CN102206631A - 一种开源方式筛选靶向结合人dyrk1a基因靶位点的锌指蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，属于基因工程技术领域。该方法包括：(1)3个锌指蛋白库的构建；(2)报告载体和报告菌株的构建；(3)有效锌指库的筛选；(4)有效锌指库的连接、组装；(5)利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白。本发明所述的方法具有获得的锌指蛋白特异性和亲和性较高，组装的锌指核酸酶有更高的效率的优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法。
背景技术
锌指核酸酶技术是新近发展起来的一种可用于基因功能分析、动植物转基因研究以及基因治疗等领域的新兴技术。人工锌指核酸酶(Zinc fingernuclease，ZFN)是由锌指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)与非特异核酸酶结合的人工合成酶，此酶的N末端为锌指蛋白DNA结合域，能识别含有特定碱基序列的DNA序列，并结合在此位点；C末端是为非特异性核酸酶Fok I结构域。ZFN能识别一段特异的DNA序列，设计好的两个互补的ZFN分子以二聚体的形式同时特异性结合到目标DNA上，并在中间的5～7bp处切割，产生一个双链切口(Double strand break，DSB)，然后利用细胞固有的同源重组(Homologous recombination，HR)或非同源末端连接(Non-homologousend-joining，NHEJ)修复机制将切口修复，从而达到精确定点修饰和改造致病基因的目的，不仅将基因组靶向修饰的效率提高了3～5个数量级，而且具有极高的特异性。
人工锌指蛋白由若干锌指域组成，每个锌指单位约含30氨基酸残基，当Zn2+存在时折叠形成紧密的β-β-α结构，其中Zn2+夹叠在α螺旋和两股反向平行的β折叠中，与β折叠末端的2个半胱氨酸和α螺旋C末端的2个组氨酸形成四面体结构.单个锌指的α螺旋插入DNA双螺旋的大沟，其-1、2、3、6位置上的氨基酸残基可识别并结合DNA序列上3个连续碱基(Triplet)，而骨架结构保守。改变α螺旋上这几个位点的氨基酸残基，锌指识别位点的碱基也会改变，从而可增加锌指识别特异位点的多态性.如果把α螺旋-1至6位置上的7个关键氨基酸完全随机化，可得到一个锌指库，该库理论上可识别任意一个三联碱基。
特异识别并结合靶向DNA序列的锌指蛋白筛选是锌指核酸酶技术的核心，也是该技术的重点和难点.目前有模块式(Modular Assembly)和开源式两种方法组装或筛选特异性锌指蛋白.模块式方法不考虑锌指间的相互作用，将识别靶位点上三联碱基的若干单锌指直接依次连接组装，获得的锌指蛋白特异性较低；而开源式方法则更多地考虑多个锌指间的协同作用，将识别靶位点上各三联碱基的锌指库依次连接组装，再利用细菌双杂交系统筛选出与靶位点识别并结合的锌指蛋白，该方法获得的锌指蛋白特异性和亲和性较高，组装成的锌指核酸酶成功率更高。
Maeder等拥有识别所有三联碱基GNN和部分TNN的锌指库。每个识别特定三联碱基的锌指库至多含有95个锌指。该锌指库库容有限，不能对ANN或CNN等三联碱基筛选，并且没有这些锌指库的实验室也无法实现筛选。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有锌指库的不足，提供了一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，该锌指蛋白是三锌指蛋白即由三个锌指域(三个锌指单位)组成的锌指蛋白。
本发明的技术方案如下：
一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，包含下述步骤：
(1)、3个锌指蛋白库的构建：分别以已知的由ZF1、ZF2和ZF3组成的三锌指序列为模板，构建3个锌指蛋白库，其中每个锌指蛋白库中保持三锌指序列中的两个锌指序列不变，只将其中一个锌指序列的α螺旋中编码7个氨基酸的21碱基完全随机化，得到该锌指域随机的锌指蛋白库ZFP1、ZFP2和ZFP3，其中ZFP1库中所有序列保持ZF2和ZF3不变，仅ZF1为随机序列；ZFP2库中所有序列保持ZF1和ZF3不变，仅ZF2为随机序列；ZFP3库中所有序列保持ZF1和ZF2不变，仅ZF3为随机序列；
(2)、报告载体和报告菌株的构建：以阳性报告载体pBAC-BA-lacZ为底物，构建碱基序列片段，其中在该碱基序列片段中的原阳性报告载体相应位置上的三联碱基被作为引物的锌指序列识别的三联碱基代替；将所述碱基序列片段与阴性报告载体pBAC-lacZ骨架连接，得到报告载体；把所得到的报告载体分别转化到感受态细胞KJBAC中，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株，所述报告菌株分别为pBAC-RZFBS3-lacZ、pBAC-RZFBS2-lacZ、pBAC-RZFBS1-lacZ、pBAC-RZFBS-lacZ、pBAC-LZFBS1-lacZ、pBAC-LZFBS2-lacZ、pBAC-LZFBS3-lacZ、pBAC-LZFBS-lacZ；
(3)、有效锌指库的筛选：分别取步骤(1)中得到的锌指蛋白库和质粒pGal 4-Kan同时电转化到步骤(2)所得的报告菌株中，筛选得到有效锌指库；
(4)、有效锌指库的连接、组装：以步骤(3)筛选得到的同为一侧的有效锌指库为底物，用重叠PCR的方法将同侧的三个有效锌指库，分别扩增并连接起来，构建成识别整个右边靶位点的锌指蛋白库RF和左边靶位点的锌指蛋白库LF；
(5)、利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白：取步骤(4)中得到的锌指蛋白库RF和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS-lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合右半边靶位点的锌指蛋白；取步骤(4)中得到的锌指蛋白库LF和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS-lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合左半边靶位点的锌指蛋白。
上述技术方案中所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其中，所述步骤(1)中锌指蛋白库ZFP1、ZFP3和ZFP2的构建包括下述步骤：
(1)ZF1随机的ZFP1片段、ZF3随机的ZFP3片段和ZF2随机的ZFP2片段的构建，其中ZF1随机的ZFP1片段是通过以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZF1-F和ZFR为引物，进行PCR反应扩增；然后以此PCR反应产物为底物，以ZFF和ZFR引物，进行PCR反应扩增，得到ZF1随机的ZFP1片段；
ZF3随机的ZFP3片段是通过以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF和ZF3-R为引物，进行PCR反应扩增；然后以此PCR产物为底物，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR反应扩增，扩增完整的锌指蛋白表达片段，即得即ZF3随机的ZFP3片段；
ZF2随机的ZFP2片段是通过以以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应扩增三锌指片段上半部分；以pGP-FB-orig BA为底物，ZF2-F和ZFR为引物，扩增该片段的后半部分，将ZF2中的21个关键碱基随机化，然后将这两部分PCR产物等量混合，以ZFF和ZFR为引物，扩增全长片段，获得ZF2随机的ZFP2片段；
(2)将ZFP1片段、ZFP3片段和ZFP2片段分别与表达载体pGP-FF骨架连接；连接产物电转化到电转化感受态细胞JM109中，单克隆产物经培养后收集，提取质粒，获得ZF1随机的ZFP1库、ZF3随机的ZFP3库和ZF2随机的ZFP2库。
上述技术方案中所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其中，所述步骤(2)中报告载体和报告菌株的构建的具体步骤为：以阳性报告载体pBAC-BA-lacZ为底物，以RP为反向引物，分别以RZF3、RZF2、RZF1、RZF、LZF1、LZF2、LZF3和LZF为正向引物，分别扩增得到8个碱基序列片段RZFBS3、RZFBS2、RZFBS1、RZFBS、LZFBS1、LZFBS2、LZFBS3和LZFBS，该8个片段纯化酶切后，与双酶切后的阴性报告载体pBAC-lacZ骨架连接，分别得到8个报告载体pBAC-RZFBS3-lacZ、pBAC-RZFBS2-lacZ、pBAC-RZFBS1-lacZ、pBAC-RZFBS-lacZ、pBAC-LZFBS1-lacZ、pBAC-LZFBS2-lacZ、pBAC-LZFBS3-lacZ、pBAC-LZFBS-lacZ；把各个测序正确报告载体分别转化到感受态细胞KJBAC中，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株。
上述技术方案中所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其中，所述步骤(3)中有效锌指库的具体筛选步骤为：
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP3和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS3-lacZ中，筛选得到有效锌指库RZF3(Effective RZF3 pool)；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP2和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS2-lacZ中，筛选得到有效锌指库RZF2(Effective RZF2 pool)；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP1和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS1-lacZ中，筛选得到有效锌指库RZF1(Effective RZF1 pool)；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP3和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS3-lacZ中，筛选得到有效锌指库LZF3(Effective LZF3 pool)；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP2和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS2-lacZ中，筛选得到有效锌指库LZF2(Effective LZF2 pool)；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP1和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS1-lacZ中，筛选得到有效锌指库LZF1(Effective LZF1 pool)。
上述技术方案中所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其中，所述步骤(4)中有效锌指库的连接、组装的具体步骤为：以步骤(3)获得的有效锌指库RZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库RF3；以有效锌指库RZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库RF2；以有效锌指库RZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库RF1；取等量的扩增产物有效锌指库RF1、有效锌指库RF2和有效锌指库RF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的RZFP序列片段，即靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库RF；
以步骤(3)获得的有效锌指库LZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库LF3；以有效锌指库LZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库LF2；以有效锌指库LZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库LF1；取等量的扩增产物有效锌指库LF1、有效锌指库LF2和有效锌指库LF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的LZFP序列片段，即靶向结合左边识别位点的锌指蛋白库LF。
上述技术方案中所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其中，所述步骤(5)中利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白的具体步骤为：以步骤(4)所得的靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库RF为底物，用Xba I和BamH I双酶切后和线性化的pGP-FF骨架连接，连接产物转化到感受态细胞JM109中，提取质粒；将该质粒和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS-lacZ中，培养后挑取所有深色蓝斑菌落，继续培养后收集菌体，从β-半乳糖苷酶活性比阳性对照至少大三倍的单克隆中提取质粒，再转化到JM109感受态中扩增，提取质粒，得到识别右边靶序列锌指蛋白；
以步骤(4)所得的靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库LF为底物，用Xba I和BamH I双酶切后和线性化的pGP-FF骨架连接，连接产物转化到感受态细胞JM109中，提取质粒；将该质粒和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS-lacZ中，培养后挑取所有深色蓝斑菌落，继续培养后收集菌体，从β-半乳糖苷酶活性比阳性对照至少大三倍的单克隆中提取质粒，再转化到JM109感受态中扩增，提取质粒，得到识别左边靶序列锌指蛋白。
本发明所述的方法具有以下有益效果：
本发明采用开源式方法筛选靶向结合靶基因位点的锌指蛋白，将识别靶位点上各三联碱基的锌指库依次连接组装，再利用细菌双杂交系统筛选出与靶位点识别并结合的锌指蛋白，该方法获得的锌指蛋白特异性和亲和性较高，组装的锌指核酸酶有更高的效率。
附图说明：
1、图1为本发明所采用的底物和引物的PCR扩增示意图；
2、图2为本发明有效锌指库的连接组装中RF1有效锌指库、RF2有效锌指库、RF3有效锌指库的PCR扩增产物和三个有效锌指序列重叠PCR扩增产物的凝胶电泳图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
实施例一、
一、3个锌指蛋白库的构建：
1、ZF1(zinc finger 1，锌指域1)随机的ZFP1库的构建
1.1、ZF1随机的ZFP1片段的构建
以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZF1-F和ZFR为引物，用pfu polymerase按表1所示PCR反应体系扩增，循环条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s共28个循环，最后72℃延伸10min.将ZF1中的21个关键碱基随机化，然后以此PCR反应产物为底物，ZFF和ZFR引物，用pfu polymerase按表2所示PCR反应体系扩增，循环条件为：94℃5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s共20个循环，最后72℃延伸10min，扩增完整的锌指蛋白表达片段，即ZF1随机的ZFP1片段(Random ZFP1PCR fragment)；
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应体系
1.2、ZF1随机的ZFP1库的构建
获得的ZFP1片段(Random ZFP1 PCR fragment)用BamH I & Xba I在表3所示条件下双酶切后与在表4所示条件下双酶切的线性化表达载体pGP-FF骨架于16℃在表5所示条件下连接过夜；
连接产物经Takara核酸共沉剂纯化，2500V，5ms电转化到电转化感受态细胞JM109中，于LB+100μg/mL ampcillin固体培养基中，37℃培养过夜，刮下所有单克隆，再于LB+100μg/mL ampcillin液体培养基中，250rpm，37℃培养2h，按Tiangen质粒提取试剂盒说明提取质粒，获得ZF1随机的ZFP1库。
表3 ZFP1片段双酶切体系
表4 pGP-FF质粒双酶切体系
表5经BamH I与Xba I双酶切后的rZFP1片段和pGP-FF骨架连接体系
2、ZF3随机的ZFP3库的构建
以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF和ZF3-R为引物，用pfu polymerase按表1所示PCR反应体系扩增，循环条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s共20个循环，最后72℃延伸10min，将ZF3中的21个关键碱基随机化，然后以此PCR产物为底物，以ZFF和ZFR为引物按用pfu polymerase按表2所示PCR反应体系扩增，循环条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s共15个循环，最后72℃延伸10min，扩增完整的锌指蛋白表达片段，即ZF3随机的ZFP3片段(Random ZFP3PCR fragment)。
按ZFP1库的构建原理构建ZFP3库。
3、ZF2随机的ZFP2库的构建
以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF和ZF2-up为引物，用pfu polymerase按表1所示PCR反应体系，循环条件为：94℃ 5min，94℃30s，55℃ 30s，72℃ 30s共15个循环，最后72℃延伸10min，扩增三锌指片段上半部分(ZFP-Up PCR Fragment)；以pGP-FB-orig BA为底物，ZF2-R和ZFR为引物用pfu polymerase按表1所示PCR反应体系，循环条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s共15个循环，最后72℃延伸10min，扩增该片段的后半部分(ZFP-Down PCR Fragment)，将ZF2中的21个关键碱基随机化.然后将这两部分PCR产物等量混合，以ZFF和ZFR为引物用pfu polymerase按表6体系，循环条件为：94℃ 5min，94℃30s，55℃ 30s，72℃ 30s共20个循环，最后72℃延伸10min，扩增全长片段，获得ZF2随机的ZFP2片段。
再按照ZFP1库的构建原理构建ZFP2库.
表6 PCR反应体系
二、报告载体和报告菌株的构建
以阳性报告载体pBAC-BA-lacZ为底物，以RZF3和RP引物，用pfupolymerase按表7所示PCR反应体系，循环条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s共30个循环，最后72℃延伸10min，扩增RZFBS3片段(RZFBS3 PCR fragment)，该片段用右边靶序列中锌指3识别的三联碱基f3’替换阳性报告载体相应位置上的三联碱基f3，并保持其他两个三联碱基f2和f1不变。
表7 PCR反应体系
用EcoR I & Cla I按表8所列体系双酶切RZFBS3片段，按表9所列体系双酶切pBAC-lacZ，双酶切产物按Tiangen胶回收试剂盒说明进行。按表10所列连接体系将双酶切的阴性报告载体pBAC-lacZ骨架和双酶切的RZFBS3 PCR fragment快速连接20min，然后转化感受态细胞EPI 300中，37℃ 160rpm温育1h，再于LB+30μg/mL chloramphenicol/5μg/mLara℃固体培养基中37℃培养约18h，挑取3个单克隆扩增，按Tiangen质粒提取试剂盒说明提取质粒，送南京金斯特生物科技有限公司测序，测序正确载体标记为pBAC-RZFBS3-lacZ。
同样方法，将靶位点的三联碱基分别替换阳性报告载体中相应位置上的三联碱基，可得到pBAC-RZFBS2-lacZ、pBAC-RZFBS1-lacZ、pBAC-RZFBS-lacZ、pBAC-LZFBS1-lacZ、pBAC-LZFBS2-lacZ、pBAC-LZFBS3-lacZ、pBAC-LZFBS-lacZ等7个报告载体。
把各个测序正确的报告载体分别转化到感受态细胞KJBAC中，于LB+30μg/mL chloramphenicol固体培养基中37℃过夜培养，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株。
表8 RZFBS3 PCR产物双酶切体系
表9 质粒pBAC-lacZ双酶切体系
表10 双酶切的RZFBS3 PCR片段和pBAC-lacZ连接体系
三、有效锌指库的筛选(the selection of Effective zinc finger pools)
取ZFP3库1μg和质粒pGal 4-Kan 1μg同时电转化到含有报告质粒pBAC-RZF3-lacZ的电转化报告菌株KJBAC中，电转条件2500V，5ms.于LB+100μg/mL ampcillin/30μg/mL chloramphenicol/100μg/mLkanamycin/12μg/mL Xgal/10μg/mL IPTG的固体培养基上，37℃培养18h，挑取大约100个深色蓝斑，混合培养4～5h，用Tiangen质粒提取试剂盒说明提取质粒，得到识别并结合右边靶位点中三联碱基f3的有效锌指库RZF3(Effective RZF3 pool).同样方法得到分别靶向结合其他五个三联碱基的有效锌指库RZF2(Effective RZF2 pool)，RZF1(EffectiveRZF1 pool)和LZF3(Effective LZF3 pool)，LZF2(Effective LZF2 pool)，LZF1(Effective LZF1 pool)。
四、有效锌指库的连接组装
如图1所示，以有效锌指库RZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库RF3；以有效锌指库RZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库RF2；以有效锌指库RZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库RF1；取等量的扩增产物有效锌指库RF1、有效锌指库RF2和有效锌指库RF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的RZFP序列片段，即靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库RF；
以有效锌指库LZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库LF3；以有效锌指库LZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库LF2；以有效锌指库LZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库LF1；取等量的扩增产物有效锌指库LF1、有效锌指库LF2和有效锌指库LF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的LZFP序列片段，即靶向结合左边识别位点的锌指蛋白库LF。
所得各库片段大小如图2所示，其中有效锌指库的PCR产物检测M：NEBPCR marker，列1为有效锌指库RF3 PCR扩增产物，111bp；列2为有效锌指库RF2 PCR扩增产物，147bp；列3为有效锌指库RF1 PCR扩增产物，141bp；列4为三个有效锌指序列重叠PCR产物，275bp。
以有效锌指库RZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库RF3；以有效锌指库RZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库RF2；以有效锌指库RZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库RF1；取等量的扩增产物有效锌指库RF1、有效锌指库RF2和有效锌指库RF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的RZFP序列片段，即靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库RF；
以有效锌指库LZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库LF3；以有效锌指库LZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库LF2；以有效锌指库LZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库LF1；取等量的扩增产物有效锌指库LF1、有效锌指库LF2和有效锌指库LF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的LZFP序列片段，即靶向结合左边识别位点的锌指蛋白库LF。
表11 PCR反应体系
取等量的扩增产物RF1 PCR product，RF2 PCR product，RF3 PCRproduct，以ZFF和ZFR为引物，用pfu polymerase按表12所列PCR反应体系进行扩增，循环条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s共15个循环，最后72℃延伸5min，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的ZFP片段，即靶向结合右半边识别位点的锌指蛋白库RF碱基序列片段。
取等量的扩增产物LF1 PCR product，LF2 PCR product，LF3 PCRproduct，以ZFF和ZFR引物用pfu polymerase按表12所列PCR反应体系进行扩增，循环条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s共15个循环，最后72℃延伸5min，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的ZFP片段，即靶向结合左半边识别位点的锌指蛋白库LF碱基序列片段。
表12 全长ZFP的PCR扩增体系
锌指蛋白库的RF或LF碱基序列片段经核算共沉剂纯化后，以纯化产物为底物，用Xba I和BamH I按表4双酶切，双酶切产物按核酸共沉剂说明纯化.双酶切产物和线性化的pGP-FF骨架按表7所列连接体系连接16℃连接过夜，连接产物按核酸共沉剂说明纯化后，转化到感受态细胞JM109中，按Tiangen质粒提取试剂盒说明提取质粒pGP-RZFP或pGP-LZFP。
取该质粒pGP-RZFP 1μg和质粒pGal 4-Kan 1 ug共转化到含有pBAC-RZFBS-lacZ的报告菌株中，电转条件2500V，5ms，于LB+100μg/mL ampcillin，30μg/mL kanamycin，12.5μg/mL chloramphenicol，12μg/mL Xgal，10μg/mL IPTG and 500μM IPTG的固体培养基上，37℃培养18h，挑取所有深色蓝斑，于LB+100μg/mL ampcillin，30μg/mLkanamycin，12.5μg/mL chloramphenicol，10μM ZnSO4 and 500μM IPTG液体培养基中，37℃培养14～18h，1∶40稀释，OD600＝0.3～0.8时，收集菌体，向100μL培养物中加11μL裂解液，充分混匀，室温下反应至少15min.取15μL反应液加到含有β-巯基乙醇的135μL Z pfu buffer和30μL 4mg/mL ONPG中，GENMED细菌β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书测定420nm处的吸光值，并按下面公式计算β-半乳糖苷酶活性。
U＝k×1000/OD600
凡活性比阳性对照至少大三倍的，从相应的单克隆中提取质粒，再转化到JM109感受态中扩增，于LB+100μg/mL ampcillin上，37℃培养18h，提取质粒，得到识别右半边靶序列锌指蛋白。
同理，取质粒pGP-LZFP 1 μg和质粒pGal 4-Kan 1 ug共转化到含有pBAC-LZFBS-lacZ的报告菌株中，最终可获得识别右半边靶序列锌指蛋白。
将筛选出的表达载体中锌指蛋白的编码序列与非限制性核酸内切酶FokI的基因连接，克隆到合适的表达载体中，就可以用于该基因的靶向修饰。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，包含下述步骤：
(1)、3个锌指蛋白库的构建：分别以已知的由ZF1、ZF2和ZF3组成的三锌指序列为模板，构建3个锌指蛋白库，其中每个锌指蛋白库中保持三锌指序列中的两个锌指序列不变，只将其中一个锌指序列的α螺旋中编码7个氨基酸的21碱基完全随机化，得到该锌指域随机的锌指蛋白库ZFP1、ZFP2和ZFP3，其中ZFP1库中所有序列保持ZF2和ZF3不变，仅ZF1为随机序列；ZFP2库中所有序列保持ZF1和ZF3不变，仅ZF2为随机序列；ZFP3库中所有序列保持ZF1和ZF2不变，仅ZF3为随机序列；
(2)、报告载体和报告菌株的构建：以阳性报告载体pBAC-BA-lacZ为底物，构建碱基序列片段，其中在该碱基序列片段中的原阳性报告载体相应位置上的三联碱基被作为引物的锌指序列识别的三联碱基代替；将所述碱基序列片段与阴性报告载体pBAC-lacZ骨架连接，得到报告载体；把所得到的报告载体分别转化到感受态细胞KJBAC中，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株，所述报告菌株分别为pBAC-RZFBS3-lacZ、pBAC-RZFBS2-lacZ、pBAC-RZFBS1-lacZ、pBAC-RZFBS-lacZ、pBAC-LZFBS1-lacZ、pBAC-LZFBS2-lacZ、pBAC-LZFBS3-lacZ、pBAC-LZFBS-lacZ；
(3)、有效锌指库的筛选：分别取步骤(1)中得到的锌指蛋白库和质粒pGal 4-Kan同时电转化到步骤(2)所得的报告菌株中，筛选得到有效锌指库；
(4)、有效锌指库的连接、组装：以步骤(3)筛选得到的同为一侧的有效锌指库为底物，用重叠PCR的方法将同侧的三个有效锌指库，分别扩增并连接起来，构建成识别整个右边靶位点的锌指蛋白库RF和左边靶位点的锌指蛋白库LF；
(5)、利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白：取步骤(4)中得到的锌指蛋白库RF和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS-lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合右半边靶位点的锌指蛋白；取步骤(4)中得到的锌指蛋白库LF和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS-lacZ中，挑取深蓝色菌落，提取酶活较高菌落质粒，即为结合左半边靶位点的锌指蛋白。
2.根据权利要求1所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中锌指蛋白库ZFP1、ZFP3和ZFP2的构建包括下述步骤：
(1)ZF1随机的ZFP1片段、ZF3随机的ZFP3片段和ZF2随机的ZFP2片段的构建，其中ZF1随机的ZFP1片段是通过以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZF1-F和ZFR为引物，进行PCR反应扩增；然后以此PCR反应产物为底物，以ZFF和ZFR引物，进行PCR反应扩增，得到ZF1随机的ZFP1片段；
ZF3随机的ZFP3片段是通过以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF和ZF3-R为引物，进行PCR反应扩增；然后以此PCR产物为底物，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR反应扩增，扩增完整的锌指蛋白表达片段，即得即ZF3随机的ZFP3片段；
ZF2随机的ZFP2片段是通过以以锌指蛋白表达质粒pGP-FB-orig BA为底物，ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应扩增三锌指片段上半部分；以pGP-FB-orig BA为底物，ZF2-F和ZFR为引物，扩增该片段的后半部分，将ZF2中的21个关键碱基随机化，然后将这两部分PCR产物等量混合，以ZFF和ZFR为引物，扩增全长片段，获得ZF2随机的ZFP2片段；
(2)将ZFP1片段、ZFP3片段和ZFP2片段分别与表达载体pGP-FF骨架连接；连接产物电转化到电转化感受态细胞JM109中，单克隆产物经培养后收集，提取质粒，获得ZF1随机的ZFP1库、ZF3随机的ZFP3库和ZF2随机的ZFP2库。
3.根据权利要求1所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(2)中报告载体和报告菌株的构建的具体步骤为：以阳性报告载体pBAC-BA-lacZ为底物，以RP为反向引物，分别以RZF3、RZF2、RZF1、RZF、LZF1、LZF2、LZF3和LZF为正向引物，分别扩增得到8个碱基序列片段RZFBS3、RZFBS2、RZFBS1、RZFBS、LZFBS1、LZFBS2、LZFBS3和LZFBS，该8个片段纯化酶切后，与双酶切后的阴性报告载体pBAC-lacZ骨架连接，分别得到8个报告载体pBAC-RZFBS3-lacZ、pBAC-RZFBS2-lacZ、pBAC-RZFBS1-lacZ、pBAC-RZFBS-lacZ、pBAC-LZFBS1-lacZ、pBAC-LZFBS2-lacZ、pBAC-LZFBS3-lacZ、pBAC-LZFBS-lacZ；把各个测序正确报告载体分别转化到感受态细胞KJBAC中，所得单克隆即为含有识别不同靶位点的报告菌株。
4.根据权利要求1所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(3)中有效锌指库的具体筛选步骤为：
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP3和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS3-lacZ中，筛选得到有效锌指库RZF3；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP2和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS2-lacZ中，筛选得到有效锌指库RZF2；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP1和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS1-lacZ中，筛选得到有效锌指库RZF1；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP3和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS3-lacZ中，筛选得到有效锌指库LZF3；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP2和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS2-lacZ中，筛选得到有效锌指库LZF2；
取步骤(1)中得到的锌指蛋白库ZFP1和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS1-lacZ中，筛选得到有效锌指库LZF1。
5.根据权利要求1所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(4)中有效锌指库的连接、组装的具体步骤为：以步骤(3)获得的有效锌指库RZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库RF3；以有效锌指库RZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库RF2；以有效锌指库RZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库RF1；取等量的扩增产物有效锌指库RF1、有效锌指库RF2和有效锌指库RF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的RZFP序列片段，即靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库RF；
以步骤(3)获得的有效锌指库LZF3为底物，以ZFF和ZF2-up为引物，进行PCR反应，扩增出有效锌指库LF3；以有效锌指库LZF2为底物，ZF1-Down和ZF3-up引物扩增出有效锌指库LF2；以有效锌指库LZF1为底物，ZF2-Down和ZFR引物扩增出有效锌指库LF1；取等量的扩增产物有效锌指库LF1、有效锌指库LF2和有效锌指库LF3，以ZFF和ZFR为引物，进行PCR扩增，将三个有效锌指库连接起来，获得全长的LZFP序列片段，即靶向结合左边识别位点的锌指蛋白库LF。
6.根据权利要求1所述的开源方式筛选靶向结合人DYRK1A基因靶位点的锌指蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(5)中利用细菌双杂交原理筛选出具有较高特异性和亲和力的三锌指蛋白的具体步骤为：以步骤(4)所得的靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库RF为底物，用Xba I和BamH I双酶切后和线性化的pGP-FF骨架连接，连接产物转化到感受态细胞JM109中，提取质粒；将该质粒和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-RZFBS-lacZ中，培养后挑取所有深色蓝斑菌落，继续培养后收集菌体，从β-半乳糖苷酶活性比阳性对照大三倍以上的单克隆中提取质粒，再转化到JM109感受态中扩增，提取质粒，得到识别右边靶序列锌指蛋白；
以步骤(4)所得的靶向结合右边识别位点的锌指蛋白库LF为底物，用Xba I和BamH I双酶切后和线性化的pGP-FF骨架连接，连接产物转化到感受态细胞JM109中，提取质粒；将该质粒和质粒pGal 4-Kan共转化到步骤(2)所得的报告菌株pBAC-LZFBS-lacZ中，培养后挑取所有深色蓝斑菌落，继续培养后收集菌体，从β-半乳糖苷酶活性比阳性对照至少大三倍的单克隆中提取质粒，再转化到JM109感受态中扩增，提取质粒，得到识别左边靶序列锌指蛋白。
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2011
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