TW201819632A - 使用經由非同源末端連接修復路徑的基因組內重組的轉基因的位點特異性整合 - Google Patents

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約瑟夫 帕托里諾
安德烈 沃登
皮爾路吉 巴羅尼
馬修 辛普森
唐亞 斯傳吉
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Abstract

提供一種修飾植物細胞中至少一靶基因座的組合物和方法，其包括將一或多個靶基因座和一或多個供體基因座提供至植物細胞、植物或植物部分，提供至少一切割位點特異性核酸酶而使靶基因座內產生雙股斷裂，隨後在至少一靶基因座內的至少一供體基因座形成非同源末端連接。本發明還提供於這些方法中所使用的靶基因座、供體基因座和核酸酶基因座，以及包括這些靶基因座、供體基因座，核酸酶基因座和/或重組基因座的植物細胞、植物和植物部分。

Description

使用經由非同源末端連接修復路徑的基因組內重組的轉基因的位點特異性整合 相關申請案之交叉引用
本申請案請求於2016年11月21日提交之美國臨時專利申請案第62/424574號之優先權與權益，其全文係以引用方式併入本文中。
以引用方式併入的電子遞交資料
以全文引用之方式併入的為與本申請案同時提交且如下標識之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表：創建於2017年10月12日的命名為「76767 FINAL SEQ_ST25」的一個88.3 KB ASCII(文本)文件。
本發明係有關於使用經由非同源末端連接修復路徑的基因組內重組的轉基因的位點特異性整合。
供將轉基因定點整合到植物基因組中的精確、穩健和可重複的技術已成為開發轉基因植物的長期目標。傳統的轉化方法依賴於在植物基因組內隨機引入轉基因。不幸的是，這些方法在應用上可能受到限制，特別是由於優良作物品種中的多數為轉化不良。這種技術障礙的極點導致轉基因在植物基因組中不需要之位置上產生低效轉化。最近已研發出經由位點特異性核酸 酶的使用來進行植物中轉基因的特異性整合，而作為在特定基因組位置中整合轉基因的有效解決方案。然而，這種技術仍受到低轉化效率的限制。因此，有需要開發植物轉化技術，而使此植物轉化技術轉基因的位點特異性整合具有穩健的效率。
在一實施例中，本發明關於經由提供包含有一基因組DNA的一第一活體植物，將經整合的供體DNA插入一植物基因組靶基因座內的方法，所述基因組DNA包括被多個識別序列側接的該供體DNA和該植物基因組靶基因座，其中所述植物基因組靶基因座包括至少一識別序列；提供包含有一基因組DNA的一第二活體植物，所述基因組DNA包括將至少一鋅指核酸酶編碼的DNA，該至少一鋅指核酸酶被改造以在該識別序列上切割該基因組DNA；將所述第一和第二活體植物進行雜交，使得F1種子在所述第一或第二活體植物上產生；在該F1種子或一F1植物中表達該鋅指核酸酶，其中所述經表達的鋅指核酸酶於該識別序列切割該供體DNA和該基因組DNA；以及使包含有一基因組DNA的所得F1植物生長，其中該供體DNA經由非同源末端連接而被整合在該植物基因組靶基因座的該識別序列內。在此實施例的樣態中，該識別序列包括至少一識別序列。在另一樣態中，該識別序列包括第一和第二識別序列。在其他樣態中，該第一和第二識別序列是相同的。在隨後的樣態中，經由使該第一和第二活體植物進行雜交以提供該鋅指核酸酶，而使該鋅指核酸酶切割兩個識別序列。在其他樣態中，該供體DNA和該植物基因組靶基因座不相連接。在另一樣態中，該供體DNA和該植物基因組靶基因座是位於同源染色體上。在另一樣態中，該供體DNA和該植物基因組靶基因座是位於非同源染色體上。在一實施例中，該植物基因組靶基因座更包括一表達盒。在此實施例的一樣態中，該表達盒是位於該第一與第 二識別序列間。在此實施例的另一樣態中，該表達盒是位於該第一識別序列外。在此實施例的另一樣態中，該表達盒是位於該第二識別序列外。在另一實施例中，該第一活體植物對至少一基因組靶基因座是純合的。在另一實施例中，該第一活體植物於至少一供體DNA是純合的。在一實施例中，該第一活體植物於至少一基因組靶基因座是雜合的。在一實施例中，該第一活體植物於至少一供體DNA是雜合的。在另一實施例中，該植物基因組靶基因座是一轉基因基因座。在其他實施例中，該植物基因組靶基因座是一內源基因座。在一些樣態中，該鋅指核酸酶是由一啟動子所驅動。示例性的啟動子包含花粉特異性啟動子、種子特異性啟動子和/或發育階段特異性啟動子。在另一實施例中，該供體DNA包括一可選擇的標記。
在一實施例中，本發明關於藉由以下方法將一轉基因傳遞到其他植物中：將由以包括一基因組靶基因座和該轉基因的經分離核酸分子而轉化的植物細胞或組織而再生的一第一植物與由以包括可操作地連接到鋅指核酸酶的啟動子的經分離核酸分子而轉化的植物細胞或組織而再生的一第二植物進行雜交；表達該鋅指核酸酶，使得一第一鋅指核酸酶單體與一第二鋅指核酸酶單體配對；獲得由雜交產生的一F1植物，其中該轉基因經由非同源端連接而特異性地且穩定地整合在該基因組靶基因座內；以及培育由前述雜交所產生的該F1植物。在此實施例的一樣態中，從以包括可操作地連接到該鋅指核酸酶的該啟動子的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物是包括至少一鋅指核酸酶單體。在另一樣態中，從以包括可操作地連接到該鋅指核酸酶的該啟動子的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物是包括該第一和該第二鋅指核酸酶單體。在隨後的樣態中，從以包括可操作地連接到該鋅指核酸酶的該啟動子的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物是包括該第一鋅指核酸酶單體。 在其他樣態中，從以包括該基因組靶基因座與該轉基因的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物更包括包括可操作地連接到一第二鋅指核酸酶的一啟動子的一經分離的核酸分子，其中所述第二鋅指核酸酶是包括所述第二鋅指核酸酶單體。在另一樣態中，該第一和第二鋅指核酸酶單體導致該轉基因的釋放，且經由雙股斷裂而切割該基因組靶基因座。
在一實施例中，本發明是關於使用本發明的方法所生產的F1植物。於此實施例的一態樣中，該F1植物係包括一轉基因事件。在一實施例中，該轉基因事件是殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮利用效率性狀、水分使用效率性狀、營養品質性狀、DNA結合性狀、小RNA性狀、選擇標誌物性狀或其任何組合。在一些實施例中，該轉基因事件是一農藝性狀。在一些實施例中，該轉基因事件是一除草劑耐受性性狀。除草劑耐受性性狀的非限制性實例是dgt-28性狀、aad-1性狀或aad-12性狀。於此實施例的其它態樣中，該轉基因植物係產生一商品化產品。在一實施例中，該商品化產品可包含蛋白質濃縮物、蛋白質分離物、穀物、膳食、麵粉、油和/或纖維而作為商品化產品的非限制性實例。在此實施例的另一樣態中，該轉基因植物是單子葉植物。單子葉植物的非限制實例是玉米種植物。在此實施例的另一樣態中，該轉基因植物是雙子葉植物。雙子葉植物的非限制實例是煙草植物。
在一實施例中，本發明關於藉由以下方法將一供體DNA插入一植物基因組靶基因座中：獲得包含有該植物基因組靶基因座的一活體植物細胞，其中該植物基因組靶基因座包括一識別序列；提供一供體DNA，該供體DNA包括側接該供體DNA的至少一識別序列；提供並表達一位點特異性核酸酶，其中該經表達的位點特異性核酸酶於該識別序列切割該植物基因組靶基因座和該供體DNA；以及獲取所得植物細胞，其中該供體DNA經由非同 源末端連接而整合在該植物基因組靶基因座的該識別序列中。在此方法之一樣態中，在細胞週期的一階段經由非同源末端連接將該供體DNA整合到該植物基因組靶基因座的該識別序列內。在此方法之一樣態中，該細胞週期的階段是選自由第2間期(G2)細胞週期階段、第一間期(G1)細胞週期階段、DNA合成(S階段)細胞週期階段、有絲分裂(M)細胞週期階段及其任意組合所組成的群組。在此方法之另一樣態中，該位點特異性核酸酶是選自由鋅指核酸酶、CRISPR、TALEN、大範圍核酸酶、CRE重組酶及其任意組合所組成的群組。在此方法之另一樣態中，該位點特異性核酸酶是選自由鋅指核酸酶、CRISPR、TALEN、大範圍核酸酶、CRE重組酶及其任何組合所組成的群組。
在一實施例中，本發明關於將一供體DNA片段從一親本植物到一F1子代植物的靶位點的基因組內重組移動的方法。在此方法的一樣態中，該供體DNA經由該靶基因座內的供體DNA片段的單側入侵(OSI)而整合在該靶基因座內。該靶基因座可是基因座、線粒體基因座或葉綠體基因座。在另一樣態中，藉由從一位點特異性核酸酶產生的雙股斷裂可促進該供體DNA的插入。這種位點特異性核酸酶的非限制性實例包含：CRISPR cas9、CRISPR cpf1、TALENS以及鋅指核酸酶。在一些樣態中，該雙股斷裂可能發生在該供體DNA的兩側。在其他樣態中，該雙股斷裂可能發生在該靶基因座。在另一樣態中，在細胞週期的階段期間，該供體DNA可整合到該靶基因座內。該細胞週期的示例性階段可包含第2間期(G2)細胞週期階段、第一間期(G1)細胞週期階段、DNA合成(S階段)細胞週期階段、有絲分裂(M)細胞週期階段及其任意組合。在一些樣態中，該方法包含包括該供體DNA片段的一親本植物。在其他樣態中，該方法包含包括該位點特異性核酸酶的一親本植物。因此，包括該供體DNA的一第一親本植物可與包括 該位點特異性核酸酶的一第二親本植物進行雜交。如此雜交的結果產生一F1子代植物。在一些樣態中，該F1子代植物包括經由OSI介導的插入而整合在該靶基因座內的該供體DNA。
在一實施例中，本發明關於經由以下方式將供體DNA以NHEJ介導整合在一植物基因組靶基因座內的方法：藉由提供包含一基因組DNA的一第一活體植物，所述DNA包括以多個識別序列與該植物基因組靶基因座側接的該供體DNA，其中所述植物基因組靶基因座是包括至少一識別序列；提供含有一基因組DNA的一第二活體植物，所述DNA包括將設計用於切割該識別序列的一位點特異性核酸酶進行編碼的一轉基因；將該第一和第二活體植物進行雜交以產生一F1子代；產生一F1子代，其中使該F1子代種子生長至成熟；在細胞週期的階段，在該F1子代內表達該位點特異性核酸酶；以該位點特異性核酸酶切割該供體DNA與該植物基因組靶基因座；經由NHEJ介導的整合機制，將該供體DNA整合到該植物基因組靶基因座內，其中該供體DNA在該植物基因組靶基因座內的整合是發生在細胞週期階段；以及獲得具有整合在該植物基因組靶基因座內的該供體DNA的一F1植物。在本方法的一樣態中，該細胞週期的階段是選自由第2間期(G2)細胞週期階段、第1間期(G1)細胞週期階段、DNA合成(S階段)細胞週期階段、有絲分裂(M)細胞週期階段及其任意組合所組成的群組。在此方法的另一樣態中，該位點特異性核酸酶是選自由鋅指核酸酶、CRISPR、TALEN、大範圍核酸酶、CRE重組酶及其任意組合所組成的群組。
在一實施例中，本發明關於經由以下方式將一供體DNA插入到一植物基因組的一靶基因座內：提供至少一供體DNA，所述至少一供體DNA是與穩定整合在該植物基因組內的多個識別序列側接，其中該供體DNA的該識別序列也存在於該靶基因座內；提供至少一鋅指核酸酶，其被改造以在 經穩定整合於該植物基因組內的該識別序列上切割該基因組DNA；表達該鋅指核酸酶，其中該經表達的鋅指核酸酶於該識別序列上切割該供體DNA與該靶基因座；以及，獲得該所得植物基因組，其中該供體DNA經由非同源末端連接而整合在該靶基因座的該識別序列內。在此方法的一樣態中，該供體DNA藉由一第一植物轉化方法而穩定整合在該植物基因組內。在此方法的一樣態中，該鋅指核酸酶經由一第二植物轉化方法而穩定整合在該植物基因組內。在此方法的一樣態中，還包含培養包括該供體DNA的整個植物的另一步驟。在此方法的一樣態中，包含培養包括該鋅指核酸酶的整個植物的另一步驟。
除前述示例性樣態和實施例外，經由研讀以下描述，將使其他樣態與實施例變得更為明顯。
列於所附序列表之核酸序列係以核苷酸鹼基之標準縮寫字母顯示，如在37 C.F.R.§ 1.822所定義。每一核酸序列只顯示一股，但需理解互補股包含於對所附序列表中所參照顯示的股。
圖1顯示pDAB1585的質粒圖譜。
圖2顯示pDAB118259的質粒圖譜。
圖3顯示pDAB118257的質粒圖譜。
圖4顯示pDAB118261的質粒圖譜。
圖5顯示根據本發明的用於將兩個親本植物進行雜交的方法的過程示意圖。
圖6描述靶基因組基因座(即標記為「靶」)內以及所得的整合物(即，標記為「靶向」)的所得供體(即，標記為「NHEJ供體」和「HDR供體」)的漸滲)。圖6中更提供如PCR擴增子所示的所得整合的凝膠電泳。
圖7顯示pDAB118253的質粒圖譜。
圖8顯示pDAB118254的質粒圖譜。
圖9顯示pDAB113068的質粒圖譜。
圖10顯示pDAB105825的質粒圖譜。
圖11顯示pDAB118280的質粒圖譜。
圖12顯示經由同源性定向修復的該基因組內重組過程的示意圖。
圖13顯示經由非同源末端連接修復的基因組內重組過程的示意圖。
圖14顯示經由單側入侵(OSI)的該基因組內重組過程的示意圖。
圖15顯示經由內部基因組重組產生子代(F1)植物的原位定向重組的示意圖。
圖16顯示靶基因組基因座(即，標記為「靶植物」)和所得整合物(即，標記為「靶向植物」)內的供體(即，標記為「NHEJ供體植物」和「HDR供體植物」)的所得漸滲。圖16中更提供如PCR擴增子所示的所得整合的凝膠電泳。
圖17顯示於靶基因組基因座(即，標記為「靶植物」)和所得整合物(即，標記為「靶向植物」)內的供體(即，標記為「OSI供體植物」)的所得漸滲。所得的整合的凝膠電泳如PCR擴增子所示。
總覽
本文揭露用於在植物基因組內整合供體多核苷酸序列的方法和組合物。在某些實施例中，本發明關於供在植物基因組的特定基因座內的供體多核苷酸的原位移動的育種策略。在此實施例的某些樣態中，該供體多核苷酸序列經由非同源末端連接(NHEJ)介導的細胞機制而整合在該植物基因組 內。在此實施例的某些樣態中，該供體多核苷酸序列經由該供體序列一側上的非同源末端連接(NHEJ)介導的細胞機制和該供體序列另一側上的同源性定向修復(HDR)介導的細胞機製而整合在該植物基因組內。在此實施例的另一樣態中，該供體多核苷酸在將兩個親本植物進行雜交後被靶向至一特定基因組基因座內。在此實施例的另一樣態中涉及以下靶向基因組的重排：i)在供體和靶基因座的位置同時進行雙股斷裂的形成，ii)供體模板序列的切除，以及iii)於靶基因座處的非同源性定向修復。最終，該經隨機整合的供體序列是被整合到該靶基因座中。新穎靶向方法的開發允許經由常規植物轉化技術快速發展含有多核苷酸供體序列、位點特異性核酸酶結合序列以及位點特異性核酸酶的親本系。這些親本系可用於在該植物基因組與位點特異性核酸酶的特定基因座內的供體之原位靶向遞送，以規避與低效轉化方法以及位點特異性對隨機DNA整合的低頻率相關的技術問題。此外，供體和位點特異性核酸酶的前述原位靶向遞送允許在該子代植物中的該靶和供體之切割和整合同時發生在所有各種細胞週期階段(G1、S、G2和M)，因而導致供體經由在這種細胞週期階段起作用的DNA修復和重組機制而移動到該基因組靶基因座。
經由非同源末端連接(NHEJ)修復的原位靶向將表示一位點特異性DNA整合和轉基因堆積的改進手段。在遞送該位點特異性核酸酶時，來自該供體的該基因組基因座和旁側序列可經由雙股斷裂被切割。從而切割所得的供體序列，且可供整合在該經切割的基因組基因座內。使用該經切割的供體模版對該靶基因組基因座進行NHEJ修復時，該供體會被特異性整合到一位點特異性基因座內。本發明提供經由NHEJ介導的細胞機制將基因組供體序列精確整合到基因組基因座內的方法和組合物。
定義
所提供的定義和方法定義了本發明且指引所屬領域中具有通常知識者實踐本發明。除非另有說明，術語應根據相關領域的普通技術人員的習慣用法來理解。在發生爭議的情況下，包含於前述定義內的本發明將會受到控制。除非上下文另有要求，單數術語應包含複數個，複數術語應包含單個。本文提及的所有出版物、專利和其他參考文獻經由引用整體併入本文而用於所需之目的，如同每個單獨的出版物或專利申請被具體和單獨地指明經由引用而併入般，除非僅將專利或專利出版物的特定部分指明為經由引用併入本文。
為了闡述本發明，提供以下術語、縮寫和定義。
術語「約」在本文中用於表示大約、大致、周圍或特定區域中。當術語「約」與數值範圍結合使用時，它經由將所列數值的上下邊界延伸來修改其範圍。通常，術語「約」在本文中用於將高於和低於所列值的數值往上或往下修改20%(高些或低些)，優選地為15%，更優選地為10%，以及最優選地為5%。
如本文所用，術語「包括(comprises)」、「包括(comprising)」、「包含(includes)」、「包含(including)」、「具有(has)」、「具有(having)」、「含有(contains)」或「含有(containing)」或其任何其它變化意為非排他性或開放式的。例如，包括所列出組成元素的組合物、混合物、流程、方法、物品或裝置不一定僅限於這些元件，而可包含未明確列出或如此組合物、混合物、流程、方法、物品或裝置所固有的其它組成元素。此外，除非有明確指出相反的意思，否則「或」是指包容性的或且不是獨佔的或。例如，條件A或B由以下任何一者滿足：A為真(或存在)且B為假(或不存在)，A為假(或不存在)且B為真(或存在)以及A和B兩者都為真(或存在)。
本文所用的術語「發明」或「本發明」是非限制性術語且不旨在表示特定發明的任何單一實施例，而是包含本申請案中所揭露的所有可能的實施例。
本文所用的術語「基因組」或「基因組DNA」是指宿主生物的遺傳基因信息。所述基因組DNA包括細胞或生物體的全部遺傳物質，包含細胞核的DNA(染色體DNA)、染色體外DNA以及胞器DNA(例如線粒體、質體與葉綠體)。優選地，術語基因組或基因組DNA是指細胞核的染色體DNA。
本文所用的術語「染色體DNA」或「染色體DNA序列」是指與細胞週期狀態無關的細胞核的基因組DNA。因此，染色體DNA可能被組織在染色體或染色單體中，這些染色體或染色單體可以是濃縮的或展開的。
如本文中所用，術語「天然的」或「自然的」係界定於自然界中所發現之條件。「天然DNA序列」為自然界中存在之藉由自然手段或傳統育種技術產生而非藉由遺傳工程改造(例如，使用分子生物學/轉化技術)所產生的DNA序列。
如本文所用，與核酸或氨基酸序列相關的「內源性」是指多核苷酸、基因或多肽在生物體或生物體的基因組中的天然位置的天然形式。「內源」分子是在特定環境條件下在特定發育階段通常存在於特定細胞中的分子。例如，內源的核酸可包括染色體、線粒體、葉綠體或其他胞器的基因組，或天然存在的附加體核酸。額外的內源性分子可包含蛋白質，例如，轉錄因子和酶。
如本文所用之「外源序列」是指通常不存在於細胞中但可經由一或多種遺傳、生物化學或其它方法引入細胞的分子。「細胞中的正常存在」是針對細胞的特定發育階段和環境條件而決定的。因此，例如，僅在肌肉發育 過程中存在的分子是對於成年肌細胞的外源分子。類似地，經熱休克誘導的分子是對於非熱休克細胞的外源性分子。外源分子可以包括，例如，任何多肽或其片段、官能障礙內源性分子的功能型版本或正常功能型內源性分子的故障功能型式的編碼序列。因此，外源分子可以包括來自另一物種的編碼序列，該另一物種是宿主細胞中內源性基因的異種同源物。
外源分子可以是諸如由組合化學過程產生的小分子，或大分子如蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、糖蛋白、脂蛋白、多醣、任何前述分子中之經修飾的衍生物，或包括一或多種前述分子的任何複合物。核酸包含DNA和RNA，可是單股或雙股；可以是直鏈、支鏈或環狀的；以及可以是任意長度。核酸包含那些能夠形成雙股體的核酸，以及能形成三股體的核酸。參見(例如)美國專利第5,176,996號與第5,422,251號。蛋白質包含但不限於位點特異性核酸酶蛋白、DNA結合蛋白、轉錄因子、染色質重構因子、甲基化DNA結合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙醯化酶、去乙醯化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓撲異構酶、旋轉酶和解旋酶。
外源性分子可以是與內源性分子相同類型的分子，例如，外源性蛋白質或核酸。例如，外源核酸可以包括感染性病毒基因組、引入細胞的質粒或附加體，或細胞中通常不存在的染色體。將外源性分子引入細胞的方法是所屬領域具有通常知識者已知的，且包括但不限於脂質介導的轉移(即脂質體，包含中性和陽離子脂質)、電穿孔法、直接注射、細胞融合、粒子轟擊(particle bombardment)，磷酸鈣共沉澱、奈米粒子轉化、DEAE-葡聚醣介導的轉移以及病毒載體介導的轉移。
本文所用的術語「嵌合」是指包括「經重組」序列的序列。例如，所述序列是經重組，且在天然狀況下不一起被發現。
術語「重組(recombine)」或「重組(recombination)」是指任何 連接多核苷酸的方法。該術語包含端對端連接，以及將一序列插入另一序列。該術語旨在涵蓋包含物理連接技術，如黏端連接法和平端連接法。也可人造地或重組地合成這些序列以包含所述經重組的序列。此外，該術語可以涵蓋(包括)在第二序列中的一序列的整合，例如，經由同源重組而在生物體基因組內之多核苷酸的整合可以由「重組」而引發。為了本發明的目的，術語「同源性重組」用於表示由於同源的遺傳物質片段之間的相互作用而發生的重組。相比之下，為了本發明的目的，術語「非同源重組」用於表示因著非同源或相同遺傳物質片段之間的相互作用而發生的重組。非同源末端連接(NHEJ)是非同源重組的一個實例。在其他樣態中，所述術語是指DNA或RNA序列的部分在兩DNA或RNA分子之間的重排。「同源性重組」發生在經由每個DNA分子中存在的同源或互補核苷酸序列雜交的兩個DNA分子之間。
如本文所用術語「同源區」不限於給定的單個多核苷酸序列，而是可包括啟動子、編碼區、終止子序列、增強子序列、基質附著區或一或多個表達盒的一部分或完整序列。術語「同源區」經由共享足夠的序列同一性而與另一「同源區」結合而獲得意義，藉以能夠經由與其他同源區進行同源重組而重組。因為同源區域不受另一同源區域的足夠序列同一性以外的任何結構特徵的限制，所以給定的序列可能對同源區域B是同源區域A，但同時可能是對同源區域Y是同源區域X。因此，供體基因座的同源區域必須在靶基因座的另一同源區或相同供體基因座的另一序列的背景下理解，例如，如和與包括同源區B的靶基因組合一起使用時，給定的序列可是供體基因座的同源區域A。
本文所用的術語「隔離」是指已從其自然環境中移除。
如本文中所用，術語「經純化的」係有關將分子或化合物分離為一 種實質上不含有通常在天然或自然環境中與該分子或化合物相關聯的汙染物之形式，且意指已由於與原始組成中之其他組分分離而在純度上有所增加。術語「經純化的核酸」在本文中用於描述已從包含但不限於多肽、脂質和碳水化合物的其它化合物分離的核酸序列。
如本文所用術語「多核苷酸」、「核酸」和「核酸分子」可互換使用，且可以包括單個核酸；多個核酸；核酸片段、變體或其衍生物；以及核酸構建體(例如，信使RNA(mRNA)和質粒DNA(pDNA))。多核苷酸或核酸可含有全長cDNA序列或其片段的核苷酸序列，其包含非轉譯的5'和/或3'序列和編碼序列。多核苷酸或核酸可包括任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可以包含未經修飾的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或經修飾的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以包括單股和雙股DNA；作為單股和雙股區域之混合物的DNA；單股和雙股RNA；以及作為單股和雙股區域之混合物的RNA。包括DNA和RNA的雜合分子可以是單股、雙股或單股和雙股區域的混合物。前述術語還包含經化學上、酵素上和代謝上修飾的多核苷酸或核酸形式。
應當理解，特定的DNA或多核苷酸也指其互補體，其序列是根據去氧核糖核苷酸鹼基配對的規則而決定。儘管本發明的序列表中可僅提供DNA之一股，但是本領域具有通常知識者將理解到可從本文提供的股確定和決定互補股。因此，可以使用單股之多核苷酸來決定互補股，因此，兩條股(即有義股和反義股)是由單股加以示例。
如本文所用術語「基因」是指編碼功能性產物(RNA或多肽/蛋白質)的核酸。基因可包含編碼功能性產物的序列之前(5'非編碼序列)和/或之後(3'非編碼序列)的調控序列。
本文所用的「轉基因(Transgene)」、「轉基因的(transgenic)」 或「重組體(recombinant)」是指由人操控的多核苷酸或由人操控的多核苷酸的複本或互補體。例如，包括可操作地連接到第二多核苷酸的啟動子的轉基因表達盒可包含相對包含表達盒的經分離核酸經人為操控所產生之第二多核苷酸為異源的啟動子(例如，經由Sambrook et al.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,(1989)or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3,John Wiley & Sons,Inc.(1994-1998)描述的方法)在另一實例中，經重組的表達盒可包括以這樣的方式而組合的多核苷酸，使得此種多核苷酸在天然中極不可能被發現。例如，由人操控的限制性位點或質粒載體序列可以與該第二多核苷酸側接或將啟動子與該第二多核苷酸分離。本領域具有通常知識者將理解到，多核苷酸可以許多方式操控，且不限於以下實例。於一實例中，轉基因係為基因序列(例如除草劑抗性基因)、編碼工業上或醫藥學上適用之化合物的基因或編碼所需農藝性狀之基因。在另一實例中，轉基因係為反義核酸序列，其中該反義核酸序列的表現抑制了目標核酸序列的表現。轉基因可含有可操作地連接至轉基因(例如啟動子)之調控序列。
如本文所用，術語「編碼序列」是指編碼特定胺基酸序列的核酸序列。「調控序列」是指位於編碼序列上游(例如，5'非編碼序列)、內或下游(例如，3'非編碼序列)的核苷酸序列，其影響轉錄、RNA加工或穩定性或編碼序列的轉譯。調控序列包含，例如，但不限於：啟動子；轉譯領導序列；內含子；聚腺苷酸化識別序列；RNA加工位點；效應子結合位點；以及莖環結構。
如本文所用，術語「多肽」包含單個多肽、多個多肽及其片段。該術語是指由醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)組成的分子。術語「多肽」是指兩個或更多個胺基酸的任何股(chain)或多股 (chains)，且不指產物的特定長度或大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白質、胺基酸鏈和用於指兩個或更多胺基酸的股(chain)或多股(chains)的任何其它術語，皆包含在「多肽」的定義內，且上述術語可與本文中的「多肽」互換使用。多肽可以從天然生物性來源分離或經由重組技術產生，但特定多肽不一定從特定核酸轉譯而來。多肽可以任何適當的方式產生，例如，包含但不限於經由化學合成。同樣，可以經由將以不同於相應的天然編碼序列的形式被引入生物體的天然編碼序列或其部分表達來產生多肽。
如本文所用，術語「異源性」是指在其參考(宿主)生物體中其位置通常不通常發現的多核苷酸、基因或多肽。例如，異源性核酸可是通常在不同基因組位置於參考生物體中發現的核酸。作為進一步的實例，異源性核酸可是通常不存在於參考生物體中的核酸。可經由將異源性多核苷酸、基因或多肽引入宿主生物體來產生包括異源性多核苷酸、基因或多肽的宿主生物體。在具體實例中，異源性多核苷酸包括天然編碼序列或其部分，其以不同於相應天然多核苷酸的形式重新引入源生物體。在具體實例中，異源性基因包括以不同於相應的天然基因的形式重新引入源生物體的天然編碼序列或其部分。例如，異源性基因可包含天然編碼序列，其是嵌合基因的一部分，該嵌合基因包含重新引入天然宿主的非天然調控區。在具體實例中，異源性多肽是以不同於相應天然多肽的形式重新引入源生物體的天然多肽。
異源性基因或多肽可以是包括編碼功能性多肽的功能性多肽或核酸序列的基因或多肽，該功能性多肽與另一基因或多肽融合，藉以產生嵌合或融合多肽，或編碼其的基因。特定實施例的基因和蛋白質包含這些序列的具體示例的全長序列和部分、片段(segments)、片段(fragments，包含連續片段和與全長分子相比的內部和/或末端缺失)、變體、突變體、嵌合體和融 合體。
如本文中所用，術語「核酸分子」係可指聚合物形式的核苷酸，其可包含RNA、cDNA、基因體DNA及合成形式之有義股及反義股兩者，及以上各物的混合聚合物。核苷酸係可指核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸之任一者的經修飾形式。如本文中所用之「核酸分子」係與「核酸」及「聚核苷酸」同義。前述術語係包含單股及雙股形式的DNA。核酸分子可包含自然存在的核苷酸以及藉由天然存在之核苷酸鍵及/或非天然存在之核苷酸鍵連接在一起的經修飾核苷酸中之任一者或兩者。
如熟習該項技術者應易於瞭解，核酸分子可經化學或生物化學修飾，或可含有非天然或衍生化核苷酸鹼基。舉例而言，這類修飾包含標記、甲基化、用類似物取代一或多個天然存在之核苷酸、核苷酸間修飾(例如，不帶電之連接的修飾：如甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等；帶電之連接的修飾：如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；側接部分的修飾：如胜肽；嵌入劑修飾：如吖啶、補骨脂素等；螯合劑修飾；烷基化劑；以及經修飾連接：如α變旋異構核酸(α異頭核酸，alpha anomeric nucleic acids)等)。術語「核酸分子」亦包含任何拓撲構形，包含單股、雙股、部分雙螺旋、三螺旋、髮夾形、環形及鎖式構形。
術語「序列」是指任何一系列核酸鹼基或胺基酸殘基，且可指或不可指編碼或表示基因或蛋白質的序列。本文使用的許多遺傳構建體是根據各種遺傳元件相互間的相對位置進行描述的。
如本文中所用，術語「植物」係包含整株植物以及植物之任何後代、細胞、組織或一部分。術語「植物部分」包含植物的任何部分，所述植物包含，例如，但不限於：種子(包含成熟種子、未成熟種子以及不含種皮的未成熟胚)；植物原生質體；植物切削；植物細胞；植物細胞培養：植物 器官(例如，包含但不限於莖、根、芽，果實、胚珠、雄蕊、葉、胚、分生組織部分、癒傷組織、配子體、孢子體、花粉、胚、小孢子、下胚軸、子葉、花、果實、花藥、萼片、花瓣、花粉、種子、相關外植體等)。植物組織或植物器官可為種子、植物癒合組織或組織成結構或功能單元之任何其他植物細胞群。植物細胞或組織培養物可能能夠再生一個具有獲得該細胞或組織之植物的生理及形態特徵的植物，且能夠再生一個具有與該植物實質上相同基因型之植物。相比之下，一些植物細胞不能夠再生來產生植物。植物細胞或組織培養物中之可再生細胞係可為胚芽、原生質體、分生細胞、植物癒合組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、穗絲、花、果仁、穗、穗軸、果殼或梗。
植物部分包括可收穫部分及適用於繁殖子代植物的部分。適用於繁殖的植物部分包含(例如)且不限於：種子；果實；插條；幼苗；塊莖；及根莖。植物之可收穫部分係可為植物之任何可用部分，包含(例如)且不限於：花；花粉；幼苗；塊莖；葉；莖；果實；種子；及根。
植物細胞係為植物之結構及生理單元。如本文所用的植物細胞包含原生質體以及具有細胞壁的原生質體。植物細胞係可呈經分離之單細胞或細胞聚集物(例如脆弱的植物癒合組織及經培養細胞)，且可為較高級的組織單元(例如植物組織、植物器官及植物)的一部分。因此，植物細胞係可為原生質體、配子產生細胞或可再生成整株植物之細胞或細胞集合。因此，包括多個植物細胞且能夠再生成整株植物的種子在本文實施例中係視為「植物部分」。
如本文中所使用，術語「啟動子」係指位於從轉錄開始之上游和/或下游的一區域或序列，且其涉及RNA聚合酶和其他蛋白質的識別和結合以啟動轉錄。啟動子允許其控制的基因的適當活化或抑制。啟動子可含有被轉 錄因子識別的特異性序列。這些因子可結合至一個啟動子DNA序列，導致RNA聚合酶(一種從基因的編碼區域合成RNA的酶)的添補。「組成性」啟動子為在多數生理學及發育條件下在多數組織中具有活性之啟動子。「誘導型」啟動子為生理學(例如藉由外部施加特定化合物)或以發育方式調控之啟動子。「組織特異性」啟動子僅在特定類型之組織或細胞中具有活性，而「組織較佳」啟動子為較佳(但非排他地)在特定組織或細胞中具有活性。「在植物或植物細胞中具有活性之啟動子」為有能力初始化植物細胞中之轉錄的啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子是用於本發明的方法，例如，花粉特異性啟動子。
術語「接近的(close to)」或「近鄰的(proximal)」當關於靶基因座或供體基因座的一元件相對於靶基因座或供體基因座之另一元件的位置時，後者例如為，用於標記基因或罕見的切割核酸酶或靶基因座或供體基因座的任何其他元件的稀有的切割核酸酶切割位點、同源區域、區域Z或表達盒，其是指不超過50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp或不超過10000bp的長度。
術語「表達盒」或「基因表達盒」-例如，當涉及用於位點特異性核酸酶的表達盒時，是指這些構建體中待表達的DNA是可操作地連接至至少一遺傳控制元件，其使其表達或調節其表達(即轉錄和/或轉譯)。在此，表達可以是，例如，穩定型的或瞬時型的、組成型的或誘導型的。此外，該術語是指可操作地連接到基因(例如轉基因)的啟動子，其進一步可操作地連接到3'-UTR終止序列。多個基因表達盒是可彼此堆疊。
如本文中所用，術語「可操作地連接」係關於當第一核酸序列與第二核酸序列係呈功能關係時，第一核酸序列係與第二核酸序列可操作地連 接。舉例而言，當啟動子影響編碼序列之轉錄或表達時，啟動子係與編碼序列可操作地連接。當以重組方式產生時，可操作地連接之核酸序列一般為鄰接的，且在必需接合兩個蛋白編碼區域時，位在同一個讀取框架中。然而，核酸序列無需是鄰接以便可操作地連接。
當用以參照調控序列與編碼序列時，術語「可操作地連接」係指該調控序列影響該所連結之編碼序列的表達。「調控序列」、「調控元件」或「控制元件」係指影響轉錄之時機與程度/數量、RNA處理或穩定性或是相關編碼序列之轉譯的核苷酸序列。調節序列可包括啟動子、轉譯領導序列、內含子、強化子、主幹-環圈結構、抑制物結合序列、終止序列、多腺苷酸化辨識序列等等。特定的調節序列可位於一與其可操作地連接的編碼序列的上游和/或下游。還有，可操作地連接至一編碼序列的一特定的調節序列可位於雙股核酸分子之相關連互補股鏈上。
當用於參照兩個或更多個胺基酸序列時，術語「可操作地連接」是指第一個胺基酸序列與至少一個其它胺基酸序列呈功能關係。
術語「整合DNA」或「整合供體DNA」是指插入到基因組內的DNA。在大多數實施例中，這種DNA在基因組內的併入是發生，使得經整合的DNA可以經由一般的細胞繁殖被傳遞給子代。該術語通常用於證實將外來或外源DNA成功靶向至生物體基因組的靶基因座。
如本文中所用，術語「表達」、「基因表達」係可互換使用且有關將核酸轉錄單元(包含(例如)基因組DNA或cDNA)之編碼資訊轉化成細胞之操作性、非操作性或結構部分的過程，其常包含蛋白質的合成。基因表現可受到外部信號影響；例如，細胞、組織或生物體暴露於增加或降低基因表現之試劑。亦可在由DNA到RNA到蛋白質之路徑中的任何位置來調控基因的表現。基因表現的調控係(例如)經由控制對轉錄、轉譯、RNA運輸及加 工的作用、諸如mRNA之中間分子的降解、或經由特異性蛋白分子在其已製得之後的活化、失活、隔室化或降解、或藉由其組合而發生。基因表現可藉由本領域中已知的任何方法在RNA層級或蛋白質層級進行量測，所述方法包括(但不限於)北方墨點法、RT-PCR、西方墨點法、或體外、原位或體內蛋白質活性分析。
術語「轉化(導入)(transform)」或「轉導(transduce)」是指將核酸分子轉移到細胞中的過程。當該核酸分子變成被該細胞穩定地複製時，將一核酸分子導入一細胞，該細胞係為「經轉化(transformed)」，無論是藉由將核酸分子併入細胞基因體中，或是藉由附加複製。如本文中所使用，術語「轉化(transformation)」係涵蓋可將核酸分子導入至這類細胞中之所有技術。實例包括但不限於：以病毒載體轉染；以質體載體轉化；電穿孔(Fromm等人.(1986)Nature 319：791-3)；脂質體轉染(Felgner等人.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7)；顯微注射(Mueller等人.(1978)Cell 15：579-85)；農桿菌(Agrobacterium)介導之轉移(Fraley等人.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)；直接DNA吸收；以及微粒轟擊(Klein等人.(1987)Nature 327：70)。
術語「標記(物)」是指存在或不存在向宿主細胞或生物體傳播可檢測表型的基因或序列。各種類型的標誌物包含(但不限於)選擇標記、篩選標記和分子標記。
術語「可選擇標記」是指作為基因的標記。這些基因可以被表達以傳遞使得生物體對特定環境條件具有抵抗性或易受特定環境條件影響的表型。篩選標記還可以傳遞易於觀察且可區分性狀的表型，如綠色螢光蛋白(GFP)、GUS或β-半乳糖苷酶。分子標記是，例如，可經由寡核苷酸探查能被唯一鑑別的序列特徵，例如RFLP(限制性片段長度多態性)或SSR標 記(簡單序列重複)。
術語「載體」或「質體」是指可以引入細胞的外源性的、自我複製的核酸分子，從而產生轉化的細胞。載體可包含允許其在宿主細胞中複製的核酸序列，諸如一複製起點。實例包含(但不限於)將外源性DNA攜載到細胞內的質體、黏質體、噬菌體或病毒。載體亦可包含一或多個基因、反義分子及/或選擇標誌物基因以及本領域中已知的其他遺傳元件。載體係可轉導、轉化或感染細胞，藉此使細胞表達出由該載體所編碼之核酸分子及/或蛋白質。載體可選擇性地包含協助實現核酸分子進入細胞的材料(例如微脂體(脂質體)、蛋白質編碼等等)。
術語「供體」或「供體構建體」是指作為官能團引入宿主細胞或生物體的整組DNA區段。
本文所用的術語「側接(flank)」或「旁側(側翼)(flanking)」表示在給定序列的任一側存在相同、相似或相關的序列。描述為「側翼」的片段不一定直接融合到它們側接的片段，因為在給定序列及其側翼序列之間可以存在其間的、非特定的DNA。用於描述相對位置的這些和其他術語根據遺傳學領域的一般接受用法來使用。
術語「切割」是指DNA分子的共價骨架的斷裂。可經由多種方法引發切割，包含(但不限於)磷酸二酯鍵的酶促或化學水解。單股(鏈)切割和雙股(鏈)切割都是可能的，且因為兩個不同的單股切割事件的結果可能導致雙股切割的發生。DNA切割可能導致鈍端或交錯端的產生。在某些實施例中，融合多肽用於靶向雙股DNA切割。
在同源染色體對之情形中，術語「同源」係指長度、基因位置及著絲點位置類似且在減數分裂期間排成行且形成突觸的來自個體的染色體對。在個體中，同源染色體對的一條染色體來自個體之母親(即「母源」)，而該 對之另一染色體來自父親(即「父源」)。在基因之情形中，術語「同源(性)」係指各基因存在於各同源染色體內的相同位置且具有相同功能的基因對。
術語「鋅指核酸酶」或「ZFN」是指包括至少一鋅指DNA結合結構域的嵌合蛋白質分子，其有效連接至至少一能夠切割DNA的核酸酶。通常，經由在靶基因座處的ZFN之切割而導致在該基因座處的雙股斷裂(DSB)。
術語「鋅指DNA結合蛋白」或「鋅指蛋白」為經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之一種蛋白質或一種較大蛋白質內的結構域的鋅指DNA結合蛋白、ZFP(或結合結構域)，前述一或多個鋅指係為該結合結構域內其結構經由鋅離子配位而被穩定化之胺基酸序列區域。術語鋅指DNA結合蛋白常常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。鋅指結合結構域可「經(工程)改造」以結合至一預定核苷酸序列。用於(工程)改造鋅指蛋白之方法的非限制性實例係經設計及選擇。所設計的鋅指蛋白為自然界中不存在的蛋白質，其設計/組成大體上由合理準則產生。設計之合理準則包含應用取代法則及電腦化算法以處理現有ZFP設計及結合資料之資料庫儲存資訊中的資訊。參見(例如)美國專利第6,140,081、6,453,242、6,534,261及6,785,613號；亦參見WO 98153058、WO 98153059、WO 98153060、WO 021016536及WO 031016496；以及美國專利第6,746,838、6,866,997及7,030,215號。
術語「靶」或「靶基因座」或「靶區」是指經由本發明的靶向基因組重組方法而選擇進行修飾的基因或DNA片段。通常，靶是宿主生物的內源基因、編碼區段、對照(控制)區域、內含子、外顯子或其部分。然而，靶可以是宿主DNA的任何部分或部分，包含整合在宿主DNA的細胞核、線粒體或葉綠體基因組內的外源序列。
術語「可生長發育的(viable)」是指能夠正常生長和發育的植物。
本文所用的術語「基因座」是指染色體或核酸分子上的特定物理位置。基因座的等位基因是位於同源染色體上的相同位點。如本文所用的「Loci(複數個「基因座」)」是指核酸分子上相同或不同染色體以及相同或不同特定物理位置上的特定物理位置。
術語「多個」以非限制性方式意指等於或大於1的任何整數。就此而言，這裡使用的術語「多個(plurality)」和「多個(a plurality)」可包含，例如，「單個」、「多個」或「一個或多個」。在整個說明書中可使用術語「多個(plurality)」或「多個(a plurality)」來描述一或多個組件、裝置、元件、單元、參數等。
術語「識別序列」是指由位點特異性核酸酶識別與結合的多核苷酸序列(內源或外源性的)。通常，這是在經由雙股斷裂誘導劑在植物細胞基因組中誘導雙股斷裂的基因組內的DNA序列。術語「識別序列」和「識別位點」在本文中可互換使用。
術語「雜交(crossing)」是指通過授粉使配子融合以產生後(子)代的行為。
術語「傳遞(transmitting)」是指所需轉基因經由兩個親本植物之間的性雜交向至少一後(子)代植物進行漸滲(introgression)或插入(insertion)，該親本植物中至少一者在其基因組內具有所需的等位基因。
術語「連接」、「緊密連接」和「非常緊密連接」是指基因或標記物間的連接，且更指染色體上的基因或標記物顯出在下一代可測量的被一同傳遞到個體的機率的現象。兩個基因或標記物彼此越接近，越接近(1)之這機率就越大。因此，術語「經連接的(linked)」可指一或多種與機率大 於0.5的基因一同傳遞的基因或標誌物(其被預期來自標記物/基因位於不同染色體上的獨立組合(assortment))。因為染色體上的兩個基因或標記物的接近程度直接關係到基因或標記物在下一代被一同傳遞給個體的機率，所以術語「經連接的(linked)」於本文中也可指一或多個基因或標誌物位於相同染色體上彼此約0.1Mb至約2.0Mb之間。因此，兩個「經連接的」基因或標記物可相隔約2.00Mb；約1.95Mb；約1.90Mb；約1.85Mb；約1.80Mb；約1.75Mb；約1.70Mb；約1.65Mb；約1.60Mb；約1.55Mb；約1.50Mb；約1.45Mb；約1.40Mb；約1.35Mb；約1.30Mb；約1.25Mb；約1.20Mb；約1.15Mb；約1.10Mb；約1.05Mb；約1.00Mb；約0.95Mb；約0.90Mb；約0.85Mb；約0.80Mb；約0.75Mb；約0.70Mb；約0.65Mb；約0.60Mb；約0.55Mb；約0.50Mb；約0.45Mb；約0.40Mb；約0.35Mb；約0.30Mb；約0.25Mb；約0.20Mb；約0.15Mb；約0.10Mb；約0.05Mb；約0.025Mb；約0.0125Mb；以及約0.01Mb。
術語「未連接」是指缺乏轉基因盒的物理連接，使得它們不在後(子)代中共分離(co-segregate)。
術語「同型結合的(純合的)(homozygous)」是指當在相應的染色體基因座具有一對相同的等位基因時，生物體被稱為同型結合的(純合的)。
術語「異型結合的(heterozygous)」是指當在相應染色體基因座具有一對不同等位基因時，生物體是異型結合的。
實施例
本發明關於在植物基因組靶基因座內插入供體DNA的方法。在一實施例中，該供體DNA最初整合在該植物基因組內，然後移動到特定植物基因組靶基因座中。在一些實施例中，提供含有基因組DNA的第一活體的 植物，其包含與多個識別序列和該植物基因組靶基因座側接的供體DNA，其中該植物基因組靶基因座還含有至少一識別序列。在一些實施例中，提供含有位點特異性核酸酶的第二活體植物。在一些實施例中，該第一與第案活體植物是經雜交已產生F1種子。在一些實施例中，表達該位點特異性核酸酶，且切割至少一位點特異性核酸酶識別序列，以釋放供體多核苷酸且在該植物基因組基因座內產生雙股斷裂。在一些實施例中，該供體DNA被整合至該植物基因組基因座內。在一些實施例中，該供體DNA經由非同源端連接機制整合在該植物基因組基因座內。
在一實施例中，該供體DNA是多核苷酸片段。這樣的多核苷酸片段含有去氧核糖核苷酸鹼基對。然而，在其他實施例中，該供體多核苷酸是含有核糖核苷酸鹼基對的供體RNA多核苷酸。在另一實施例中，該供體多核苷酸是雙股(鏈)或單股(鏈)的。雙股供體多核苷酸的末端是完全鈍的或包含突出的5'或3'突出端(即「黏性端」)。在隨後的實施例中，該供體多核苷酸片段不含有與植物基因組內的任何其它多核苷酸序列(即內源或外源序列)同源(即，超過12個相同鹼基對的序列)的區域。在一實施例中，該供體DNA是不將編碼序列編碼且不產生蛋白質的多核苷酸片段。在其他實施例中，該供體DNA是將開放閱讀框編碼但不被轉譯成功能性蛋白質(例如RNAi分子)的多核苷酸片段。在其他實施例中，該供體DNA是將可經由調控表達元件(例如啟動子、5'UTR、內含子、3'UTR等)轉譯成功能性蛋白質的開放閱讀框進行編碼的多核苷酸片段。由該供體DNA多核苷酸片段編碼的功能性蛋白質的非限制性實例包含：可選擇標記物、農藝性狀、除草劑耐受性性狀、抗蟲性狀等。在另一實施例中，該供體DNA多核苷酸片段將調控區或結構核酸進行編碼。該供體序列可以是任何長度，例如，長度在2至20,000個鹼基對之間(或在其之間或之上的任何整數值)。 如本發明所提供，該供體多核苷酸是穩定整合在植物的染色體內，然後隨後被釋放並被靶向至位於同一植物的染色體上的基因組基因座。
在一實施例中，本發明關於經工程改造而切割識別序列的位點特異性核酸酶。可將位點特異性核酸酶，例如ZFN、TALENs、大範圍核酸酶和/或CRISPR/CAS加以工程改造，以結合和切割於該靶基因座中的任何多核苷酸序列。
在一實施例中，該植物基因組靶基因座是該植物基因組內的基因組多核苷酸序列。在一些實施例中，該植物基因組靶基因座位於經由植物轉化(形)方法穩定整合在該植物基因組內的轉基因內。在其他實施例中，該植物基因組靶基因座是位於人工染色體內，該人工染色體是被預先插入植物細胞核內。在另一實施例中，該植物基因組靶基因座是位於天然或內源植物基因組內。這樣的植物基因組靶基因座可在該植物基因組的編碼序列內或在編碼序列側翼的調控元件中進行鑑別。在其他實施例中，可於該植物基因組的非編碼區內鑑別該植物基因組靶基因座。
根據本發明的一實施例，使用位點特異性核酸酶來切割基因組DNA。因此，前述切割引起靶基因組基因座中的雙股斷裂，藉以促進供體DNA(例如感興趣的核酸)的插入。例如可以根據美國專利6,453,242中揭露的方法，經由位點特異性核酸酶結合結構域之結合，來實現將植物靶基因座內的識別序列進行選擇或鑑別，其揭露內容被併入本文中，該專利亦揭露用於設計結合於所選識別序列之鋅指蛋白質(ZFPs)的方法。熟悉本技藝者應瞭解，亦可簡單目測核苷酸序列來選擇目標基因座(位點)。因此，本文所述之方法中可使用任何靶基因座(目標位點)之選擇方式。此外，識別序列可以由本領域具有通常知識者設計且整合在植物基因組內，這樣的識別序列可能期望用作靶向基因組基因座。
對於ZFP DNA結合結構域，識別序列通常由多個相鄰靶亞位點構成。靶亞位點係指核苷酸三聯體或核苷酸四聯體之序列，其可與經個別鋅指結合之相鄰四聯體重疊一個核苷酸。參見例如WO 02/077227，其揭示內容併入本文中。靶位點的長度一般為至少9個核苷酸，且因此經包含至少三個鋅指之鋅指結合域結合。然而，例如4-指結合結構域與12-核苷酸識別序列之結合、5-指結合結構域與15-核苷酸識別序列之結合或6-指結合結構域與18-核苷酸識別序列之結合亦可能。如將顯而易知，較大結合結構域(例如7-、8-、9-指及更高)與較長識別序列之結合亦符合本發明。
根據一個具體實施例例，識別序列不必為多個三核苷酸。在發生交叉股相互作用之情況中(參見例如美國專利6,453,242及WO 02/077227)，多指結合結構域之一或多個個別鋅指可結合於重疊四聯體亞位點。因此，三指蛋白質可結合10-核苷酸序列，其中第十核苷酸為經末端指結合之四聯體部分，四指蛋白質可結合13-核苷酸序列，其中第十三核苷酸為經末端指結合之四聯體部分等。
多指結合結構域中之個別鋅指之間的胺基酸連接子序列之長度及性質亦影響與目標(靶)序列之結合。舉例而言，多指結合結構域中之相鄰鋅指之間存在所謂「非典型連接子」、「長連接子」或「結構性連接子」而可允許該等指結合不緊鄰之亞位點。此類連接子之非限制性實例描述於例如美國專利第6,479,626號及WO 01/53480中。因此，鋅指結合結構域之識別序列中的一或多個亞位點可彼此相隔1、2、3、4、5個或更多個核苷酸。一個非限制性實例將為結合於13-核苷酸識別序列之四指結合結構域，該識別序列的序列中包含兩個連續3-核苷酸亞位點、一個插入核苷酸及兩個連續三聯體亞位點。
而從自然界中存在之蛋白質鑑別的DNA結合多肽通常結合於不連 續核苷酸序列或基元(例如共有識別序列)，本技藝中現有且已知用於修飾許多此類DNA結合多肽以識別不同核苷酸序列或基元之方法。DNA結合多肽包括(例如但不限於)：鋅指DNA結合結構域；白胺酸拉鏈；TALENS；CRIPSP-cas9；CRISPR-cpf1；UPA DNA結合結構域；GAL4；TAL；LexA；Tet抑制子；LacR；以及類固醇激素受體。
在一些實例中，DNA結合多肽為鋅指。個別鋅指基元可設計成目標且特異性結合於大範圍DNA位點中之任一者。典型Cys2His2(以及非典型Cys3His1)鋅指多肽藉由向目標DNA雙螺旋之大溝中插入α-螺旋來結合DNA。鋅指識別DNA為模塊，各指主要接觸靶(目標)中的三個連續鹼基對，且多肽中之幾個關鍵殘基介導識別。藉由在靶向核酸內切酶中納入多個鋅指DNA結合結構域，靶向核酸內切酶之DNA結合特異性可進一步提高(且因此由此帶來的任何基因調節作用的特異性亦可提高)。參見例如Urnov等人.(2005)Nature 435：646-51。因此，可工程改造且利用一或多個鋅指DNA結合多肽，使得引入至宿主細胞中之靶向核酸內切酶與宿主細胞之基因組內之單一DNA序列相互作用。優選地，該鋅指蛋白質是非天然存在的，因為其為經工程改造以結合所選擇的識別序列。參見例如Beerli等人.(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等人.(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等人.(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等人.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等人.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；美國專利第6,453,242號；第6,534,261號；第6,599,692號；第6,503,717號；第6,689,558號；第7,030,215號；第6,794,136號；第7,067,317號；第7,262,054號；第7,070,934號；第7,361,635號；第7,253,273；以及美國專利公開案第2005/0064474號；第2007/0218528號；第2005/0267061號，其均以全文引用之方式併入本文中。
經工程改造之鋅指結合域與天然存在的鋅指蛋白質相比可具有新穎結合特異性。工程改造方法包括(但不限於)合理設計及多種類型之選擇。合理設計包括例如使用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列及個別鋅指氨基酸序列之資料庫，其中各三聯體或四聯體核苷酸序列與結合特定三聯體或四聯體序列的鋅指的一或多個氨基酸序列關聯。參見例如共同擁有之美國專利第6,453,242及6,534,261號，其以全文引用的方式併入本文中。
或者，DNA結合域可來源於核酸酶。舉例而言，諸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII以及I-TevIII之歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的識別序列為已知的。亦參見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfort等人.(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等人.(1989)Gene 82：115-118；Perler等人.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人.(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人.(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs目錄。另外，歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的DNA結合特異性可經工程改造以結合非自然識別序列。參見例如Chevalier等人.(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等人.(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth等人.(2006)Nature 441：656-659；Paques等人.(2007)Current Gene Therapy 7：49-66；美國專利公開案第20070117128號。
作為另一替代，DNA結合結構域可來源於白胺酸拉鏈蛋白質。白胺酸拉鏈是許多真核調節蛋白中之蛋白質-蛋白質相互作用中涉及的一類蛋白質，該等真核調節蛋白為與基因表現有關之重要轉錄因子。白胺酸拉鏈係指此等跨越幾個界(包括動物、植物、酵母等)之轉錄因子中共用之通用結構基元。白胺酸拉鏈由兩個多肽(均二聚體或雜二聚體)以白胺酸殘基經α-螺旋均 勻間隔使得兩個多肽之白胺酸殘基在螺旋的同一面上結束的方式結合於特異性DNA序列形成。白胺酸拉鏈之DNA結合特異性可用於本文揭示之DNA結合域中。
於一些實例中，一或多種核酸酶之DNA結合結構域係包括自然存在或經工程改造(非自然存在)之TAL效應物DNA結合結構域。參見(例如)美國專利公開案第20110301073號，其係以全文引用方式併入本文中。已知黃單胞菌屬(Xanthomonas)之植物病原菌會在重要作物中引起許多疾病。黃單胞菌屬之病原性係視保守性III型分泌(T3S)系統而定，該系統將更多不同效應蛋白注入植物細胞中。這些注入的蛋白質當中包括轉錄活化因子樣(TALEN)效應物，其模擬植物轉錄活化因子並操控植物轉錄組(參見Kay等人，(2007)Science 318：648-651)。這些蛋白質含有DNA結合結構域及轉錄活化結構域。一種最充分表徵之TAL效應物為來自野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種(Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria)之AvrBs3(參見Bonas等人，(1989)Mol Gen Genet 218：127-136及WO2010079430)。TAL效應物含有一種由串聯重複序列構成的中心結構域，每個重複序列含有大約34個胺基酸，這些重複序列對於這些蛋白質之DNA結合特異性是關鍵的。另外，其含有一個核定位序列及一個酸性轉錄活化結構域(綜述參見Schornack S，等人，(2006)J Plant Physiol 163(3)：256-272)。另外，在植物病原性細菌青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)中已發現到兩個名為brg11與hpx17的基因是與青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)生物變種菌株GMI1000及生物變種4菌株RS1000中之黃單胞菌AvrBs3家族是同源的(參見Heuer等人，(2007)Appl and Enviro Micro 73(13)：4379-4384)。這些基因彼此之間的核苷酸序列有98.9%相同，差異在於hpx17的重複結構域中有1,575bp的缺失。然而，這兩種基因產物與黃單孢菌AvrBs3家族蛋白的序列一致性均小於40%。參見 例如美國專利公開案第20110301073號，其以全文引用的方式併入本文中。
此等TAL效應物之特異性係視串聯重複序列中所發現之序列而定。該重複序列係包括大致102bp且其彼此之間通常有91-100%的同源性(Bonas等人，同上)。重複序列的多形現象通常位於位置12及13處，且在位置12及13處之高變雙殘基的身分標識與TAL效應物目標序列中之連續核苷酸的身分標識之間似乎存在一對一的對應性(參見Moscou及Bogdanove,(2009)Science 326：1501及Boch等人，(2009)Science 326：1509-1512)。已用實驗方式測定這些TAL效應物之用於DNA識別之天然編碼，使得位置12及13處之HD序列結合至胞嘧啶(C)，NG結合至T，NI結合至A、C、G或T，NN結合至A或G，及ING結合至T。這些DNA結合性重複序列已被組配為具有新的重複序列組合與數目的蛋白質，並製造出能夠在植物細胞中與新序列相互作用且活化非內源性報告基因之表現的人工轉錄因子(Boch等人，同上)。經工程改造之TAL蛋白已被連接至FokI裂解半結構域，以產生在酵母報告測定(基於質體之目標)中展現出活性之TAL效應子結構域核酸酶融合物(TALEN)。
CRISPR(成簇的、規律間隔的短回文重複序列)叢集規律間隔短回文重複序列)/CAS(CRISPR相關的)核酸酶系統是近來經工程改造之基於可用于基因組工程改造的細菌系統之核酸酶系統。其係部分地基於許多細菌和古細菌之適應性免疫反應。當病毒或質體侵入細菌時，侵入者的DNA區段藉由「免疫」反應轉化成CRISPR RNA(crRNA)。此crRNA接著通過部分互補的區域與稱為tracrRNA之另一類型的RNA結合，以引導Cas9核酸酶至與目標DNA中之與crRNA同源之稱為「原型間隔子」的區域。Cas9在crRNA轉錄物內所含的20個核苷酸的引導序列所指定的位點處裂解DNA，以在DSB處產生鈍端。Cas9需要crRNA及tracrRNA以用於位點特異性DNA識 別及裂解。此系統現已經工程改造以使得crRNA及tracrRNA可組合成一個分子(「單引導RNA」)，且該單引導RNA之crRNA等效部分可經工程改造以引導Cas9核酸酶引導至任何所期望的序列(參見Jinek等人(2012)Science 337，第816頁-第821頁，Jinek等人，(2013),eLife 2：e00471，及David Segal,(2013)eLife 2：e00563)。在其他實例中，crRNA是與tracrRNA相關聯，以引導Cpf1核酸酶到與crRNA同源的區域而以交錯端切割DNA(參考Zetsche,Bernd，等人Cell 163.3(2015)：759-771.)因此，CRISPR/Cas系統可經工程改造以在基因組中之所期待的靶處形成雙股斷裂(DSB)，且經由修復抑制劑的使用而影響DSB的修復，從而增加容易出錯的修復。
在某些實施例中，位點特異性核酸酶蛋白可以是天然存在的位點特異性核酸酶蛋白的「功能性衍生物」。原生序列多肽之「功能衍生物」為具有與原生序列多肽相同之定性生物學特性的化合物。「功能衍生物」包括(但不限於)原生序列之片段及原生序列多肽及其片段之衍生物，限制條件為其具有與相應原生序列多肽相同之生物活性。本文涵蓋之生物活性為功能衍生物將DNA受質水解成片段之能力。術語「衍生物」涵蓋多肽之胺基酸序列變異體、共價修飾及其融合物。位點特異性核酸酶蛋白多肽或其片段之適合衍生物包括(但不限於)位點特異性核酸酶蛋白質或其片段之突變體、融合物、共價修飾。包含鋅指、talens(轉錄激活子樣效應因子核酸酶)、CRISPR cas9、CRISPR cpf1或其片段之衍生物的位點特異性核酸酶蛋白質以及位點特異性核酸酶蛋白或其片段的衍生物可自細胞獲得或化學合成或藉由組合此等兩個程序獲得。細胞可為天然產生位點特異性核酸酶蛋白質之細胞，或天然產生位點特異性核酸酶蛋白質且經基因工程改造以產生較高表現水平之內源性位點特異性核酸酶蛋白質或自外源引入之核酸產生位點特異性核酸酶蛋白質的細胞，該核酸編碼與內源性位點特異性核酸酶蛋白質相同或不同之位 點特異性核酸酶蛋白質。在一些情況中，細胞不會天然產生位點特異性核酸酶蛋白質且經基因工程改造產生位點特異性核酸酶蛋白質。經由將具有賦予該位點特異性核酸酶蛋白質功能性的其它結構域的該位點特異性核酸酶蛋白質共同表達，將該位點特異性核酸酶蛋白質配置在植物細胞中(例如guide RNA for CRISPR；wo forms of guide RNAs can be used to facilitate Cas-mediated genome cleavage as disclosed in Le Cong,F.，等人，(2013)Science 339(6121)：819-823.)。
在其他具體實施例中，DNA結合結構域可與裂解(核酸酶)結構域關聯。舉例而言，歸巢核酸內切酶的DNA結合特異性可經修飾，同時保留核酸酶功能。另外，鋅指蛋白質亦可融合至裂解結構域形成鋅指核酸酶(ZFN)。本文所揭示之融合蛋白的裂解結構域部分可自任何核酸內切酶或核酸外切酶獲得。可以衍生出裂解結構域之例示性核酸內切酶包括(但不限於)限制性核酸內切酶及歸巢核酸內切酶。參見例如2002-2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；及Belfort等人.(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。已知裂解DNA之額外酶(例如S1核酸酶；綠豆核酸酶；胰臟DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸內切酶；亦參見Linn等人.(編)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。已知包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII以及I-TevIII之歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的非限制性實例。亦參見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfort等人.(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等人.(1989)Gene 82：115-118；Perler等人.(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人.(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人.(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs目錄。此等酶(或其功能片段)中之一或多者可用作裂解結構域及裂解半結構域之來源。
限制性核酸內切酶(限制酶)存在於許多物種中且能夠序列特異性結合於DNA(在識別位點)，且在結合位點處或結合位點附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在從識別位點移除之位點處裂解DNA且具有可分離結合及裂解結構域。舉例而言，IIS型酶FokI催化DNA之雙股裂解，在一股上距離其識別位點9個核苷酸處且在另一股上距離其識別位點13個核苷酸處。參見例如美國專利第5,356,802號；美國專利第5,436,150號以及美國專利第5,487,994號；以及Li等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768；Kim等人.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等人.(1994b)J.Biol.Chem.269：31,978-31,982。因此，在一個具體例中，融合蛋白包含來自至少一種IIS型限制酶之裂解結構域(或裂解半結構域)及一或多個鋅指結合域，其可經或未經工程改造。
裂解結構域可與結合域分離之例示性IIS型限制酶為FokI。此特定酶呈二聚體時有活性。Bitinaite等人.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10,570-10,575。因此，出於本發明之目的，用於所揭示之融合蛋白中的FokI酶部分視為裂解半結構域。因此，對於使用鋅指-FokI融合物的靶向雙股裂解及/或細胞序列靶向置換，可使用各自包含FokI裂解半結構域之兩個融合蛋白來復原催化活性裂解結構域。或者，亦可使用含有鋅指結合域及兩個FokI裂解半結構域之單個多肽分子。使用鋅指-FokI融合物之靶向裂解及靶向序列改變的參數提供於本發明之別處。
裂解結構域或裂解半結構域可為保留裂解活性或保留多聚(例如二聚)形成功能裂解結構域之能力的任何蛋白質部分。例示性IIS型限制酶描述 於國際公開案WO 2007/014275中，其以全文引用之方式併入本文中。
為了提高裂解特異性，裂解結構域亦可經修飾。在某些具體例中，採用裂解半結構域之變異體，此等變異體使裂解半結構域之均二聚降至最低且防止裂解半結構域之均二聚。此類經修飾之裂解半結構域的非限制性實例詳細描述於WO 2007/014275中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，裂解結構域包含使均二聚降至最低或防止均二聚的經工程改造之裂解半結構域(亦稱為二聚結構域突變體)。此類具體例為熟悉本技藝者已知且描述於例如美國專利公開案第20050064474號；第20060188987號；第20070305346號以及第20080131962號中，其全部揭示內容均以全文引用之方式併入本文中。FokI之位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537及538處的胺基酸殘基為影響FokI裂解半結構域之二聚的全部目標。
形成絕對雜二聚體之FokI的額外經工程改造之裂解半結構域亦可用於本文所述之ZFN中。形成絕對雜二聚體之Fok I之例示性經工程改造之裂解半結構域包括第一裂解半結構域在Fok I之胺基酸殘基位置490及538處包括突變且第二裂解半結構域在胺基酸殘基486及499處包括突變的對。在一實施例中，490處之突變用Lys(K)置換Glu(E)；538處之突變用Lys(K)置換Iso(I)；486處之突變用Glu(E)置換Gln(Q)；以及位置499處之突變用Lys(K)置換Iso(I)。特定言之，本文所述之經工程改造之裂解半結構域藉由在一個裂解半結構域中使位置490(E→K)及538(I→K)突變以產生命名為「E490K：I538K」的經工程改造之裂解半結構域且藉由在另一裂解半結構域中使位置486(Q→E)及499(I→L)突變以產生命名為「Q486E：I499L」的經工程改造之裂解半結構域來製備。本文所述之經工程改造之裂解半結構域為絕對雜二聚體突變體，其中異常裂解降至最低或消除。參見例如美國專利公開 案第2008/0131962號，其揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，經工程改造之裂解半結構域在位置486、499及496(相對於野生型FokI編號)處包含突變，例如將位置486處之野生型Gln(Q)殘基置換為Glu(E)殘基，位置499處之野生型Iso(I)殘基置換為Leu(L)殘基且位置496處之野生型Asn(N)殘基置換為Asp(D)或Glu(E)殘基的突變(分別亦稱為「ELD」及「ELE」結構域)。在其他實施例中，經工程改造之裂解半結構域在位置490、538及537(相對於野生型FokI編號)處包含突變，例如將位置490處之野生型Glu(E)殘基置換為Lys(K)殘基，位置538處之野生型Iso(I)殘基置換為Lys(K)殘基且位置537處之野生型His(H)殘基置換為Lys(K)或Arg(R)殘基的突變(分別亦稱為「KKK」及「KKR」結構域)。在其他實施例中，經工程改造之裂解半結構域在位置490及537(相對於野生型FokI編號)處包含突變，例如將位置490處之野生型Glu(E)殘基置換為Lys(K)殘基且位置537處之野生型His(H)殘基置換為Lys(K)或Arg(R)殘基的突變(分別亦稱為「KIK」及「KIR」結構域)。(參見美國專利公開案第20110201055號)。在其他實施例中，經工程改造之裂解半結構域包含「Sharkey」及/或「Sharkey'」突變(參見Guo等人，(2010)J.Mol.Biol.400(1)：96-107)。
本文所述之經工程改造之裂解半結構域可使用任何適合方法製備，例如藉由美國專利公開案第20050064474號；第20080131962號；以及第20110201055號中所述之野生型裂解半結構域(Fok I)之定點突變誘發製備。或者，核酸酶可在核酸識別序列處使用所謂「分裂酶」技術於活體內裝配(參見例如美國專利公開案第20090068164號)。此類分裂酶之組分可在各別表現構建體上表現，或可在一個開放閱讀框架中連接，其中個別組分例如藉由自裂解2A肽或IRES序列來分離。組分可為個別鋅指結合結構域或大範圍核酸 酶核酸結合結構域之結構域。
核酸酶可在使用之前，例如在如WO 2009/042163及20090068164中所述之基於酵母之染色體系統中針對活性進行篩選。核酸酶表現構建體使用本技藝中已知之方法容易設計。參見例如美國專利公開案20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；以及國際公開案WO 07/014275。核酸酶可在組成性啟動子或誘導型啟動子(例如在棉子糖及/或半乳糖存在下活化(去抑制)且在葡萄糖存在下抑制之半乳糖激酶啟動子)控制下表現。
識別序列之間的距離係指如自彼此最接近的序列的邊緣所量測兩個識別序列之間插入的核苷酸數或核苷酸對數。在裂解取決於兩個鋅指結構域/裂解半結構域融合分子與相隔(個別)識別序列之結合的某些實施例中，兩個識別序列可在相對DNA股上。在其他實施例中，兩個識別序列都在相同的DNA股上。對於最佳基因組基因座中之靶向整合，一或多個ZFPs經工程改造以結合於預定裂解位點處或其附近之識別序列，且包括經工程改造之DNA結合結構域及裂解結構域的融合蛋白在細胞中表現。融合蛋白之鋅指部分與識別序列結合時，DNA在識別序列附近藉由裂解結構域，較佳經雙股斷裂而裂解。
在最佳基因組基因座中存在雙股斷裂有助於經由NHEJ整合外源序列。在一些例子中，在最佳基因組基因座中雙股斷裂的存在是有助於經由NHEJ和HDR的組合來整合外源序列。因此，在一實施例中，包括要插入之靶向基因組基因座的供體DNA的多核苷酸將不包含與該靶向基因組基因座同源的區域。在供體DNA和靶向基因組基因座之間跨越12個鹼基對的多個相同序列的多核苷酸片段被認為是用於此目的的同源區域。
在一些例子中，將多個位點特異性核酸酶蛋白質的部署提供給植物 細胞。在一實施例中，可向植物細胞提供兩個位點特異性核酸酶蛋白質，其中每一位點特異性核酸酶在基因組的獨特位置進行切割。在一實施例中，可向植物細胞提供三個位點特異性核酸酶蛋白質，其中每一位點特異性核酸酶在基因組的獨特位置進行切割。在一實施例中，可向植物細胞提供四個位點特異性核酸酶蛋白質，其中每一位點特異性核酸酶在基因組的獨特位置進行切割。在一實施例中，可向植物細胞提供五個位點特異性核酸酶蛋白質，其中每一位點特異性核酸酶在基因組的獨特位置進行切割。在一實施例中，可向植物細胞提供六個或以上之位點特異性核酸酶蛋白質，其中每一位點特異性核酸酶在基因組的獨特位置進行切割。使用多個位點特異性核酸酶蛋白質的這種使用將適用於本領域具有通常知識者
根據本發明，可使用將多核苷酸供體序列和核酸酶序列作為DNA構建體(例如，基因表達盒)引入宿主細胞的任何公知方法。這些包含使用磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、PEG、電穿孔、超聲波方法(例如，聲孔效應(sonoporation))、脂質體、顯微注射、裸DNA、質粒載體、病毒載體、附加型的(episomal)和整合型的(integrative)等兩者以及任何將經複製的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外來遺傳物質引入宿主細胞的其他公知方法(參考例如Sambrook等人，supra)。需使用特定的核酸插入程序才能成功地將至少一種基因引入能夠表達所選蛋白質的宿主細胞中。
如上所述，DNA構建體可藉由各種常規技術而被引入所需植物物種的基因組中。對於這樣技術的回顧，請參考，例如：Weissbach & Weissbach用於植物分子生物學的方法(1988,Academic Press,N.Y.)Section VIII,pp.421-463；以及Grierson & Corey，植物分子生物學(1988,2d Ed.),Blackie,London,Ch.7-9。藉由用碳化矽纖維的攪拌，可以使用諸如植物細胞原生質體的電穿 孔和顯微注射技術將DNA構建體直接引入植物細胞的基因組DNA中(參見，(例如)美國專利第5,302,523及5,464,765號)，或者DNA構建體可使用諸如DNA粒子轟擊之基因槍方法而直接引入到植物組織(參見，(例如)Klein等人(1987)Nature 327：70-73)。或者，DNA構建體可經由奈米粒子轉化而引入至植物細胞中(參見，(例如)美國專利公開案第20090104700號，其係以全文引用方式併入本文中)。或者，DNA構建體可與適合的T-DNA邊界/側翼區域組合且被常規的根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主載體引入。根癌土壤桿菌介導的轉化技術，包含御甲(disarming，解除)及使用二元載體，其在科學文獻中有詳加的描述。參見例如Horsch等人.(1984)Science 233：496-498,and Fraley等人(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 80：4803.
另外，基因傳遞(轉移)可使用非土壤桿菌(Agrobacterium)細菌或病毒來達成，諸如根瘤菌(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、馬鈴薯病毒X、花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)及木薯脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)及/或菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus)，參見(例如)Chung等人(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。當細胞被使用二元T DNA載體(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12：8711-8721)或共同培養程序(Horsch et al.(1985)Science 227：1229-1231)之細菌感染時，根癌土壤桿菌宿主之毒力功能將引導包含構建體與相鄰標記物之T-股插入植物細胞DNA。一般來說，土壤桿菌轉化系統用於將單子葉植物工程改造(Bevan等人(1982)Ann.Rev.Genet.16：357-384；Rogers等人(1986)Methods Enzymol.118：627-641)。土壤桿菌轉化系統亦可用以將DNA轉化以及傳遞(轉移)至單子葉植物和植物細胞。參見美國專利第5,591,616號；Hernalsteen等人(1984)EMBO J 3：3039-3041；Hooykass-Van Slogteren等人(1984)Nature 311：763-764；Grimsley等人(1987)Nature 325：1677-179；Boulton等人(1989)Plant Mol.Biol.12：31-40；以及Gould等人(1991)Plant Physiol.95：426-434。
其他的基因轉移和轉化方法包含(但不限於)經由鈣-、聚乙二醇(PEG)-或電穿孔介導的裸DNA的攝入的原生質體轉化(see Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722,Potrykus等人(1985)Molec.Gen.Genet.199：169-177；Fromm等人(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：5824-5828；以及Shimamoto(1989)Nature 338：274-276)以及electroporation of plant tissues(D'Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505)。植物細胞轉化的其他方法包含顯微注射、碳化矽介導的DNA攝入(Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reporter 9：415-418)，以及microprojectile bombardment(參見Klein等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：4305-4309；以及Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell 2：603-618)。
在具體實施例中，供體DNA在細胞學期間被整合到基因組靶基因座內。細胞分裂週期通常由四個不同的階段組成，在典型的體細胞中需18-24小時完成。S期代表染色體DNA複製的階段，然後是間(隔)期(G2)，其中細胞準備在M期期間在子細胞之間分離染色體。在M期完成後，細胞進入第二次間期，G1，其將M期從S期分離。G1是細胞期，其中細胞決定繼續分裂或退出細胞週期。
在一些實施例中，可經由將細胞停滯在細胞週期的間期2(G2)和/或經由激活參與非同源末端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達來增強重組的頻率。在一些實施例中，可經由將細胞停滯在細胞週期的間期2(G2)和/或經由激活參與非同源末端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達和/或經由抑制參與同源重組的蛋白質的表達或活性來增 強重組的頻率。
在一些實施例中，可經由將細胞停滯在細胞週期的間期1(G1)和/或經由激活參與非同源末端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達來增強重組的頻率。在一些實施例中，可經由將細胞停滯在細胞週期的間期1(G1)和/或經由激活參與非同源末端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達以及/或經由抑制參與同源重組的蛋白質的表達或活性來增強重組的頻率。
在一些實施例中，經由將細胞停滯在細胞週期的DNA合成期(S期)和/或經由激活參與非同源末端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達來增強重組的頻率。在一些實施例中，經由將細胞停滯在細胞週期的DNA合成期(S期)和/或經由激活參與非同源末端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達和/或經由抑制參與同源重組的蛋白質的表達或活性來增強重組的頻率。
在一些實施例中，可經由將細胞停滯在細胞週期的有絲分裂(M)期和/或經由激活參與非同源端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達來增強重組的頻率。在其他實施例中，可經由將細胞停滯在細胞週期的有絲分裂(M)期和/或經由激活參與非同源末端連接重組的一或多個分子(蛋白質、RNA)的表達和/或經由抑制參與同源重組的蛋白質的表達或活性來增強重組的頻率。
在其他實施例中，性狀可包含轉(殖)基因性狀。適用於本發明所揭示之構建體之轉基因性狀包含(但不限於)賦予以下之編碼序列：(1)對害蟲或疾病之抗性；(2)對除草劑之耐受性；(3)增加價值之農藝性狀，諸如產量提高、氮利用效率、水使用效率及營養品質；(4)蛋白質與DNA以位點特異性方式結合；(5)小RNA之表現；以及(6)選擇標記物。根據一實施例，轉基因 編碼賦予殺昆蟲抗性、除草劑耐受性、小RNA表現、氮使用效率、水使用效率或營養品質之選擇標記物或基因產物。
1.昆蟲抗性
多種昆蟲抗性編碼序列為轉基因性狀之具體例。例示性昆蟲抗性編碼序列為此項技術中已知的。作為可操作地連接於本發明之調控組件的昆蟲抗性編碼序列的具體例，提供以下性狀。提供例示性鱗翅目昆蟲抗性之編碼序列包括：cry1A；cry1A.105；cry1Ab；cry1Ab(截短型)；cry1Ab-Ac(融合蛋白)；cry1Ac(以Widestrike®進行銷售)；cry1C；cry1F(以Widestrike®進行銷售)；cry1Fa2；cry2Ab2；cry2Ae；cry9C；mocry1F；pinII(蛋白酶抑制劑蛋白質)；vip3A(a)；以及vip3Aa20。提供例示性鞘翅目昆蟲抗性之編碼序列包含：cry34Ab1(以Herculex®進行銷售)；cry35Ab1(以Herculex®進行銷售)；cry3A；cry3Bb1；dvsnf7；以及mcry3A。提供例示性多昆蟲抗性之編碼序列包含ecry31.Ab。以上昆蟲抗性基因清單不意欲是限制性的。任何昆蟲抗性基因均為本發明所涵蓋。
2.除草劑耐受性
多種除草劑耐受性編碼序列為轉基因性狀之實施例。例示性除草劑耐受性編碼序列為此項技術中已知的。提供以下性狀作為可操作地連接至本發明之調控組件的除草劑耐受性編碼序列之實施例。草甘膦除草劑含有藉由抑制EPSPS酶(5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶)之作用模式。此酶涉及於植物生長及發育必需的芳族胺基酸的生物合成中。可用於抑制此酶之各種酶機制為本技藝中已知的。編碼此類酶之基因可操作地連接至本發明之基因調控組件。在一實施例中，選擇標記物基因包含(但不限於)編碼草甘膦抗性基因之基因包含：突變型EPSPS基因，諸如2mEPSPS基因、cp4 EPSPS基因、mEPSPS基因、dgt-28基因；aroA基因；及草甘膦降解基因，諸如草甘 膦乙醯轉移酶基因(gat)及草甘膦氧化酶基因(gox)。此等性狀目前以Gly-TolTM、Optimum®、GAT®、Agrisure® GT及Roundup Ready®進行銷售。草銨膦(glufosinate)及/或畢拉草(bialaphos)化合物之抗性基因包含dsm-2、bar及pat基因。bar及pat性狀目前以LibertyLink®進行銷售。包含在內的還有提供對2,4-D之抗性的耐受性基因，諸如aad-1基因(應注意aad-1基因對於芳氧基苯氧基丙酸酯除草劑具有進一步活性)及aad-12基因(應注意aad-12基因對於吡啶氧基乙酸酯合成植物生長素具有進一步活性)。此類性狀以Enlist®作物保護技術進行銷售。ALS抑制劑(磺醯脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基硫代苯甲酸酯及磺醯基胺基-羰基-三唑啉酮)之抗性基因為此項技術中已知的。此等抗性基因最常由ALS編碼基因序列之點突變引起。其他ALS抑制劑抗性基因包含hra基因、csr1-2基因、Sr-HrA基因及surB基因。一些性狀以商標Clearfield®進行銷售。抑制HPPD之除草劑包括吡唑啉酮，諸如苄草唑(pyrazoxyfen)、吡草酮(benzofenap)及苯吡唑草酮(topramezone)；三酮，諸如甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、環磺酮(tembotrione)、苯并雙環酮(benzobicyclon)；及二酮腈，諸如異噁唑草酮(isoxaflutole)。此等例示性HPPD除草劑可被已知性狀所忍受。HPPD抑制劑之實例包含hppdPF_W336基因(關於對異噁唑草酮之抗性)及avhppd-03基因(關於對甲基磺草酮之抗性)。苯腈除草劑耐受性狀之實例包含bxn基因，其已顯示出賦予對除草劑/抗生素溴苯腈(bromoxynil)之抗性。汰克草(dicamba)之抗性基因包含如國際PCT公開案第WO 2008/105890號中所揭示之汰克草單氧化酶基因(dmo)。PPO或PROTOX抑制劑類型的除草劑(例如，三氟羧草醚(acifluorfen)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟丙草酯(flupropazil)、環戊噁草酮(pentoxazone)、唑草酮(carfentrazone)、異丙吡草酯(fluazolate)、吡草醚(pyraflufen)、苯草醚(aclonifen)、草芬定(azafenidin)、丙炔氟草胺 (flumioxazin)、氟烯草酸(flumiclorac)、必芬諾(bifenox)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、乳氟禾草靈(lactofen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)及甲磺草胺(sulfentrazone))之抗性基因為此項技術中已知的。賦予對PPO之抗性的例示性基因包含野生型阿拉伯芥PPO酶之過度表現(Lermontova I與Grimm B,(2000)Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen.Plant Physiol 122：75--83.)、枯草桿菌(B.subtilis)PPO基因(Li,X.and Nicholl D.2005.Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops.Pest Manag.Sci.61：277-285 and Choi KW,Han O,Lee HJ,Yun YC,Moon YH,Kim MK,Kuk YI,Han SU and Guh JO,(1998)Generation of resistance to the diphenyl ether herbicide,oxyfluorfen,via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants.Biosci Biotechnol Biochem 62：558--560.)。吡啶氧基或苯氧基丙酸及環己酮之抗性基因包含ACC酶抑制劑編碼基因(例如Acc1-S1、Acc1-S2及Acc1-S3)。賦予對環己二酮及/或芳氧基苯氧基丙酸之抗性的例示性基因包含精吡氟氯禾靈(haloxyfop)、禾草靈(diclofop)、精噁唑禾草靈酸(fenoxyprop)、吡氟禾草靈(fluazifop)及喹禾靈(quizalofop)。最後，可抑制光合作用之除草劑(包含三嗪或苯甲腈)係藉由psbA基因(對三嗪之耐受性)、1s+基因(對三嗪之耐受性)及腈水解酶基因(對苯甲腈之耐受性)而提供耐受性。上列除草劑耐受性基因清單並不意欲為限制性的。任何除草劑耐受性基因係皆為本發明所涵蓋。
3.農藝性狀
多種農藝性狀編碼序列為轉殖基因性狀之具體例。例示性農藝性狀編碼序列為本技藝中已知的。提供以下性狀作為可操作地連接於本發明之調控組件的農藝性狀編碼序列的實施例。如由pg基因提供之延遲果實軟化抑 制造成細胞壁中果膠分子斷裂之聚半乳糖醛酸酶的生成，且因此造成果實延遲軟化。再者，acc基因之延遲果實熟化/老化用於抑制天然acc合成酶基因的正常表現，從而導致乙烯減少生成及果實熟化延遲。然而，accd基因使果實熟化激素乙烯之前驅物代謝，從而導致果實熟化延遲。或者，sam-k基因藉由減少生成乙烯之反應物S-腺苷甲硫胺酸(SAM)而造成熟化延遲。如由cspB基因提供之乾旱壓力耐受性表現型係藉由保留RNA穩定性及轉譯而在水壓力條件下維持正常的細胞功能。另一實例包含催化該賦予水壓力耐受性之滲透保護化合物甘胺酸甜菜鹼產生的EcBetA基因。此外，RmBetA基因催化該賦予水壓力耐受性之滲透保護化合物甘胺酸甜菜鹼的產生。藉由將與一或多種內源性轉錄因子相互作用以調控植物之日/夜生理過程的蛋白質表達之bbx32基因來提供光合作用及產率的提高。可藉由編碼熱穩定α-澱粉酶之amy797E基因的表達來增加乙醇的生成，該酶藉由增加降解澱粉時所用之澱粉酶的熱穩定性而提高生物乙醇的生成。最後，可藉由編碼二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)酯合成酶之cordapA基因的表現來產生經修飾之胺基酸組成物，而該酶增加了胺基酸離胺酸的生成。上列農藝性狀編碼序列列表並不意欲為限制性的。任何農藝性狀編碼序列皆為本發明所涵蓋。
4.DNA結合蛋白
多種DNA結合蛋白編碼序列為轉基因性狀之具體例。例示性DNA結合蛋白編碼序列為本技藝中已知的。作為可操作地連接於本發明之調控組件之DNA結合蛋白編碼序列的實施例，可包含以下類型的DNA結合蛋白：鋅指、Talens、CRISPRS及大範圍核酸酶。上列DNA結合蛋白編碼序列列表並不意欲為限制性的。任何DNA結合蛋白編碼序列皆為本發明所涵蓋。
5.小RNA
多種小RNAs為轉基因性狀之具體例。例示性小RNA性狀為本技 藝中已知的。提供以下性狀作為可操作地連接至本發明之調控組件的小RNA編碼序列的實施例。舉例而言，延遲果實熟化/老化之抗efe小RNA經由編碼乙烯形成酶之ACO基因的沉默來抑制乙烯生成而延遲熟化。改變木質素生成之ccomt小RNA藉由抑制內源性S-腺苷-L-甲硫胺酸：反式咖啡醯基CoA 3-O-甲基轉移酶(CCOMT基因)而減少愈創木基(G)木質素之含量。再者，野生種馬鈴薯(Solanum verrucosum)中之黑斑傷痕耐受性可藉由Ppo5小RNA觸發Ppo5轉錄體降解以阻斷黑斑傷痕出現而減少。包含在內的還有與含有西方玉米根蟲Snf7基因之240bp片段的dsRNA一起抑制西方玉米根蟲之dvsnf7小RNA。改質澱粉/碳水化合物可由諸如pPhL小RNA(降解PhL轉錄體以限制經由澱粉降解形成還原糖)及pR1小RNA(降解R1轉錄體以限制經由澱粉降解形成還原糖)之小RNA而產生。此外，由觸發Asn1降解以削弱天冬醯胺形成及減少聚丙烯醯胺之asn1小RNA產生諸如丙烯醯胺減少之益處。最後，pgas ppo抑制小RNA之非褐變表現型抑制PPO，從而產生具有非褐變表現型的蘋果。上列小RNA清單並不意欲為限制性的。任何小RNA編碼序列皆為本發明所涵蓋。
6.選擇標記物
亦描述為報告基因之多種選擇標記物為轉基因性狀之實施例。有許多方法可用於確認選擇標記物在經轉化植物中的表現，包含(例如)DNA定序及PCR(聚合酶鏈鎖反應)、南方墨點法、RNA墨點法、用於偵測由載體表現之蛋白質的免疫方法。但是，報告基因通常係經由目視觀察在表現時會產生有色產物之蛋白質來進行觀察。例示性報告基因在本技藝中是已知的，其編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP、Phi-YFP)、紅色螢光蛋白(DsRFP、RFP等)、β-半乳糖苷酶及其類似物(參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其內容係以全文引用的方式併入本文中)。
選擇標記物基因係用於篩選經轉化的細胞或組織。選擇標記物基因包括編碼抗生素抗性之基因，諸如編碼新黴素磷酸轉移酶II(NEO)、大觀黴素/鏈黴素抗性(AAD)及潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HGR)之基因以及賦予對除草化合物之抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼對除草劑不敏感的經修飾目標蛋白或在除草劑可起作用之前使其在植物中降解或脫毒之酶。舉例而言，已經藉由使用編碼突變型目標酶5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)之基因而獲得對於草甘膦的抗性。EPSPS之基因及突變體為所熟知的，且進一步描述於下文中。已經藉由使用編碼PAT或DSM-2、腈水解酶、AAD-1或AAD-12(其各自為使其各自的除草劑脫毒之蛋白質的實例)之細菌基因而獲得對於草銨膦、溴苯腈及2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)之抗性。
在一實施例中，除草劑可抑制生長點或分生組織，包括咪唑啉酮或磺醯脲，且此等除草劑之乙醯羥基酸合成酶(AHAS)及乙醯乳酸合成酶(ALS)的抗性/耐受性基因是所熟知的。草甘膦抗性基因分別包含突變的5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)及dgt-28基因(經由導入重組核酸及/或天然EPSPs基因之各種形式的體內突變誘發)、aroA基因及草甘膦乙醯基轉移酶(GAT)基因。其他膦醯基化合物之抗性基因包含來自於鏈黴菌屬(包含吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)及綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridichromogenes))之bar及pat基因，及吡啶氧基或苯氧基丙酸及環己酮(ACC酶抑制劑編碼基因)。賦予對環己二酮及/或芳氧基苯氧基丙酸(包含精吡氟氯禾靈、禾草靈、精噁唑禾草靈酸、吡氟禾草靈、喹禾靈)之抗性的例示性基因包含乙醯輔酶A羧化酶(ACC酶)之基因；Acc1-S1、Acc1-S2及Acc1-S3。在一實施例中，除草劑可抑制光合作用，包含三嗪(psbA及1s+基因)或 苯甲腈(腈水解酶基因)。再者，此類選擇標記物可包括陽性選擇標記物(諸如磷酸甘露糖異構酶(PMI))。
在一實施例中，選擇標記物基因包括(但不限於)編碼以下之基因：2,4-D；新黴素磷酸轉移酶II；氰胺水合酶；天冬胺酸激酶；二氫吡啶二羧酸酯合成酶；色胺酸脫羧酶；二氫吡啶二羧酸酯合成酶及脫敏的天冬胺酸激酶；bar基因；色胺酸脫羧酶；新黴素磷酸轉移酶(NEO)；潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HYG)；二氫葉酸還原酶(DHFR)；草丁膦乙醯轉移酶；2,2-二氯丙酸去鹵酶；乙醯羥基酸合成酶；5-烯醇丙酮醯莽草酸-磷酸合成酶(aroA)；鹵芳基腈水解酶；乙醯輔酶A羧化酶；二氫葉酸合成酶(sul I)；及32kD的光反應系統II多肽(psbA)。實施例亦包含編碼對以下各物之抗性的選擇標記物基因：氯黴素；甲胺喋呤；潮黴素；大觀黴素；溴苯腈；草甘膦；及草丁膦。上列選擇標記物基因列表並不意欲為限制性的。任何報告基因或選擇標記物基因皆為本發明所涵蓋。
在一些實施例中，編碼序列經合成以便在植物中有最佳的表現。例如，在一個實施例中，基因之編碼序列已藉由密碼子優化而經修飾，以增強在植物中的表現。殺蟲劑抗性轉基因、除草劑耐受性轉基因、氮利用效率轉基因、水分使用效率轉基因、營養品質轉基因、DNA結合轉基因或選擇標記物轉基因可經優化以在特定植物品種中表現，或替代性地可經修飾以便在雙子葉或單子葉植物中有最佳的表現。植物較佳密碼子可自所關注的特定植物品種中有最大表現量的蛋白質中所出現頻率最高的密碼子來判定。在一個具體例中，編碼序列、基因或轉基因經設計在植物中以更高的程度來表現，從而產生更高的轉化效率。對於植物基因優化的方法是所熟知的。關於合成DNA序列之優化及生成的指導可見於(例如)WO2013016546、WO2011146524、WO1997013402、美國專利第6166302號及美國專利第 5380831號，其係以引用方式併入本文中。
在其他實施例中，性狀可包括非轉基因性狀，諸如原生性狀或內源性性狀。例示性原生性狀可包括產量性狀、疾病抗性性狀、害蟲抗性性狀、除草劑耐受性的耐受能力性狀、生長性狀、尺寸性狀、生物質生產率性狀、產生種子的量的性狀、鹽度抗性性狀、熱應激抗性性狀、冷應激抗性性狀、乾旱應激抗性性狀、雄性不育性狀、蠟狀澱粉性狀、經修飾之脂肪酸代謝性狀、經修飾之植酸代謝性狀、經修飾之碳水化合物代謝性狀、經修飾之蛋白質代謝性狀以及此類性狀之任何組合。
在其他具體例中，例示性原生性狀可包括早期活力、應力耐受性、乾旱耐受性、提高的營養物使用效率、提高之根質量以及提高之水使用效率。額外例示性原生性狀可包括對真菌、細菌及病毒病原體之抗性、植物昆蟲抗性；改良之花尺寸、改良之花數目、改良之花色素沉著及形狀、改良之葉數目、改良之葉色素沉著及形狀、改良之種子數目、改良之葉及花圖案及分佈、改良之節點之間的莖長度、改良之根質量及根發育特徵，以及提高之乾旱、鹽及抗生素耐受性。果實特異性原生性狀包括提高之番茄紅素含量、提高之來源於番茄紅素(包括胡蘿蔔素、花青素苷及葉黃素)之代謝物的含量、提高之維生素A含量、提高之維生素C含量、提高之維生素E含量、改良之果實色素沉著及形狀、改良之果實熟化特徵、果實對真菌、細菌及病毒病原體之抗性、果實對昆蟲之抗性、改良之果實尺寸以及改良之果實紋理，例如可溶性固體、總固體及細胞壁組分。
在一個態樣中，原生性狀可對特定作物具有特異性。玉米中的例示性原生性狀可包含美國專利第9,288,955號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。大豆中之例示性原生性狀可包含美國專利第9,313,978號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。棉花中的例示性原生性狀 可包含美國專利第8,614,375號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。高梁中的例示性原生性狀可包含美國專利第9,080,182號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。小麥中的例示性原生性狀可包含美國專利申請案第2015/0040262號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。小麥中之例示性原生性狀可包含美國專利第8,927,833號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。蕓薹屬植物中之例示性原生性狀可包含美國專利第8,563,810號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。菸草植物中之例示性原生性狀可包含美國專利第9,096,864號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。
確認轉基因或轉基因性狀整合的方法是本領域已知的。例如，轉基因或轉基因性狀的檢測可經由例如聚合酶連鎖反應(PCR)來實現。藉由使用兩個側接多態性之多態性區段隨後是DNA擴增的寡核苷酸引子來進行PCR偵測。此步驟涉及DNA熱變性，隨後在低溫下將引子黏接至其互補序列，且使用DNA聚合酶延長黏接之引子的週期。在擴增之後在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠上尺寸分離DNA片段包括該方法之主要部分。此類選擇及篩選方法為本領域技術人員所熟知。可用於鑑別轉基因植物之分子確認方法為熟悉本技藝者已知的。下文進一步描述若干例示性方法。
已發現到供使用於序列偵測之分子信標。簡言之，設計一個FRET寡核苷酸探針以與側接基因組及插入DNA接合點重疊。FRET探針之獨特結構使其含有保持螢光部分及淬滅部分緊密接近之二級結構。該FRET探針及PCR引子(插入DNA序列中的一個引子及側接基因組序列中的一個引子)在熱穩定聚合酶及dNTP的存在下進行循環。在成功PCR擴增之後，FRET探針與靶序列之雜交導致探針二級結構被移除以及該螢光部分與淬滅部分之空間分離。螢光信號指示因成功擴增與雜交而存在的側接基因組/轉基因插入序 列。此類用於以擴增反應形式偵測之分子信標測定為本發明之一實施例。
水解探針測定(或稱為TAQMAN®(Life Technologies,Foster City,Calif.))為一種偵測及定量DNA序列之存在的方法。簡言之，FRET寡核苷酸探針設計成在轉基因內具有一個寡核苷酸以及在側接基因組序列中具有一個寡核苷酸用於事件特異性偵測。該FRET探針及PCR引子(插入DNA序列中的一個引子及側接基因組序列中的一個引子)在熱穩定聚合酶及dNTP的存在下進行循環。FRET探針的雜交導致FRET探針上之螢光部分裂解及釋放而離開淬滅部分。螢光信號指示出因成功擴增及雜交而存在的側接/轉基因插入序列。此類用於以擴增反應形式偵測之水解探針測定為本發明之一實施例。
KASPar®測定係為一種偵測及定量DNA序列之存在的方法。簡言之，包括經整合之基因表現盒多核苷酸的基因組DNA樣本使用稱為KASPar®分析系統之基於聚合酶鏈鎖反應(PCR)的分析法來進行篩選。用於實施本發明之KASPar®測定可利用一種含有多個引子之KASPar® PCR測定混合物。用於該PCR測定混合物中的引子可包含至少一個順向引子及至少一個反向引子。該順向引子含有對應於該DNA聚核苷酸的一個特定區域之序列，而該反向引子含有對應於該基因組序列的一個特定區域之序列。另外，用於PCR測定混合物之引子可包括至少一個順向引子及至少一個反向引子。舉例而言，該KASPar® PCR分析混合物可使用對應於兩個不同等位基因之兩個順向引子以及一個反向引子。該等順向引子中之一者含有一個對應於該內源性基因組序列之特定區域的序列。第二個順向引子含有一個對應於該DNA聚核苷酸的一個特定區域的序列。該反向引子含有對應於該基因組序列的一個特定區域的序列。此類用於以擴增反應形式偵測之KASPar®測定為本發明之一實施例。
在一些實施例中，螢光訊號或螢光染料係選自由以下組成之群：HEX螢光染料、FAM螢光染料、JOE螢光染料、TET螢光染料、Cy 3螢光染料、Cy 3.5螢光染料、Cy 5螢光染料、Cy 5.5螢光染料、Cy 7螢光染料及ROX螢光染料。
在其他實施例中，擴增反應使用適合的第二螢光DNA染料進行，該染料能夠以可被流式細胞儀偵測之濃度範圍對細胞的DNA染色，且具有可被即時熱循環儀偵測之螢光發射光譜。本技藝中具有通常知識者應瞭解到其他核酸染料是已知的且不斷被鑑別出來。可採用具有適當激發及發射光譜之任何適宜核酸染料，諸如YO-PRO-1®、SYTOX Green®、SYBR Green I®、SYTO11®、SYTO12®、SYTO13®、BOBO®、YOYO®及TOTO®。
於另外的實施例中，可使用次世代測序(NGS)技術進行偵測。如由Brautigma等人於2010年所描述，DNA序列分析可用以測定經分離及擴增的片段之核苷酸序列。經擴增的片段可經分離及再選殖至載體中，且使用股終止物方法(亦稱為桑格定序(Sanger sequencing))或染料終止物定序來定序。另外，擴增物可用下一代測序技術來定序。NGS技術不需要再選殖步驟，且可在單一反應中完成多個測序讀序。有三個NGS平台在市場上可以購得，即來自454 Life Sciences/Roche之Genome Sequencer FLXTM、來自Solexa之Illumina Genome AnalyserTM及Applied Biosystems的SOLiDTM(「Sequencing by Oligo Ligation and Detection(以寡核苷酸連接與偵測方式測序)」的縮寫)。另外，有兩種目前正在開發的單分子測序方法。此等方法包括來自Helicos BioscienceTM的true Single Molecule Sequencing(tSMS，真正單一分子測序)及來自Pacific Biosciences的Single Molecule Real TimeTM sequencing(SMRT，單一分子實時DNA測序)。
由454 Life Sciences/Roche進行銷售的Genome Sequencher FLXTM為 一種長讀序NGS，其使用乳化PCR及焦磷酸定序以產生測序讀序片段。可使用300-800bp的DNA片段或含有3-20kb片段的基因庫。對於250至400百萬鹼基之總產量而言，該等反應每次運行可產生超過一百萬個約250至400個鹼基的讀序片段。此技術產生最長的讀序片段，但每次運行的總序列輸出與其他NGS技術相比是較低的。
由SolexaTM進行銷售的Illumina Genome AnalyserTM為一種短讀序NGS，其測序是基於固相橋式PCR，藉由使用以螢光染料標記之可逆性終止核苷酸的合成方法來進行。可使用含有長達10kb之DNA片段的雙端測序基因庫構建體。該等反應產生超過一億個長度為35-76個鹼基之短讀序片段。此資料每次運行可產生3-6千億鹼基。
由Applied BiosystemsTM進行銷售的Sequencing by Oligo Ligation and Detection(SOLiD)系統為一種短讀序技術。此NGS技術使用了長度達10kb之片斷化雙股DNA。該系統藉由接合經染料標記之寡核苷酸引子以及乳化PCR產生十億個短讀序片段來進行測序，每次運行產生多達300億鹼基之總序列輸出。
Helicos BioscienceTM的tSMS及Pacific BiosciencesTM之SMRT應用不同的方式，使用單個DNA分子進行序列反應。tSMS HelicosTM系統每次運行產生多達8億個短讀序片段而得到210億鹼基。此等反應使用經螢光染料標記的虛擬終止核苷酸來完成，其被稱為「以合成方式測序」之方法。
由Pacific BiosciencesTM進行銷售的SMRT下一代測序系統係以合成方式進行實時測序。此技術由於不受可逆式終止物的限制，而可產生多達1,000bp長之讀序片段。使用此技術每天可產生相當於二倍體人類基因組之一倍覆蓋度的原始讀取通量。
本發明的一實施例提供一種將轉基因傳遞至其他植物的方法，其藉 由：a)將由以包括一基因組靶基因座和該轉基因的經分離核酸分子而轉化的植物細胞或組織而再生的一第一植物與由以包括可操作地連接到鋅指核酸酶的啟動子的經分離核酸分子而轉化的植物細胞或組織而再生的一第二植物進行雜交；b)表達該鋅指核酸酶，使得一第一鋅指核酸酶單體與一第二鋅指核酸酶單體配對；c)獲得由雜交產生的一F1植物，其中該轉基因經由非同源端連接而特異性地且穩定地整合在該基因組靶基因座內；以及d)培育由前述雜交所產生的該F1植物。
在本發明的另一樣態中，提供用於生產第一世代(F1)植物的子代的方法，所述方法通常包括將第一親本植物與第二親本植物雜交，其中該第一親本植物或該第二親本植物包括與識別序列側接的供體DNA為和/或位點特異性核酸酶。任何時候，該第一親本植物與該第二親本植物進行雜交，其中該第二親本植物與第一親本植物不同(即，含有不存在於該第一親本植物中的轉基因)，而產生子代或第一世代(F1)玉米雜種植物。如此，子代或F1雜種植物可以經由本發明的方法和組合物而產生。因此，經由非同源末端連接細胞修復機制而將供體DNA整合到靶基因組基因座內而產生任何子(後)代或F1植物或種子是本發明的一實施例。
在本發明的一實施例中，將第一和第二植物進行「雜交」的前述步驟包括以授粉接近性(pollinating proximity)種植第一植物和第二植物的種子。在一些情況下，將第一和第二植物進行「雜交」的步驟包括將第一親本植物去雄，並將從第二植物獲得的花粉施用於該第一植物的柱頭以使該第一植物受育。如果親本植物的性成熟時間不同，可採用技術來獲得合適的缺 口，即，在所指定為雌性的親本植物上期間確保穗絲(silks)來自指定為雄性的親本植物的花粉的可用性對花粉而言是易受粉的。可用於獲得所需切口的方法包含使較快成熟植物延遲開花，例如(但不限於)延遲較快成熟種子的種植、切割或燃燒較快成熟植物的頂部葉子(而非殺死該植物)或使較慢的成熟植物加速開花，例如，經由以設計用於加速發芽和生長的薄膜覆蓋較慢成熟的植物，或經由切割幼穗芽的尖端以暴露穗絲。
進一步的步驟包括將前述植物的種子加以培育或生長。在如此的實施例中，在溫室條件下或在適當的生長條件下的田野間獲得種子並使其萌芽，以確保生產出活體的健康植物。其他的步驟包括收取從接受花粉的植物的穗於接近成熟或成熟時的種子。在一特別的實施例中，從雌性親本植物收穫種子，且當需要時，可培育該經收穫的種子以產生子代或第一世代(F1)雜種植物。
在後續的實施例中，本發明關於將所期望的性狀引入子代植物。在該實施例的一樣態中，該所期望性狀選自由殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、抗病性狀、產量增加性狀、營養品質性狀、農藝增加性狀及其組合所組成的群組。所需性狀的其他例子包含經修飾的脂肪酸代謝，例如，經由以硬脂醯-ACP去飽和酶的反義基因轉化植物以增加植物的硬脂酸含量。See Knultzon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2624(1992)。降低植酸鹽含量：(i)引入植酸酶編碼基因將增強植酸鹽的分解，對經轉化植物中添加更多的游離磷酸鹽。例如，參見Van Hartingsveldt et al.,Gene 127：87(1993),for a disclosure of the nucleotide sequence of an Aspergillus niger phytase gene。(ii)可引入降低植酸鹽含量的基因。在玉米中，例如，可經由先複製然後重新引入與負責以低水平植酸為特徵的玉米突變體的單一等位基因相關的DNA來實現。參見Raboy et al.,Maydica 35：383(1990)。(iii)例如，經由以將改變 澱粉分支模式的酶的基因編碼而將植物進行轉化而影響經修飾的碳水化合物組成。參見Shiroza et al.,J.Bacteriol.170：810(1988)(nucleotide sequence of Streptococcus mutans fructosyltransferase gene),Steinmetz et al.,Mol.Gen.Genet.200：220(1985)(nucleotide sequence of Bacillus subtillus levansucrase gene),Pen et al.,Bio/Technology 10：292(1992)(production of transgenic plants that express Bacillus licheniformis α-amylase),Elliot et al.,Plant Molec.Biol.21：515(1993)(nucleotide sequences of tomato invertase genes),Sogaard et al.,J.Biol.Chem.268：22480(1993)(site-directed mutagenesis of barley α-amylase gene),and Fisher et al.,Plant Physiol.102：1045(1993)(corn endosperm starch branching enzyme II).可能期望的特徵的其他實例包含更高的產量、經改良的莖、經增強的根生長和發育、縮短作物成熟時間、改善農藝品質、更高營養價值、更高的澱粉可提取性或澱粉發酵力；對殺蟲劑、除草劑、害蟲、高溫和乾旱以及疾病的抗性和/或耐受性；以及發芽時間的一致性、直立的生長、生長速度、成熟度以及仁或種子之大小。
在另一實施例中，本發明關於用於生產F1植物的子代的方法。可使用各種育種方案來產生子代植物。在通常稱為系族方法的一方法中，親本可以與另一種不同的植物，例如，第二自交親本植物進行雜交，其本身表現出一或多種經選擇的期望特徵或賦予經選擇的期望特徵到雜種組合。如果兩個原始親本植物無法提供所有期望的特徵，則可以將其他來源包含在繁殖種群中。子代植物，即，純種，純合自交系，也可用作育種的起始材料或開發子代植物的來源群體。
此後，將得到的種子收成，選擇所得的子代植物並在隨後的世代中自交或同胞自交，例如約5至約7代或更多世代，直到基本上不再分離出與近交親本不同的所有因子的世代產生，從而提供了大量不同的、純種的自交 系。
在產生子代植物的另一實施例中，通常稱為逆代雜交(backcrossing)，可經由將親本植物與攜帶編碼感興趣的特定性狀以產生F1子代植物的基因的另一親本植物(稱為供體或非輸迴親本)進行雜交，而將一或多種所需性狀引入親本。顯性和隱性等位基因都可以經由逆代雜交而傳遞。供體植物也可是自交的，但從最廣泛的意義上講，可以是與輪迴親本雜交繁殖的任何植物品種或種群的成員。接著，選擇具有所需性狀的F1子代植物。然後，經選擇的子代植物與可育親本進行雜交以產生逆代雜交子代植物。此後，選擇包括所需性狀和可育親本的生理和形態特徵的逆代雜交子代植物。此循環重複進行約一次至約八次循環，優選地連續進行約三次或更多次以產生經選擇的較高逆代雜交子代植物，其包括當在相同的環境條件下生長時親本或經恢復的可育親本的期望的性狀以及所有生理和形態特徵。示例性期望的性狀包含昆蟲抗性、增強的營養品質、蠟質澱粉、除草劑抗性、產量穩定性、產量增加以及對細菌、真菌和病毒疾病的抗性。植物育種領域的普通技術人員將意識到，育種者使用各種方法來幫助決定哪些植物應從分離族群中被選擇，且最終哪些自交系將被用於發展用於商業化的雜種。除育種者使用的種原和其他技能的知識外，選擇過程的一部分是取決於實驗設計以及統計分析之使用。使用實驗設計和統計分析來幫助確定哪些植物、哪些植物家族以及最終哪些自交系和雜種組合對於一或更多個感興趣的性狀顯著更好或不同。使用實驗設計方法來評估誤差，以便可以更準確地確定兩自交系或兩雜交系間的差異。統計分析包含平均值的計算、變異來源的統計顯著性的確定以及適當變異數成分的計算。通常使用5%或1%的顯著性水平來決定針對特定性狀發生的差異是真實的或是由於環境或實驗誤差造成。植物育種領域的普通技術人員將知道如何評估兩種植物品種的性狀，以確定這些 品種所表達的兩種性狀間是否沒有顯著差異。例如，參見Fehr,Walt,Principles of Cultivar Development,p.261-286(1987)，其以引用方式併入本文。平均性狀值可以用於確定性狀差異是否顯著，且優選地在於相同環境條件下生長的植物上測量所述性狀。
該方法導致產生後代F1自交植物，其基本上具有輪迴親本所需的所有形態和生理特徵以及感興趣的特定經傳遞性狀。因為這樣的子代自交植物對於控制所感興趣的經傳遞性狀的基因座而言是雜合的，所以最後的逆代雜交世代隨後將被自交，藉以為所傳遞的性狀提供純種子代。
可經由使用遺傳標記如SSR、RFLP、SNP或AFLP標記物來加速逆代雜交，藉以鑑別具有來自輪迴親本的最大遺傳互補的植物。
直接選擇可能適用於單一基因座而作為顯性特徵，如除草劑抗性性狀。對於這個選擇過程，在逆代雜交之前，用除草劑噴灑初始雜交的子代。 噴灑消除不具有所期望除草劑抗性特性的任何植物，且只有那些具有除草劑抗性基因的植物才被用於隨後的逆代雜交。在經傳遞的特徵是隱性等位基因的情況下，可能有必要將子代的測試引入，以確定所期望特徵是否已成功傳遞。然後對所有其他逆代雜交世代重複進行前述選擇過程，無論是直接的還是間接的。
本領域普通技術人員應了解，逆代雜交可與系族育種相結合，因為當親本植物與另一植物雜交，所得到的子代與該第一親本逆代雜交，之後，得到的這種單一逆代雜交的子代是於自交後所開發的新自交系。當所恢復之親本特徵比希望經由常規逆代雜交所獲得之全部者更少時，這種逆代雜交和系族育種的組合是有用的。
本發明還關於一或多個植物部分。在一實施例中，植物部分包含植物細胞、植物原生質體、植物可由其再生之植物細胞組織培養物、植物 DNA、植物癒傷組織、植物團塊以及在植物或植物部分中完整的植物細胞如胚、花粉、胚珠、花、種子、仁、穗、穗軸、葉、殼、莖、根、根尖、支持根、側花穗分枝、花藥、雄花序、穎片、穗絲、分蘗等。
在隨後的實施例中，本發明關於從植物細所再生的植物。其他實施例包含包括該植物細胞的植物。在一些實施例中，該植物可為單子葉植物或雙子葉植物。在其他實施例中，該單子葉植物是玉米植物。其他的實施例包含植物部分、植物組織或植物種子。
在其他實施例中，本發明是關於植物細胞。如本文所提及的術語「細胞」涵蓋能夠自我複制的活生物體，且可為分類在植物界下的真核生物的細胞。在一些實施例中，該細胞為植物細胞。在一些實施例中，該植物細胞可是(但不限於)任何高等植物，包含雙子葉植物和單子葉植物，以及消耗性植物，包含作物植物和用於其油的植物。因此，任何植物物種或植物細胞可如下進一步描述的那樣被選擇。
在一些實施例中，根據本發明的植物細胞包含(但不限於)任何高等植物，包含雙子葉和單子葉植物兩者，特別是包含作物植物的消耗性植物。這些植物可包含(但不限於)，例如：苜蓿、大豆、棉花、油菜(也被描述為芥花籽)、亞麻子、玉米、大米、臂形草屬植物、小麥、紅花、高粱、甜菜、向日葵、煙草和草皮草。因此，可選擇任何植物物種或植物細胞。在一些實施例中，本文使用的植物細胞和由其生長或衍生的植物包含(但不限於)可從油菜(Brassica napus)；印度芥菜(Brassica juncea)；衣索匹亞芥菜(Brassica carinata)；蕪菁(Brassica rapa)；捲心菜(Brassica oleracea)；大豆(Glycine max)；亞麻籽/亞麻(Linum usitatissimum)；玉米(也被稱為玉米)(Zea mays)；紅花(Carthamus tinctorius)；向日葵(Helianthus annuus)；煙草(Nicotiana tabacum)；阿拉伯芥；巴西堅果 (Betholettia excelsa)；蓖麻(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；香菜(Coriandrum sativum)；棉花(Gossypium spp.)；花生(Arachis hypogaea)；荷荷巴(Simmondsia chinensis)；油棕(Elaeis guineeis)；橄欖(Olea eurpaea)；水稻(Oryza sativa)；南瓜(Cucurbita maxima)；大麥(Hordeum vulgare)；甘蔗(Saccharum officinarum)；水稻(Oryza sativa)；小麥(Triticum spp.包含Triticum durum和Triticum aestivum)；以及浮萍(Lemnaceae sp.)獲得的細胞。在一些實施例中，植物物種內的遺傳背景可能有所不同。
本發明的一些實施例還提供商品，例如，由轉基因植物或種子所生產的商品。商品可以包含(例如且但不限於)：本發明的植物或轉基因植物的食品、蛋白質濃縮物、纖維、膳食、油、麵粉或壓碎或完整的穀物或種子。在一或多種商品或商品中將編碼包括轉基因的多肽的一或多個核苷酸序列進行檢測是事實上(基於事實)的證據，即商品或商品是至少部分由本發明的轉基因植物所產生。在一特別的實施例中，本發明的商品包括可檢測量的編碼包括轉基因的多肽的核酸序列。在一些實施例中，例如，可經由獲得轉基因植物並從中製備食物或飼料來生產這樣的商品。
在以下實例中進一步舉例說明本發明的實施例。應該理解的是，這些實例僅是作為示例而給出的。從以上實施例和以下實例中，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，且在不脫離其精神和範圍的情況下，可對本發明的實施例進行各種改變和修改，以使其於各種用法和條件下適用。因此，除了本文所示和所描述者外，由以上描述對本發明的實施例進行的各種修改，對於本領域技術人員而言將是明顯的。這樣的修改也落入所附申請專利範圍的範圍內。以下是經由說明的方式而加以提供，並不意在限製本發明的範圍。
實例
實例1：菸草基因表達盒的設計與建構
建構pDAB1585(圖1)二元質體此質體載體包含數個用於靶向供體聚核苷酸序列的數個基因表達盒和位點特異性核酸酶辨識序列。第一基因表達盒含有可操作地連接到潮黴素抗性基因(HPTII)的阿拉伯芥泛素3啟動子(At Ubi3啟動子)，並被根癌土壤桿菌ORF24 3'UTR終止序列(Atu ORF 24 3'UTR)所終止。該基因表達盒隨後是RB7基質附著區(RB7 MAR)以及Scd27位點特定特異性核酸酶識別序列(Scd27 ZFP位點)。識別序列(即Scd27 ZFN結合位點)的四個串聯重複位於MAR和4-CoAS內含子序列的兩側。此結合位點是迴文序列(序列辨識編號：28；GCTCAAGAACAT和序列辨識編號：29；TACAAGAACTCG)，使得只有單個ZFN需要表達Fok1核酸酶結構域而在切割位點二聚化。第二基因表達盒含有可操作地連接到綠色螢光蛋白基因(Cop GFP 5'複本)的5'端的截短片段的根癌土壤桿菌△mas啟動子(Atu Mas啟動子)，其可操作地連接到IL-1位點特定核酸酶識別序列(序列辨識編號16的IL-1ZFP位點；ATTATCCGAGTTCACCAGAACTCGGATAAT和序列辨識編號30；ATTATCCGAGTTCTGGTGAACTCGGATAAT)，其與β-葡萄醣醛酸酶基因(GUS)可操作地連接，且被根癌土壤桿菌胭脂鹼合成酶3'UTR終止序列(Atu Nos 3'UTR)所終止。第三基因表達盒含有綠色螢光蛋白基因(Cop GFP 3'複本)3'末端的截短片段，其與根癌土壤桿菌ORF1 3'UTR終止序列(Atu ORF1 3'UTR)可操作地連接，其與Scd27位點特異性核酸酶識別序列(Scd27 ZFP位點)可操作地連接，其可操作地連接到阿拉伯芥4-香豆醯-coA-合成酶內含子1，其可操作的連接於膦絲菌素乙醯轉移酶外顯子(PAT 3'外顯子(人造)的3'末端的截短片段，且被根癌土壤桿菌ORF25/26 3'UTR終止序列(Atu ORF25/26 3'UTR)所終止。此質體利用本領域公知的技術所構建，該基因表達盒被揭露為為序列辨識編號1。
建構pDAB118259(圖二)二元質體該質體載體含有兩個彼此以反式構型定位的基因表達盒，以及用於切除多核苷酸序列的位點特異性核酸酶識別序列，藉以作為供NHEJ整合的供體構建體。該第一基因表達盒含有可操作地連接到膦絲菌素乙醯轉移酶外顯子(PAT 5'外顯子(人造))的5'末端的阿拉伯芥泛素10啟動子(At Ubi10啟動子)。該基因表達盒由重複的Scd27位點特異性核酸酶辨識序列(Scd27ZFP位點)所側接。第二基因表達盒含有可操作地連接到dgt-28轉基因(DGT-28)的阿拉伯芥泛素11啟動子(At Ubi11啟動子)且被玉米(Zea mays)PER 5'3'UTR終止序列(ZmPer5 3'UTR)所終止。此質體利用本領域公知的技術所建構，該基因表達盒被揭露為序列辨識編號2。
建構pDAB118257(圖三)二元質體此質體載體含有兩個彼此以反式構型定位的基因表達盒，以及用於切除多核苷酸序列的位點特異性核酸酶識別序列，藉以作為用於同源性定向修復整合的供體構建體。第一基因表達盒含有可操作地連接到阿拉伯芥泛素10啟動子(At Ubi10啟動子)的RB7基質附著區(RB7 MAR)，At Ubi10啟動子與膦絲菌素乙醯轉移酶外顯子(PAT5'外顯子(人造))的5'末端可操作地連接，PAT5'外顯子可操作地連接到阿拉伯4-香豆醯-coA-合成酶內含子1。該基因表達盒由重複的Scd27位點特異性核酸酶識別序列(Scd27ZFP位點)所側接。第二基因表達盒含有可操作地連接到dgt-28轉基因(DGT-28)的阿拉伯芥泛素11啟動子(At Ubi11啟動子)，DGT-28可與玉米PER 5 3'UTR終止序列(ZmPer5 3'UTR)可操作地連接。此質體利用本領域公知的技術建構，該基因表達盒被揭露為為序列辨識編號3。
建構pDAB118261(圖四)二元質體該質體載體含有兩個以順式構型相互定位的基因表達盒。第一基因表達盒含有可操作地連接到scd27a 3鋅指核酸酶轉基因(SCD27a 3：FokI Dicot)的木薯脈花葉病毒啟動子(CsVMV啟動子)，且被根癌土壤桿菌ORF23 3'UTR終止序列(AtuORF23 3'UTR)所終止。第二基因表達盒含有可操作地連接到dgt-28轉基因(DGT-28)的阿拉伯芥泛素11啟動子(At Ubi11啟動子)，且被玉米PER 5 3'UTR終止序列(ZmPer5 3'UTR)所終止。此質體使用本領域公知的技術所構建，該基因表達盒被揭露為序列辨識編號4。
實例2：鋅指蛋白的設計
針對SCD27和IL-1的所鑑別DNA識別序列的鋅指蛋白定向依前述描述而設計。參見e.g.,Urnov et al.,(2005)Nature 435：646-551.示例性靶序列和識別螺旋和識別序列最初在美國專利第9,428,756號和美國專利第9,187,758號中提供(其公開內容經由引用整體併入本文)。為前面所提的識別序列設計鋅指核酸酶(ZFN)識別序列。開發和測試許多ZFP設計，藉以鑑別以最高水平效率與辨識序列中之識序列加以結合之指。以最高水平效率結合於鋅指辨識序列的特定鋅指蛋白識別螺旋被用於在玉米基因組內供體序列的靶向與整合。
將Scd27與IL-1鋅指設計併入至編碼具有至少一具有CCHC結構之指的蛋白質的鋅指表達載體中。參見美國專利公開案第2008/0182332號。特定言之，每種蛋白質中之最後指具有用於識別螺旋之CCHC主鏈。非典型鋅指編碼序列經四胺基酸ZC連接子及來源於玉米之opaque-2核位置信號融合至IIS型限制酶FokI之核酸酶結構域(Wah等人.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10564-10569之序列的胺基酸384-579)，以形成鋅指核酸酶(ZFNs)。參見美國專利第7,888,121號。選擇針對多種功能結構域之鋅指用於活體內 用途。許多鋅指核酸酶被設計、生產和測試，以結合至推定的基因組靶基因座，上述鋅指核酸酶被鑑別為具有體內活性且被表徵為能夠有效地結合和剪切原位靶基因座內獨特的多核苷酸識別序列。
使用本領域普遍已知的技巧和技術(參見例如Ausubel或Maniatis)設計和完成上述含有該鋅指核酸酶基因表達構建體的質體載體。各鋅指核酸酶編碼序列被融合至編碼opaque-2核位置信號之序列(Maddaloni等人(1989)Nuc.Acids Res.17：7532)，其位於鋅指核酸酶之上游。將非典型的鋅指編碼序列融合到IIS型FokI限制酶的核酸酶結構域(Wah等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10564-10569的胺基酸384-579)。融合蛋白的表達由強組成型啟動子所驅動。表達盒還包含3'UTR(包括轉錄終止子和聚腺苷酸化位點)。將來自Thea asigna virus(明脈扁刺蛾病毒)之核苷酸序列進行編碼的自行水解2A(Szymczak等人，(2004)Nat Biotechnol.22：760-760)加入到複製至構建體之兩個鋅指核酸酶融合蛋白之間。
實例3：煙草植物轉化
藉由使用土壤桿菌共培養時的隨機整合，將pDAB1585構建體穩定轉化至菸草中。利用在20%Clorox®溶液中浸泡10分鐘將菸草植物種子的進行表面滅菌且在無菌水中漂洗兩次。使菸草植物無菌生長於在PhytaTrays®(Sigma,St.Louis,MO)中之具有以8g/L TC瓊脂(Phytotechnology Laboratories)固化之30g/L蔗糖之TOB培養基(Phytotechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)以28℃與日照16小時、黑暗8小時的光週期(60μmol m2 sec2)下進行培養。為了以經整合供體構建體製造轉基因植物事件，將葉盤(1cm 2)進行切割且在攜帶質體pDAB188257或pDAB188259的根癌土壤桿菌菌株LBA4404的過夜培養物中加以溫育，生長至OD600~1.2nm，在無菌濾紙 上吸乾，然後置於TOB+MS培養基(Phytotechnology Laboratories)和30g/L蔗糖中，該蔗糖是加入1mg/L吲哚乙酸和1mg/L芐胺基嘌呤且用8g/L TC瓊脂(Phytotechnology Laboratories)固化-在100×20mm以Nescofilm®(Karlan Research Products Corporation,Cottonwood,AZ)密封的盤中(每個培養皿10個葉盤)。在共培養72小時後，將葉盤轉移到TOB+250Ceph+50KAN，其是具有250mg/L頭孢噻肟(cephotaxime)和50mg/L卡那黴素(kanamycin)(Phytotechnology Laboratories)的相同培養基。3至4週後，在將葉子進行採樣和分子分析之前，將苗移植到PhytaTrays中具有250mg/L頭孢噻肟和50mg/L卡那黴素的TOB-250Ceph+50KAN MS培養基中額外3至4週。然後，將在具有50mg/L卡那黴素的培養基上呈現枝芽伸長和根生長的綠色植物進行取樣以用於分子分析。取樣涉及用無菌手術刀切割葉片組織，並將1-2cm2置於1.2mL聚類管中而用於PCR分析，或將3-4cm2置於2.0mL Safe Lock管(Eppendorf,Hauppauge,NY)中用於由用於快速冷凍之乾冰包圍的南方墨點法進行分析。然後用3M TM Micropore TM膠帶(Fisher Scientific,Nazareth,PA)將該管覆蓋，並在Virtual XL-70(VirTis,Gardiner,NY)中凍乾48小時。一旦組織被凍乾，將該管蓋蓋上並在8℃下儲存直至分析。根據qPCR和南方墨點法分析，為每個構建體選擇三個單拷貝、完整事件，並將經再生的T0植物轉移到溫室並允許自花授粉。
經由分子確認獲得且確認轉化體。開發含有具有以ZFN切割位點側接的非功能性除草劑抗性基因的單一拷貝、純合T2標靶系的轉基因植物。包含pDAB1585的T股的此靶系被開發用於經由同源性定向修復而建立用於靶向轉基因整合的概念驗證。簡言之，煙草RB7基質附著區(MAR)和阿拉伯芥4-香豆醯合成酶內含子-1(4-CoAS)用作為與進來的供體DNA同源 的序列。包含膦絲菌素乙醯轉移酶(PAT)基因的3'片段用於在靶向供體整合之後的體外選擇。ZFN結合位點(Scd27)的四個串聯重複位於MAR和4-CoAS內含子序列的兩側。該結合位點是迴文序列(序列辨識編號：28；GCTCAAGAACAT和序列辨識編號：29；TACAAGAACTCG)，使得Fok1核酸酶結構域僅需要表達單個ZFN而在該切割位點二聚化。
再者，使用前述轉化方法將供體構建體(即，pDAB118257、HDR供體和pDAB118259、NHEJ供體)分別轉化到轉基因pDAB1585煙草植物中。獲得含有用於pDAB1585的T股片段和用於pDAB118257或pDAB118259的第二T股片段兩者的轉基因植物，並使用qPCR和南方墨點法分析經由分子確認進行確認。將該經再生的T0植物轉移至溫室並使其自花授粉。
最後，使用前述轉化方法將鋅指核酸酶構建體(即，pDAB118261)轉化到煙草植物中。含有pDAB118261的T股片段的轉基因植物經由使用qPCR和南方墨點法分析的分子確認而獲得且確認。將該經再生的T0植物轉移至溫室並使其自花授粉。
將來自每個經選擇的T0供體/靶和ZFN植物的自花授粉的T1子代(~25種子)的樣品在TOB-培養基上進行無菌發芽，且在qPCR分析之後，將純合個體(連同幾個無效個體作為對照)選擇、轉移到溫室而用於雜交以產生F1子代。
實例4：煙草的雜交
在純合的T1供體/靶和ZFN(和無效)植物(圖5)之間的雜交是使用經控制授粉進行的。將來自供體/靶植物的花藥的花粉引入ZFN(和無效)植物的柱頭，反之亦然，以在獨立事件之間產生所有可能的組合。在授粉前的15-30分鐘，使用鑷子~將作為雌性的植物去雄(即，在開裂之前將花 藥移除)。經由觀察花藥和花色選擇要去雄的花。新開的花朵在邊緣呈亮粉紅色，花藥仍閉合。不使用含有經開裂花藥的花朵。從單一的花序的多個花被去雄和授粉。使用鑷子將來自父本的花藥移除並將其摩擦到黏性接受的柱頭上，直到柱頭被花粉覆蓋。然後以列出所作雜交和授粉日期的授粉標籤標記花朵。當蒴(capsules)變褐和乾燥時，收穫它們並移除子代種子。
將來自每個(供體/靶)x ZFN(和無效)雜交的F1子代的樣品(~25種子)在TOB-培養基上無菌發芽，並將葉片鋪在用Nescofilm®密封的用8g/L TC瓊脂在100x20mm培養皿(每盤10個葉盤)中固化的加入1mg/L吲哚乙酸和1mg/L芣氨基嘌呤的具有30g/L蔗糖的TOB+250Ceph+5BASTA-MS培養基。對來自再生植物的葉子樣品進行取樣，並使用進-出PCR和南方墨點法分析進行靶向整合分析。將來自每個雜交的少數植物轉移至溫室並允許自花授粉以產生F2子代，藉以經由草銨膦選擇和分子確認進行另外的篩選。
實例5：分子確認
轉基因拷貝數測定和經由水解探針測定的轉錄分析是經由使用LIGHTCYCLER®480系統(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)的即時PCR而進行。使用LIGHTCYCLER®探針設計軟體2.0針對感興趣基因(PAT和NPTII拷貝數和FokI之表達)和內部參考基因(PalA拷貝數和elflα的表達)(GenBank ID：AB008199和Genbank登錄號：XM_009595030)的測定進行設計。為用於擴增反應，在包含0.4μM之每一引子以及0.2μM之每一探針(表1與表2)的10μL體積多重反應中以1X最終濃度製備LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix(ROCHE APPLIED SCIENCE,Indianapolis,IN)。對於具有螢光獲取的選擇性標記物，在60℃延伸40秒而進行兩步驟擴增反應(表3)。
使用相對定量模組使用LIGHTCYCLER®軟體版本1.5進行即時PCR數據分析，並根據△△Ct方法。對於拷貝數，每次運行包含來自單拷貝校準品的gDNA樣品和已知的兩份拷貝檢測。
經由qPCR鑑定和選擇包含PAT和NPTII基因的單拷貝的煙草。這些事件提前進行了南方墨點分析。將組織樣品收集在15ml Eppendorf管(微量離心管)中並凍乾。用Geno/Grinder®2010(SPEX Sample Prep,Metuchen,NJ)和不銹鋼珠進行組織浸解。在組織浸解後，使用NucleoSpin Plant II Midi Kit TM(Macherey-Nagel,Bethehem,PA)根據製造商建議的規範將gDNA分離。
經由Quant-IT Pico Green DNA測定試劑盒TM(Molecular Probes, Invitrogen,Carlsbad,CA)對基因組DNA進行定量。為了進行南方墨點分析，將量化的gDNA調整到10μg。然後用NsiI(拷貝數)和MfeI(PTU)限制酶(New England BioLabs,Ipwich,MA)在37℃過夜消化這些事件，隨後用Quick-Precip TM(Edge BioSystem,Gaithersburg,MD)根據製造商建議的規範進行清除。事件在40%伏特的0.8%SeaKem LE瓊脂凝膠TM(Lonza,Rockland,ME)上運作。然後將凝膠變性、中和，然後轉移到尼龍帶電膜(Millipore,Bedford,MA)過夜。然後使用UV Strata linker 1800TM將DNA結合到膜上(Stratagene,La Jolla,CA)。然後將該印跡與25ml DIG Easy HYB TM(Roche Indianapolis,IN)預雜交。根據製造商建議的規範，使用DIG system TM(Roche)將用於雜交之探針標記。然後將該探針加入該印跡並溫育過夜。然後根據製造商對DIG/CDP-starTM(Roche)建議的規範將印跡洗滌並進行檢測。然後使用BioRad Gel TM doc使印跡可視化。
實例6：經由NHEJ和HDR確認煙草中的靶向和基因內重組
結果表明，煙草植物可以利用NHEJ定向修復機制將來自一親本的供體DNA移動到子代植物(F1植物)內的位點特異性基因組基因座中。因此，含有由ZFN切割識別位點(來自pDAB1585)側接的經整合3'部分pat可選擇標記基因的轉基因植物是用作該靶基因組基因座。這些轉基因植物還含有相應的5'部分pat序列(帶有或不帶有任何側翼同源臂或任何其他同源性區域)，且側接有作為供體DNA序列的ZFN切割位點(來自pDAB118257或pDAB118259)。在將上述轉基因植物與含有ZFN表達事件(來自pDAB118261)的第二轉基因植物雜交後，ZFN經由切割識別序列(例如Scd27位點)釋放供體，且還在於第一轉基因植物中整合的基因組基因座(在pDAB1585T-股整合的Scd27位點)上產生雙股斷裂。接著，經由 NHEJ或HDR介導的重組機制(圖6)將供體基因(例如pat)整合到位點特異性基因座內。靶和供體在子代植物內的同時切割和整合是發生在所有的細胞週期階段(G1、S、G2和M)，藉以導致供體經由NHEJ介導的過程與pat選擇性標記物基因的官能化而移動到靶基因座中。
假設在靶系內插入dgt-28供體DNA以發生兩種定向之一者。dgt-28轉基因的整合和這種整合的定向經由「進-出」PCR測定來確認。進-出PCR測定使用設計用於與靶稻(Oryzae sativa)泛素3啟動子序列結合的出「出」引物。另外，設計「進」引物以結合dgt-28供體序列。使用這些引物完成的擴增反應僅擴增插入目標基因座的供體基因。所得到的PCR擴增子由兩種引子產生，並由跨越插入物連接處的序列所組成。測定中包含陽性和陰性對照。
使用終端PCR來檢測上述序列。使用~25ng模板基因組DNA、0.2μMdNTPs、0.4μM順向和反向引子以及0.25ul Ex Taq HS聚合酶進行PCR反應。反應分三步驟完成：第一步驟由94℃(3分鐘)一個循環以及94℃(30秒)、68℃(30秒)和72℃(2分鐘)35個循環所組成。對擴增子進行測序以確認pat基因已經整合到靶系內。另外，將5'進-出PCR的擴增子稀釋並在1%TAE凝膠上運行，並使用BioRad Gel doc軟體而可視化，藉以鑑別含有約2.6Kb的預期擴增子大小的事件。
5'和3'進-出PCR檢測
假設將pat供體DNA插入到靶系內以發生兩個定向中之一者(圖6)。經由進-出PCR測定證實pat轉基因的整合和這種整合的定向。進-出PCR分析使用設計為與靶結合的「出」引子。此外，設計「進」引子以與供體序列結合(表4)。使用這些引子完成的擴增反應僅擴增插入靶基因座的識別序列的供體基因。所得到的PCR擴增子由兩種引子所產生，並由跨越插 入物連接處的序列所組成。
使用終端PCR來檢測上述序列。使用表5所述的模板基因組DNA和試劑進行PCR反應。使用表6、7和8中所述的PCR譜完成反應。5'和3'進-出PCR的擴增子在1%TAE凝膠上運行且使用BioRad Gel TM doc軟體而可視化，藉以分別鑑別含有約2.2Kb和2.3Kb的預期擴增子大小的事件(圖6)。對一些擴增子進行測序以確認供體已整合到目標系內。
總計，200株植物中的6株顯出用於NHEJ靶向的陽性5'或3'進-出PCR產物。同樣地，50株植物中的15株顯出用於HDR靶向的陽性5'或3'進-出PCR產物。經由事件內pat基因的存在，能夠在含膦絲菌素的培養基(即，Liberty herbicide；Bayer CropScience,Kansas City,MO)上選擇靶向事件。使用先前描述的方法，經由南方墨點法可進一步確認靶向插入事件的存在。
實例7：玉米(例如，玉米或玉蜀黍)基因表達盒的設計和構建
構建pDAB118253(圖7)二元質體。該質體載體含有用於供體多核苷酸序列之靶向的幾個基因表達盒和位點特異性核酸酶識別序列。第一基因表達盒含有與phi-yellow螢光蛋白基因(PhiYFP(含內含子))可操作地 連接的稻(Oryza sativa)泛蛋白3啟動子(OsUbi3啟動子)，其包含馬鈴薯(Solanum tuberosum)LS1內含子(ST-LS1內含子)，且該第一基因表達盒進一步可操作地連接至玉米過氧化物酶5,3'UTR終止序列(ZmPer5 3'UTR)。該基因表達盒之後是eZFN1位點特異性核酸酶識別序列(序列辨識編號：31；CAATCCTGTCCCTAGTGGATAAACTGCAAAAGGC和序列辨識編號：32；GCCTTTTGCAGTTTATCCACTAGGGACAGGATTG的eZFN1結合位點；)、工程化著陸墊1序列(ELP1 HR2)，且經由用於同源性定向修復整合(3'Vector Homology)的另外的同源序列所終止。第二基因表達盒含有可操作地連接到含有馬鈴薯LS1內含子(ST-LS1內含子)的aad-1基因(AAD-1)的甘蔗(sugar cane)桿狀病毒啟動子(SCBV啟動子)，且可操作地連接到玉米脂肪酶3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)。該質體使用本領域公知的技術構建，該基因表達盒揭露為序列辨識編號：24。
構建pDAB118254(圖8)二元質體非同源末端連接(NHEJ)供體。該質體載體含有彼此順式定位的兩個基因表達盒，以及用於切除多核苷酸序列的位點特異性核酸酶識別序列，以作為用於將供體序列NHEJ整合到靶基因組基因座中的供體構建體。第一基因表達盒含有可操作地連接於玉米脂肪酶3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)的dgt-28轉基因(Trap4 DGT-28)。此基因表達盒的側翼是重複的eZFN1位點特異性核酸酶識別序列(eZFN1結合位點)。第二基因表達盒含有玉米泛素1啟動子(ZmUbi1啟動子)，該玉米泛素1啟動子可操作地連接至草丁膦乙醯轉移酶轉基因(PAT)，該草丁膦乙醯轉移酶轉基因是與玉米脂肪酶3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)可操作連接。該質體使用本領域公知的技術構建，該基因表達盒被揭露為序列辨識編號：25。
構建含有同源衍生修復(HDR)供體的pDAB113068(圖9)二元 質體。該質體載體含有彼此順式定位的兩個基因表達盒和用於切除多核苷酸序列的位點特異性核酸酶識別序列，以作為用於同源性定向修復整合的供體構建體。該第一基因表達盒含有稻(Oryzae sativa)泛蛋白3(Os ubi3內含子)，該稻泛蛋白3可操作地連接至dgt-28轉基因(DGT-28)，該dgt-28轉基因與玉米脂肪酶3 3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)可操作地連接。該基因表達盒的側翼是重複的eZFN1位點特異性核酸酶識別序列(eZFN1結合位點)。此外，還可以使用幾種另外的位點特異性核酸酶識別序列(例如，序列辨識編號：33；GCCTTTTGCAGTTT和序列辨識編號：34；AAACTGCAAAAGGC的SBS8196結合位點；序列辨識編號：35；TATGCCCGGGACAAGTG和序列辨識編號：36；CACTTGTCCCGGGCATA的SBS19354結合位點；序列辨識編號：37；CAATCCTGTCCCTA和序列辨識編號：38；TAGGGACAGGATTG的SBS15590結合位點；序列辨識編號：39；CAATCCTGTCCCTAGTGAGATGGGCGGGAGTCTT和序列辨識編號：40；AAGACTCCCGCCCATCTCACTAGGGACAGGATTG的eZFN8結合位點；以及序列辨識編號：41；TGGGCGGGAGTCTT和序列辨識編號：42；AAGACTCCCGCCCA的SBS18473結合位點)被包含在該基因表達盒的3'端的下游。第二基因表達盒含有玉米泛素1啟動子(ZmUbi1啟動子)，該玉米泛素1啟動子是可操作連接至草丁膦乙醯轉移酶轉基因(PAT)，該草丁膦乙醯轉移酶轉基因是與玉米脂肪酶3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)可操作地連接。該質體使用本領域公知的技術構建，該基因表達盒被揭露為序列辨識編號：26。
鋅指核酸酶(ZFN1)載體pDAB105825(圖10)包括於玉米泛素1啟動子與內含子1(ZmUbi1啟動子v2)及ZmPer5 3'UTR v2的表達下的ZFN1編碼序列(如前在美國專利第9,428,756號與美國專利第9,187,758號 所述，其中的每一者經由引用整體併入本文)。第二基因表達盒含有水稻Actin1(OSAct1)啟動子，該水稻Actin1啟動子可操作地連接於膦絲菌素乙醯轉移酶轉基因(PAT)，該膦絲菌素乙醯轉移酶轉基因可操作地連接至玉米脂肪酶3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)。該質體使用本領域公知的技術加以構建。
構建含有單側供體(OSI)的pDAB118280(圖11)二元質體。該質體載體含有彼此順式定位的兩個基因表達盒和用於切除多核苷酸序列的位點特異性核酸酶識別序列，以作為用於同源性定向修復整合的供體構建體。第一個基因表達盒含有稻(Oryza sativa)泛素3(Os ubi3內含子)，該稻泛素3可操作地連接至dgt-28轉基因(DGT-28)，該dgt-28轉基因是與玉米脂肪酶3 3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)可操作連接。該基因表達盒的側翼是重複的eZFN1位點特異性核酸酶識別序列(eZFN1結合位點)。第二基因表達盒含有玉米泛素1啟動子(ZmUbi1啟動子)，該玉米泛素1啟動子可操作地連接至草丁膦乙醯轉移酶轉基因(PAT)，該草丁膦乙醯轉移酶轉基因與玉米脂肪酶3'UTR終止序列(ZmLip3'UTR)可操作地連接。該質體使用本領域公知的技術構建，該基因表達盒被揭露為序列辨識編號：27。
實例8：鋅指蛋白質的設計
針對所鑑別的eZFN1的DNA識別序列的鋅指蛋白定向如前所述進行設計。參見，例如Urnov et al.,(2005)Nature 435：646-551。示例性的靶序列和識別螺旋是揭露於美國專利第9,428,756號與美國專利第9,187,758號，其中之每一者經由引用全文併入本文。鋅指核酸酶(ZFN)識別序列被設計用於之前描述的eZFN1識別序列。開發和測試許多ZFP設計，以鑑別出與植物基因組靶基因座的識別序列以最高效率相結合的指。以最高水平效率結合於鋅指辨識序列的特定鋅指蛋白識別螺旋被用於在玉米基因組內供體序列 的靶向與整合。
將eZFN1鋅指設計併入至編碼具有至少一個具有CCHC結構之指的蛋白質的鋅指表達載體中。參見美國專利公開案第2008/0182332號。特定言之，每種蛋白質中之最後指具有用於識別螺旋之CCHC主鏈。非典型鋅指編碼序列經四胺基酸ZC連接子及來源於玉米之opaque-2核位置信號融合至IIS型限制酶FokI之核酸酶結構域(Wah等人.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10564-10569之序列的胺基酸384-579)，以形成鋅指核酸酶(ZFNs)。參見美國專利第7,888,121號。選擇針對多種功能結構域之鋅指用於活體內用途。在被設計、生產和測試以結合假定的基因組識別序列的許多ZFN中，在這些實驗中使用的ZFN被鑑別為具有體內活性，且被表徵為能夠有效地結合和切割原位基因組靶基因座內的基因組多核苷酸識別序列。
上文描述含有ZFN基因表達構建體的質體載體是使用本領域公知的技能和技術進行設計和完成。各鋅指編碼序列融合至編碼opaque-2核位置信號之序列(Maddaloni等人(1989)Nuc.Acids Res.17：7532)，其位於鋅指核酸酶之上游。將非典型的鋅指編碼序列融合到IIS型FokI限制酶的核酸酶結構域(Wah等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10564-10569的胺基酸384-579)。融合蛋白的表達經由強組成型啟動子所驅動。該表達盒還包含3'UTR(包括轉錄終止子和聚腺苷酸化位點)。在被複製到構建體中的兩種鋅指核酸酶融合蛋白之間加入編碼來自Thosea asigna virus(明脈扁刺蛾病毒)(Szymczak等人，(2004)Nat Biotechnol.22：760-760)的核苷酸序列的自水解2A。
實例9：玉米轉化
將上述二元表達載體轉化到根癌土壤桿菌菌株DAt13192三元體中(美國臨時專利申請第61/368965號)。選擇細菌菌落，且二元質體DNA經 分離且經限制酶分解來確認。
土壤桿菌介導之玉米轉化。
土壤桿菌介導之轉化係用以穩定地將一嵌合基因整合至植物基因組中，並因此生成產生轉基因玉米細胞、組織與植物。採用二元轉化載體的玉米轉化方法是本領域已知的，例如，在國際PCT公開號WO2010/120452中所述。這些方法被用於供這些實驗將玉米植物轉化。
在溫室中轉移並建立T0植物。
在含有甲基合氯氟(haloxyfop)或草胺膦(phosphinothricin)的培養基上選擇經轉化的植物組織。經再生的植物係自Phytatrays移植到填充有生長培養基(ProMix BX；Premier Tech Horticulture)之小盆(T.O.Plastics,3.5”SVD)中，並以保濕頂(Arco Plastics Ltd.)覆蓋，接著在生長室(28℃日/24℃夜、16小時光照期、50-70% RH、200μEm-2 sec-1光強度)中進行健化。當植物達到V3-V4發育階段時，將其移植到Sunshine Custom Blend 160TM土壤混合物中並在溫室(光暴露型：光合或同化；強光限制：1200PAR；16小時晝長；27℃日/24℃夜)中生長至開花。採取定期觀察以追踪任何異常表型。
在溫室中生產T1半合子種子
所得到的T0轉基因植物經由NGS(序列捕獲方法)而用於拷貝數的分析且一子集接著用於以轉基因供體植物(用pDAB118254二元體或pDAB113068二元體所產生者)將轉基因靶植物(用pDAB118253二元體所產生者)進行相互雜交以獲得T1種子獲得含有pDAB118253的T股片段以及pDAB118254或pDAB113068的T1轉基因玉米植物，且經由使用qPCR和南方墨點法分析的分子確認來進行確認。將所獲得的T1轉基因玉米植物轉植至溫室並生長至成熟。對於質體pDAB118280，經由土壤桿菌(Agrobacterium)將與靶轉基因pDAB118253純合的植物重新轉化。
種植T1子種子的子集，分析植物的靶/供體轉基因(包含pDAB118253/pDAB118254轉基因、pDAB118253/pDAB113068或pDAB118253/pDAB118280轉基因)的接合性。使用如上所述qPCR方法來完成這些測定。使用PhiYFP和AAD1的qPCR反應來確定靶細胞系的接合性，同時使用PAT和DGT28的qPCR反應來確定供體細胞系的接合性。從這些測定中獲得11個T1玉米植物，而用於pDAB118253靶系植物和pDAB118254供體系植物的雜交。同樣的，該測定導致獲得的三個T1玉米植物用於pDAB118253靶系植物和pDAB113068供體系植株的雜交。這些T1植物對於靶和供體轉基因兩者都是半合子的，且隨後供以含有鋅指核酸酶的純合玉米植物進行雜交而用於切割eZFN1。來自用於測試NHEJ重組機制的將pDAB118253靶系植物和pDAB118254供體系植物進行雜交而產生的132株和用於測試同源性定向修復機制的將來自pDAB118253靶系植物和pDAB113068供體系植物進行雜交而產生的56株植物隨後是與含有鋅指核酸酶基因表達盒的玉米植物進行雜交。
實例10：玉米植物的雜交
在供體/靶和ZFN(以及無效)植物之間的雜交是使用受控授粉而進行的。將含有ZFN基因表達盒的兩個純合事件的八十八粒種子以交錯排列種植，以確保來自pDAB118253靶系植物/pDAB118254供體系植物或來自pDAB118253靶系植物/pDAB113068供體系植物所脫落的花粉將受精ZFN植物。從經雜交的植物收集未成熟的胚。
接下來，將未成熟的胚在含有草甘膦的選擇培養基上生長。篩選未成熟的玉米胚中存在的dgt-28轉基因以鑑別含有功能性dgt-28轉基因(表6和7)的未成熟玉米胚。總計，在再生培養基上選擇83株植物用於NHEJ靶向(表6)，而234株植株經再生用於HDR靶向(表7)。經由分子檢測確 認植物。使用用於pat、aad-1、dgt-28和phi-yfp的qPCR測定來測試植物。不含phi-yfp轉基因的植物接著進行「進-出」終端PCR測試。「進-出」PCR測試測定未成熟胚中預期的重組事件的5'端的存在。設計PCR反應以擴增跨越稻(Oryzae sativa)泛素3啟動子和dgt-28編碼序列的擴增子。「進-出」PCR測試也針對預期的重組事件的3'端進行檢測。設計PCR反應以擴增跨越dgt-28編碼序列和甘蔗桿狀病毒啟動子的擴增子。甘蔗桿狀病毒啟動子序列是驅動pat選擇標記物轉基因的啟動子。接著將「進-出」PCR陽性的植物放進溫室，隨後使用南方墨點法分析進行分析。使用先前描述的方法經由單獨的進-出PCR反應和南方墨點法檢測靶向插入事件的存在。PCR產物的預期凝膠片段大小和預期的南方墨點法條帶圖譜(帶型)表明，供體序列從其原始基因組位置被切除，以在另一所需基因組基因座處進行位點特異性整合。
實例11：分子確認
T0植物定量PCR檢測和拷貝數估計
使用設計用於檢測轉基因/序列的相對拷貝數的引物經由定量即時PCR檢測來分析假定的轉基因小植株的轉基因拷貝數。使用針對gDNA參考基因、轉化酶以及鋅指核酸酶的靶基因aad-1、pat、ELP、dgt-28、phi-yfp、fok1結構域以及specR選擇性標記物的特異性TaqMan®測定來測定拷貝數。將選擇用於接著的單拷貝事件移植到5加侖的盆中並提交供下一代測序(NGS)序列捕獲。
使用設計用於檢測轉基因/序列的相對拷貝數或相對轉錄水平的引子經由定量即時PCR測定來分析假定的轉基因植株的轉基因拷貝數。在v1-v2階段，從每個植物收集小葉子的撕裂物進行分子分析。使用Qiagen MagAttract試劑盒TM提取DNA或使用Thermo KingFisherFlex TM robot(Thermo Scientific,Inc.)上的Ambion MagMax®試劑盒提取RNA。使用加 入oligoTVN TM的Applied Biosystems High Capacity reverse transcription kitTM將RNA轉變成cDNA。使用針對gDNA參考基因、轉化酶、轉錄物參考基因、延伸因子，以及靶基因aad-1、pat、ELP、dgt-28、phi-yfp，fok1和specR(表10)的特定TaqMan®測定進行拷貝數或相對轉錄物分析。根據表11和根據表12的運作條件建立BiplexTaqMan®PCR反應。使用ROCHE LIGHTCYCLER®480即時PCR系統依據製造商的建議分析每一反應所產生的螢光程度。以465/510nm的光密度激發FAM螢光部分(QPCR-TARGET)，以533/580nm的光密度激發HEX/VIC螢光部分(QPCR-REFERENCE)。藉由將未知樣品之靶/參考值與已知拷貝數標準品(1-拷貝代表之半合子(hemi)植物、2-拷貝代表之純合子(homo)植物)之靶/參考值進行比較的LIGHTCYCLER®480TM輸出而確定拷貝數。經由比較靶/參考值來確定相對轉錄水平，數據未被進一步標準化。
5’進-出PCR偵測(HDR-OSI)
dgt-28供體DNA在靶系內的插入可發生於兩種定向中之一者。dgt-28轉基因的整合和這種整合的定向經由「進-出」PCR測定來確認。進-出PCR測定使用設計用於結合靶稻(Oryzae sativa)泛素3啟動子序列的「出」引物。此外，設計「進」引物以結合dgt-28供體序列。使用這些引子完成的擴增反應僅擴增被插入基因組靶基因座的供體基因。所得到的PCR擴增子由兩種引子所產生，且由跨越插入物連接處的序列所組成。測定中包含陽性和陰性對照。
使用終端PCR來檢測上述序列。使用~25ng模板基因組DNA、0.2μMdNTPs、0.4μM順向和反向引子以及0.25ul Ex Taq HS聚合酶進行PCR反應。反應分三步驟完成：第一步驟由94℃(3分鐘)一個循環和94℃(30秒)、68℃(30秒)和72℃(2分鐘)35個循環所組成。對幾個有代表性的植物進行擴增子測序，以確認dgt-28基因已整合到靶系中。另外，將5'進-出PCR的擴增子稀釋且在1%TAE凝膠上運行，並使用BioRad Gel doc軟體而可視化，藉以鑑別含有約2.6Kb的預期擴增子大小的事件。
3’進-出PCR偵測(HDR)
dgt-28供體DNA在靶系內的插入是可以兩種定向中之一者而發生。dgt-28轉基因的整合和這種整合的定向(方向)是經由進-出PCR測定來確認。進-出PCR測定是使用設計為結合靶甘蔗桿狀病毒(sugar cane bacilliform virus)啟動子序列的「出」引子。此外，設計「進」引物以結合dgt-28供體序列。使用這些引子完成的擴增反應僅擴增被插入基因組靶基因座的供體基因。所得到的PCR擴增子由兩種引子所產生，且由跨越插入物連接處的序列所組成。測定中包含陽性和陰性對照。
使用終端PCR來檢測上述序列。使用~25ng模板基因組DNA、0.2μMdNTPs、0.4μM順向和反向引子以及0.25ul Ex Taq HS聚合酶進行PCR反應。反應分三步驟完成：第一步驟由94℃(3分鐘)一個循環和94℃(30秒)、63.9℃(30秒)和72℃(3分鐘)35個循環所組成。對幾個有代表性的植物進行擴增子測序，以確認dgt-28基因已整合到靶系中。另外，將3'進-出PCR的擴增子稀釋且在1%TAE凝膠上運行，並使用BioRad Gel doc軟體而可視化，藉以鑑別含有約3.2Kb的預期擴增子大小的事件。
3’進-出PCR偵測(OSI)
dgt-28供體DNA在靶系內的插入是可以兩種定向中之一者而發生。dgt-28轉基因的整合和這種整合的定向(方向)是經由進-出PCR測定來確認。進-出PCR測定是使用設計用於結合到經工程化著陸墊(ELP)的「出」引物。此外，設計「進」引物以結合dgt-28供體序列。使用這些引子完成的擴增反應僅擴增被插入基因組靶基因座的供體基因。所得到的PCR擴增子由兩種引子所產生，且由跨越插入物連接處的序列所組成。測定中包含 陽性和陰性對照。
使用終端PCR來檢測上述序列。使用~25ng模板基因組DNA、0.2μMdNTPs、0.4μM順向和反向引子以及0.25ul Ex Taq HS聚合酶進行PCR反應。反應分三步驟完成：第一步驟由94℃(3分鐘)一個循環和94℃(30秒)、64℃(30秒)和72℃(2分鐘)35個循環所組成。對幾個有代表性的植物進行擴增子測序，以確認dgt-28基因已整合到靶系內。另外，將3'進-出PCR的擴增子稀釋且在1%TAE凝膠上運行，並使用BioRad Gel docTM軟體而可視化，藉以鑑別含有約2.9Kb的預期擴增子大小的事件。
實例12：經由NHEJ、OSI和HDR確認玉米中的靶向和基因內重組
結果表明，玉米植物可利用NHEJ定向修復機制將來自一親本的供體DNA移動到位點特異性基因組基因座中。因此，含有與ZFN切割識別位點(來自pDAB118253)側接的經整合phi-yfp選擇性標記基因的轉基因植物是作為靶基因組基因座。此外，這些轉基因植物還含有無啟動子的dgt-28轉基因序列(沒有任何側翼同源臂或任何其他同源區域)，且與作為供體DNA序列的ZFN切割位點(來自pDAB118254)側接。在將上述轉基因植物與含有ZFN表達事件(來自pDAB118253)的第二轉基因植物進行雜交後，ZFN將經由切割識別序列(例如，eZFN1結合位點)而釋放供體，且還在基因組基因座處產生雙股斷裂，藉以釋放整合在第一轉基因植物內的phi-yfp標記物基因(在pDAB T股整合的eZFN位點處)。接著，供體基因(例如dgt-28轉基因)將經由NHEJ介導的重組機制而整合到位點特異性基因座內。可鑑別成功重組的植物而供在草甘膦上進行選擇，且這些植物不會表達PHI-YFP蛋白。靶和供體在子代植物內的同時切割和整合是發生在所有的細胞週期階段(G1、S、G2和M)，由此導致供體經由NHEJ介導的過程與pat選擇性標記物基因的官能化而移動到基因組靶基因座中。
可以在含有草甘膦的培養基上選擇靶事件(例如，Roundup herbicide；Monsanto,St.Louis,MO)。靶向插入事件的存在可經由使用先前描述的方法的單個進-出PCR反應和南方墨點法來檢測。確認PCR產物的預期凝膠片段大小和表示存在靶向插入的預期南方墨點帶型，且選擇含有適當靶向插入於基因組基因座內供體的子代植物。圖12、圖13、圖14和圖15提供基因組內 重組過程的示意圖，並將NHEJ介導和OSI方法與同源重組方法進行比較。確認HDR和NHEJ靶向的進-出PCR是描述於圖16中。總計，從NHEJ(表6)獲得11個進-出PCR陽性植物，而從HDR靶向(表7)獲得175個進-出PCR陽性植物。
實例13：玉米中靶向和基因內重組的確認
結果表明，玉米植物可利用NHEJ或OSI定向修復機制將來自一親本的供體DNA移動到位點特異性基因組基因座。因此，包含可操作地連接至側接ZFN切割識別位點(來自pDAB118253)的稻(Oryza sativa)泛素3啟動子(OsUbi3啟動子)的經整合phi-yfp報告基因的轉基因植物是作為靶基因組基因座。此外，這些轉基因植物還含有可操作地連接於來自水稻(Oryzae sativa)泛素3(Os ubi3內含子)的內含子的無啟動子dgt-28轉基因序列，其提供靶基因組基因座5'同源性(沒有任何側翼同源臂或任何其它同源性區域在3'端)且側接作為供體DNA序列的ZFN切割位點(來自pDAB118280)(圖17)。在將上述轉基因植物與含有ZFN表達事件(來自pDAB105825)的第二轉基因植物進行雜交後，ZFN將經由切割識別序列(例如，eZFN1結合位點)而釋放供體，且還在基因組基因座處產生雙股斷裂以釋放整合在第一轉基因植物內的phi-yfp標記物基因(在pDAB T股整合的eZFN位點處)。接著，供體基因(例如dgt-28轉基因)將經由OSI或NHEJ介導的重組機制而整合到位點特異性基因座內。c可鑑別成功重組的植物而供在草甘膦上進行選擇，且這些植物不會表達PHI-YFP蛋白。靶和供 體在子代植物內的同時切割和整合是發生在所有的細胞週期階段(G1、S、G2和M)，由此導致供體經由NHEJ介導的過程與pat選擇性標記物基因的官能化而移動到基因組靶基因座中。
在供體/靶和ZFN(以及無效)植物之間的雜交是使用受控授粉而進行。將含有ZFN基因表達盒的純合事件以交錯排列的方式加以種植，以確保從pDAB118253靶/pDAB118280供體植物掉落的花粉會使ZFN植物受精。從經雜交的植物收集未成熟的胚。
接著，使未成熟的胚在含有草甘膦的選擇性培養基上生長。篩選未成熟的玉米胚中存在的dgt-28轉基因，以鑑別含有功能性dgt-28轉基因的胚。使用用於pat、aad-1、dgt-28和phi-yfp的qPCR測定來測試前述植物。接著將qPCR陽性植物進行「進-出」終點PCR測試。「進-出」PCR測試測定未成熟胚中所預期重組事件的5'端存在。設計PCR反應以擴增跨越稻(Oryzae sativa)泛素3啟動子和dgt-28編碼序列的擴增子。「進-出」PCR測試也針對預期的重組事件的3'端進行測定。設計PCR反應以擴增跨越dgt-28編碼序列和特異於靶基因座的TLP1序列的擴增子(圖17)。接著將「進-出」PCR陽性的植物置入溫室，隨後使用序列分析進行分析。總計，對再生培養基上所選擇的66株植物進行OSI靶向的PCR確認，而對61株植物進行NHEJ靶向的確認(表18)。對選擇的「進-出」PCR陽性進行序列分析以作進一步確認。對5'端的預期完美修復而3'末端的插入缺失(indels/插入或缺失)進一步確認供體在靶基因座的OSI介導位點特異性整合(表19)。
儘管在某些實施例中已經描述本發明的各樣態，但是可以在本發明的精神和範圍內對其進行進一步修改。因此，本申請旨在含括使用其一般原理的本發明的實施例的任何變化、用途或修改。此外，本申請旨在含括這些與本發明相偏離的內容，這些偏離在這些實施例所屬領域的已知或慣例實踐中，且落入所附申請專利範圍內。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 使用經由非同源末端連接修復路徑的基因組內重組的轉基因的位點特異性整合
<130> 76767-US-NP
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13219
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB1585的基因表達盒
<400> 1
<210> 2
<211> 4137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB118259的基因表達盒
<400> 2
<210> 3
<211> 7339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB118257的基因表達盒
<400> 3
<210> 4
<211> 4148
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB118261的基因表達盒
<400> 4
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 6
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 7
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<211> 21
<212> DNA
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<223> 引子序列
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<212> DNA
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(IL-1)
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<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 17
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 18
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<211> 7743
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自pDAB118253的基因表達盒
<400> 24
<210> 25
<211> 5103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自pDAB118254的基因表達盒
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<211> 7256
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自pDAB113068的基因表達盒
<400> 26
<210> 27
<211> 7746
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自pDAB118280的基因表達盒
<400> 27
<210> 28
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 對Scd27的位點特異性核酸酶結合位點
<400> 28
<210> 29
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 對scd27的位點特異性核酸酶結合位點
<400> 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(IL-1)
<400> 30
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性結合位點(eZFN1)
<400> 31
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性結合位點(eZFN1)
<400> 32
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS8196)
<400> 33
<210> 34
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS8196)
<400> 34
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS19354)
<400> 35
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS19354)
<400> 36
<210> 37
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS15590)
<400> 37
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS15590)
<400> 38
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(eZFN8)
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<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(eZFN8)
<400> 40
<210> 41
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS18473)
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<210> 42
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位點特異性核酸酶結合位點(SBS18473)
<400> 42
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 43
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 45
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 49
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 50
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<212> DNA
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<223> 引子序列
<400> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 52
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<212> DNA
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<223> 引子序列
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<212> DNA
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<220>
<223> 引子序列
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<211> 20
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<223> 引子序列
<400> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
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<213> 人工序列
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<223> 引子序列
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<212> DNA
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<223> 引子序列
<400> 59
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<223> 引子序列
<400> 60
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<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子序列
<400> 64
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 66
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 69
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 70
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
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<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 72
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 73
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子序列
<400> 74

Claims (28)

  1. 一種用於將經整合的供體DNA插入植物基因組靶基因座內的方法，所述方法包括：a)提供包含有一基因組DNA的第一活體植物，所述基因組DNA包括被多個識別序列側接的所述供體DNA以及所述植物基因組靶基因座，其中所述植物基因組靶基因座包括至少一識別序列；b)提供含有一基因組DNA的一第二活體植物，所述基因組DNA包括將至少一鋅指核酸酶進行編碼的DNA，該至少一鋅指核酸酶被改造以在所述識別序列上切割所述基因組DNA；c)將所述第一和第二活體植物進行雜交，使得F1種子在所述第一或第二活體植物上產生；d)在該F1種子或一F1植物中表達該鋅指核酸酶，其中所述經表達的鋅指核酸酶於該識別序列切割該供體DNA和該基因組DNA；以及e)使包含有一基因組DNA的所得F1植物生長，其中該供體DNA經由非同源末端連接而被整合在該植物基因組靶基因座的該識別序列內。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該識別序列包括一第一和第二識別序列。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該第一和第二識別序列是相同的。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中所述鋅指核酸酶是藉由使所述第一和第二活體植物雜交而提供，使得所述鋅指核酸酶切割兩個識別序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該供體DNA和該植物基因組 靶基因座不相連接。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該供體DNA和該植物基因組靶基因座是位於同源染色體上，或位於非同源染色體上。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟a)的該植物基因組靶基因座更包括一表達盒，該表達盒是位於：a)在該第一與第二識別序列間；或b)在該第一識別序列外；或c)在該第二識別序列外。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述第一活體植物對於至少一基因組靶基因座是純合的，或對於至少一供體DNA是純合的。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述第一活體植物對於至少一基因組靶基因座是雜合的，或對於至少一供體DNA是雜合的。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該植物基因組靶基因座是：a)一轉基因基因座；或b)一內源基因座。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該鋅指核酸酶是由一啟動子所驅動，該啟動子是選自由花粉特異性啟動子、種子特異性啟動子和發育階段特異性啟動子所組成的群組。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該供體DNA包括一可選擇的標記物。
  13. 一種將轉基因傳遞到其他植物的方法，該方法包括：a)將由以包括一基因組靶基因座和該轉基因的經分離核酸分子而轉化的植物細胞或組織而再生的一第一植物與由以包括可操作地連接到一鋅指核酸酶的啟動子的經分離核酸分子而轉化的植物細胞或組織而再 生的一第二植物進行雜交；b)表達該鋅指核酸酶，使得一第一鋅指核酸酶單體與一第二鋅指核酸酶單體配對；c)獲得由前述雜交所產生的一F1植物，其中該轉基因經由非同源末端連接而特異性地且穩定地整合在該基因組靶基因座內；以及d)培育由前述雜交所產生的該F1植物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中從以包括可操作地連接到該鋅指核酸酶的該啟動子的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物是包括至少一鋅指核酸酶單體。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中從以包括可操作地連接到該鋅指核酸酶的該啟動子的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物是包括該第一和該第二鋅指核酸酶單體。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中從以包括可操作地連接到該鋅指核酸酶的該啟動子的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物是包括該第一鋅指核酸酶單體。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中從以包括該基因組靶基因座與該轉基因的該經分離的核酸分子而轉化的該植物細胞或組織再生的該植物更包括包括可操作地連接到一第二鋅指核酸酶的一啟動子的一經分離的核酸分子，其中所述第二鋅指核酸酶是包括所述第二鋅指核酸酶單體。
  18. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中步驟b)中的該第一和該第二鋅指核酸酶單體的該配對導致該轉基因的釋放和該基因組靶基因座的切割。
  19. 如申請專利範圍第1或13項所述之F1植物，更包括一轉基因事件。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之F1植物，其中該轉基因事件包括一農藝性狀。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之F1植物，其中該農藝性狀是選自由殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮利用效率性狀、水分使用效率性狀、營養品質性狀、DNA結合性狀、小RNA性狀、選擇標誌物性狀或其任何組合所組成之群組。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之F1植物，其中該農藝性狀包括一除草劑耐受性性狀。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之F1植物，其中該除草劑耐受性性狀包括一dgt-28編碼序列。
  24. 如申請專利範圍第21項所述之F1植物，其中該轉基因植物是產生一商品。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之F1植物，其中該商品是選自由蛋白質濃縮物、蛋白質分離物、穀物、膳食、麵粉、油或纖維所組成的群組。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之F1植物，其中該轉基因植物是選自由雙子葉植物或單子葉植物所組成的群組。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之F1植物，其中該單子葉植物是玉米植物。
  28. 如申請專利範圍第26項所述之F1植物，其中該雙子葉植物是煙草植物。
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