JP6649261B2 - 最適なトウモロコシ遺伝子座 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2013年11月4日出願の米国仮特許出願第61/899,598号に対する利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
配列表の写しは、2014年10月31日に作成されたファイル名「7560232316_SeqList_ST25.txt」を有し、13メガバイトのサイズを有するASCIIフォーマットの配列表として、EFS−Webを介して電子工学的に提出され、本明細書と同時的に出願される。このASCIIフォーマットのドキュメント中に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テーブルリストの写しは、2013年11月4日に作成されたファイル名「Table3」を有し、8メガバイトのサイズを有する.PDFフォーマットのテーブルリストとして、EFS−Webを介して電子工学的に提出され、本明細書と同時的に出願される。この.PDFフォーマットのドキュメント中に含まれるテーブルリストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[1]組換え配列であって、
loci_137693_G1(配列番号387)、
loci_265551_G1(配列番号463)、
loci_128078_G1(配列番号560)、
loci_168286_G1(配列番号573)、
loci_3733_G1(配列番号1268)、
loci_203075_G1(配列番号2030)、
loci_232484_G1(配列番号2053)、
loci_136086_G1(配列番号4425)、
loci_203704_G1(配列番号2033)、
loci_127268_G1(配列番号2709)、
loci_204637_G1(配列番号2731)、
loci_291068_G1(配列番号3230)、
loci_232222_G1(配列番号3357)、
loci_43577_G1(配列番号3428)、
loci_204726_G1(配列番号424)、
loci_232228_G1(配列番号4529)
からなる群から選択される非遺伝子配列と、少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも1Kbの核酸配列、および
上記組換え配列を産生するために上記非遺伝子配列中に挿入されている目的のDNA
を含む、組換え配列。
[2]上記目的のDNAが、上記非遺伝子配列に対して特異的なジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、上記[1]に記載の組換え配列。
[3]上記目的のDNAが、上記非遺伝子配列に対して特異的なジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、上記[1]に記載の組換え配列。
[4]上記目的のDNAが、分析ドメインを含む、上記[1]に記載の組換え配列。
[5]上記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、上記[1]に記載の組換え配列。
[6]上記目的のDNAが、ペプチドをコードする、上記[1]に記載の組換え配列。
[7]上記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、上記[1]に記載の組換え配列。
[8]上記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、上記[1]に記載の組換え配列。
[9]上記非遺伝子配列の2以上が、各々、2以上の組換え配列を産生するために挿入された目的のDNAを含み、上記2以上の組換え配列が、同じ染色体上に位置する、上記[1]に記載の組換え配列。
[10]上記目的のDNAおよび/または上記非遺伝子配列が、上記非遺伝子配列中への上記目的のDNAの挿入の間に改変される、上記[1]に記載の組換え配列。
[11]上記非遺伝子配列が、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_136086(配列番号4425)、optimal_loci_232484(配列番号2053)、optimal_loci_203075(配列番号2030)、optimal_loci_3733(配列番号1268)、optimal_loci_168286(配列番号573)、optimal_loci_128078(配列番号560)、optimal_loci_265551(配列番号463)、optimal_loci_127268(配列番号2709)、optimal_loci_204726(配列番号424)およびoptimal_loci_232222(配列番号3357)からなる群から選択される、上記[1]から[10]のいずれか一項に記載の組換え配列。
[12]上記非遺伝子配列が、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_136086(配列番号4425)、optimal_loci_232484(配列番号2053)、optimal_loci_203075(配列番号2030)、optimal_loci_3733(配列番号1268)、optimal_loci_168286(配列番号573)、optimal_loci_128078(配列番号560)およびoptimal_loci_265551(配列番号463)からなる群から選択される、上記[1]から[10]のいずれか一項に記載の組換え配列。
[13]上記非遺伝子配列が、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_203075(配列番号2030)およびoptimal_loci_128078(配列番号560)からなる群から選択される、上記[1]から[10]のいずれか一項に記載の組換え配列。
[14]上記非遺伝子配列が、optimal_loci_137693_G1(配列番号387)、optimal_loci_265551_G1(配列番号463)、optimal_loci_128078_G1(配列番号560)、optimal_loci_168286_G1(配列番号573)、optimal_loci_3733_G1(配列番号1268)、optimal_loci_203075_G1(配列番号2030)、optimal_loci_232484_G1(配列番号2053)およびoptimal_loci_204637_G1(配列番号2731)からなる群から選択される、上記[1]から[10]のいずれか一項に記載の組換え配列。
[15]上記[1]から[10]のいずれか一項に記載の組換え配列を含む、トウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分またはトウモロコシ植物細胞。
[16]目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、
a.loci_137693_G1(配列番号387)、loci_265551_G1(配列番号463)、loci_128078_G1(配列番号560)、loci_168286_G1(配列番号573)、loci_3733_G1(配列番号1268)、loci_203075_G1(配列番号2030)、loci_232484_G1(配列番号2053)、loci_136086_G1(配列番号4425)、loci_203704_G1(配列番号2033)、loci_127268_G1(配列番号2709)、loci_204637_G1(配列番号2731)、loci_291068_G1(配列番号3230)、loci_232222_G1(配列番号3357)、loci_43577_G1(配列番号3428)、loci_204726_G1(配列番号424)およびloci_232228_G1(配列番号4529)からなる群から、少なくとも90%の配列同一性を有する標的非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座を選択するステップ;
b.上記標的非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座と特異的に結合してそれを切断する部位特異的ヌクレアーゼを選択するステップ;
c.上記部位特異的ヌクレアーゼをトウモロコシ植物細胞中に導入するステップ;
d.上記目的のDNAを上記植物細胞中に導入するステップ;
e.上記目的のDNAを上記標的非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座中に挿入するステップ;ならびに
f.上記非遺伝子遺伝子座に標的化された上記目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を選択するステップ
を含む、方法。
[17]上記目的のDNAが、分析ドメインを含む、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[18]上記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[19]上記目的のDNAが、ペプチドをコードする、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[20]上記目的のDNAが、導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[21]上記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[22]上記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPRヌクレアーゼ、TALEN、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼからなる群から選択される、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[23]上記目的のDNAが、相同組換え修復組込み方法を介して、上記非遺伝子遺伝子座内に組み込まれる、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[24]上記目的のDNAが、非相同末端結合組込み方法を介して、上記非遺伝子遺伝子座内に組み込まれる、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[25]上記目的のDNAの2以上が、上記標的非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座の2以上中に挿入される、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[26]上記標的非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座の2以上が、同じ染色体上に位置する、上記[25]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[27]上記目的のDNAおよび/または上記標的非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座が、上記標的非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座中への上記目的のDNAの挿入の間に改変される、上記[16]に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
[28]少なくとも1Kbの精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座であって、
loci_137693_G1(配列番号387)、loci_265551_G1(配列番号463)、
loci_128078_G1(配列番号560)、loci_168286_G1(配列番号573)、loci_3733_G1(配列番号1268)、loci_203075_G1(配列番号2030)、
loci_232484_G1(配列番号2053)、loci_136086_G1(配列番号4425)、
loci_203704_G1(配列番号2033)、loci_127268_G1(配列番号2709)、
loci_204637_G1(配列番号2731)、loci_291068_G1(配列番号3230)、
loci_232222_G1(配列番号3357)、loci_43577_G1(配列番号3428)、
loci_204726_G1(配列番号424)およびloci_232228_G1(配列番号4529)
からなる群から選択される非遺伝子配列と、少なくとも90%の配列同一性を有する、精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[29]上記非遺伝子配列が、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_136086(配列番号4425)、optimal_loci_232484(配列番号2053)、optimal_loci_203075(配列番号2030)、optimal_loci_3733(配列番号1268)、optimal_loci_168286(配列番号573)、optimal_loci_128078(配列番号560)およびoptimal_loci_265551(配列番号463)からなる群から選択される、上記[28]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[30]上記非遺伝子配列が、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_203075(配列番号2030)およびoptimal_loci_128078(配列番号560)からなる群から選択される、上記[28]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[31]上記非遺伝子配列が、optimal_loci_137693_G1(配列番号387)、optimal_loci_265551_G1(配列番号463)、optimal_loci_128078_G1(配列番号560)、optimal_loci_168286_G1(配列番号573)、optimal_loci_3733_G1(配列番号1268)、optimal_loci_203075_G1(配列番号2030)、optimal_loci_232484_G1(配列番号2053)およびoptimal_loci_204637_G1(配列番号2731)からなる群から選択される、上記[28]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[32]上記非遺伝子配列中に挿入された目的のDNAをさらに含む、上記[28]から[31]のいずれか一項に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[33]上記目的のDNAが、上記非遺伝子配列に対して特異的なジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、上記[32]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[34]上記目的のDNAが、上記非遺伝子配列に対して特異的なジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、上記[32]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[35]上記目的のDNAが、分析ドメインを含む、上記[32]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[36]上記目的のDNAが、ペプチドをコードしていない、上記[32]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[37]上記目的のDNAが、ペプチドをコードしている、上記[32]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[38]上記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、上記[32]に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[39]上記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、上記[32]、[37]または[38]のいずれか一項に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[40]上記非遺伝子配列の2以上が、各々、2以上の組換え配列を産生するために挿入された目的のDNAを含み、上記2以上の組換え配列が、同じ染色体上に位置する、上記[32]から[39]のいずれか一項に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[41]上記目的のDNAおよび/または上記非遺伝子配列が、上記非遺伝子配列中への上記目的のDNAの挿入の間に改変される、上記[32]から[40]のいずれか一項に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[42]上記目的のDNAが、相同組換え修復機構または非相同末端結合修復機構を介して挿入される、上記[32]から[41]のいずれか一項に記載の精製された非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座。
[43]組換え配列を含む植物であって、上記組換え配列は、
非遺伝子配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列、および
上記非遺伝子配列中に挿入されている、目的のDNA
を含む、植物。
[44]上記非遺伝子配列が、
loci_137693_G1(配列番号387)、loci_265551_G1(配列番号463)、
loci_128078_G1(配列番号560)、loci_168286_G1(配列番号573)、
loci_3733_G1(配列番号1268)、loci_203075_G1(配列番号2030)、
loci_232484_G1(配列番号2053)、loci_136086_G1(配列番号4425)、
loci_203704_G1(配列番号2033)、loci_127268_G1(配列番号2709)、
loci_204637_G1(配列番号2731)、loci_291068_G1(配列番号3230)、
loci_232222_G1(配列番号3357)、loci_43577_G1(配列番号3428)、
loci_204726_G1(配列番号424)およびloci_232228_G1(配列番号4529)
からなる群から選択される、上記[43]に記載の植物。
[45]上記組換え配列の2以上を含む、上記[43]に記載の植物。
[46]上記組換え配列が、同じ染色体上に位置する、上記[43]に記載の植物。
[47]上記目的のDNAが、上記非遺伝子配列に対して特異的なジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、上記[43]に記載の植物。
[48]上記目的のDNAが、上記非遺伝子配列に対して特異的なジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、上記[43]に記載の植物。
[49]上記目的のDNAが、分析ドメインを含む、上記[43]に記載の植物。
[50]上記目的のDNAが、ペプチドをコードしていない、上記[43]に記載の植物。
[51]上記目的のDNAが、ペプチドをコードしている、上記[43]に記載の植物。
[52]上記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、上記[43]に記載の植物。
[53]上記目的のDNAおよび/または上記非遺伝子配列が、上記非遺伝子配列中への上記目的のDNAの挿入の間に改変される、上記[43]に記載の植物。
一実施形態によれば、最適な非遺伝子トウモロコシゲノム配列および外因性配列を含む組換え配列が提供され、この外因性配列は、最適な非遺伝子トウモロコシゲノム配列中に挿入されている。一実施形態では、本開示は、loci_137693_G1(配列番号387)、loci_265551_G1(配列番号463)、loci_128078_G1(配列番号560)、loci_168286_G1(配列番号573)、loci_3733_G1(配列番号1268)、loci_203075_G1(配列番号2030)、loci_232484_G1(配列番号2053)、loci_136086_G1(配列番号4425)、loci_203704_G1(配列番号2033)、loci_127268_G1(配列番号2709)、loci_204637_G1(配列番号2731)、loci_291068_G1(配列番号3230)、loci_232222_G1(配列番号3357)、loci_43577_G1(配列番号3428)、loci_204726_G1(配列番号424)、loci_232228_G1(配列番号4529)からなる群から選択される非遺伝子配列と、少なくとも90%、95%または99%の配列同一性を有する少なくとも1Kbの核酸配列を、この非遺伝子配列中に挿入された目的のDNAと共に含む、組換え配列に関する。一実施形態では、最適な非遺伝子トウモロコシゲノム配列中への目的のDNAの挿入は、挿入部位の近位の非遺伝子遺伝子座配列の変更によって、非遺伝子遺伝子座の元の配列を改変する。かかる改変には、例えば、非遺伝子遺伝子座配列の欠失、逆位、挿入および重複が含まれる。さらなる一態様では、一実施形態は、目的のDNAに関し、この目的のDNAは、前記非遺伝子配列中に挿入されている。別の一態様では、一実施形態は、目的のDNAが、表8のジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、組換え配列を含む。別の一態様では、一実施形態は、目的のDNAが、表8のジンクフィンガー標的部位において挿入されている、組換え配列を含む。別の一実施形態では、この組換え配列は、分析ドメインをさらに含む挿入された目的のDNAを含む。別の一実施形態では、この組換え配列は、ペプチドをコードしていない挿入された目的のDNAを含む。さらなる一実施形態では、この組換え配列は、ペプチドをコードする目的のDNAを含む。なお別の一実施形態では、この組換え配列は、遺伝子発現カセットをさらに含む挿入された目的のDNAを含む。一実施形態では、この遺伝子発現カセットは、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子を含む。さらなる一実施形態では、この組換え配列は、2以上の遺伝子発現カセットを含む。別の一実施形態では、組換え配列は、2以上の組換え配列を産生するために挿入された目的のDNAを各々が含む前記非遺伝子配列の2以上を含み、この2以上の組換え配列は、同じ染色体上に位置する。さらなる一実施形態では、この組換え配列は、非遺伝子配列中への前記目的のDNAの挿入の間に改変される目的のDNAおよび/または非遺伝子配列を含む。別の一実施形態では、本開示は、loci_137693_G1(配列番号387)、loci_265551_G1(配列番号463)、loci_128078_G1(配列番号560)、loci_168286_G1(配列番号573)、loci_3733_G1(配列番号1268)、loci_203075_G1(配列番号2030)、loci_232484_G1(配列番号2053)、loci_136086_G1(配列番号4425)、loci_203704_G1(配列番号2033)、loci_127268_G1(配列番号2709)、loci_204637_G1(配列番号2731)、loci_291068_G1(配列番号3230)、loci_232222_G1(配列番号3357)、loci_43577_G1(配列番号3428)、loci_204726_G1(配列番号424)、loci_232228_G1(配列番号4529)からなる群から選択される非遺伝子配列と、少なくとも90%、95%または99%の配列同一性を有する少なくとも1Kbの核酸配列を、この非遺伝子配列中に挿入された目的のDNAと共に含む、組換え配列を含む、トウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分またはトウモロコシ植物細胞に関する。
本発明を説明および特許請求する際に、以下の用語法が、以下に示す定義に従って使用される。
トウモロコシ(Zea mays)ゲノム中の特定の位置に導入遺伝子および導入遺伝子スタックを標的化することは、トランスジェニック事象の品質を改善し、トランスジェニック事象の産生に関連する費用を低減させ、トランスジェニック植物製品を作製するための新たな方法、例えば逐次的遺伝子スタッキングを提供する。全体として、特定のゲノム部位への導入遺伝子の標的化は、商業的に有益である可能性が高い。大幅な進歩が、植物および他のゲノム中の予め選択された部位へのドナーポリヌクレオチドの付加を促進し得る、ZFN、CRISPRおよびTALENなどの部位特異的ヌクレアーゼの開発に向かって、ここ数年間になされてきた。しかし、標的化のために適切なゲノム部位の属性については、それほど知られていない。歴史的に、ゲノム中の非必須遺伝子および病原体(ウイルス)組込み部位が、標的化のための遺伝子座として使用されてきた。ゲノム中のかかる部位の数は、かなり限定的であり、したがって、ドナーポリヌクレオチド配列の標的化のために使用され得る最適なゲノム遺伝子座の同定および特徴付けが必要とされている。標的化に従順なことに加えて、最適なゲノム遺伝子座は、導入遺伝子発現および育種適用を支持し得る中立部位であると予測される。
一実施形態によれば、外因性配列の挿入のために最適な非遺伝子トウモロコシゲノム配列を同定するための方法が提供される。この方法は、低メチル化された、少なくとも1Kb長のトウモロコシゲノム配列を最初に同定するステップを含む。一実施形態では、この低メチル化されたゲノム配列は、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、12、13、14、15、16または17Kb長である。一実施形態では、この低メチル化されたゲノム配列は、約1〜約4Kb長であり、さらなる一実施形態では、約2Kb長である。配列は、その配列内に1%未満のDNAメチル化を有する場合、低メチル化されたとみなされる。一実施形態では、このメチル化状態は、正常な対照DNAサンプル内の対応するCpGジヌクレオチド、CHGまたはCHHトリヌクレオチドにおいて見出される総シトシンの量と比較した、選択されたトウモロコシ配列内の1または複数のCpGジヌクレオチド、CHGまたはCHHトリヌクレオチドにおける5−メチルシトシンの存在に基づいて測定される。CHHメチル化は、グアニンでなくてもよい2つのヌクレオチドが後に続く5−メチルシトシンを示し、CHGメチル化とは、グアニンが後に続くアデニン、チミンまたはシトシン塩基に先行する5−メチルシトシンを指す。より具体的には、一実施形態では、この選択されたトウモロコシ配列は、500ヌクレオチドの選択されたトウモロコシ配列当たり、1未満、2未満または3未満のメチル化されたヌクレオチドを有する。一実施形態では、この選択されたトウモロコシ配列は、500ヌクレオチドの選択されたトウモロコシ配列当たり、CpGジヌクレオチドにおいて、1未満、2未満または3未満の5−メチルシトシンを有する。一実施形態では、この選択されたトウモロコシ配列は、1〜4Kb長であり、5−メチルシトシンを欠く1Kb配列を含む。一実施形態では、この選択されたトウモロコシ配列は、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8または8.5Kb長であり、その全長中に1または0のメチル化されたヌクレオチドを含む。一実施形態では、この選択されたトウモロコシ配列は、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8または8.5Kb長であり、その全長内にCpGジヌクレオチドにおける5−メチルシトシンを含まない。一実施形態によれば、選択されたトウモロコシ配列のメチル化は、供給源組織に基づいて変動し得る。かかる実施形態では、配列が低メチル化されているか否かを決定するために使用されるメチル化レベルは、2以上の組織から(例えば、根および苗条から)単離された配列中のメチル化の平均量を示す。
1.最適なゲノム遺伝子座(OGL)の周囲の低メチル化された領域の長さ
a.根組織および苗条組織についてのゲノムワイドなメチル化プロファイルを、ゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素で消化した後のIllumina/Solexa 1G並行配列決定データを使用して確立した(Wang et al., (2009) Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell 21(4): 1053-1069)。ゲノムにマッピングされる配列は、マッピングされた位置におけるDNAメチル化の存在を示し、マッピングされた配列を有さない染色体ストレッチは、メチル化の非存在(低メチル化)を示した。OGLの各々の周囲の低メチル化された領域の長さを、記載されたメチル化プロファイルを使用して計算した。
a.各OGLについて、1Mbウインドウ内のOGLのいずれかの側上のマーカーの対を、同定した。染色体にわたるマーカーの各対の間での組換え頻度を、マーカー間の遺伝的距離(センチモルガン(cM))の、マーカー間のゲノム物理的距離(Mb)に対する比率に基づいて計算した。
a.各OGLについて、OGLのヌクレオチド配列を、BLASTベースの相同性検索を使用して、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノムに対してスキャンした。これらのOGL配列は、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノムから同定されるので、この検索を介して同定された第1のBLASTヒットは、OGL配列自体を示す。各OGLについての第2のBLASTヒットを同定し、このヒットのアラインメントカバー度を、トウモロコシ(Zea mays)ゲノム内のOGL配列の独自性の尺度として使用した。
a.トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Maize Genome DB(www.maizegdb.org)から抽出した。各OGLについて、その上流近隣または下流近隣における最も近い注釈付きの遺伝子を同定し、OGL配列とこの遺伝子との間の距離を(bpで)測定した。
a.各OGLについて、ヌクレオチド配列を分析して、存在するグアニン塩基およびシトシン塩基の数を推定した。この計数を、各OGLの配列長の百分率として示し、GC%についての尺度を提供する。
a.トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Maize Genome DB(www.maizegdb.org)から抽出した。各OGLについて、OGLの周囲の40Kbウインドウを規定し、このウインドウとオーバーラップする位置を有する注釈付きの遺伝子の数を計数した。
a.トウモロコシ遺伝子の転写物レベルでの発現を、RNAseqテクノロジーを使用して、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73の根組織および苗条組織から生成したトランスクリプトームプロファイリングデータを分析することによって測定した。各OGLについて、OGLの周囲の40Kb近隣中に存在するトウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノム内の注釈付きの遺伝子を、同定した。ウインドウ中の遺伝子の各々についての発現レベルを、トランスクリプトームプロファイルから抽出し、平均遺伝子発現レベルを計算した。
a.特定のヌクレオチド配列についてヌクレオソーム占有率のレベルを識別することで、染色体機能および配列のゲノム情況についての情報が提供される。NuPoP(商標)統計パッケージは、任意のサイズのゲノム配列についてのヌクレオソーム占有率および最も確からしいヌクレオソームポジショニングマップを予測するためのユーザーフレンドリーなソフトウェアツールを提供する(Xi, L., Fondufe-Mittendor, Y., Xia, L., Flatow, J., Widom, J. and Wang, J.-P., Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model, BMC Bioinformatics, 2010, doi:10.1186/1471-2105-11-346)。各OGLについて、ヌクレオチド配列を、NuPoP(商標)ソフトウェアに供し、ヌクレオソーム占有率スコアを計算した。
a.トウモロコシ染色体の各々におけるセントロメアの位置、および染色体アームの長さに関する情報を、Maize genome DB(www.maizegdb.org)から抽出した。各OGLについて、OGL配列からそれが位置する染色体のセントロメアまでのゲノム距離が(bpで)測定される。染色体内のOGLの相対的位置は、それが存在する特定の染色体アームの長さに対する、セントロメアまでのそのゲノム距離の比率として示される。
a.各OGLについて、OGL位置の周囲の1Mbゲノムウインドウが規定され、そのゲノム位置がこのウインドウとオーバーラップする、トウモロコシ1Kb OGLデータセット中のOGLの数が、集計される。
a)この非遺伝子配列は、配列内に1%よりも多いDNAメチル化を含まない;
b)この非遺伝子配列は、トウモロコシ染色体セントロメアから0.0984〜0.973のゲノム距離の比率の相対的位置値を有する;
c)この非遺伝子配列は、34.38〜61.2%のグアニン/シトシンパーセント含量範囲を有する;および
d)この非遺伝子配列は、約1Kb長〜約4.9Kb長である。
一実施形態によれば、ポリヌクレオチドドナー配列を挿入するための高度に望ましい位置として、トウモロコシ(Zea mays)のゲノム遺伝子座を同定した後で、1または複数の目的の核酸が、同定されたゲノム遺伝子座中に挿入され得る。一実施形態では、この目的の核酸は、外因性遺伝子配列または他の望ましいポリヌクレオチドドナー配列を含む。別の一実施形態では、ポリヌクレオチドドナー配列を挿入するための高度に望ましい位置として、トウモロコシ(Zea mays)のゲノム遺伝子座を同定した後で、1または複数の最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座の目的の核酸が、任意選択で、同定されたゲノム遺伝子座中への目的のDNAの引き続く組込みと共に、欠失、切除または除去され得る。一実施形態では、最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座中への目的の核酸の挿入は、外因性遺伝子配列または他の望ましいポリヌクレオチドドナー配列の除去、欠失または切除を含む。
宿主細胞中にDNA構築物としてポリヌクレオチドドナー配列およびヌクレアーゼ配列を導入するための周知の手順のいずれかが、本開示に従って使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、PEG、エレクトロポレーション、超音波的方法(例えば、ソノポレーション)、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび組込みの両方、ならびにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる(例えば、Sambrook et al.、上記を参照のこと)。使用される特定の核酸挿入手順は、選択されたタンパク質を発現することが可能な宿主細胞中に少なくとも1つの遺伝子を首尾よく導入することが可能であることだけが必要である。
a.目的の核酸の挿入のための標的として、最適な非遺伝子トウモロコシ遺伝子座を選択するステップ;
b.部位特異的ヌクレアーゼをトウモロコシ植物細胞中に導入するステップであって、この部位特異的ヌクレアーゼは、非遺伝子配列を切断する、ステップ;
c.目的のDNAをこの植物細胞中に導入するステップ;および
d.前記非遺伝子配列に標的化された目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を選択するステップ。
a.目的の核酸の挿入のための標的として、最適な非遺伝子トウモロコシ遺伝子座を選択するステップ;
b.部位特異的ヌクレアーゼをトウモロコシプロトプラスト細胞中に導入するステップであって、この部位特異的ヌクレアーゼは、非遺伝子配列を切断する、ステップ;
c.目的のDNAをトウモロコシプロトプラスト細胞中に導入するステップ;および
d.前記非遺伝子配列に標的化された目的のDNAを含むトランスジェニックトウモロコシプロトプラスト細胞を選択するステップ。
a.この非遺伝子配列は、少なくとも1Kb長であり、配列内に1%よりも多いDNAメチル化を含まない;
b.この非遺伝子配列は、トウモロコシゲノム内で、0.00041〜62.42cM/Mbの比率の組換えを示す;
c.この非遺伝子配列は、トウモロコシゲノムの、0〜0.962レベルのヌクレオソーム占有率を示す;
d.この非遺伝子配列は、トウモロコシゲノム中に含まれる任意の他の配列と、40%未満の配列同一性を共有する;
e.この非遺伝子配列は、トウモロコシ染色体セントロメアから0.00373〜0.99908のゲノム距離の比率の相対的位置値を有する;
f.非遺伝子配列は、25.17〜68.3%のグアニン/シトシンパーセント含量範囲を有する;
g.この非遺伝子配列は、遺伝子配列の近位に位置する;および
h.前記非遺伝子配列を含む、トウモロコシゲノム配列の1Mb領域は、1または複数のさらなる非遺伝子配列を含む。一実施形態では、この最適な非遺伝子トウモロコシ遺伝子座は、クラスター1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、2、3、4、5、6、7、8、9、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31または32の遺伝子座から選択される。
本明細書に開示されるドナー分子は、標的化された相同性非依存的方法および/または相同性依存的方法を介して、細胞のゲノム中に組み込まれる。かかる標的化された組込みのために、このゲノムは、ヌクレアーゼ、例えば、DNA結合ドメイン(例えば、ジンクフィンガー結合ドメイン、CRISPRまたはTALエフェクタードメインが、所定の切断部位またはその近傍において標的部位を結合するように操作される)とヌクレアーゼドメイン(例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン)との間での融合物を使用して、所望の位置(単数または複数)において切断される。特定の実施形態では、各々がDNA結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質が、細胞中で発現され、機能的切断ドメインが再構成されDNAが標的部位の近傍で切断されるような方法で、並置された標的部位に結合する。一実施形態では、切断は、2つのDNA結合ドメインの標的部位間で生じる。これらのDNA結合ドメインの一方または両方が、操作され得る。米国特許第7,888,121号;米国特許出願公開第20050064474号ならびに国際特許公開WO05/084190、WO05/014791およびWO03/080809もまた参照のこと。
トウモロコシゲノム遺伝子座中への標的化された挿入のためのポリヌクレオチドドナー配列は、典型的には、長さが約10〜約5,000ヌクレオチドの範囲である。しかし、約5、6、7、8、9、10、11および12Kb長の配列を含む、最大で20,000ヌクレオチドの実質的により長いヌクレオチドが、使用され得る。さらに、ドナー配列は、置き換えられた領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含み得る。一実施形態では、この目的の核酸は、標的化されたゲノム遺伝子座と相同性を共有する1または複数の領域を含む。一般に、目的の核酸配列の相同な領域は、組換えが望まれるゲノム配列と少なくとも50%の配列同一性を有する。特定の実施形態では、目的の核酸の相同な領域は、標的化されたゲノム遺伝子座中に位置する配列と、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または99.9%の配列同一性を共有する。しかし、1%と100%との間の任意の値の配列同一性が、目的の核酸の長さに依存して存在し得る。
1.有害生物または疾患に対する抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列(例えば、iRNA)
(A)植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物における疾患抵抗性遺伝子(R)の産物と病原体における対応する非病原性(Avr)遺伝子の産物との間の特異的相互作用によって活性化される場合が多い。植物変種は、特定の病原体株に対して抵抗性である植物を操作するために、クローニングされた抵抗性遺伝子で形質転換され得る。かかる遺伝子の例には、クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)に対する抵抗性に関するトマトCf−9遺伝子(Jones et al., 1994 Science 266:789)、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)pv.tomatoに対する抵抗性に関するタンパク質キナーゼをコードするトマトPto遺伝子(Martin et al., 1993 Science 262:1432)、およびシュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)に対する抵抗性に関するシロイヌナズナ属(Arabidopsis)RSSP2遺伝子(Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089)が含まれる。
(A)成長点(growing point)または成長点(meristem)を阻害する除草剤、例えば、イミダザリノン(imidazalinone)、スルホンアニリド(sulfonanilide)またはスルホニルウレア除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的な遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素(Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)としても公知の、変異体アセト乳酸シンターゼ(ALS)(Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241)をコードする。
(A)例えば、植物のステアリン酸含量を増加させるためにアンチセンス遺伝子またはステアロイル−ACPデサチュラーゼでトウモロコシまたはアブラナ属(Brassica)を形質転換することによって改変された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。
(1)フィターゼコード遺伝子、例えば、クロコウジカビ(Aspergillus niger)フィターゼ遺伝子(Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)の導入は、フィテート(phytate)の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離ホスフェート(phosphate)を追加する。
本明細書に開示するように、本開示は、少なくとも1Kbの最適な非遺伝子トウモロコシゲノム配列および目的のDNAを含む組換えゲノム配列を提供し、ここで、この挿入された目的のDNAは、前記非遺伝子配列中に挿入されている。一実施形態では、目的のDNAは、分析ドメイン、有害生物または疾患に対する抵抗性を付与する遺伝子もしくはコード配列(例えば、iRNA)、除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、または付加価値形質を付与するもしくはそれに寄与する遺伝子であり、この最適な非遺伝子トウモロコシゲノム配列は、以下の1、2、3、4、5、6、7または8の特徴を含む:
a.この非遺伝子配列は、約1Kb長〜約8.3Kb長であり、メチル化されたポリヌクレオチドを含まない;
b.この非遺伝子配列は、トウモロコシゲノム内で、0.00041〜62.42cM/Mbの比率の組換えを示す;
c.この非遺伝子配列は、トウモロコシゲノムの、0〜0.962レベルのヌクレオソーム占有率を示す;
d.この非遺伝子配列は、トウモロコシゲノム中に含まれる任意の他の配列と、40%未満の配列同一性を共有する;
e.この非遺伝子配列は、トウモロコシ染色体セントロメアから0.00373〜0.99908のゲノム距離の比率の相対的位置値を有する;
f.この非遺伝子配列は、25.17〜68.3%のグアニン/シトシンパーセント含量範囲を有する;
g.この非遺伝子配列は、ネイティブ非遺伝子配列を含む連続するゲノムDNAの40Kb以内で、既知または予測されたトウモロコシコード配列を含む遺伝子配列の近位に位置する;および
h.この非遺伝子配列は、第2の非遺伝子配列を少なくとも含むトウモロコシゲノム配列の1Mb領域中に位置する。一実施形態では、この最適な非遺伝子トウモロコシゲノム配列は、ネイティブ非遺伝子配列を含む連続するゲノムDNAの40Kb以内に、1〜9の既知または予測されたトウモロコシコード配列を含む遺伝子領域を有するとして、さらに特徴付けられる。一実施形態では、この最適な非遺伝子トウモロコシ遺伝子座は、クラスター1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、2、3、4、5、6、7、8、9、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31または32の遺伝子座から選択される。
組換えの最適な非遺伝子トウモロコシ遺伝子座を含むトランスジェニック植物もまた、本開示の一実施形態に従って提供される。かかるトランスジェニック植物は、当業者に公知の技術を使用して調製され得る。
[実施例]
トウモロコシ(Zea mays)ゲノムを、具体的基準を使用するバイオインフォマティクスアプローチを用いてスクリーニングして、ポリヌクレオチドドナーを標的化するための最適なゲノム遺伝子座を選択した。ゲノム遺伝子座を選択するために使用した具体的基準は、植物ゲノム内の導入遺伝子の最適な発現についての検討、部位特異的DNA結合タンパク質によるゲノムDNAの最適な結合についての検討、およびトランスジェニック植物製品の開発要求を使用して開発した。ゲノム遺伝子座を同定および選択するために、トウモロコシ(Zea mays)ゲノムのゲノムおよびエピゲノムデータセットを、バイオインフォマティクスアプローチを使用してスキャンした。ゲノムおよびエピゲノムデータセットのスクリーニングは、以下の基準を満たした選択された遺伝子座を生じた:1)低メチル化され、1Kb長よりも大きい;2)ポリヌクレオチドドナーの部位特異的ヌクレアーゼ媒介性組込みを介して標的化可能;3)農学的に中立または非遺伝子;4)組み込まれた導入遺伝子がそこから発現され得る領域;および5)遺伝子座内/遺伝子座の周囲の組換えを有する領域。したがって、合計5,286のゲノム遺伝子座(配列番号1〜配列番号5286)を、これらの具体的基準を使用して同定した。これらの具体的基準はさらに、以下に詳細に記載されている。
トウモロコシ(Zea mays)ゲノムをスキャンして、DNAが低メチル化された1Kbよりも大きい最適なゲノム遺伝子座を選択した。トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73から単離した苗条組織および根組織のゲノムワイドなDNAメチル化レベルを、Illumina(商標)/Solexa(商標)1G並行配列決定データを使用してバイオインフォマティクス方法を介して調査した。これらのデータは、Wang et al., (2009) Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell 21(4): 1053-1069)で特定されるプロトコールに従って、上記トウモロコシ(Zea mays)植物組織から単離されたゲノムDNAから生成した。これらのデータは、NCBI Genbank、アクセッション番号;GEO:GSE15286において入手可能である。生配列決定読み取りを、Krueger F, Andrews SR (2011) Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics 27: 1571-1572)に記載されるBismark(商標)マッピングソフトウェアを使用して収集し、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73参照ゲノムに対してマッピングした。
トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位がポリヌクレオチドドナーの部位特異的ヌクレアーゼ媒介性組込みを介して標的化可能であるかを決定した。トウモロコシ(Zea mays)ゲノムは、メチル化され、高いレベルの配列重複を有する高度に反復性のDNAの長いストレッチを含むことが、当該分野で公知である。トウモロコシ(Zea mays)ゲノム中の既知の反復性領域の注釈付け情報を、Maize Genome Database(http://www.maizegdb.org/およびLawrence, CJ et al (2008) MaizeGDB: The Maize Model Organism Database for Basic, Translational, and Applied Research. Int J Plant Genomics. 2008:496957において入手可能)から収集した。
トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位が農学的に中立または非遺伝子であったかを決定した。このように、上記低メチル化された部位をスクリーニングして、任意の既知または予測された内因性トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73コード配列とオーバーラップしたまたは含んだ任意の部位を除去した。この目的のために、既知の遺伝子の注釈付けデータおよび発現配列タグ(EST)データのマッピング情報を、Maize Genomic Database(www.maizegdb.orgおよびMonaco, M., et al., Maize Metabolic Network Construction and Transcriptome Analysis. doi:10.3835/plantgenome2012.09.0025; Posted online 23 Jan. 2013において入手可能)から収集した。オープンリーディングフレームに対してすぐ2Kb上流および1Kb下流の任意のゲノム領域もまた検討した。これらの上流領域および下流領域は、遺伝子機能に重要な既知または未知の保存された調節エレメントを含み得る。上に以前に記載した低メチル化された部位を、既知の遺伝子(2Kb上流および1Kb下流の領域を含む)およびESTの存在について分析した。既知の遺伝子(2Kb上流および1Kb下流の領域を含む)またはESTとアラインしたまたはオーバーラップした任意の低メチル化された部位を、下流の分析から除去した。
トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位が発現されたトウモロコシ遺伝子の近位内に存在したかを決定した。トウモロコシ(Zea mays)遺伝子の転写物レベルでの発現を、Wang et al., (2009) Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell. 21(4): 1053-1069に記載されるように、RNAseq(商標)テクノロジーを使用して、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73の根組織および苗条組織から生成したトランスクリプトームプロファイリングデータを分析することによって測定した。各低メチル化された部位について、分析を完了して、低メチル化された部位の近位にある40Kb領域内に存在する任意の注釈付きの遺伝子、および低メチル化された部位の近位に位置する注釈付きの遺伝子の平均発現レベルを同定した。ゼロでない平均発現レベルを有する注釈付きの遺伝子から40Kbよりも遠くに位置した低メチル化された部位は、発現されたトウモロコシ(Zea mays)遺伝子の近位でないことが決定され、さらなる分析から除去した。
トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73において同定された低メチル化された部位をさらに分析して、どの部位が組換えの証拠を有し、従来の育種を介した他の系統のトウモロコシ(Zea mays)中への最適なゲノム遺伝子座の浸透性交雑を促進できたかを決定した。多様なトウモロコシ(Zea mays)遺伝子型は、農学的に目的の形質を含む新たな改善されたトウモロコシ(Zea mays)系統を開発するために、従来の育種の間に慣用的に交配される。このように、導入遺伝子の植物媒介性の形質転換を介してトウモロコシ(Zea mays)系統内の最適なゲノム遺伝子座中に浸透性交雑される農学的形質は、従来の植物育種の間の減数分裂組換えを介して、他のトウモロコシ(Zea mays)系統、特に精鋭の系統中にさらに浸透性交雑されることが可能であるはずである。上記低メチル化された部位をスクリーニングして、あるレベルの減数分裂組換えを有した部位を同定および選択した。組換え「コールドスポット」として特徴付けられた染色体領域内に存在する任意の低メチル化された部位を、同定および除去した。トウモロコシ(Zea mays)では、これらのコールドスポットを、複数のマッピング集団から生成された高解像度マーカーデータセットを使用して規定した。(Jafar Mammadov, Wei Chen, Anastasia Chueva, Karthik Muthuraman, Ruihua Ren, David Meyer, and Siva Kumpatla. 2011. Distribution of Recombinant Frequencies across the Maize Genome. 52nd Annual Maize Genetics Conference)。
上記選択基準の適用は、トウモロコシ(Zea mays)ゲノムからの、合計52,885の最適なゲノム遺伝子座の同定を生じた。表2は、同定された最適なゲノム遺伝子座の長さをまとめる。これらの最適なゲノム遺伝子座は、以下の特徴を有する:1)1Kb長よりも大きい低メチル化されたゲノム遺伝子座;2)ポリヌクレオチドドナーの部位特異的ヌクレアーゼ媒介性組込みを介して標的化可能なゲノム遺伝子座;3)農学的に中立または非遺伝子のゲノム遺伝子座;4)導入遺伝子がそこから発現され得るゲノム遺伝子座;および5)ゲノム遺伝子座内の組換えの証拠。表2に記載される全ての最適なゲノム遺伝子座のうち、1Kbよりも大きい最適なゲノム遺伝子座だけをさらに分析し、ドナーポリヌクレオチド配列の標的化のために利用した。これらの最適なゲノム遺伝子座の配列は、配列番号1〜配列番号5,286として開示される。集合的に、これらの最適なゲノム遺伝子座は、本明細書の以下にさらに実証されるように、ドナーポリヌクレオチド配列で標的化され得るトウモロコシ(Zea mays)ゲノム内の位置である。
5,286の同定された最適なゲノム遺伝子座(配列番号1〜配列番号5,286)を、F分布および主成分分析統計方法を使用してさらに分析して、最適なゲノム遺伝子座のグループ分けのための代表的な集団およびクラスターを規定した。
同定された5,286の最適なゲノム遺伝子座を、連続確率分布統計分析を使用して統計的に分析した。連続確率分布統計分析の一実施形態として、F分布検定を完了して、代表的な数の最適なゲノム遺伝子座を決定した。F分布検定分析を、当業者に公知の方程式および方法を使用して完了した。さらなるガイダンスについて、参照によって本明細書に組み込まれるK.M Remund, D. Dixon, DL. Wright and LR. Holden. Statistical considerations in seed purity testing for transgenic traits. Seed Science Research (2001) 11, 101-119に記載されるF分布検定分析は、F分布検定の非限定的な一例である。このF分布検定は、最適なゲノム遺伝子座のランダムサンプリングを仮定し、その結果、任意の非妥当遺伝子座は、5,286の最適なゲノム遺伝子座にわたって均等に分布し、サンプリングされた最適なゲノム遺伝子座の数は、5,286の最適なゲノム遺伝子座の総集団の10%以下である。
次に、主成分分析(PCA)統計方法を完了して、5,286の同定された最適なゲノム遺伝子座を含むデータセットの類似性および差異をさらに評価および可視化して、標的化検証のための多様な遺伝子座のサンプリングを可能にした。PCAには、より大きな数の相関変数を主成分と呼ばれるより少ない数の無相関な変数へと変形する数学的アルゴリズムが関与する。
a.このデータセット中の最適なゲノム遺伝子座の長さは、最小1,000Bp〜最大8,267Bpの範囲であった。
a.トウモロコシでは、染色体位置についての組換え頻度を、複数のマッピング集団から生成された内部高解像度マーカーデータセットを使用して規定した(Jafar Mammadov, Wei Chen, Anastasia Chueva, Karthik Muthuraman, Ruihua Ren, David Meyer, and Siva Kumpatla. 2011. Distribution of Recombinant Frequencies across the Maize Genome. 52nd Annual Maize Genetics Conference)。
b.染色体にわたるマーカーの任意の対の間での組換え頻度を、マーカー間の遺伝的距離(センチモルガン(cM))の、マーカー間の物理的距離(Mb)に対する比率に基づいて計算した。例えば、マーカーの対の間の遺伝的距離が1cMであり、マーカーの同じ対の間の物理的距離が2Mbである場合、計算された組換え頻度は、0.5cM/Mbである。各最適なゲノム遺伝子座について、少なくとも1Mb離れたマーカーの対を選択し、この様式で組換え頻度を計算した。これらの組換え値は、最小0.00041cM/Mb〜最大62.42cM/Mbの範囲であった。
a.各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列を、デフォルトパラメーター設定を使用するNCBI BLAST(商標)ソフトウェア(バージョン2.2.23)実行を使用するBLAST(商標)ベースの相同性検索を使用して、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノムに対してスキャンした(Stephen F. Altschul et al (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。これらの最適なゲノム遺伝子座配列は、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノムから同定されるので、この検索を介して同定された第1のBLAST(商標)ヒットは、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73配列自体を示す。各最適なゲノム遺伝子座配列についての第2のBLAST(商標)ヒットを同定し、このヒットのアラインメントカバー度(BLAST(商標)ヒットによってカバーされる最適なゲノム遺伝子座のパーセントとして示される)を、トウモロコシ(Zea mays)ゲノム内の最適なゲノム遺伝子座配列の独自性の尺度として使用した。第2のBLAST(商標)ヒットについてのこれらのアラインメントカバー度値は、最小0%〜最大39.98%の配列同一性の範囲であった。より高いレベルの配列同一性においてアラインしたいずれの配列も、考慮しなかった。
a.トウモロコシ(Zea mays)ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Maize Genome Database(www.maizegdb.orgおよびMonaco, M., et al., Maize Metabolic Network Construction and Transcriptome Analysis. doi:10.3835/plantgenome2012.09.0025; Posted online 23 Jan. 2013において入手可能)から抽出した。各最適なゲノム遺伝子座について、上流位置および下流位置の両方を考慮して最も近い注釈付きの遺伝子を同定し、最適なゲノム遺伝子座配列とこの遺伝子との間の距離を測定した(Bp)。例えば、最適なゲノム遺伝子座が染色体1中の500位から1500位までに位置し、この最適なゲノム遺伝子座に対して最も近い遺伝子が染色体1中の2000位から3000位までに位置する場合、最適なゲノム遺伝子座からこの最も近い遺伝子までの距離は、500Bpであると計算される。5,286全ての最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらの値は、最小1001Bp〜最大34,809Bpの範囲であった。
a.各最適なゲノム遺伝子座について、ヌクレオチド配列を分析して、存在するグアニン塩基およびシトシン塩基の数を推定した。この計数は、各最適なゲノム遺伝子座の配列長さの百分率として示され、GC%についての尺度を提供する。トウモロコシの最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらのGC%値は、25.17%〜68.3%の範囲である。
a.トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Maize Genome Databaseから抽出した。5,286の最適なゲノム遺伝子座配列の各々について、最適なゲノム遺伝子座配列の周囲の40Kbウインドウを規定し、このウインドウとオーバーラップする位置を有する注釈付きの遺伝子の数を計数した。これらの値は、40Kb近隣内に最小1遺伝子〜最大9遺伝子の範囲であった。
a.トウモロコシ遺伝子の転写物レベルでの発現を、RNAseq(商標)テクノロジーを使用して、トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73の根組織および苗条組織から生成した利用可能なトランスクリプトームプロファイリングデータを分析することによって測定した(Mortazavi, A. et al., Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5, 621-628 (2008); Wang et al., Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell. 2009 April; 21(4): 1053-1069)。トウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノム中の既知の遺伝子の遺伝子注釈付け情報および位置を、Maize Genome Databaseから抽出した。各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座の周囲の40Kb近隣に存在したトウモロコシ(Zea mays)c.v.B73ゲノム内の注釈付きの遺伝子を同定した。遺伝子の各々についての発現レベルを、上述の引用に記載されたトランスクリプトームプロファイルから抽出し、平均遺伝子発現レベルを計算した。トウモロコシ(Zea mays)のゲノム内の全ての遺伝子の発現値は大きく変動する。最小発現値は0であり、最大発現値は2511.397であり、平均発現値は18.489であり、中央値発現値は3.604である。5,286の最適なゲノム遺伝子座データセットの全てについての平均発現値は、最小0.00369〜最大2233.06の範囲であった。
a.特定のヌクレオチド配列についてのヌクレオソーム占有率のレベルを理解することで、染色体機能および配列のゲノム情況についての情報が提供される。NuPoP(商標)統計パッケージを使用して、任意のサイズのゲノム配列について、ヌクレオソーム占有率および最も確からしいヌクレオソームポジショニングマップを予測した(Xi, L., Fondufe-Mittendor, Y., Xia, L., Flatow, J., Widom, J. and Wang, J.-P., Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model, BMC Bioinformatics, 2010, doi:10.1186/1471-2105-11-346.)。5,286の最適なゲノム遺伝子座の各々について、ヌクレオチド配列を、NuPoP(商標)ソフトウェアを用いた分析に供し、ヌクレオソーム占有率スコアを計算した。トウモロコシの最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらのヌクレオソーム占有率スコアは、最小0〜最大0.962の範囲であった。
a.セントロメアは、2つの姉妹染色分体を接続する、染色体上の領域である。セントロメアのいずれかの側の染色体の部分は、染色体アームとして公知である。10全てのトウモロコシ染色体上のセントロメアのゲノム位置を、公開されたトウモロコシ(Zea mays)c.v.B73参照配列において同定した(Schnable, P., et al., (2009) The B73 maize genome: complexity, diversity and dynamics. Science, 326(5956): 1112-1115)。トウモロコシ(Zea mays)染色体の各々におけるセントロメアの位置および染色体アームの長さに関する情報を、Maize Genome Databaseから抽出した。各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座配列からそれが位置する染色体のセントロメアまでのゲノム距離が測定される(Bp)。染色体内の最適なゲノム遺伝子座の相対的位置は、それが存在する特定の染色体アームの長さに対する、セントロメアまでのそのゲノム距離の比率として示される。トウモロコシの最適なゲノム遺伝子座データセットについてのこれらの相対的位置値は、最小0.00373〜最大0.99908のゲノム距離の比率の範囲であった。
a.各最適なゲノム遺伝子座について、最適なゲノム遺伝子座位置の周囲の1Mbゲノムウインドウを規定し、考慮した最適なゲノム遺伝子座を含む、この領域内に存在するまたはこの領域とオーバーラップする他のさらなる最適なゲノム遺伝子座の数を計算した。1Mb中の最適なゲノム遺伝子座の数は、最小1〜最大22の範囲であった。
合計72のゲノム遺伝子座を、32の別個のクラスター内にクラスター化された5,286のゲノム遺伝子座から、ドナーポリヌクレオチド配列による標的化のために同定および選択した。32のクラスターの各々について、代表的ゲノム遺伝子座(表4中に上記したようにクラスターの重心に最も近い32の代表的ゲノム遺伝子座)および各クラスター内のさらなる遺伝子座を選択した。これらのさらなる最適なゲノム遺伝子座を、トウモロコシ(Zea mays)c.v.Hi−II(標的化スクリーニング系統)およびトウモロコシ(Zea mays)c.v.B104(形質転換系統)の両方についてのゲノムDNA配列データからなる全ゲノムデータベースに対して、5,286全ての選択された最適なゲノム配列を最初にスクリーニングすることによって選択して、両方の系統由来のゲノムにおけるカバー度(どのくらいの最適なゲノム遺伝子座が両方のゲノム中に存在したか)および配列同一性の百分率を決定した。Hi−IIおよびB104の両方のゲノムデータベース中の100%カバー度(両方のゲノム間でアラインされた最適な遺伝子座の配列全体長さ)および100%同一性を有するさらなる最適なゲノム遺伝子座を、標的化検証のために選択した(図5)。比較的、少数の代表的ゲノム遺伝子座が、Hi−IIゲノムデータベースおよびB104ゲノムデータベースの両方において、100%未満のカバー度および同一性の配列同一性を有した(図5)。他の基準、例えば、最適なゲノム遺伝子座のゲノム遺伝子座サイズ、独自性の程度、GC%含量および染色体分布もまた、さらなる最適なゲノム遺伝子座を選択する際に考慮に入れた。72の選択された最適なゲノム遺伝子座の染色体位置および各トウモロコシ(Zea mays)の最適なゲノム遺伝子座の特定のゲノム立体配置は、それぞれ図6および表5に示される。
代表的ゲノム遺伝子座の同定されたDNA配列に対するジンクフィンガータンパク質を、以前に記載されたように設計した。例えば、Urnov et al., (2005) Nature 435:646-551を参照のこと。例示的な標的配列および認識らせんは、表7(認識らせん領域設計)および表8(標的部位)に示される。表8では、ZFP認識らせんによって接触される標的部位中のヌクレオチドは、大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)標的部位を、以前に記載した72の選択されたゲノム遺伝子座の全てについて設計した。多数のZFP設計を開発し、試験して、上記のようにトウモロコシ(Zea mays)において同定および選択された72の異なる代表的ゲノム遺伝子座標的部位と、最も高いレベルの効率で結合したフィンガーを同定した。最も高いレベルの効率でジンクフィンガー認識配列と結合した特異的ZFP認識らせん(表7)を、トウモロコシ(Zea mays)ゲノム内のドナー配列の標的化および組込みに使用した。
以前に記載されたように同定されたZFN遺伝子発現構築物を含むプラスミドベクターを、当該分野で一般に公知の技能および技術を使用して、設計および完了した(例えば、AusubelまたはManiatisを参照のこと)。各ZFNコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置付けたopaque−2核局在化シグナルをコードする配列(Maddaloni et al., (1989) Nuc. Acids Res. 17:7532)に融合させた。非正準ジンクフィンガーコード配列を、IIS型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメイン(Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のアミノ酸384〜579)に融合させた。融合タンパク質の発現を、トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン遺伝子由来の強い構成的プロモーター(これは、5’非翻訳領域(UTR)を含む(Toki et al., (1992) Plant Physiology 100;1503-07)によって駆動した。この発現カセットは、トウモロコシ(Zea mays)ペルオキシダーゼ5遺伝子(Per5)遺伝子由来の3’UTR(転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む)もまた含んだ(米国特許出願公開第2004/0158887号)。トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス由来のヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性2A(Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760)を、構築物中にクローニングされた2つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質間に付加した。
プラスミドを、制限酵素消化を介して構築し、DNA配列決定を介して確認した。
ジンクフィンガーヌクレアーゼベクターのサブセットを、自動化DNA構築パイプラインを介してクローニングした。全体として、自動化パイプラインは、以前に記載したのと同一のZFN構造を有するベクター構築を生じた。ZFNのDNA結合特異性を付与する各ジンクフィンガーモノマーを、KPFアミノ酸モチーフにおいて2〜3の独自の配列へと分割した。ZFN断片の5’末端および3’末端の両方を、BsaI認識部位(GGTCTCN)および誘導されたオーバーハングを含めることで改変した。オーバーハングを、6〜8部のアセンブリのみが所望の全長発現クローンを生じるように、分布させた。改変されたDNA断片を、de novo合成した(Synthetic Genomics Incorporated、La Jolla、CA)。単一のトウモロコシ(Zea mays)骨格pDAB118791を、トウモロコシZFN構築の全てにおいて使用した。これは、ZmUbilプロモーターおよびOpaque2 NLSならびにFokIドメインおよびZmPer5 3’UTRを含んだ。枯草菌(Bacillus subtilis)由来のBsaI隣接SacB遺伝子を、Opaque2 NLSとFokIドメインとの間にクローニングした。推定ライゲーション事象を、スクロース含有培地上にプレートした場合、このSacBカセットは、ベクター骨格の夾雑を低減または排除する陰性選択因子として作用する。全ての構築において反復して利用した第2の部分は、pDAB117462であった。このベクターは、全てBsaI部位が隣接した、第1のモノマーFok1ドメイン、t2Aスタッター配列および第2のモノマーOpaque2 NLSを含む。
大きい数の遺伝子座の迅速な試験を支持するために、新規のフレキシブルな普遍的ドナー系配列を設計し、構築した。この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、ハイスループットベクター構築方法論および分析と適合性であった。この普遍的ドナー系は、少なくとも3つのモジュラードメイン:可変ZFN結合ドメイン、非可変分析およびユーザーが規定した特徴ドメイン、ならびにベクタースケールアップのための単純なプラスミド骨格から構成された。この非可変普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、全てのドナーに共通し、全てのトウモロコシ(Zea mays)標的部位にわたって使用され得るアッセイの有限のセットの設計を可能にし、したがって、標的化の評価における均一性を提供し、分析サイクル回数を低減させた。これらのドメインのモジュラー的性質は、ハイスループットなドナーアセンブリを可能にした。さらに、この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、下流の分析を単純化し、結果の解釈を向上させることを目的とした他の独自の特徴を有する。これは、診断的に予測されたサイズへのPCR産物の消化を可能にする非対称制限部位配列を含んでいる。PCR増幅において問題となることが予測される二次構造を含む配列を除去した。この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列は、サイズが小さい(3.0Kb未満)。最後に、この普遍的ドナーポリヌクレオチド配列を、時宜を得た様式で大量の試験DNAの嵩を増やす高コピーpUC19骨格上に構築した。
トウモロコシ(Zea mays)c.v.Hi−IIプロトプラストへの送達の前に、各ZFN構築物のためのプラスミドDNAを、供給業者の指示に従ってPURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM(登録商標)(Promega Corporation、Madison、WI)またはPLASMID MAXI KIT(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用して、大腸菌(E. coli)の培養物から調製した。
トウモロコシ(Zea mays)c.v.Hi−II懸濁細胞を、3.5日の維持スケジュールで維持し、4mLのパッケージ化細胞体積(packed cell volume)(PCV)の細胞を収集し、20mLの酵素溶液(0.6%PECTOLYASE(商標)、6%CELLULASE(商標)(「Onozuka」R10;Yakult Pharmaceuticals、Japan)、4mM MES(pH5.7)、0.6Mマンニトール、15mM MgCl2)を含む50mL 無菌コニカルチューブ(Fisher Scientific)に移した。培養物をキャップし、PARAFILM(商標)で包み、プロトプラストが放出されるまで、室温で16〜18時間のインキュベーションのために速度設定10でプラットホームロッカー(Thermo Scientific、Vari Mix platform Rocker)上に置いた。インキュベーション後、一滴の細胞を顕微鏡下でチェックして、消化の品質をチェックし、消化された細胞を、100μm細胞ストレーナーを介して濾過し、10mLのW5培地[2mM MES(pH5.7)、205mM NaCl、167mM CaCl2、6.7mM KCl]でリンスし、その後、70μmおよび40μmの細胞ストレーナーを介して濾過した。100μmおよび40μmのストレーナーを、10mLのW5培地でリンスした。濾過したプロトプラストを、リンスした培地と共に、50mL遠心分離チューブ中に収集し、最終体積は、およそ40mLであった。次いで、8mLの「重勾配溶液(Heavy Gradient solution)」[500mMスクロース、1mM CaCl2、5mM MES(pH6.0)]を、プロトプラスト/酵素溶液の底に緩徐に添加し、スイングアームバケットローターを有する遠心分離機中で300〜350×gで15分間遠心分離した。遠心分離後、約7〜8mLのプロトプラストバンドを取り出し、25mLのW5で洗浄し、180〜200×gで15分間遠心分離した。次いで、これらのプロトプラストを、10mLのMMG溶液[4mM MES(pH5.7)、0.6Mマンニトール、15mM MgCl2]中で再懸濁した。プロトプラストを、血球計算器またはフローサイトメーターを使用して計数し、MMGを使用して1mL当たり167万まで希釈した。
およそ50万のプロトプラスト(MMG溶液中300μl)を、2mLチューブに移し、40μlのDNAと混合し、室温で5〜10分間インキュベートした。次に、300μlの新たに調製したPEG溶液[36%PEG 4000、0.3Mマンニトール、0.4M CaCl2]を添加し、この混合物を、反転による定期的混合によって室温で15〜20分間インキュベートした。インキュベーション後、1mlのW5洗浄を緩徐に添加して穏やかに混合し、プロトプラストを、180〜200×gで15分間の遠心分離によってペレット化した。このペレットを、1mLのWI培地[4mM MES(pH5.7)、0.6Mマンニトール、20mM KCl]中で再懸濁し、プロトプラスト含有チューブをアルミニウムホイルで包み、室温で約16時間にわたって一晩インキュベートした。
表5の選択されたゲノム遺伝子座の各々について、トウモロコシ(Zea mays)プロトプラストを、yfp遺伝子発現対照、ZFN単独、ドナー単独、ならびに1:10の比(重量で)でのZFNおよびドナーDNAの混合物を含む構築物でトランスフェクトした。50万のプロトプラストのトランスフェクションのためのDNAの総量は、80μgであった。全ての処理を、3または6のいずれかの再現で実施した。使用したyfp遺伝子発現対照は、トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーター−黄色蛍光タンパク質コード配列−トウモロコシ(Zea mays)Per5 3’UTRおよびイネアクチン1プロモーター−patコード配列−トウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’UTR遺伝子発現カセットを含むpDAB8393(図11)であった。トランスフェクション当たり一貫した量の総DNAを提供するために、サケ精子、またはyfp遺伝子含有プラスミドのいずれかを、必要に応じてフィラーとして使用した。典型的な標的化実験では、4μgのZFNを、単独でまたは36μgのドナーと共にトランスフェクトし、適切な量のサケ精子またはpUC19プラスミドDNAを添加して、DNAの全体量を80μgにした。フィラーとしてyfp遺伝子発現プラスミドを含めると、複数の遺伝子座および再現処理にわたるトランスフェクション品質の評価が可能になる。
ZFNトランスフェクトしたトウモロコシ(Zea mays)c.v.Hi−IIプロトプラストを、2ml EPPENDORF(商標)チューブ中で1600rpmでの遠心分離によって、トランスフェクションの24時間後に回収し、上清を完全に除去した。ゲノムDNAを、QIAGEN PLANT DNA EXTRACTION KIT(商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用して、プロトプラストペレットから抽出した。この単離されたDNAを、50μLの水中に再懸濁し、濃度をNANODROP(登録商標)(Invitrogen、Grand Island、NY)によって決定した。DNAの完全性を、0.8%アガロースゲル電気泳動でサンプルを泳動することによって推定した。全てのサンプルを、PCR増幅のために標準化して(20〜25ng/μL)、配列決定(Illumina,Inc.、SanDiego、CA)のためのアンプリコンを生成した。処理したサンプルおよび対照サンプル由来の各試験ZFN認識配列を包含する領域を増幅するためのバーコード化PCRプライマーを設計し、IDT(Coralville、IA、HPLC精製した)から購入した。最適な増幅条件を、23.5μLの反応中で0.2μMの適切なバーコード化プライマー、ACCUPRIME PFX SUPERMIX(商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA)および100ngの鋳型ゲノムDNAを使用する勾配PCRによって同定した。サイクリングパラメーターは、95℃での最初の変性(5分間)、その後の、変性(95℃、15秒間)、アニーリング(55〜72℃、30秒間)、伸長(68℃、1分間)の35サイクル、および最終伸長(68℃、7分間)であった。増幅産物を、3.5%TAEアガロースゲル上で分析し、各プライマーの組合せに適切なアニーリング温度を決定し、上記のように対照サンプルおよびZFN処理サンプルからアンプリコンを増幅するために使用した。全てのアンプリコンを、3.5%アガロースゲル上で精製し、水中に溶出させ、NANODROP(商標)によって濃度を決定した。次世代配列決定のために、ZFN処理したおよび対応するトウモロコシプロトプラスト対照由来の約100ngのPCRアンプリコンを一緒にプールし、llumina次世代配列決定(NGS)を使用して配列決定した。
非相同末端結合(NHEJ)媒介性のドナー挿入を介した、トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的内の普遍的ドナーポリヌクレオチド配列の標的化の検証を、セミスループット(semi-throughput)プロトプラストベースの迅速試験分析方法を使用して実施した。各トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的について、3〜6のZFN設計を試験し、標的化を、次世代配列決定方法によってZFN媒介性の切断を測定し(図12)、ジャンクショナルイン−アウトPCRによってドナー挿入を測定することによって、評価した(図13)。両方のアッセイにおいて陽性であったトウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座を、標的化可能な遺伝子座として同定した。
トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的がドナー挿入のために標的化され得るか否かを決定するために、ZFN構築物および普遍的ドナーポリヌクレオチド構築物を、ゲノムDNAを分析のために抽出する前に24時間にわたってインキュベートしたトウモロコシプロトプラストに共送達した。発現されたZFNが、トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的においておよびドナー中での両方で、標的結合部位を切断することができた場合、線状化したドナーを、非相同末端結合(NHEJ)経路を介して、トウモロコシゲノム中の切断された標的部位中に挿入する。トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的における標的化された組込みの確認を、「イン−アウト」PCR戦略に基づいて完了し、この戦略では、「イン」プライマーは、ネイティブの最適なゲノム遺伝子座における配列を認識し、「アウト」プライマーは、ドナーDNA内の配列に結合する。これらのプライマーは、ドナーDNAがトウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的において挿入された場合にだけ、PCRアッセイが予測されたサイズを有する増幅産物を産生するように、設計した。このイン−アウトPCRアッセイを、挿入接合部の5’末端および3’末端の両方において実施した。組み込まれたポリヌクレオチドドナー配列の分析に使用したプライマーを、表9に提供する。
全てのPCR増幅を、TAKARA EX TAQ HS(商標)キット(Clonetech、Mountain View、CA)を使用して実施した。第1のイン−アウトPCRを、1×TAKARA EX TAQ HS(商標)緩衝液、0.2mMのdNTPs、0.2μMの「アウト」プライマー(表9)、0.05μMの「イン」プライマー(上記普遍的ドナーカセットから設計した)、0.75単位のTAKARA EX TAQ HS(商標)ポリメラーゼおよび10ngの抽出されたトウモロコシプロトプラストDNAを含む20μLの最終反応体積において実施した。次いで、この反応を、94℃で2分間、98℃で12秒間および68℃で2分間の20サイクル、その後72℃で10分間からなるPCRプログラムを使用して実施し、4℃で維持した。最終PCR産物を、可視化のために、1KB PLUS DNA LADDER(商標)(Life Technologies、Grand Island、NY)と共に、アガロースゲル上で泳動した。
このドナープラスミド、およびトウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的を特異的に切断するように設計された1つのZFNを、トウモロコシ(Zea mays)c.v.Hi−IIプロトプラスト中にトランスフェクトし、細胞を24時間後に収集した。イン−アウトジャンクショナルPCRによる、対照、ZFN処理されたおよびドナーと共にZFN処理されたプロトプラストから単離されたゲノムDNAの分析は、ZFNによるゲノムDNA切断の結果として、普遍的ドナーポリヌクレオチドの標的化された挿入を示した(表12)。これらの研究は、この普遍的ドナーポリヌクレオチド系が、内因性部位における標的化を評価するため、および候補ZFNをスクリーニングするために使用され得ることを示している。最後に、プロトプラストベースの迅速標的化分析および新規の普遍的ドナーポリヌクレオチド配列系は、ゲノム標的をスクリーニングするための迅速な手段および植物における正確なゲノム操作の試みのためのZFNを提供する。これらの方法は、DNAの二本鎖破断または一本鎖破断を導入する任意のヌクレアーゼを使用して任意の目的の系においてゲノム標的における部位特異的切断およびドナー挿入を評価するために拡張され得る。
ランダムに組み込まれたトウモロコシ形質転換事象を、米国特許第7,838,733号に記載されるaad−1導入遺伝子を含むpDAB105817およびpEPS1027プラスミドによる形質転換によって生成した(図14)。多数の事象を生じさせ、1,027の安定な事象を分析して、米国特許出願公開第2012/0258867号に記載されるゲノム隣接分析(genome flanking analysis)方法を介して、いずれの事象がトウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的内にランダムに組み込まれた導入遺伝子を含んだかを決定した。こうして、223の事象における組み込まれた導入遺伝子の染色体位置を、トウモロコシ(Zea mays)ゲノム内でマッピングした。このデータ、表13は、組み込まれた導入遺伝子の染色体位置が、低メチル化された領域内の(45〜73%)、および少なくとも1Kbエリアの下流の転写単位(プロモーター/遺伝子/3’UTR)中の(60%)、組込みを実証したことを示した。
一そろいの最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座を、5,286の最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座から同定して、遺伝子発現カセットの部位特異的標的化のための複数の遺伝子座を選択し、遺伝子発現カセットのスタックを生成した。以下の基準を使用して、最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座のプールをフィルターにかけ、一そろいの最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座を選択した:
1)3Kbの長さよりも大きい。この最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座は、少なくとも2セットの遺伝子発現カセットの組込みで標的化され得る。
2)0.5〜1.0の組換え頻度、これは、同定された5,286の最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座の平均組換え頻度よりも低い(平均組換え頻度は約2.0である)。
3)同定された5,286の最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座の40Kb以内の内因性遺伝子の平均発現よりも高い。根組織および苗条組織における40Kb領域以内の遺伝子の平均発現は、6.30よりも高く、これは、全ての最適な非遺伝子トウモロコシゲノム遺伝子座の48パーセンタイルである。
4)トウモロコシ(Zea mays)c.v.B104とトウモロコシ(Zea mays)c.v.Hi−IIとの間の、90%よりも高い配列カバー度および配列同一性。
Claims (32)
- 組換えDNAを含むトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞であって、前記組換えDNAが、
loci_137693_G1(配列番号387)、
loci_265551_G1(配列番号463)、
loci_128078_G1(配列番号560)、
loci_168286_G1(配列番号573)、
loci_3733_G1(配列番号1923)、
loci_203075_G1(配列番号2030)、
loci_232484_G1(配列番号2053)、
loci_136086_G1(配列番号4425)、
loci_203704_G1(配列番号2033)、
loci_127268_G1(配列番号2709)、
loci_204637_G1(配列番号2731)、
loci_291068_G1(配列番号3230)、
loci_232222_G1(配列番号3357)、
loci_43577_G1(配列番号3428)、
loci_204726_G1(配列番号424)、および
loci_232228_G1(配列番号4529)
からなる群から選択されるDNAと少なくとも90%の配列同一性を有する、1Kb〜8.4Kbの長さの非遺伝子DNAであって、前記トウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞のゲノム内に位置する、非遺伝子DNA、ならびに
前記非遺伝子DNA中に挿入されている目的のDNAを含む、トウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。 - 前記目的のDNAが、前記非遺伝子DNAに対して特異的なジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、前記非遺伝子DNAに対して特異的なジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、分析ドメインを含む、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードする、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子、または選択可能なマーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記非遺伝子DNAの2以上が、各々、2以上の組換えDNAを産生するために挿入された目的のDNAを含み、前記2以上の組換えDNAが、同じ染色体上に位置する、請求項1に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記非遺伝子DNAが、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_136086(配列番号4425)、optimal_loci_232484(配列番号2053)、optimal_loci_203075(配列番号2030)、optimal_loci_3733(配列番号1923)、optimal_loci_168286(配列番号573)、optimal_loci_128078(配列番号560)、optimal_loci_265551(配列番号463)、optimal_loci_127268(配列番号2709)、optimal_loci_204726(配列番号424)およびoptimal_loci_232222(配列番号3357)からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記非遺伝子DNAが、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_136086(配列番号4425)、optimal_loci_232484(配列番号2053)、optimal_loci_203075(配列番号2030)、optimal_loci_3733(配列番号1923)、optimal_loci_168286(配列番号573)、optimal_loci_128078(配列番号560)およびoptimal_loci_265551(配列番号463)からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記非遺伝子DNAが、optimal loci_204637(配列番号2731)、optimal_loci_203075(配列番号2030)およびoptimal_loci_128078(配列番号560)からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記非遺伝子DNAが、optimal_loci_137693_G1(配列番号387)、optimal_loci_265551_G1(配列番号463)、optimal_loci_128078_G1(配列番号560)、optimal_loci_168286_G1(配列番号573)、optimal_loci_3733_G1(配列番号1923)、optimal_loci_203075_G1(配列番号2030)、optimal_loci_232484_G1(配列番号2053)およびoptimal_loci_204637_G1(配列番号2731)からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、
a.loci_137693_G1(配列番号387)、loci_265551_G1(配列番号463)、loci_128078_G1(配列番号560)、loci_168286_G1(配列番号573)、loci_3733_G1(配列番号1923)、loci_203075_G1(配列番号2030)、loci_232484_G1(配列番号2053)、loci_136086_G1(配列番号4425)、loci_203704_G1(配列番号2033)、loci_127268_G1(配列番号2709)、loci_204637_G1(配列番号2731)、loci_291068_G1(配列番号3230)、loci_232222_G1(配列番号3357)、loci_43577_G1(配列番号3428)、loci_204726_G1(配列番号424)およびloci_232228_G1(配列番号4529)からなる群から選択される核酸に対して少なくとも90%の配列同一性を有する標的非遺伝子トウモロコシゲノム核酸を選択するステップ;
b.前記標的非遺伝子トウモロコシゲノム核酸と特異的に結合してそれを切断する部位特異的ヌクレアーゼを選択するステップ;
c.前記部位特異的ヌクレアーゼをトウモロコシ植物細胞中に導入するステップ;
d.前記目的のDNAを前記植物細胞中に導入するステップ;
e.前記目的のDNAを前記標的非遺伝子トウモロコシゲノム核酸中に挿入するステップ;ならびに
f.前記非遺伝子核酸に挿入された前記目的のDNAを含むトランスジェニック植物細胞を選択するステップを含む、方法。 - 前記目的のDNAが、分析ドメインを含む、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードしない、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、ペプチドをコードする、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、2以上の遺伝子発現カセットを含む、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPRヌクレアーゼ、TALEN、ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、相同組換え修復組込み方法を介して、前記非遺伝子核酸内に組み込まれる、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAが、非相同末端結合組込み方法を介して、前記非遺伝子核酸内に組み込まれる、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAの2以上が、前記標的非遺伝子トウモロコシゲノム核酸の2以上中に挿入される、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記標的非遺伝子トウモロコシゲノム核酸の2以上が、同じ染色体上に位置する、請求項23に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 前記目的のDNAおよび/または前記標的非遺伝子トウモロコシゲノム核酸が、前記標的非遺伝子トウモロコシゲノム核酸中への前記目的のDNAの挿入の間に改変される、請求項14に記載のトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
- 組換えDNAを含むトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞であって、前記組換えDNAは、
loci_137693_G1(配列番号387)、
loci_265551_G1(配列番号463)、
loci_128078_G1(配列番号560)、
loci_168286_G1(配列番号573)、
loci_3733_G1(配列番号1923)、
loci_203075_G1(配列番号2030)、
loci_232484_G1(配列番号2053)、
loci_136086_G1(配列番号4425)、
loci_203704_G1(配列番号2033)、
loci_127268_G1(配列番号2709)、
loci_204637_G1(配列番号2731)、
loci_291068_G1(配列番号3230)、
loci_232222_G1(配列番号3357)、
loci_43577_G1(配列番号3428)、
loci_204726_G1(配列番号424)、および
loci_232228_G1(配列番号4529)
からなる群から選択される非遺伝子DNAと少なくとも95%の配列同一性を有する、1Kb〜8.4Kbの長さの核酸であって、前記トウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞のゲノム内に位置する、核酸、ならびに
前記非遺伝子DNA中に挿入されている目的のDNAであって、前記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素使用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養品質遺伝子、DNA結合遺伝子、または選択可能なマーカー遺伝子を含む、トウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。 - 前記組換えDNAの2以上を含む、請求項26に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記組換えDNAが、同じ染色体上に位置する、請求項27に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、前記非遺伝子DNAに対して特異的なジンクフィンガー標的部位の近位に挿入されている、請求項26に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、前記非遺伝子DNAに対して特異的なジンクフィンガー標的部位の対の間に挿入されている、請求項26に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記目的のDNAが、殺虫剤抵抗性遺伝子または除草剤耐性遺伝子を含む、請求項26に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
- 前記非遺伝子DNAが、
loci_137693_G1(配列番号387)、
loci_265551_G1(配列番号463)、
loci_128078_G1(配列番号560)、
loci_168286_G1(配列番号573)、
loci_3733_G1(配列番号1923)、
loci_203075_G1(配列番号2030)、
loci_232484_G1(配列番号2053)、
loci_136086_G1(配列番号4425)、
loci_203704_G1(配列番号2033)、
loci_127268_G1(配列番号2709)、
loci_204637_G1(配列番号2731)、
loci_291068_G1(配列番号3230)、
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からなる群から選択されるDNAを含む、請求項26から31のいずれか一項に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物細胞。
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