BR102016029899A2 - Compositions and methods for efficient administration of transgenes - Google Patents

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M. ELLIS Christine
E. GOLEY Michael
T. LARUE Clayton
L. Leclere Sherry
Qi Qungang
Shao Aihua
Y. Thai Kwan
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Monsanto Technology Llc
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Abstract

a invenção refere-se a moléculas de dna recombinante e construtos de transgene úteis para proporcionar localização subcelular de proteínas eficiente em plantas transgênicas. moléculas de dna recombinante e os construtos para conferir tolerância a herbicidas ou resistência a plantas são ainda fornecidos, assim como plantas que exibem tolerância a herbicidas e métodos para a produção ou utilização de tais plantas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA DIRECIONAMENTO EFICIENTE DE TRANSGENES".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 62/270,180, depositado em 21 de dezembro, 2015 e Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 62/364.715, depositado em 20 de julho, 2016, aqui incorporados por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A invenção refere-se genericamente aos campos da agricultura, biotecnologia vegetal e biologia molecular. Mais especificamente, a invenção refere-se a composições e métodos para a produção de plantas transgênicas que exibem tolerância ou resistência a herbicidas.
INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[003] Uma forma legível por computador de uma listagem de sequências é depositada com este pedido por apresentação electrónica e é incorporada a este pedido por referência na sua totalidade. A listagem de sequência está contida no arquivo chamado MONS389US_sequence_listing.txt, que é de 125,128 kilobytes de tamanho (medido em sistema operacional MS Windows) e criada em 22 de novembro de 2016.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[004] A produção de novas plantas transgênicas oferece o potencial para plantas de cultivo significativamente melhoradas que exibem traços benéficos, tais como a tolerância a herbicida melhorada, para permitir estratégias de controle de plantas daninhas aprimoradas. No entanto embora as proteínas úteis para a produção de características benéficas em culturas sejam conhecidas, a localização subcelular efi- caz (conhecida como direcionamento) e o processamento destas proteínas recombinantes em células de plantas transgênicas permanecem um obstáculo considerável. Existe, portanto, uma necessidade para novos peptídeos de trânsito capazes de localizar eficazmente proteínas recombinantes dentro de células vegetais.
SUMÁRIO
[005] Um aspecto da invenção refere-se a uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito do cloroplasto (CTP), operacionalmente ligado a uma sequência de DNA que codifica uma dicamba mono-oxigenase (DMO) ou uma protoporfirinogênio oxidase (PPO) em que o CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3. Em certas modalidades, a sequência de DNA que codifica um CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7-14. Outras modalidades, a DMO ou PPO compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18-27 e 40-59. Numa modalidade, a sequência de DNA de um DMO ou PPO compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 28-37 e 61-102. Em modalidades específicas, a DMO ou PPO é definida como uma proteína de tolerância a herbicida que é capaz de conferir tolerância a herbicidas, quando expressa numa célula de planta. Em modalidades particulares, a proteína de tolerância a herbicidas é uma proteína de DMO e o CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3 ou a proteína de tolerância a herbicidas é uma proteína de PPO e o CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2.
[006] Num outro aspecto, a invenção proporciona um construto de DNA compreendendo uma molécula de DNA recombinante tal co- mo aqui descrito operativamente ligada a um promotor heterólogo funcional numa célula de planta.
[007] Em ainda outro aspecto, o invento proporciona uma planta transgênica, célula de planta, parte de planta ou semente transformada com uma molécula de DNA recombinante da invenção. Em modalidades específicas, a planta é uma planta monocotiledônea. Plantas monocotiledôneas que podem ser utilizadas com a invenção incluem, mas não estão limitadas a milho ou plantas de trigo. Numa outra modalidade, a planta é uma planta dicotiledônea. Plantas dicotiledôneas que podem ser utilizadas com a invenção incluem, mas não estão limitados a uma planta de soja, algodão ou Brassica.
[008] Em ainda outro aspecto, uma molécula de DNA recombi-nante da invenção é proporcionada que está presente dentro de um material vegetal não vivo. Num exemplo, as células vegetais estão dentro do âmbito da invenção desde que estas contenham uma molécula de DNA recombinante da presente invenção. Numa modalidade estas células de plantas podem ser células de plantas regeneráveis ou podem ser células de plantas não regeneráveis não suscetíveis de serem regeneradas numa planta.
[009] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona métodos de produção de produtos de base que compreendem uma quantidade detectável de uma molécula de DNA recombinante da invenção, incluindo os produtos produzidos deste modo. Em certas modalidades, os produtos de base fornecidos pela invenção incluem sementes não viáveis ou suas partes, tecido de planta, tecido de planta desidratada congelado, tecido de planta processado, sêmola, farinha, flocos, farelo e fibra. Produtos de base podem ser viáveis ou não viáveis. Produtos primários não viáveis incluem, mas não estão limitados a sementes não viáveis e grãos; sementes industrializadas, partes de sementes e partes de plantas; tecido desidratado vegetal, tecido vegetal congelado e tecidos de plantas processados. Produtos primários da invenção contêm uma quantidade detectável de uma molécula de DNA recom-binante tal como aqui descrito. Os métodos para a detecção de uma molécula de DNA recombinante da invenção são bem conhecidos na técnica.
[0010] Num aspecto adicional, o invento proporciona um método para produzir uma planta tolerante a herbicida que compreende os passos de: a) transformação de uma célula vegetal com um construto de DNA da invenção e b) regenerar uma planta a partir da célula de planta transformada que compreende o construto de DNA. Em uma modalidade do método, a planta regenerada é tolerante a um herbicida selecionado a partir do grupo que consiste de dicamba e um inibidor de PPO.
[0011] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de produzir uma planta tolerante a herbicida que compreende os passos de: a) cruzar uma planta progenitora que compreende uma molécula de DNA recombinante da presente invenção com ela própria ou com uma segunda planta para produzir uma ou mais plantas de progênie; e b) seleção de uma planta de progênie compreendendo a referida molécula de DNA. Em uma modalidade do método, a planta descendente é tolerante a um herbicida selecionado a partir do grupo que consiste de dicamba e um inibidor de PPO.
[0012] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para a expressão de uma DMO ou PPO em uma célula de planta que compreende a introdução de uma molécula de DNA recombinante da invenção para uma célula vegetal. Em uma modalidade da invenção, a introdução de uma molécula de DNA recombinante compreende transformação da célula de planta.
[0013] Num outro aspecto, a invenção proporciona um método para controlar o crescimento de ervas daninhas em um ambiente de cul- tivo de culturas que compreende os passos de: a) plantação de uma planta ou semente da invenção num ambiente de cultivo de cultura; e b) aplicar ao ambiente de cultivo de cultura uma quantidade de dicam-ba ou um herbicida inibidor da PPO eficaz para controlar o crescimento de ervas daninhas. Em modalidades específicas, a aplicação do herbicida é feita pré ou pós-emergente. Numa modalidade, a quantidade de herbicida não danifica a planta ou semente. Em certas modalidades do método, a semente ou planta é uma planta monocotiledô-nea ou sementes, tais como planta ou semente de milho ou trigo. Em outras modalidades, a planta ou semente de planta é uma dicotiledô-nea ou semente, tais como planta de soja, algodão ou Brassica. Outras modalidades, o herbicida é um inibidor de dicamba ou PPO. BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA
[0014] Figura 1. Plantas de milho F1 transgênicas que expressam H_N10 (SEQ ID NO: 43) operativamente ligadas a APG6 (SEQ ID NO: 1) ou 12G088600TP (SEQ ID NO: 38) após o tratamento de aplicação do herbicida de 0,036 libras i.a./acre S-3100 aplicado em V2 seguido por V4 seguido por V8.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0015] A SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de CTP albino e verde pálido (APG6) de Arabidopsis thaliana.
[0016] A SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos de uma variante optimizada de terminal amino do CTP de APG6 da SEQ ID NO: 1.
[0017] A SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos do CTP da proteína de choque térmico (CR88) de 90 kDa de Arabidopsis thaliana [0018] A SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos do CTP de Ph.ShkG-CTP4.
[0019] A SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos do CTP de Ps.RbcS 3C.
[0020] A SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos do CTP de Os.Waxy.
[0021] As SEQ ID NO: 7-11 são sequências de ácidos nucleicos que codificam CTP de APG6 da SEQ ID NO: 1 optimizadas para expressão de monocotiledônea ou dicotiledônea.
[0022] A SEQ ID NO: 12 é a sequência de ácido nucleico que codifica CTP de APG6 da SEQ ID NO: 2.
[0023] As SEQ ID NO: 13 e 14 são sequências de ácidos nuclei-cos que codificam CTP de At.CR88 otimizado para expressão de dico-tiledônea ou monocotiledônea, respectivamente.
[0024] As SEQ ID NO: 15-17 são sequências de ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NO: 4-6, respectivamente.
[0025] Aa SEQ ID NO: 18-27 são sequências de aminoácidos que codificam variantes de dicamba mono-oxigenase (DMO).
[0026] As SEQ ID NO: 28-37 são sequências de ácidos nucleicos que codificam variantes de DMO de SEQ ID NO: 18-27, respectivamente.
[0027] A SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos do peptí-deo de trânsito do cloroplasto de 12G088600TP de algodão optimiza-do para a expressão de dicotiledôneas.
[0028] A SEQ ID NO: 39 é sequências de ácidos nucleicos que codificam SEQ ID NO: 38.
[0029] A SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos de H_N90.
[0030] A SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácidos de H_N20.
[0031] A SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos de H_N60.
[0032] A SEQ ID NO: 43 é a sequência de aminoácidos de H_N10.
[0033] A SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos de H_N30.
[0034] A SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos de H_N40.
[0035] A SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos de H_N50.
[0036] A SEQ ID NO: 47 é a sequência de aminoácidos de H_N70.
[0037] A SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos de H_N100.
[0038] A SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos de H_N110.
[0039] As SEQ ID NO: 50-56 são sequências de aminoácidos a que falta a metionina de partida correspondente à SEQ ID NOs: 40, 41,43, 44, 45, 46 e 48, respectivamente.
[0040] A SEQ ID NO: 57-58 são variantes de aminoácido de SEQ ID NO: 50.
[0041] A SEQ ID NO: 59 é uma variante de aminoácido de SEQ ID NO: 56.
[0042] A SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos da proto-porfirinogênio oxidase de tuberculatus Amaranthus ("waterhemp") (WH_PPO).
[0043] As SEQ ID NO: 61-70 são sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID NO: 40-49, respectivamente, códon-otimizadas para expressão de E. coli.
[0044] As SEQ ID NO: 71-80 são as sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID NO: 40-49, respectivamente, códon-otimizadas para expressão de dicotiledôneas.
[0045] As SEQ ID NO: 81-87 são as sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID NO: 50-56, respectivamente, códon-otimizadas para expressão de dicotiledôneas.
[0046] As SEQ ID NO: 88 e 91 são variantes de nucleotídeos de SEQ ID NO: 50 e 51, respectivamente.
[0047] As SEQ ID NOs: 89, 90 e 92 são sequências de nucleotí-deos que codificam SEQ ID NOs: 57-59, respectivamente.
[0048] As SEQ ID NO: 93-102 são as sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID NO: 40-49, respectivamente, códon-otimizadas para expressão de monocotiledôneas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0049] Peptídeos de trânsito de cloroplastos (CTP) para localização de proteínas de tolerância a herbicida no interior das células são conhecidos na técnica, mas o grau de localização subcelular e processamento eficaz para qualquer combinação de CTP e proteína de tole-râcia ao herbicida são difíceis de prever. Localização e processamento determinam o nível de expressão e a função de uma proteína de tolerância a herbicidas e, portanto, afetam o fenótipo de tolerância a herbicida de uma célula transgênica, planta ou semente compreendendo a proteína. Vários CTPs foram testados com proteínas de tolerância a herbicidas úteis, incluindo dicamba mono-oxigenases (DMO) e as pro-toporfirogênio oxidases (PPO) em plantas transgênicas. No entanto, o processamento e a localização da proteína pobres ou incompletos são muitas vezes vistos.
[0050] A presente invenção supera estes obstáculos, fornecendo novas moléculas recombinantes de DNA capazes de proporcionar uma melhor localização e processamento de cloroplasto, bem como composições e métodos para a utilização destes. Moléculas de DNA re-combinante da presente invenção compreendem uma sequência de DNA que codifica um CTP operacionalmente ligado a DMO ou PPO. As moléculas de DNA recombinantes da invenção proporcionam localização de cloroplasto de DMO ou PPO e tolerância melhorada ao herbicida de dicamba ou PPO em plantas compreendendo as moléculas de DNA recombinantes.
[0051] Em certas modalidades, a invenção proporciona moléculas de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA que codifica um CTP que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3 operativamente ligado a uma sequência de DNA que codifica uma proteína de tolerância a herbicida. Em algumas modalidades, a invenção proporciona moléculas de DNA recombinante que compreendem sequências de DNA que codificam os CTPs, como um CTP que possui uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3, operacionalmente ligado a uma sequência de DNA que codifica uma proteína de DMO, por exemplo uma proteína de DMO possui uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18-27. Outras modalidades, a invenção proporciona moléculas de DNA recombinante que compreendem sequências de DNA que codificam os CTPs, como um CTP que possui uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3, operacionalmente ligado a uma sequência de DNA que codifica uma proteína de PPO, tal como uma proteína de PPO que possui uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 40-60.
Moléculas de DNA Recombinante [0052] Tal como aqui utilizado, o termo "recombinante" refere-se a um DNA não natural, polipeptídeo, proteína, célula, semente ou planta que é o resultado da engenharia genética e, como tal, não seria normalmente encontrado na natureza e foi criado por intervenção humana. Uma "molécula de DNA recombinante" é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA que não ocorre naturalmente e que é o resultado da intervenção humana, tal como uma molécula de DNA composta por uma combinação de pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas uma para a outra. Um exemplo de uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA que codifica um CTP que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3 operativamente ligadas a uma sequência de DNA que codifica uma proteína de DMO compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18-27. Exemplos de proteínas de DMO são fornecidos na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1. Dicamba monooxigenases (DMO) [0053] Outro exemplo de uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA que codifica um CTP que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13 operativamente ligadas à sequência de DNA que codifica uma proteína de PPO compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 40-60. Uma célula recombinante, semente ou planta é uma célula, semente ou planta transgênica compreendendo DNA, por exemplo, uma célula, semente, planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA recombinante da invenção. Exemplos de proteínas de PPO são fornecidos na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2. Protoporfirinogênio oxidases (PPO) [0054] Exemplos de sequências de CTP que possam ser utilizadas de acordo com a invenção são fornecidos na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3. peptídeos de Trânsito do Cloroplasto (CTP) [0055] Tal como aqui utilizado, o termo "molécula de DNA isolada" significa que uma molécula de DNA está presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não está no seu ambiente natural. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma sequência codificadora da proteína e sequência de CTP heteróloga é uma molécula de DNA isolada, quando presente no ge-noma de uma planta transgênica, célula ou semente, uma vez os componentes dessa molécula de DNA recombinante não estão no seu ambiente natural (isto é, o genoma do organismo em que cada componente foi observado pela primeira vez). Uma molécula de DNA recombinante presente no genoma de uma planta transgênica é uma molécula de DNA isolada, já que a molécula de DNA recombinante não foi encontrada naturalmente nesse genoma da planta e, assim, é isolada do seu ambiente natural.
[0056] Tal como aqui utilizado, o termo "manipulação genética" refere-se à criação, por intervenção humana, de um DNA, proteína ou organismo que não seria normalmente encontrado na natureza. A engenharia genética pode ser usada para produzir um DNA, polipeptí-deo, proteína, célula, semente ou planta que foi concebido e criado em laboratório, utilizando uma ou mais das técnicas de biotecnologia, tais como biologia molecular, bioquímica de proteínas, a transformação bacteriana e transformação de plantas. Por exemplo, a engenharia genética pode ser utilizada para criar um gene quimérico que compreende uma molécula de DNA que codifica um CTP que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3, operacionalmente ligado a uma proteína de DMO compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18-27 e, opcionalmente, pode ainda compreender um promotor heterólogo funcional numa célula de planta. Em outro exemplo, a engenharia genética pode ser utilizada para criar um gene quimérico que compreende uma molécula de DNA que codifica um CTP que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-3, operacionalmente ligada a uma proteína de PPO compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 40-60 e, opcionalmente, pode ainda compreender um promotor heterólogo funcional numa célula de planta. Tal gene quimérico pode ser produzido utilizando uma ou mais das técnicas de biologia molecular, tais como a clonagem de genes, ligação de DNA e síntese de DNA.
[0057] O termo "transgene" refere-se a uma molécula de DNA incorporada artificialmente no genoma de um organismo como resultado de intervenção humana, tais como por meio de métodos de transformação de plantas. Tal como aqui utilizado, o termo "transgênico" significa compreender um transgene, por exemplo, uma "planta transgêni-ca" refere-se a uma planta que compreende um transgene no seu ge-noma e um "traço transgênico" refere-se a uma característica ou fenó-tipo transmitido ou conferido pela presença de um transgene incorporado no genoma da planta. Como resultado de tal alteração genômica, a planta transgênica é algo distintamente diferente da planta de tipo selvagem relacionada e a característica transgênica é uma característica que não se encontra naturalmente na planta de tipo selvagem. As plantas transgênicas da presente invenção compreendem as moléculas de DNA recombinantes proporcionadas pela presente invenção.
[0058] Tal como aqui utilizado, o termo "heterólogo" refere-se à relação entre dois ou mais materiais derivados de fontes diferentes e, portanto, não normalmente associados na natureza. Por exemplo, uma proteína de DMO é heteróloga em relação a um CTP operativamente ligado se tal combinação não é normalmente encontrada na natureza. Num outro exemplo, uma molécula de DNA recombinante que codifica um CTP operacionalmente ligado a uma proteína de DMO é heterólogo relativamente a um promotor operativamente ligado que seja funcional numa célula de planta, se tal combinação não é normalmente encontrada na natureza. Uma molécula de DNA recombinante particular pode igualmente ser heteróloga em relação a uma célula, sementes ou organismo em que está inserido quando não ocorrem naturalmente em que determinada célula, semente ou organismo.
[0059] Tal como aqui utilizado, o termo "molécula de codificação da proteína do DNA" ou "molécula de DNA de codificação de polipep-tídeo" refere-se a uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína ou polipeptídeo, tal como uma proteína ou polipeptídeo para conferir tolerância a herbicidas ou para controle de insetos. Uma "sequência codificante de proteína" ou "sequência de codificação de polipeptídeo" significa uma sequência de DNA que codifica uma proteína ou polipeptídeo. Uma "sequência" significa um arranjo sequencial dos nucleotídeos ou aminoácidos. Os limites de uma sequência de codificação da proteína ou sequência de codificação de polipeptídeo são geralmente determinados por um códon de iniciação da tradução no terminal 5' e um códon de paragem da tradução no terminal 3'. A molécula que codifica a proteína ou molécula de codificação do polipeptídeo pode compreender uma sequência de DNA que codifica uma sequência de proteína ou polipeptídeo. Tal como aqui utilizado, "expressão do transgene", "que expressa um trans-gene", "expressão de proteína", "expressão do polipeptídeo", "expressando uma proteína" e "que expressa um polipeptídeo" significam a produção de uma proteína ou polipeptídeo através do processo de transcrição uma molécula de DNA em RNA mensageiro (mRNA) e a tradução do mRNA em cadeias polipeptídicas, as quais podem ser enoveladas em última análise em proteínas. Uma molécula de DNA codificante de proteína ou molécula de DNA de codificação de polipeptídeo pode ser operativamente ligada a um promotor heterólogo em um construto de DNA para utilização na expressão da proteína ou polipeptídeo de uma célula transformada com a molécula de DNA re-combinante. Tal como aqui utilizado, "operativamente ligado" significa duas moléculas de DNA ligadas de forma que uma possa afetar a função da outra. Moléculas de DNA operacionalmente ligadas podem ser parte de uma única molécula contígua e podem ou não estar adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de DNA que codifica a proteína ou molécula de DNA de codificação de polipeptídeo em um construto de DNA em que as duas moléculas de DNA são dispostas de tal modo que o promotor pode afetar a expressão do transgene.
[0060] As moléculas de DNA recombinante da presente invenção incluem uma sequência de DNA que codifica um DMO operativamente ligado a uma sequência de CTP. Tal como aqui utilizado, "mono-oxigenase dicamba" ou "DMO" significa um oxigenase capaz de catalisar a degradação enzimática de dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico) de ácido 3,6-diclorosalíclico (3,6-DCSA), tais como a mono-oxigenase dicamba codificada pelo do gene desmetilase de (DMO) de Steno-trophomonas maltophilia. Mono-oxigenases dicamba são conhecidas na técnica e incluem as sequências de proteínas previstas como SEQ ID NOs: 18-27 e identificadas na Tabela 1.
[0061] As moléculas de DNA recombinante da presente invenção incluem uma sequência de DNA que codifica um PPO operativamente ligado a uma sequência de CTP. Tal como aqui utilizado, "protoporfiri-nogênio-oxidase" ou "PPO" significa uma oxidase capaz de converter enzimaticamente protoporfirinogênio IX para protoporfirina IX. Proto-porfigênio oxidases são conhecidas na técnica e incluem as sequências de proteínas previstas como SEQ ID NOs: 40-60 e identificadas na Tabela 2.
[0062] As moléculas de DNA recombinante da presente invenção incluem uma sequência de DNA que codifica uma sequência de CTP operativamente ligada às moléculas de DNA que codificam proteínas fornecidas pela presente invenção em que o CTP facilita a localização da molécula de proteína recombinante no interior da célula. CTPs são também conhecidos na técnica como sequências de sinal, sequências de direcionamento, peptídeos de direcionamento e sequências de localização. Os cloroplastos são também conhecidos na técnica como plastídios. Ao facilitar a localização de proteínas no interior da célula, o CTP assegura a localização de uma proteína para o cloroplasto para a atividade enzimática ideal e pode aumentar a acumulação de proteína recombinante e proteger a proteína de degradação proteolítica. Após a translocação para o cloroplasto, o CTP é normalmente clivado da proteína, também referido como processamento. Processamento de CTP pode ser completo (o que significa que o CTP completo é clivado da extremidade amino-terminal da proteína), incompleto (o que significa que um ou mais aminoácidos de CTP permanecem na extremidade amino-terminal da proteína) ou resultar em remoção de um ou mais aminoácidos da extremidade amino-terminal da proteína. Processamento completo do CTP a partir de uma proteína DMO aumenta o nível de acumulação da proteína, aumentando assim a tolerância a di-camba e reduzindo os níveis de lesão na célula transgênica, sementes ou organismo após a aplicação do herbicida. CTPs são fornecidos como SEQ ID NOs: 1-6 e 38 e identificados na Tabela 3. A sequência de DNA que codificam cada CTP, optimizadas para a expressão em mo-nocotiledôneas e dicotiledôneas, é fornecida como SEQ ID NOs: 7-17 e 39.
[0063] Moléculas de DNA recombinante da presente divulgação podem ser sintetizadas e modificadas por métodos conhecidos na técnica ou completamente ou em parte, particularmente quando é desejável proporcionar sequências úteis para a manipulação de DNA (tal como sítios de reconhecimento de enzimas de restrição ou sítios de clonagem baseada em recombinação), sequências preferidas de plantas (tais como o uso de planta-códon ou sequências de consenso de Kozak) ou sequências úteis para a projetar construto de DNA (tais como sequências de espaçador ou de ligação). Moléculas de DNA recombi-nante da presente invenção incluem sequências de DNA degeneradas que codificam a mesma sequência de aminoácidos tal como uma sequência de DNA aqui proporcionada. Sequências de DNA degeneradas podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na técnica e a tabela de códon de DNA. A presente invenção inclui moléculas de DNA recombinante e proteínas que têm pelo menos 85% de identida- de de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência, pelo menos 96% de identidade de sequência, pelo menos 97% de identidade de sequência, pelo menos 98% de identidade de sequência e pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de moléculas de DNA ou polipeptídeo recombinante aqui proporcionados. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender uma sequência de DNA possuindo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7-14 ou a uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 28-37 e 61-102. Uma molécula de DNA recombinante do presente invento pode codificar uma sequência de proteína que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3; ou a uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18-27 e 40-59.
[0064] Tal como aqui utilizado, o termo "identidade de sequência percentual" ou "identidade de sequência %" refere-se à percentagem de nucleotídeos idênticos ou aminoácidos em uma sequência de poli-nucleotídeo ou polipeptídeo linear de uma sequência de referência ("query") (ou a sua cadeia complementar) em comparação com uma sequência de teste ("sujeito") (ou a sua cadeia complementar) quando as duas sequências são alinhadas de forma ideal (com apropriada de-leções, hiatos e inserções de nucleotídeo ou aminoácido totalizando menos do que 20 porcento da sequência de referência ao longo da janela de comparação). O alinhamento ideal de sequências para ali- nhar uma janela de comparação é bem conhecidos daqueles versados na técnica e pode ser realizado por ferramentas, tais como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, o método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman e por implementações computadorizadas destes algoritmos, tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA disponível como parte do pacote de software de Análise de Sequência GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., San Diego, CA), Megalign (DNAStar Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wl 53715) e MUSCLE (versão 3.6) (Edgar, Nucleic Acids Research 32(5): 1792-7, 2004) com os parâmetros predefinidos. Uma "fracção de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas, dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, isto é, a sequência de referência inteira ou uma menor parte definida da sequência de referência. Percentagem de identidade de sequência é representada como a fracção de identidade multiplicada por 100. A comparação de uma ou mais sequências pode ser com uma sequência de comprimento total ou uma sua porção ou com uma sequência mais longa.
[0065] Tal como aqui utilizado, um "construto de DNA" é uma molécula de DNA recombinante que compreende duas ou mais sequências de DNA heterólogas. Os construtos de DNA são úteis para a expressão do transgene e podem ser constituídos em vetores e plasmí-deos. Os construtos de DNA podem ser utilizados em vetores para o propósito de transformação, que é a introdução de DNA heterólogo numa célula hospedeira, a fim de produzir plantas e células transgêni-cas e como tal também podem estar contidos no DNA de plastos ou DNA genômico de uma planta transgênica, semente, célula ou parte da planta. Tal como aqui utilizado, um "vetor" significa qualquer molé- cula de DNA recombinante que pode ser usada para o propósito de transformação de plantas. Moléculas de DNA recombinante, tal como definidas na Listagem de Sequências podem, por exemplo, ser inseridas num vetor, como parte de um construto possuindo a molécula de DNA recombinante operacionalmente ligada a um elemento de expressão de gene que funciona de uma planta de afetar a expressão da proteína codificada pela molécula de DNA recombinante. Métodos para um construto de construtos de DNA e vetores são bem conhecidos na técnica. Os componentes de um construto de DNA ou um vetor compreendendo um construto de DNA, geralmente incluem um ou mais elementos da expressão de genes operacionalmente ligados a uma sequência de DNA capaz de transcrição, tais como o seguinte: um promotor para a expressão de um DNA operativamente ligado, uma molécula de DNA codificante de proteína operacionalmente ligada e uma região 3' não traduzida. Elementos de expressão de genes úteis na prática da invenção incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes tipos de elementos: promotor, a região 5' não traduzida, potenciador, elemento líder cis-atuação, íntron, a região 3' não traduzida e um ou mais marcadores de transgenes selecionáveis.
[0066] Os construtos de DNA da invenção podem incluir um promotor operativamente ligado a uma molécula de DNA codificadora da proteína fornecida pelo invento, pelo que o promotor dirige a expressão da molécula de proteína recombinante. Promotores úteis na prática da invenção incluem aqueles que funcionam numa célula para a expressão de um polinucleotídeo operacionalmente ligado, tal como um promotor bacteriano ou da planta. Promotores de plantas são variados e bem conhecidos na técnica e incluem aqueles que são indutí-veis, virais, sintéticos, constitutivos, temporalmente regulados espacialmente regulados e/ou espaço-temporalmente regulados.
[0067] Tal como aqui utilizado, "controle negativo" e "controle posi- tivo" significa um controle experimental projetado para fins de comparação. Por exemplo, um controle negativo ou controle positivo numa análise de planta transgênica pode ser uma planta da mesma espécie que a planta experimental (ou seja, a planta a ser testada), mas não contém a inserção transgênica, molécula de DNA recombinante ou construto de DNA da planta experimental. Um exemplo de uma planta útil para comparação com as plantas de milho transgênico é milho não transgênico LH244 (Patente US N° 6252148) ou milho não transgênico 01DKD2 (Patente US N° 7, 166,779), para comparação com plantas de soja transgênicas é soja não transgênica soja A3555 (Patente US N° 7700846) ou soja não transgênica A3244 (Patente US N° 5.659.114, 9.600.246 PVP), para comparação com a canola transgênica ou plantas Brassica napus é a linhagem Restorer de variedade 65037 de Brassica napus não transgênica, para comparação com plantas de trigo transgênicas é o germoplasma Samson de variedade de trigo não transgênica (PVP 1994) e para comparação com plantas de transgênicas de algodão é não transgênica DP393 (Patente US N° 6930228 200400266 PVP).
Plantas Transgênicas [0068] Um aspecto da invenção inclui células de plantas transgênicas, tecidos de plantas transgênicas, as plantas transgênicas e sementes transgênicas que compreendem as moléculas de DNA recombinante proporcionadas pelo presente invento. Estas células, tecidos e sementes de plantas que compreendem as moléculas de DNA recom-binantes exibem tolerância a herbicidas.
[0069] A inserção de DNA transgênico (conhecida como um "transgene") no genoma de uma planta pode ser conseguida através do ato de transformação de plantas e resulta na criação de uma nova sequência genômica molecular transgênica, conhecido como um "evento". Cada evento é único e a sequência de DNA do evento é es- pecífica para o evento. Métodos adequados para transformação de células de planta hospedeira para uso com o presente invento incluem virtualmente qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido numa célula (por exemplo, onde um construto de DNA recombinante é estavelmente integrado num cromossomo da planta) e são bem conhecidos na técnica. Um construto de DNA recombinante inserido em métodos exemplares para a introdução de um construto de DNA recombinante em plantas inclui o sistema de transformação de Agrobac-terium e bombardeio de partículas de DNA, ambos os quais são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Outro método exemplificati-vo para a introdução de um construto de DNA recombinante em plantas é a inserção de um construto de DNA recombinante no genoma de uma planta num sítio predeterminado por métodos de integração dirigida ao sítio. A integração dirigida ao sítio pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por utilização de nu-cleases de dedo de zinco, meganucleases nativas ou de engenharia, TALE-endonucleases ou uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, um sistema CRISPR/Cas9). As plantas transgênicas podem então ser regeneradas a partir de uma célula de planta transformada pelos métodos de cultura de células vegetais. Uma planta transgênica homozigótica com respeito a um transgene (isto é, duas cópias aléli-cas do transgene) pode ser obtida por autopolinização ("selfing") de uma planta transgênica autopolinizadora que contém um único transgene alelo com ela mesma, por exemplo, uma planta RO, para produzir sementes R1. Um quarto da semente R1 produzida será homozigótico no que respeita ao transgene. As plantas cultivadas a partir de sementes em germinação R1 podem ser testadas em zigosidade, tipicamente utilizando um ensaio de SNP, sequenciação de DNA ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre os heterozigotos e homozigotos, referido como um ensaio de zigosidade.
[0070] Plantas, sementes, partes de plantas, tecidos de plantas e células proporcionados pela invenção podem exibir tolerância a herbicida de dicamba. Dicamba pode ser aplicada a uma área de crescimento de plantas compreendendo as plantas e sementes proporcionados pela invenção como um método para controlar ervas daninhas, incluindo a prevenção do crescimento de ervas daninhas. As plantas e sementes fornecidos pela invenção compreendem uma característica de tolerância a herbicida e, como tal, são tolerantes à aplicação de dicamba. A aplicação do herbicida pode ser recomendada a taxa comercial (1X) ou qualquer fracção ou múltiplo da mesma, tal como duas vezes a taxa comercial recomendada (2X). Taxas de aplicação de dicamba podem ser expressas como equivalente ácido por libra por acre (Ib e.a./acre) ou equivalente ácido por grama por hectare (g e.a./ ha). A área de crescimento da planta pode ou não pode compreender plantas daninhas no momento da aplicação do herbicida. Uma dose eficaz como herbicida de dicamba para uso numa área para controlo das ervas daninhas deve consistir de uma gama de cerca de 0,1X a cerca de 30X de taxa(s) marcada ao longo de um período de crescimento. A taxa marcada de 1X para dicamba é de 0,5 Ib ea/ acre. Taxas de herbicidas podem ser convertidas entre Inglesa e métrica como: (Ib ai/ac)*1,12 = (kg ai/ha) e (kg ai/ha)*0,89 = (Ib ai/ac).
[0071] As plantas, sementes, partes de plantas, tecidos de plantas e as células podem exibir tolerância a um ou mais inibidores de PPO, referidos como herbicidas de PPO. Um ou mais herbicidas de PPO podem ser aplicados a uma área de crescimento de plantas compreendendo as plantas e sementes proporcionados pela invenção como um método para controlar ervas daninhas, incluindo a prevenção do crescimento de ervas daninhas. As plantas e sementes fornecidos pela invenção compreendem uma característica de tolerância a herbicida e, como tal, são tolerantes à aplicação de um ou mais herbicidas PPO. A aplicação do herbicida pode ser recomendada a taxa comercial (1X) ou qualquer fracção ou múltiplo da mesma, tal como duas vezes a taxa comercial recomendada (2X). A área de crescimento da planta pode ou não pode compreender plantas daninhas no momento da aplicação do herbicida. Uma dose eficaz como herbicida de um herbicida de PPO para uso numa área para controle das ervas daninhas deve consistir de uma gama de cerca de 0,1X a cerca de 30X de taxa(s) de rótulo ao longo de um período de crescimento. Herbicidas de PPO são bem conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis. Exemplos de herbicidas de PPO incluem, mas não estão limitados a éteres dife-nílicos (tal como acifluorfen, seus sais e ésteres, aclonifena, bifenox, seus sais e ésteres etoxifeno, seus sais e ésteres, fluoronitrofeno, furi-loxifeno, halosafeno, clometoxifeno, oxifluorfena, a sua sais e ésteres, lactofena, seus sais e ésteres, oxifluorfeno, fomesafena e seus sais e ésteres); tiadiazóis (tais como flutiacet-metil e tidiazimina); pirimidine-dionas ou feniluracils (tais como benzfendizona, butafenacila, acetato de [3-2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetra-hidropirimidin-3 -il)fenóxi]-2-piridilóxi] acetato de metil (Número de Registo CAS 353292-31-6 e referido aqui como S-3100), flupropacila, sa-flufenacil e tiafenacil); fenilpirazóis (tais como fluazolato, piraflufena e piraflufena-etil); oxadiazóis, como oxadiargil (e oxadiazon); triazolino-nas (tais como azafenidina, bencarbazona, carfentrazona, seus sais e ésteres e sulfentrazona); oxazolidinadionas (tais como pentoxazona); N-fenilftalimidas (tais como cinidon-etil, flumicloraque, flumicloraque-pentil e flumioxazina); derivados de benzoxazinona (tal como 1,5-dimetil-6-tioxo-3-(2,2,7-TrifLuoro-3,4-dihidro-3-oxo-4-prop-2-inil-2H-1,4-Benzoxazin-6-il)-1,3,5-triazinano-2,4-diona); flufenpir e flufenpir-etil; piraclonil; e profluazol.
[0072] Aplicações de herbicida podem ser sequencialmente ou em mistura no tanque com um, dois ou uma combinação de vários herbi- cidas ou qualquer outro herbicida compatível. Várias aplicações de um herbicida ou de dois ou mais herbicidas em combinação ou por si só, podem ser utilizadas ao longo de um período de crescimento de áreas que compreendem plantas transgênicas da invenção para o controle de um largo espectro de ervas daninhas dicotiledôneas ervas daninhas monocotiledôneas ou ambos, por exemplo, duas aplicações (como uma aplicação pré-plantio e uma aplicação pós-emergência ou uma aplicação pré-emergência e uma aplicação pós-emergência) ou três aplicações (como uma aplicação pré-plantio, uma aplicação pré-emergência e uma aplicação pós-emergência ou uma aplicação pré-emergência e duas aplicações pós-emergência).
[0073] Tal como aqui utilizado, por "tolerância" ou "tolerância a herbicidas" entende-se a capacidade de uma planta, semente ou de células para resistir aos efeitos tóxicos de um herbicida quando aplicado. A tolerância a herbicida de uma planta, sementes, tecido de planta, parte da planta ou célula pode ser medida por comparação da planta, sementes, tecido de planta, parte de planta, célula ou a um controle experimental adequado. Por exemplo, a tolerância a herbicida pode ser medida ou avaliada por aplicação de um herbicida a uma planta que compreende uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína capaz de conferir tolerância a herbicidas (a planta de teste) e uma planta da mesma espécie que não compreende molécula de DNA recombinante que codifica a proteína capaz de conferir tolerância a herbicidas (a planta de controle negativo) e em seguida, comparando a lesão planta das duas plantas em que a tolerância a herbicidas da planta de teste é indicada por uma taxa de lesões diminuída em comparação com a taxa de lesões da planta de controle negativo. Uma planta, semente, tecido de planta, parte de planta ou célula tolerante a herbicidas apresenta uma resposta diminuída para os efeitos tóxicos de um herbicida, quando comparada com uma planta, semen- tes, tecido de planta, parte da planta ou célula de controle negativo. Tal como aqui utilizado, um "traço de tolerância herbicida" é uma característica transgênica que confere tolerância a herbicida melhorada de uma planta em comparação com uma planta de controle negativo.
[0074] As plantas transgênicas, progênie, sementes, células de plantas e partes de plantas da presente invenção podem também conter uma ou mais adicionais características transgênicas. Traços adicionais transgênicos podem ser introduzido através do cruzamento de uma planta que contém um transgene que compreende as moléculas de DNA recombinantes proporcionadas pelo presente invento com outra planta transgênica que contenha uma característica adicional(is). Tal como aqui utilizado, "cruzar" significa reproduzir duas plantas individuais para produzir uma planta de progênie. Duas plantas transgênicas podem então ser cruzadas para produzir progênie que contêm as características transgênicas. Tal como aqui utilizado "progênie" designa a descendência de qualquer geração de uma planta parental e progênie transgênica compreende um construto de DNA proporcionado pelo invento e herdado de, pelo menos, uma planta parental. Alternativamente, característica ou características transgênicas adicionais podem ser introduzidas por cotransformação de um construto de DNA para essa característica transgênica adicional com um construto de DNA que compreende as moléculas de DNA recombinantes proporcionadas pelo presente invento (por exemplo, com todos os construtos de DNA presente como parte do mesmo vetor utilizado para a transformação de plantas) ou inserindo a característica adicional em uma planta transgênica compreendendo um construto de DNA fornecida pela invenção ou vice-versa (por exemplo, usando qualquer um dos métodos de transformação de plantas em uma planta transgênico ou célula vegetal). Tais características transgênicas adicionais incluem, mas não estão limitadas a um aumento da resistência aos insetos, o aumento da eficiência de utilização de água, aumento da performance de rendimento, aumento da resistência à seca, o aumento da qualidade da semente, a melhoria da qualidade nutricional, a produção de semente híbrida e aumento da tolerância a herbicidas em que o traço é medido no que diz respeito a uma planta de tipo selvagem. Tais características transgênicas adicionais são conhecidas daqueles versados na técnica; por exemplo, uma lista de tais características é fornecida pelo Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) do United States Department of Agriculture (USDA).
[0075] As plantas transgênicas e progénie que contêm uma característica transgênica proporcionada pelo invento podem ser usadas com quaisquer métodos de reprodução que são comumente conhecidos na técnica. Em linhagens de plantas que compreendem duas ou mais características transgênicas, as características transgênicas podem ser segregadas independentemente, ligadas ou uma combinação de ambos em linhagens de plantas que compreendem três ou mais características transgênicas. O retrocruzamento em uma planta proge-nitora e cruzamento com uma planta não transgênica são contemplados também, posto que é propagação vegetativa. As descrições dos métodos de reprodução que são normalmente utilizados para diferentes características e culturas são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Para confirmar a presença do(s) transgene(s) de uma determinada planta ou semente, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de biologia molecular, tais como Southern e Northern blotting, PCR e sequenciação de DNA; ensaios bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e Western blots) ou por função enzimática; ensaios de parte da planta, tais como ensaios de folhas ou raízes; e também, por meio da análise do fenótipo da planta inteira. Para analisar o processamento de CTP em uma planta transgênica particular ou semente ensaios, tais como a sequenciação de degradação de Edman ou análise de espectrometria de massa podem ser realizados na proteína de DMO ou PPO recom-binante obtida a partir da célula transgênica, planta ou semente e os dados de sequência resultantes comparados com o da proteína de DMO ou PPO, respectivamente.
[0076] A introgressão de uma característica transgênica para um genótipo da planta é obtida como o resultado do processo de conversão de retrocruzamento. Um genótipo da planta no qual uma característica transgênica foi introgressada pode ser referido como um genótipo, linhagem endocruzado ou híbrido convertido por retrocruzamento. Da mesma forma um genótipo da planta sem a característica transgê-nica desejada pode ser referido como um genótipo, linhagem endocru-zado ou híbrido não convertido.
[0077] Tal como aqui utilizado, o termo "compreendendo" significa" incluindo mas não limitado a".
EXEMPLOS
[0078] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que, à luz da presente divulgação, muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são fornecidas e ainda obter um resultado igual ou similar sem afastamento do âmbito e conceito do âmbito da invenção. Mais especificamente, será aparente que certos agentes que são quimicamente ou fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos com o mesmo ou semelhante resultado obtido. Todos os substitutos e modificações semelhantes aparentes àqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do escopo e conceito da invenção.
Exemplo 1: Expressão de CTP-DMO e localização em protoplastos de soja [0079] Um ensaio de protoplastos de soja foi usado para avaliar a eficiência de direcionamento de cloroplasto relativa de proteína re-combinante que compreende um de cinco CTPs operacionalmente ligados a uma sequência de DMO (SEQ ID NO: 27). Para monitorar distribuição de citosol e cloroplasto da proteína recombinante, uma sequência que codifica uma proteína fluorescente verde foi adicionada ao cassete que codifica a combinação de CTP e DMO recombinante (aqui referidos como CTP-DMO) de tal modo que a proteína fluorescente verde foi fundida com a extremidade de carboxi-terminal da DMO.
[0080] Protoplastos foram preparados a partir de cotilédones de feijão (germoplasma A3244). Vagens de sementes de soja imaturas foram colhidas e as sementes (4-6 mm de comprimento) foram removidas usando uma técnica estéril. O cotilédone de cada semente foi removido manualmente, cortado transversalmente em pedaços de 1 mm e incubado em tampão de CPW (pH 5,8) com 0,7 M de manitol durante 1 hora a 24-26DC no escuro, com agitação a 40 rpm. O tampão foi então removido e substituído com tampão de enzima (4% de Celulase "Onozuka R-10; 2% hemicelulase; 0,3% Macerozyme R-10 em tampão de CPW (pH 5,8; 0,49 M com manitol). O tecido de cotilédones foi incubado num agitador rotativo a 50 rpm a 24-26DC durante 2 horas. Protoplastos de soja foram liberados do tecido de cotilédones no final desta incubação agitando manualmente a placa e filtrando a suspensão através de uma camada dupla de malha de nylon de 60 um para um tubo cônico de 50 mL. Os protoplastos foram suavemente lavadas uma vez com ressuspensão e centrifugação. O sedimento final foi ressuspenso em tampão de (4 mM de MES, pH 5,7; NaCl a 150 mM; CaCl2 a 5 mM; manitol a 0,5 M) e repousou durante 1 hora em gelo. Os protoplastos foram então centrifugados e o sedimento foi ressuspenso em tampão de transformação (manitol 0,4 M; MgCl2 15 mM; MES 4 mM, pH 5,7). O volume foi ajustado para permitir 1 x 10.000.000 protoplastos/ml. A transformação foi conseguida por mistura de 12,5 pg de DNA para cada construto. O DNA foi suavemente combinado com 1,5 x 1.000.000 protoplastos, seguido pela adição de um volume igual de solução tampão de PEG. Isto foi incubado durante 5 minutos e depois lentamente diluído com 300 pl de tampão de W5 (NaCl a 154 mM; CaCl2 a 125 mM; KCl a 5 mM; MES a 2 mM, pH 5,7). Isto foi incubado durante 5 - 10 minutos e em seguida, 900 pl de tampão W5 foram lentamente adicionados. Os protoplastos foram sedimentados e ressuspensos em tampão de WI (manitol 0,5 M; MES a 4 mM (pH 5,7); KCl a 20 mM) e incubou-se a 24-26DC no escuro. Análise de microscopia foi realizada usando um Zeiss LSM510 META Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss Microlmaging, Inc., Thornwood, NY) equipado com um Krypton-Argon Ion (458, 488 nm) laser, um laser verde (543 nm) de Hélio-Néon e conjuntos de filtro vermelho FITC e Texas. Aquisição e análise de imagem foi realizada utilizando ZEN 2012 V.8.1 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY) e uma objetiva de abertura numérica 1.2 de 40X água. Comprimentos de onda de excitação de 488 nm foram utilizados (GFP) e 543 nm (autofluores-cência de cloroplasto) e filtros de emissão foram 500-530 nm (GFP) e 630-700 nm (autofluorescência de cloroplasto). Para cada construto, pelo menos 50 células individuais foram marcadas para a localização do construto: citosol, plastos ou ambos citosol e plastídeo. Os resultados foram registrados como a percentagem de células com proteína localizada no citosol ou plastídeo (ou ambos) do número total de células analisadas e são fornecidos na Tabela 4.
Tabela 4. Ensaio de direcionamento de protoplasto de soja [0081] Das cinco combinações de CTP-DMO analisadas, apenas o CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1) resultou em 100% das células que mostram a localização da proteína exclusivamente para o plastídeo. O CTP de At.CR88 (SEQ ID NO: 3) resultou em 94% das células que mostram a localização da proteína exclusivamente ao plastídeo e 6% das células que mostram a localização da proteína para o citosol e plastídeo. O CTP "A" resultou em 79% das células que mostram a localização da proteína exclusivamente para os plastídeos e 21% das células que mostram a localização para plastídeo e citosol. O CTP "B" resultou em 9% das células que mostram a localização da proteína exclusivamente para plastídeo e 91% das células que mostram a localização plastídios e citosol. O CTP "C" resultou em 18% das células que mostram a localização da proteína exclusivamente para plastídeo e 82% das células que mostram a localização plastídios e citosol. Sem um CTP, a proteína estava presente apenas no citosol. Estes resultados indicam que o CTP de APG6 foi de 100% eficiente para direcionamento de CTP-DMO para plastos e o CTP de At.CR88 foi 94% eficiente para direcionamento de CTP-DMO para plastos.
Exemplo 2: Processamento de CTP-DMO no trigo transgênico [0082] Plantas de trigo transgênicas transformadas com um cons-truto de DNA compreendendo uma molécula de DNA recombinante que codifica um dos quatro CTPs separados ligado operativamente a DMO foram utilizadas para avaliar a expressão da proteína e para determinar processamento de CTP.
[0083] Plantas de trigo transgênicas foram produzidas usando quatro vetores de transformação de plantas diferentes vetores compreendendo cada um construto de DNA contendo um dos quatro CTPs diferente operativamente ligados a DMO operativamente ligado a um promotor. Embriões imaturos pré-cultivados a partir de trigo de germo-plasma Samson (PVP 1994) foram transformados utilizando Agrobacterium tumefaciens para produzir plântulas transgênicas utilizando métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Amostras de folhas foram colhidas para análise molecular para confirmar o número de cópias do transgene no genoma de cada evento único e plantas R0 com uma cópia do transgene foram autofecundadas e sementes R1 recolhidas.
[0084] A semente (50 g) foi moída até um pó, o qual foi em seguida, adicionado a 250 ml do tampão de extração (1xTBE (89 mM de Tris-borato EDTA a 2 mM, pH 8,4), NaCl a 200 mM, 10% de glicerina, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 5 mM de benzamidina, ditiotreitol a 2 mM (DTT), inibidores da protease cOmplete™ (Roche Diagnostics Corporation, Indianopolis, IN)) e homogeneizado com um Polytron® (VWR, Radnor, PA) durante cerca de 20 segundos e em seguida, incubou-se com agitação a 4dC durante 1 a 2 horas. A mistura foi centrifugada a 4dC durante 25 min a 9000 rpm e o sobrenadante foi precipitado sequencialmente com 10% e 55% de sulfato de amónio saturado (AS), com cada passo de precipitação centrifugado a 18000 rpm durante 20 minutos. O pélete da precipitação 10% AS foi descartado.
[0085] O pélete da fracção de 10-55% foi dissolvido em 30 ml de PBS (fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,15 M) com um comprimido dos inibidores de protease cOmplete™. O sedimento dissolvido foi centrifugado e o sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de 0,22 pm. Um soro de anticorpo policlonal de cabra contra a DMO foi misturado com uma suspensão de 1:1 de resina de agarose de proteína A/G
Pierce™ (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY), depois de 1,5 horas a resina de agarose de proteína A/G carregada com anti-DMO Ab foi lavada a 3 vezes com PBS e adicionou-se cerca de 30 ml de 10% - 55% AS fracção de filtrado. Após a incubação, a resina foi centrifugada e lavada 3 vezes com PBS em seguida ressuspensa em 1 ml de PBS e transferida para um tubo de microcentrífuga e novamente sedimentada.
[0086] O sedimento final foi ressuspenso em tampão de Laemmli 2X, fervido durante 5 minutos e as amostras executadas num gel de SDS-PAGE a 10% em tampão de Tris-glicina a 185 V (constante). As proteínas no gel de SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de PVDF utilizando tampão de transferência CAPS, durante 30 min a 4dC e 100V. As proteínas ligadas à membrana de PDVF foram coradas com azul de Coomassie durante aproximadamente 30 segundos e a banda correspondente a cada uma das proteínas de DMO em na fração de AS de 10% - 55% foi excisada do blot de PVDF e utilizada para análise da sequência da proteína do terminal amino. Sequencia-ção de proteínas do terminal amino foi realizada por degradação automatizada de química de Edman, com cada análise realizada durante 15 ciclos usando química de degradação de Edman automatizada. Sistema de Sequenciamento Applied Biosystems 494 Procise® com bomba 140C Microgradient e Perkin Elmer Series 200 UV/Vis Detector foi utilizado para a análise controlada com software Procise Control (versão 2.1) (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY). Dados cro-matográficos foram coletados por meio de software de análise de se-quenciação de proteínas SequencePro® (versão 2.1). A identidade foi estabelecida para cada proteína, se foram observados, pelo menos, 8 aminoácidos consistentes com a sequência prevista da proteína esperada. Os resultados da sequenciação do terminal amino são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. A sequenciação de amino-terminal da proteína recombi-nante [0087] As designações de DMO, DMO+1, DMO+10 e DMO+12 foram usadas para indicar que a sequenciação de proteínas indicou que havia 0, 1, 10 ou 12 aminoácidos do CTP restante na extremidade amino-terminal da DMO após o processamento, respectivamente. A designação de DMO-1 foi utilizada para indicar que a primeira metioni-na da DMO foi removida após o processamento. Dois eventos únicos foram testados para a CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 18). Ambas as amostras apresentaram um aminoácido do CTP restante na extremidade amino-terminal da DMO após o processamento (DMO+1). Três eventos únicos foram testados para CTP de At.CR88 (SEQ ID NO: 3) ligado operativamente a DMO (SEQ ID NO: 18). Todas as três amostras apresentaram zero ou um ácido amino do CTP restante na extremidade amino-terminal da DMO após o processamento (DMO e DMO+1). O evento de CTP4 testado (SEQ ID NO: 4) operacionalmente ligado a DMO (SEQ ID NO: 19) mostrou doze aminoácidos do CTP restante na extremidade amino-terminal da DMO após o processamento (DMO+12). Dois eventos únicos foram testados para o CTP de Os.Waxy (SEQ ID NO: 6) operacionalmente ligado a DMO (SEQ ID NO: 18). Uma amostra mostrou dez aminoácidos do CTP restante na extremidade amino-terminal da DMO após o processamento (DMO+10) e uma revelou que a primeira meti-onina de DMO foi removida depois de processar (DMO-1). Estes resultados indicam que o CTP de APG6 e o CTP de At.CR88 são eficientemente processados a partir da DMO quando expressos em plantas transgênicas.
Exemplo 3: Expressão de CTP-DMO em Brassica napus transgê-nica [0088] A capacidade de construtos de DNA compreendendo uma molécula de DNA recombinante que codifica um dos três CTPs separados ligados operativamente a DMO para fornecer tolerância a di-camba foi avaliada com plantas transgênicas de Brassica napus.
[0089] Plantas transgênicas de Brassica napus foram produzidas utilizando três vetores de transformação de plantas diferentes compreendendo cada um construto de DNA contendo um dos três diferentes CTPs operacionalmente ligados a DMO operativamente ligada a um promotor. Linhagem Restorer de variedade 65037 de Brassica napus foi usada para transformação mediada de Agrobacteriume plantas R0 foram cultivadas na estufa. Eventos únicos foram rastreados para o número de cópias do transgene. Plantas R0 com uma cópia do transgene foram autofecundadas e sementes R1 coletadas.
[0090] Tolerância a dicamba foi avaliada utilizando plantas R0 com uma cópia do transgene com estrutura do vetor ou duas cópias do transgene. Tolerância a dicamba foi designada como lesão de dicamba de 20% ou menos em condições de estufa. Eventos R0 em vasos foram divididos em três grupos e dicamba (Clarity®) foi aplicada em uma das três taxas: (1) ausência de dicamba, (2) 1 lb ae/acre de dicamba (taxa de 2X) ou (3) 2 lb ae/acre de dicamba (taxa de 4X). As plantas transgênicas foram pulverizadas e avaliações dos danos foram registradas 21 dias mais tarde. As plantas contendo a CTP "A" operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 21) não mostraram eventos tolerantes a dicamba. As plantas contendo CTP de RbcS (SEQ ID NO: 5) operacionalmente ligado a DMO (SEQ ID NO: 21) mostraram 8 de 9 eventos com tolerância para a taxa de dicamba de 2X e 7 de 7 eventos com tolerância para a taxa de dicamba de 4X. As plantas contendo CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligada a DMO (SEQ ID NO: 20) mostraram 7 de 14 eventos com tolerância para a taxa de 2X de dicamba e seis de 18 eventos com tolerância para a taxa de 4X de dicamba. Apresentam- se os resultados na Tabela 6 Tabela 6. Tolerância a dicamba em R0 Brassica napus [0091] Tolerância a dicamba foi avaliada em plantas R0 com um uma cópia do transgene. As plantas foram pulverizadas na estufa com dicamba (Clarity) a 1 lb ea/acre (taxa de 2X) e tolerância a dicamba foi determinada 14 a 21 dias mais tarde. As plantas contendo CTP de APG6 operacionalmente ligado a DMO (SEQ ID NO: 20) mostraram 13 eventos de 31 tendo a tolerância a dicamba. As plantas contendo o CTP de RbcS operacionalmente ligado a DMO (SEQ ID NO: 21) mostraram 13 eventos de 17 tendo tolerância a dicamba. As plantas contendo o CTP "A" operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 21) apresentaram 7 eventos de 18 que tem tolerância para a dicamba. Os resultados são fornecidos na Tabela 7.
Tabela 7. Tolerância a dicamba em R0 Brassica napus [0092] Dez sementes de cada uma das 28 plantas R1 contendo o CTP de APG6 operacionalmente ligado a DMO (SEQ ID NO: 20) (APG6+DMO) e dez sementes de cada uma das 17 plantas R1 contendo CTP de RbcS operacionalmente ligado a DMO (SEQ ID NO: 21 (RbcS+DMO) foram cultivadas numa estufa. As plantas foram pulverizadas com 2 lb ea/acre de dicamba (4X) no dia da plantação, seguido por 1 Ib ea/acre de dicamba (2X) na fase V3 e 1 Ib ea /acre de dicam-ba (2X) na primeira flor (definida como> 90% de plantas tendo botão e cerca de 25% tendo pelo menos uma flor aberta). Avaliações dos danos foram tomadas sete dias após cada pulverização e expressadas como lesão por cento em comparação com controles pulverizados. Para as plantas que contêm APG6+DMO, havia 9 de progênie total de 2 eventos com pontuações de lesão de dicamba de < 20% em cada um dos três períodos de pontuação. Para as plantas que contêm RbcS+DMO existiam 77 plantas por 16 eventos com tolerância a dicamba de menos de 20% em cada um dos três períodos de avaliação.
[0093] A caracterização da proteína foi feita usando folhas colhidas a partir dos eventos R0. O tecido foliar foi moído em nitrogênio líquido e extraído com dois volumes de tampão Laemmli 2X (BioRad, Hercules, CA) contendo 10% de 2-mercaptoetanol e 5 mM de DTT. As amostras foram fervidas e 10 pl carregados num gel pré-molde a 420% Criterion™ (BioRad, Hercules, CA) e executadas em tampão de Tris/glicina/SDS a 250V durante 45 minutos. A proteína no gel foi transferida para membrana de PVDF a 400 mA durante 30 minutos em tampão de Tris/glicina contendo metanol a 20%. A proteína de DMO foi detectada utilizando antissoros policlonais de coelho anti-DMO e um anticorpo secundário anticoelho conjugado com HRP. O sinal foi detectado utilizando o kit SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent (ThermoFischer Scientific, Grand Island, NY). Havia uma única banda de aproximadamente 38 kDa, que é o tamanho esperado para uma proteína DMO completamente processada, para cada um dos três eventos contendo APG6-DMO. Havia duas bandas de aproximadamente 38 kDa e aproximadamente 41 kDa para cada um dos seis eventos contendo RbcS-DMO. A banda de 41 kDa é consistente com a DMO+27 e foi relatada em soja contendo RbcS-DMO anteriormente (Patente US No. 7838729). Houve uma expressão muito baixa da pro- teína de DMO em todos os eventos que contêm o CTP-DMO "A" e o sinal detectado depois de uma longa exposição era uma banda de aproximadamente 50 kDa e uma banda de aproximadamente 39 kDa. A banda de 50 kDa se se aproxima do tamanho esperado de um não processado CTP-DMO "A". Estes resultados indicam que APG6-DMO produziu uma única banda do tamanho esperado de acordo com um DMO completamente processado.
[0094] A proteína recombinante foi purificada a partir de tecido foliar de plantas R0 contendo APG6-DMO ou RbcS-DMO. A análise da sequência amino-terminal foi realizada usando química de degradação de Edman como descrito. A análise da sequência de amino-terminal confirmou a presença de sequências amino-terminais de DMO+27 e DMO-1 presentes em plantas contendo RbcS-DMO, consistente com o tamanho das bandas DMO vistas no Western blot. A análise da sequência amino-terminal confirmou a presença de apenas sequência de amino-terminal de DMO DMO+1 de em plantas contendo APG6-DMO, consistente com o tamanho das bandas de DMO vistas no Western blot. Este resultado confirma que a utilização do CTP de APG6 resulta em processamento completo de uma DMO operacionalmente ligada em plantas.
Exemplo 4: Expressão de CTP-DMO no milho transgênico [0095] A expressão dos construtos de DNA compreendendo uma molécula de DNA recombinante que codifica um dos dois CTPs separados ligados operativamente a DMO foi analisada em células de milho transgênicas e plantas.
[0096] Transformação transiente de protoplasto de mesofilo de milho foi utilizada para avaliar a expressão de DMO relativa de duas combinações de CTP-DMO. Os construtos de DNA foram idênticos exceto que o CTP operativamente ligada ao DMO (SEQ ID NO: 18) foi quer APG6 (SEQ ID NO: 1) ou CTP4 (SEQ ID NO: 4). Os protoplastos foram preparados essencialmente como descrito no Exemplo 1. Após a transformação, as células foram colhidas e os níveis de proteína de DMO foram determinados com um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Proteína a partir de quatro amostras de protoplastos transformados foram medidas para cada combinação de CTP-DMO como nanogramas (ng) DMO por (mg) total de miligrama de proteína. Os protoplastos transformados com APG6-DMO tinham aproximadamente níveis 4 vezes mais elevados de DMO em comparação com os protoplastos transformados com CTP4-DMO. Os dados são fornecidos na Tabela 8.
[0097] Plantas de milho transgênicas foram geradas utilizando os construtos de DNA e plantas R0 foram cultivadas. Amostras de folhas foram coletadas de plantas R0 representando oito exclusivos eventos de cópia única e uso de ELISA quantitativo para medir os níveis de DMO. A expressão em tecido de folha R0 de DMO foi de aproximadamente 4 vezes mais elevada de eventos que continham m APG6-DMO em relação a eventos contendo CTP4-DMO. Os dados são fornecidos na Tabela 8.
[0098] A sequenciação de amino-terminal foi realizada para DMO expresso em plantas de milho transgênicas. A proteína foi purificada a partir de plantas de milho transgênicas que expressam CTP4-DMO ou APG6-DMO e preparada para sequenciação de degradação de Edman essencialmente como descrito no Exemplo 2. A análise da sequência amino-terminal confirmou sequências amino-terminais de DMO+6, DMO+7, e DMO+12 presentes em plantas contendo CTP4-DMO. A análise da sequência de amino-terminal confirmou sequências amino-terminais de DMO de DMO e DMO+1 em plantas contendo APG6-DMO. Estes resultados indicam que o processamento de CTP é mais completo com APG6 em comparação com CTP4, como evidenciado pelo menor número de aminoácidos restantes de CTP na extremidade amino-terminal da DMO. Os dados são fornecidos na Tabela 8.
Tabela 8. Expressão da proteína de DMO em milho [0099] Milho transgênico foi gerado pela transformação mediada por Agrobacterium usando métodos conhecidos dos versados na técnica com um construto de DNA que contém uma molécula de DNA re-combinante que codifica qualquer APG6-DMO ou CTP4-DMO. Tolerância a dicamba foi avaliada em um teste de campo para as plantas híbridas F1 transgênicas. O teste de campo incluiu quatro tratamentos em dois locais, com duas repetições cada. Os quatro tratamentos foram: (1) dicamba (Clarity®) aplicada a 2 lbs ea/acre (4X) em V2 seguido por V4 seguido por V8; (2) dicamba aplicada em 4 lbs at/acre (8X) em V2 seguido por V4 seguido de V8; (3) dicamba aplicada a 8 lbs at/acre (16X) em V2 seguido de V4 seguido por V8; e (4) dicamba aplicada a 16 lbs at/acre (32X) em V2, seguido por V4 seguido de V8. Lesão de cultura foi avaliada dez dias após o tratamento e mensurada como uma percentagem de lesão de colheita por estágio V (CIPV2, CIPV4 ou CIPV8). No fim da estação, grão foi colhido e rendimento medido como sacas/acre. Para ambas as pontuações CIPV e rendimento a diferença menos significativa (LSD) em probabilidade de 5% (p = 0,05) foi calculada. As taxas mais elevadas de dicamba (16X e 32X) aplicadas a plantas híbridas F1 contendo APG6-DMO mostraram lesões ligeiramente menos vegetativas e maior produtividade de grãos do que as plantas que contêm CTP4-DMO. Os dados são fornecidos na Tabela 9.
Tabela 9. Teste de campo híbrido F1 de lesão de dicamba e rendimento Exemplo 5: Expressão de CTP-DMO em algodão transgênico e soja [00100] O CTP de APG6 foi otimizado para aumentar a eficácia tradução da proteína (síntese da proteína) e aumentar a acumulação de proteínas. CTP de APG6 (SEQ ID NO: 2) otimizado tem uma alteração de aminoácidos de treonina (T) por serina (S) nas posições 3 e 4 do CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1). Construtos de DNA foram feitos para comparar os dois CTPs, cada um ligado operacionalmente a DMO em soja.
[00101] Plantas de soja transgênicas foram geradas com dois construtos de DNA que eram idênticos exceto para o CTP de APG6. O primeiro construto de DNA tinha APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 18). O segundo construto de DNA tinha o APG6 optimizado (SEQ ID NO: 2) ligado operativamente a DMO (SEQ ID NO: 18). Cada construto de DNA foi utilizado para transformar soja A3555 pelo método de transformação mediado por Agrobacterium. Após a transformação, as plantas transgênicas R0 contendo uma única cópia do transgene foram identificadas por ensaio de PCR. As plantas R0 de cópia única foram cultivadas em estufa e sementes R1 foram colhidas. Dez sementes R1 por evento para 4 eventos geradas usando cada um dos dois construtos de DNA e semente de AG3555 foi plantada para avaliação de tolerância ao tratamento de dicamba pós-emergência sob condições de crescimento de estufa padrão. Di-camba (Clarity) foi aplicado no estágio V4 em 1120 g de ai/ha. Avaliações dos danos da colheita foram efetuadas 10 dias após o tratamento. Amostras de folhas de plantas de soja tolerantes a dicamba foram tomadas para medir o nível de proteínas recombinantes e análise da sequência amino-terminal. O nível de proteína de DMO foi detectado por ELISA como sendo 13,35 ± 2,7 ng/mg para as plantas de soja tolerantes a dicamba de cópia única R1 transgênicas com o CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 18). O nível de proteína de DMO foi detectado por ELISA como sendo 18,55 ± 3,1 ng/mg para as plantas de soja tolerantes a dicamba transgênicas R1 contra CTP de APG6 de cópia única optimizado (SEQ ID NO: 2). Nenhuma das proteínas de DMO foi detectada em tecido foliar de soja A3555 de controle negativo. A pontuação de lesão para os dicamba para as plantas de soja transgênicas de cópia única R1 com o CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 18) foi de 3,6%. A pontuação de lesão de dicamba para as plantas de soja transgênicas de cópia única R1 como optimizado CTP de APG6 (SEQ ID NO: 2) ligado operativamente a DMO (SEQ ID NO: 18) foi de 2,7%. A soja de controle negativo A3555 teve uma pontuação de lesão de dicamba de 99,8%. As amostras de folhas das plantas de soja trans-gênica de cópia única tolerantes a dicamba R1 foram utilizadas para a sequenciação de amino-terminal (tal como descrito nos Exemplos 2 e 4). A análise da sequência de terminal amino confirmou que o tratamento de APG6-DMO e APG6-DMO optimizado resultou em transformação completa do CTP a partir do terminal amino da proteína de DMO. Os níveis de DMO, lesão de dicamba e processamento de APG6-DMO indicaram que tanto o APG6 e APG6 optimizado quando operacionalmente ligados a DMO fornecem tolerância a dicamba e ambos os CTPs são processados totalmente em plantas. Os dados são fornecidos na Tabela 10.
Tabela 10. Teste de estufa de soja R1 [00102] Algodoeiros transgênicos foram gerados com dois constru-tos de DNA que eram idênticos exceto para o CTP de APG6. O primeiro construto de DNA tinha APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 18). O segundo construto de DNA tinha o CTP de APG6 optimizado (SEQ ID NO: 2) ligado operativamente a DMO (SEQ ID NO: 18). Cada construto de DNA foi transformado em algodão por transformação mediada por Agrobacterium usando métodos conhecidos dos versados na técnica. Após a transformação, as plantas transgênicas de algodão R0 contendo uma única cópia do transgene foram identificadas por análise de PCR, cultivadas em estufa e sementes R1 foram colhidas. Dez sementes R1 por evento de 10 eventos para cada construto e de sementes de algodão DP393 plantadas para avaliar a tolerância da cultura à aplicação pós-emergência de dicamba. Dicamba (Clarity) foi aplicada na fase V4 a 1120 g de ai/ha. Avaliações dos danos da colheita por cento foram tomadas 9 dias após o tratamento. Amostras de folhas de plantas de algodão tolerantes foram utilizadas para a medição do nível de proteína e APG6-DMO ou a análise da sequência de amino-terminal otimizada de APG6-DMO. O nível de proteína de DMO detectado através de ELISA foi 176,2 ± 103 ng/mg para as plantas de algodão transgênicas tolerantes a dicamba de cópia única R1 com o CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado a DMO (SEQ ID NO: 18). O nível de proteína detectada através de ELISA DMO foi 136,5 ± 58,6 ng/mg para as plantas de algodão transgênicas tolerantes a dicamba de cópia única R1 com o CTP de APG6 optimizado (SEQ ID NO: 2). Nenhuma das proteínas de DMO foi detectada no tecido da folha de algodão DP393 de controle negativo. A lesão para as plantas de algodão transgênicas tolerantes a dicamba de cópia única R1 com o CTP de APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligada o DMO (SEQ ID NO: 18) foi de 2,6%. A lesão de dicamba para as plantas de cópia única R1 transgênicas com o CTP de APG6 optimizado (SEQ ID NO: 2) ligada operativamente o DMO (SEQ ID NO: 18) foi de 2,2%. A lesão de algodão DP393 de controle negativo foi de 85%. Amostras de folhas de plantas R1 tolerantes a dicamba de cópia única foram usadas para a sequenciação de amino-terminal (tal como descrito nos Exemplos 2 e 4). A análise da sequência de terminal amino confirmou que o tratamento de APG6-DMO e APG6-DMO optimizado resultou em transformação completa do CTP a partir do terminal amino da proteína de DMO. O nível de expressão de proteína de DMO, lesão de dicamba e APG6-DMO e de processamento de amino-terminal de APG6-DMO optimizado indicaram que tanto o APG6 e APG6 optimizado quando operacionalmente ligados a DMO fornecem tolerância a dicamba e ambos os CTPs são processados totalmente em plantas. Os dados são fornecidos na Tabela 11.
Tabela 11. Testes de estufa de algodão R1 Exemplo 6: Expressão de CTP-PPO em milho transgênico [00103] PPOs novos que são tolerantes a herbicidas de PPO foram identificados utilizando um sistema de triagem bacteriana de herbicida. Este sistema de triagem utilizou um ensaio de crescimento da cepa de E. coli de knockout em meio LB líquido com um herbicida de PPO para identificar PPOs que não foram sensíveis ao herbicida de PPO.
[00104] A cepa de E. coli de nula foi transformada com um vetor de expressão bacteriano contendo a atividade de PPO confirmada e cultivada em meio LB líquido. A forma purificada cristalina de um dos cinco herbicidas de PPO diferentes (acifluorfeno (1 mM), flumioxazina (0,5 mM), lactofena (0,5 mM), fomesafena (1 mM) e S-3100 (100 μΜ), que representa três subclasses química diferentes de PPO, foi adicionada ao meio. As proteínas recombinantes foram expressos e as taxas de crescimento de E. coli foram medidas. As curvas de crescimento (OD600) foram medidas para as diferentes variantes na presença e na ausência dos herbicidas de PPO em pontos de tempo selecionados desde o tempo zero a vinte e quatro horas. O crescimento de uma cepa de E. coli de knockout transformada em meio LB, na presença de um herbicida de PPO indicou que o gene utilizado para transformar o E. coli codificava uma protoporfirinogênio oxidase insensíveis a herbicida (iPPO).
[00105] Dez PPOs fornecidas como SEQ ID NOS: 40-49 foram todas encontradas conferindo as taxas de crescimento normais na cepa de E. coli de knockout em meio LB, na presença de um herbicida de PPO, indicando que estas proteínas são as oxidases protoporfinogênio insensíveis a herbicida (iPPO). A cepa de E. coli de knockout que expressa o WH_PPO (SEQ ID NO: 60) foi sensível a todos os cinco herbicidas de PPO, confirmando que o ensaio era capaz de distinguir entre PPOs sensíveis e insensíveis para cada um dos herbicidas.
[00106] Quatro vetores de transformação de plantas foram criados para expressar o PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) in planta. Construtos de transformação 1 e 11 tiveram a mesma combinação de promotor mais líder mais íntron, a mesma sequência 3'UTR, o mesmo PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), mas diferiram nas sequências de CTP e foram usados na transformação de soja. Construtos de transformação 6 e 16 tiveram a mesma combinação de promotor mais líder mais íntron, a mesma sequência 3'UTR, o mesmo PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43), mas diferiram nas sequências de CTP e foram usados na transformação do milho. Tabela 12 fornece a configuração dos construtos de transformação de plantas H_N10 de PPO.
Tabela 12. Configuração de construto com H_N10 de PPO
[00107] As enzimas de PPO foram expressas em plantas de milho transgênicas e plantas transgênicas foram analisadas na tolerância a herbicida de PPO. Os vetores de transformação de plantas foram construídos compreendendo uma molécula de DNA recombinante que codifica uma das enzimas de PPO fornecidas como SEQ ID NOs: 4059. A sequência de DNA que codifica uma enzima de PPO pode incluir na extremidade 5' um códon para uma metionina, vulgarmente conhecido como um códon de iniciação ou este códon pode ser eliminado para facilitar a ligação operativa de uma sequência de peptídeo de trânsito do cloroplasto à extremidade 5' da sequência de codificação. Exemplos de sequências de proteína de enzima de PPO contendo uma metionina no terminal amino são fornecidos como SEQ ID NOs: 40-49. Exemplos de sequências de proteína de enzima de PPO sem uma metionina no terminal amino são fornecidos como SEQ ID NOs: 50-59. Para a transformação de plantas, as sequências de nucleotí-deos que codificam as enzimas de PPO putativas foram optimizados em códon para expressão quer de dicotiledôneas ou monocotiledô-neas. A Tabela 2 fornece a SEQ ID NO correspondente para as sequências de proteínas e nucleotídeos das enzimas de PPO nos vetores de transformação.
[00108] Para o milho in planta ensaios, o milho (LH244) foi trans- formado usando Agrobacterium tumefaciens e métodos convencionais conhecidos na técnica. As plantas F1 transgênicas produzidas a partir de cruzamento das plantas R0 de cópia única que expressam H_N10 (SEQ ID NO: 43) em uma de duas configurações de construto foram testadas na estufa para tolerância a herbicida. As plantas foram tratadas com 40 gramas/ha S-3100 no estágio V3 e avaliações dos danos foram tomadas sete dias após o tratamento. As plantas transgênicas de milho expressando H_N10 (SEQ ID NO: 43) na configuração de construto 6 (APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)) resultaram em 13 dos 18 eventos produzindo plantas altamente tolerantes (10% ou menos lesão), mas a configuração do construto 16 (12G088600TP (SEQ ID nO: 38) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID nO: 43)) não resultou em plantas produtoras de eventos altamente tolerantes.
[00109] As plantas F1 transgênicas produzidas a partir de cruzamento das plantas R0 de cópia única que expressam H_N10 (SEQ ID NO: 43) em uma de duas configurações de construto (construtos 6 e 16) foram testadas no campo para a tolerância a herbicida. Esta população F1 foi segregada (50% hemizigótica e 50% nula) e seleção para as plantas transgênicas não foi realizada antes de avaliações dos danos. As avaliações dos danos globais médios para uma população tal espera-se que seja mais elevada do que uma população transgênica homogénea, uma vez que é difícil de discernir plantas não transgênicas de plantas transgênicas. Os ensaios foram conduzidos em dois locais, com duas repetições e 3 tratamentos por construto. Plantas de milho não transgênicas foram usadas como um controle negativo. Os tratamentos de aplicação de herbicida foram os seguintes: Tratamento 1 foi de 0,036 lb ai/acre S-3100 aplicado em V2 seguido por (fb) V4 fb V8; Tratamento 2: era 0,072 lb ai/acre S-3100 aplicado em V2 fb V4 fb V8; Tratamento 3: era 0,144 lb ai/acre S-3100 aplicado em V2 fb V4 fb V8. Pontuações Porcento de Lesão de Cultura foram avaliadas no estágio de crescimento V2 (CIPV2) e no estágio de crescimento V4 (CIPV4) 5 a 7 dias após o tratamento (o erro V2 e V4 de erro são metade da diferença menos significativa (LSD)). As avaliações das lesões das culturas foram combinadas para ambos os locais. Todas as plantas não transgênicas e plantas com os eventos gerados utilizando construto 16 (12G088600TP (SEQ ID NO: 38) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)) mostraram entre 94.6- 99,5% de lesão, tanto após a aplicação do herbicida V2 e V4 para cada um dos três tratamentos. Plantas com eventos gerados utilizando construto 6 (APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43)) mostraram lesões em apenas 30% a 50%, após a aplicação do herbicida V2 e nenhuma lesão após a aplicação do herbicida V4. Os dados são fornecidos na Tabela 13.
Tabela 13. Ensaio de campo de eficácia de milho F1 contendo PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) [00110] Os dados de campo e estufa de milho transgênico F1 demonstraram que APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligada ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) produziu taxas de lesões reduzidas quando expresso em plantas transgênicas em comparação com as taxas de lesões quando 12G088600TP (SEQ ID nO: 38) operativamente ligada ao PPO H_N10 (SEQ ID nO: 43) foi expresso em plantas transgênicas. Ver Figura 1.
[00111] Os vetores de transformação de plantas foram criados para expressar in planta quer PPO H_N40 (SEQ ID NO: 54) ou PPO H_N90 (SEQ ID NO: 50) operacionalmente ligado a APG6 (SEQ ID NO: 1), CTP D ou CTP E. Milho (01DKD2) foi transformado usando Agrobacterium tumefaciens e métodos convencionais conhecidos na técnica. Amostras de folhas de plantas R0 resultantes foram analisadas por PCR para determinar o número de cópia do inserto do transgene. Plantas R0 cada uma contendo um único evento de transformação foram pulverizadas com 40 g de ai/ha ou 80 g de ai/ha de S-3100 aproximadamente no estágio de crescimento V5 e avaliações dos danos foram tomadas 4-7 dias após o tratamento. O número de plantas com lesões <10% (altamente tolerante) ou lesão <20% (tolerante) do número total de plantas pulverizadas foi anotado. As plantas que estavam determinadas como eventos de cópia única e que passaram de pulverização a lesão <20% foram avançadas a autofecundação e fecundação cruzada. Os dados são apresentados na Tabela 14.
Tabela 14. Avaliação de tolerância a herbicidas de CTP-PPO no milho transgênico [00112] Os resultados mostram que APG6 (SEQ ID NO: 1) consistentemente produziu tolerância a herbicidas mais elevada em comparação com as plantas transformadas com o CTP D ou CTP E quando operacionalmente ligado a H_N40 (SEQ ID NO: 54) ou H_N90 (SEQ ID NO: 50). APG6 quando operacionalmente ligado a H_N40 resultou em 21,4% a 40,2% de plantas transgênicas sendo altamente tolerantes e 41,1% a 58,9% de plantas transgênicas que são tolerantes a S-3100 a 80 g ai/ha. APG6 quando operacionalmente ligado a H_N90 resultou em 49,1% de plantas transgênicas sendo altamente tolerantes e 56,3% de plantas transgênicas que são tolerantes a S-3100 a 40 g de ai/ha. CTP D quando ligado operativamente a H_N40 resultou em 0% de plantas transgênicas sendo altamente tolerantes e 2,2% sendo tolerantes a S-3100 a 80 g de ai/ha. CTP E quando operacionalmente ligado a H_N40 resultou em 0% a 8% de plantas transgênicas sendo altamente tolerantes e 12,9% a 32,1%, sendo tolerantes a S-3100 a uma taxa herbicida inferior de 40 g de ai/ha.
[00113] Milho híbrido F1 transgênico expressando APG6 operacionalmente ligado a PPO H_N10 foi avaliado pela tolerância a diferentes sete diferentes herbicidas PPO: S-3100, fomesafena, acifluorfena, lac-tofena, flumioxazina, sulfentrazono e saflufenacil. Sementes reunidas representando 5 eventos únicos foram plantadas em vasos numa estufa, juntamente com sementes de milho híbrido como um controlo negativo.
[00114] Para testar a tolerância a herbicida de pré-emergência, os herbicidas de PPO foram aplicados individualmente em uma de duas doses com seis repetições por tratamento como se segue: S-3100 (80 ou 160 g de ai/ha), fomesafena (Reflex®, 840 ou 1680 g ai/ha), flumioxazina (Valor® SX, 210 ou 420 g ai/ha), sulfentrazona (Spartan® 4L, 840 ou 1680 g ai/ha) e saflufenacil (Sharpen®, 200 ou 400 g ai/ha). As plantas foram avaliadas quanto a percentagem de dano na colheita em 20 dias após o tratamento e sementes de milho foram incluídas como um controle negativo. As plantas transgênicas com APG6 operativamente ligado ao PPO H_N10 tiveram pontuações de lesão para os diferentes herbicidas de PPO aplicados em pré-emergência na gama de 0% a 5,8%, indicando que APG6 operacionalmente ligado a PPO H_N10 forneceu excelente tolerância pré-emergência para o milho a ambas as doses do herbicida para todos os cinco herbicidas de PPO. Plantas de milho de controle negativo tiveram pontuações de lesão variando entre 17,5% a 94,2%, com a exceção de saflufenacil, o que é esperado uma vez que esse herbicida é comercializado para utilização em plantas de milho convencionais. Os dados são apresentados na Tabela 15 com o erro padrão indicado como +/-.
Tabela 15. Pontuações de lesão pré-emergência de herbicida PPO no milho [00115] Para testar a tolerância a herbicidas pós-emergência (V3 a V4), herbicidas de PPO foram aplicados individualmente em uma das três taxas com seis repetições por tratamento como se segue: S-3100 (40, 80 ou 160 g ai/ha), fomesafena (Reflex®, 420, 840 ou 1680 g ai/ha), acifluorfeno (Ultra Blazer®, 420, 840 ou 1680 g ai/ha), lactofena (Cobra®, 220, 440 ou 880 g ai/ha), flumioxazina (Valor® SX, 105, 210 ou 420 g ai/ha), sulfentrazona (Spartan® 4L, 420, 840 ou 1680 g ai/ha) e saflufenacil (Sharpen®, 100, 200 ou 400 g ai/ha). As plantas foram avaliadas quanto a percentagem de dano na colheita em 14 dias após o tratamento e sementes de milho híbrido convencional foram incluídas como um controle negativo. As plantas transgênicas com APG6 operativamente ligado ao PPO H_N10 tiveram pontuações de lesão para os diferentes herbicidas de PPO aplicados em pós-emergência que variam de 0,5% a 5,8%, com a exceção de fomesafena a 1680 g de ai/ha em que a pontuação de lesões foi de 13,8%, indicando que APG6 operacionalmente ligado a PPO H_N10 forneceu excelente tolerância de pós-emergência para o milho em todas as taxas de herbicidas em todos os sete herbicidas de PPO. Plantas de milho de controle negativo tiveram pontuações de lesão variando entre 36,7% e 100%. Os dados são apresentados na Tabela 16 com o erro padrão indicado como +/-.
Tabela 16. pontuações de lesão pós-emergência de herbicida de PPO no milho Exemplo 7: Expressão de CTP-PPO em soja transgênica [00116] Enzimas de PPO operativamente ligadas a diferentes CTPs foram expressas em plantas de soja transgênicas e as plantas trans-gênicas foram analisadas na tolerância a herbicida de PPO.
[00117] Os vetores de transformação de plantas foram criados para expressar in planta 12G088600TP (SEQ ID NO: 38) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) ou APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43). Soja A3555 foi transformada com estes vetores de transformação de plantas e Agrobacterium tumefaciens utilizando métodos-padrão conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas regeneradas R0 foram cultivadas na estufa, autopolinizadas e semente R1 foi recolhida. As plantas transgênicas R1 que foram pulverizadas numa estufa com um dos três tratamentos de herbicida aplicados em V4 e R1: (1) 5 g de ai/ha de S-3100, (2) 10 gramas ai/ha de S-3100 ou (3) 30 gramas ai/ha de S- 3100. pontuações de lesão de cultura foram avaliadas dez dias após o tratamento. As plantas transgênicas que expressam APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) tiveram pontuações de lesão variando de 4,2%, 7,8% e 9,4% no estágio de V4 e 3%, 6,5%, para 15,7 % no estágio de R1, nas taxas de 5, 10 e 30 g de ai/ha, respectivamente. As plantas transgênicas que expressam 12G088600TP (SEQ ID NO: 38) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) tiveram pontuações média dos danos para 82,7%, 92,7%, a 98,2%% nas taxas de 5, 10 e 30 g de ai/ha, respectivamente e não sobreviveram por pontuação no estágio R1. Plantas de controle negativo tiveram pontuações de lesão média 89% semelhantes e 98% e 100% nas taxas de 5, 10 e 30 g de ai/ha, respectivamente e não sobreviveram por pontuação no estágio R1. Os dados são fornecidos na Tabela 17.
Tabela 17: Teste de herbicida de PPO de soja R1 [00118] Os vetores de transformação de plantas foram criados para expressar in planta PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47) operacionalmente ligado a um de três diferentes CTPs, APG6 (SEQ ID NO: 1) CTP F e CTP H. Soja A3555 foi transformada com estes vetores de transformação de plantas e Agrobacterium tumefaciens utilizando métodos-padrão conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas regeneradas R0 foram cultivadas na estufa e amostras de folhas de plantas R0 resultantes foram analisadas por PCR para identificar plantas contendo uma única cópia de um evento. Plantas transgênicas R0 de cópia única, cada uma representando um evento único, foram pulverizadas na estufa com o tratamento com herbicida de 20 g de ai/ha de S-3100 aplicado aproximadamente no estágio V3. Avaliações de lesão foram tiradas 14 dias após o tratamento, número que foi considerado altamente tolerante (lesão <10%) ou tolerante (lesão <20%). As plantas transgênicas que expressam APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado ao PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47) resultaram em 21,4% de eventos únicos sendo altamente tolerantes e 57,1% sendo tolerantes. As plantas transgênicas que expressam CTP F operacionalmente ligado a PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47) resultaram em 11,7% de eventos únicos sendo altamente tolerantes e 41,1% sendo tolerantes. As plantas transgênicas que expressam CTP H operacionalmente ligado a PPO H_N90 PPO H_N90 (SEQ ID NO: 47) não resultaram em eventos únicos sendo altamente tolerantes ou tolerantes. Os dados são apresentados na Tabela 18.
Tabela 18. Avaliação da eficácia de S-3100 em soja R0 [00119] Estes dados demonstraram que o CTP específico que é operacionalmente ligado a uma enzima de PPO é crítico para obter a tolerância a herbicidas, demonstrando a importância da escolha de CTP e a superioridade inesperada do CTP de APG6 em relação ao outro CTP para utilização na produção de plantas transgênicas tolerantes a herbicida.
Exemplo 8: Expressão de CTP-PPO em algodão transgênico [00120] Os vetores de transformação de plantas foram criados para expressar APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) em plantas de algodão transgênicas e as plantas transgênicas foram analisadas para a tolerância a herbicida de PPO. Algodão DP393 foi transformado utilizando os vetores de transformação de plantas e Agrobacterium tumefaciens com métodos convencionais conhecidos na técnica. Plântulas transgênicas regeneradas R0 foram cultivadas na estufa e amostras de folhas de plantas R0 resultantes foram analisadas por PCR para identificar plantas contendo uma única cópia de um evento. Plantas transgênicas R0 de cópia única, cada uma representando um acontecimento único, foram pulverizadas na estufa com o tratamento com herbicida de 20 g de ai/ha de S-3100 aplicado no estágio V2. Além disso, transgênicas de múltiplas cópias (>2 cópias/planta) foram pulverizadas na estufa com o tratamento com herbicida de 20 g de ai/ha de S-3100 aplicado no estágio V2. Avaliações dos danos foram tomados três dias após o tratamento.
[00121] O controle negativo, algodão DP393, teve lesões a 100% três dias após o tratamento de herbicida com 20 g ai/ha de S-3100. Em contraste, 21 plantas R0 de cópia única tiveram uma lesão média de 26,7%. A distribuição de lesões para as 21 plantas R0 de cópia única foi: 3 plantas com nenhuma lesão; 3 plantas com lesão de 10%; 3 plantas com lesão de 15%; 2 plantas com lesão de 20%; 7 plantas com lesão de 30%; e 3 plantas com lesão de 40%. Para plantas R0 multicópia, 14 plantas receberam tratamento de herbicida e o prejuízo médio foi de 10,4%. A distribuição de lesões para as 14 plantas multi-cópia foi: 5 plantas com nenhuma lesão; 3 plantas com lesão 5%; 1 planta com lesão de 10%; 2 plantas com lesão de 15%; 1 planta com lesão de 20%; 1 planta com lesão de 30%; e uma planta com lesão de 40%. Estes dados demonstram que algodão transgênico R0 expressando o APG6 (SEQ ID NO: 1) operativamente ligado ao PPO H_N10 (SEQ ID NO: 43) tiveram tolerância à aplicação do herbicida de S-3100 a 20 g de ai/ha aplicado no estágio V2.
REIVINDICAÇÕES

Claims (25)

1. Molécula de DNA recombinante caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito do cloroplasto (CTP) operativamente ligado a uma sequência de DNA que codifica dicamba mono-oxigenase (DMO) ou protopor-firinogênio oxidase (PPO) em que o CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-3.
2. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA que codifica o CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7-14.
3. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a DMO ou PPO compreende uma sequência de polipeptídeo selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18-27 e 40-59.
4. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA que codifica uma DMO ou PPO compreender uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 28-37 e 61-102.
5. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o CTP está ligado operativamente a uma proteína de DMO e o CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1-3.
6. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o CTP está ligado operativamente a uma proteína de PPO e o CTP compreende uma sequência seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2.
7. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de DNA como definida na reivindicação 1, operativamente ligada a um promotor heterólogo funcional numa célula de planta.
8. Material de planta não vivo caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade detectável de molécula de DNA re-combinante como definida na reivindicação 1.
9. Produto de base caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade detectável de molécula de DNA recombinan-te como definida na reivindicação 1.
10. Produto de base de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser adicionalmente definido como um produto de base selecionado a partir do grupo que consiste em sementes não viáveis ou suas partes, tecido desidratado vegetal, tecido vegetal congelado, tecidos de plantas transformadas, sêmola, farinha, flocos, farelo e fibra.
11. Método para produzir uma planta tolerante a herbicida caracterizado pelo fato de que compreende os passos de: a) transformação de uma célula vegetal com o construto de DNA de acordo com a reivindicação 7 e; b) regeneração de uma planta a partir da célula de planta transformada, que compreende o construto de DNA.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a planta regenerada é tolerante a um herbicida selecionado a partir do grupo que consiste de dicamba e um inibidor de PPO.
13. Método de produzir uma planta tolerante a herbicida caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) cruzar uma planta progenitora que compreende a molécula de DNA da reivindicação 1 com ela própria ou com uma segunda planta para produzir uma ou mais plantas de progênie; e b) seleção de uma planta descendente compreendendo a referida molécula de DNA.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a planta de progênie é tolerante a um herbicida selecionado a partir do grupo que consiste de dicamba e um inibidor de PPO.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a planta de progênie é tolerante a um herbicida inibidor de PPO selecionado a partir do grupo que consiste de S-3100, fomesafena, acifluorfeno, lactofena, flumioxazina, sulfentrazona e sa-flufenacil.
16. Método de expressão de mono-oxigenase de dicamba (DMO) ou protoporfirinogênio oxidase (PPO) caracterizado pelo fato de que compreende a introdução da molécula de DNA como definida na reivindicação 1, para uma célula vegetal.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende a transformação da célula vegetal.
18. Método para o controle de crescimento de ervas daninhas em um ambiente de crescimento de culturas caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) plantar uma planta ou semente compreendendo a molécula de DNA como definida na reivindicação 1 em um ambiente de crescimento de culturas; e b) aplicar ao ambiente de crescimento da colheita uma quantidade de dicamba ou um herbicida inibidor de PPO eficaz para controlar o crescimento de ervas daninhas.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o herbicida não danifica a planta ou semente.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a planta ou semente de planta é uma monocotile-dônea ou sementes.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de milho ou de trigo.
22. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a planta ou a semente é uma planta ou semente dicoltiledônea.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de soja, de algodão ou Brassica.
24. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o herbicida é dicamba.
25. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o herbicida é um inibidor de PPO.
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