含体内细胞。

95.如权利要求71至93中任一项所述的细胞组合物，其中所述细胞包含离体细胞或体外细胞。

96.一种药物组合物，其包含权利要求71至95中任一项所述的细胞组合物。

97.一种试剂盒，其包含(i)降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白的表达的基因编辑工具，(ii)包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的载体，以及用于根据权利要求1至42中任一项所述的方法治疗肿瘤的说明书。

98.一种试剂盒，其包含(i)降低NR4A3基因和/或NR4A3蛋白表达的基因编辑工具，(ii)包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的载体，以及用于制备包含细胞群体的组合物的说明书，其中所述细胞根据权利要求43所述的方法制备。