CN116355928A - 有效靶向转基因的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供适用于在转基因植物中提供蛋白质的有效转基因亚细胞定位的重组DNA分子和构建体。进一步提供用于赋予植物除草剂耐受性或抗性的重组DNA分子和构建体，以及展现除草剂耐受性的植物和产生或利用此类植物的方法。

Description

有效靶向转基因的组合物和方法
本申请是申请日为2016年12月19日、申请号为201680078294.7、发明名称为“有效靶向转基因的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月21日提交的美国临时申请号62/270,180和于2016年7月20日提交的美国临时申请号62/364,715的权益，这些临时申请以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明大体上涉及农业、植物生物技术以及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及用于产生展现除草剂耐受性或抗性的转基因植物的组合物和方法。
序列表的并入
通过电子提交将序列表的计算机可读形式与本申请一起提交，并且以全文引用的方并入本申请中。序列表包含在名为MONS389WO_ST25.txt的文件中，所述文件的大小为122千字节(在操作系统MS Windows中测量)并且创建于2016年12月19日。
相关技术描述
新颖转基因植物的产生为显著改进的作物植物提供展现诸如改进的除草剂耐受性等有益性状以允许增强的杂草控制策略的潜能。然而，虽然适用于在作物中产生有益性状的蛋白质为已知的，但在转基因植物细胞中这些重组蛋白的有效亚细胞定位(称为靶向)和加工仍然是重大障碍。因此需要能够将重组蛋白有效定位在植物细胞内的新颖转运肽。
概要
本发明的一个方面涉及一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含编码叶绿体转运肽(CTP)的DNA序列，所述DNA序列可操作地连接至编码麦草畏单加氧酶(DMO)或原卟啉原氧化酶(PPO)的DNA序列，其中CTP包含选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列。在某些实施方案中，编码CTP的DNA序列包含选自由SEQ ID NO:7-14组成的组的序列。在其他实施方案中，DMO或PPO包含选自由SEQ ID NO:18-27和40-59组成的组的多肽。在一个实施方案中，编码DMO或PPO的DNA序列包含选自由SEQ ID NO:28-37和61-102组成的组的序列。在特定实施方案中，将DMO或PPO定义为当在植物细胞中表达时能够赋予除草剂耐受性的除草剂耐受性蛋白质。在特定实施方案中，除草剂耐受性蛋白质为DMO蛋白，并且CTP包含选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列，或除草剂耐受性蛋白质为PPO蛋白，并且CTP包含选自由SEQ ID NO:1和2组成的组的序列。
在另一方面中，本发明提供一种包含重组DNA分子的DNA构建体，所述重组DNA分子如本文所描述可操作地连接至在植物细胞中起作用的异源启动子。
在另一方面中，本发明提供一种用本发明的重组DNA分子转化的转基因植物、植物细胞、植物部分或种子。在特定实施方案中，植物为单子叶植物。可在本发明情况下使用的单子叶植物包括但不限于玉米或小麦植物。在另一实施方案中，植物为双子叶植物。可在本发明情况下使用的双子叶植物包括但不限于大豆、棉花或芸苔属(Brassica)植物。
在另一方面中，提供本发明的重组DNA分子，所述重组DNA分子存在于非活植物材料内。在一个实例中，当植物细胞含有本发明的重组DNA分子时，这些植物细胞在本发明的范围内。在一个实施方案中，此类植物细胞可为可再生植物细胞或可为不能再生成植物的不可再生植物细胞。
在另一方面中，本发明提供产生商品产品的方法，所述商品产品包含可检测量的本发明的重组DNA分子，包括由其产生的产物。在某些实施方案中，本发明提供的商品产品包括不能活的种子或其部分、脱水的植物组织、冷冻的植物组织、加工的植物组织、膳食、粉末、薄片、麸皮以及纤维。商品产品可为能活的或不能活的。不能活的商品产品包括但不限于不能活的种子和谷粒；加工的种子、种子部分以及植物部分；脱水的植物组织、冷冻的植物组织以及加工的植物组织。本发明的商品产品含有可检测量的如本文所描述的重组DNA分子。检测本发明的重组DNA分子的方法为本领域中熟知的。
在另一方面中，本发明提供一种产生除草剂耐受性植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)用本发明的DNA构建体转化植物细胞，以及b)从包含DNA构建体的所转化的植物细胞再生出植物。在所述方法的一个实施方案中，再生的植物对选自由麦草畏和PPO抑制剂组成的组的除草剂具耐受性。
在另一方面中，本发明提供一种产生除草剂耐受性植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含本发明的重组DNA分子的亲本植物与自身或与第二植物杂交以产生一个或多个子代植物；以及b)选择包含所述DNA分子的子代植物。在所述方法的一个实施方案中，所述子代植物对选自由麦草畏和PPO抑制剂组成的组的除草剂具耐受性。
在另一方面中，本发明提供一种在植物细胞中表达PPO或DMO的方法，所述方法包括将本发明的重组DNA分子引入植物细胞中。在本发明的一个实施方案中，引入重组DNA分子包括转化植物细胞。
在另一方面中，本发明提供一种控制作物生长环境中的杂草生长的方法，所述方法包括以下步骤：a)将本发明的植物或种子种植在作物生长环境中；以及b)向作物生长环境施用可有效控制杂草生长的量的麦草畏或PPO抑制剂除草剂。在特定实施方案中，在芽前或芽后进行除草剂施用。在一个实施方案中，所述量的除草剂不会损害植物或种子。在所述方法的某些实施方案中，植物或种子为单子叶植物或种子，诸如玉米或小麦植物或种子。在其他实施方案中，植物或种子为双子叶植物或种子，诸如大豆、棉花或芸苔属植物。在其他实施方案中，除草剂为麦草畏或PPO抑制剂。
附图简述
图1.在依次于V2和V4和V8时施用0.036lb ai/英亩S-3100的除草剂施用处理之后表达可操作地连接至APG6(SEQ ID NO:1)或12G088600TP(SEQ ID NO:38)的H_N10(SEQ IDNO:43)的转基因F1玉米植物。
序列简述
SEQ ID NO:1为拟南芥(Arabidopsis thaliana)白化和淡绿色(APG6)CTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为SEQ ID NO:1的APG6 CTP的氨基末端优化的变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为拟南芥90kDa热休克蛋白(CR88)CTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为Ph.ShkG-CTP4 CTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为Ps.RbcS-3C CTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6为Os.Waxy CTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7-11为针对单子叶或双子叶表达优化的编码SEQ ID NO:1的APG6 CTP的核酸序列。
SEQ ID NO:12为编码SEQ ID NO:2的APG6 CTP的核酸序列。
SEQ ID NO:13和14分别为针对单子叶或双子叶表达优化的编码At.CR88 CTP的核酸序列。
SEQ ID NO:15-17分别为编码SEQ ID NO:4-6的核酸序列。
SEQ ID NO:18-27为编码麦草畏单加氧酶(DMO)变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28-37分别为编码SEQ ID NO:18-27的DMO变体的核酸序列。
SEQ ID NO:38为针对双子叶表达优化的棉花12G088600TP叶绿体转运肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39为编码SEQ ID NO:38的核酸序列。
SEQ ID NO:40为H_N90的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41为H_N20的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42为H_N60的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43为H_N10的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44为H_N30的氨基酸序列
SEQ ID NO:45为H_N40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46为H_N50的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47为H_N70的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48为H_N100的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49为H_N110的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50-56分别为对应于SEQ ID NO:40、41、43、44、45、46以及48的缺少起始甲硫氨酸的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57-58为SEQ ID NO:50的氨基酸变体。
SEQ ID NO:59为SEQ ID NO:56的氨基酸变体。
SEQ ID NO:60为来自糙果苋(Amaranthus tuberculatus)(水麻)(WH_PPO)的原卟啉原氧化酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61-70分别为针对大肠杆菌(E.coli)表达密码子优化的编码SEQ IDNO:40-49的核苷酸序列。
SEQ ID NO:71-80分别为针对双子叶表达密码子优化的编码SEQ ID NO:40-49的核苷酸序列。
SEQ ID NO:81-87分别为编码针对双子叶表达密码子优化的SEQ ID NO:50-56的核苷酸序列。
SEQ ID NO:88和91分别为SEQ ID NO:50和51的核苷酸变体。
SEQ ID NO:89、90以及92分别为编码SEQ ID NO:57-59的核苷酸序列。
SEQ ID NO:93-102分别为针对单子叶表达密码子优化的编码SEQ IDNO:40-49的核苷酸序列。
详细描述
用于在细胞内定位除草剂耐受性蛋白质的叶绿体转运肽(CTP)为本领域中已知的，但任何CTP和除草剂耐受性蛋白质组合的有效亚细胞定位和加工的程度均难以预测。定位和加工决定了除草剂耐受性蛋白质的表达水平和功能，并且因此影响包含所述蛋白质的转基因细胞、植物或种子的除草剂耐受性表型。已在转基因植物中在存在包括麦草畏单加氧酶(DMO)和原卟啉原氧化酶(PPO)的适用除草剂耐受性蛋白质的情况下对各种CTP进行了测试。然而，经常观察到蛋白质的不良或不完整加工和定位。
本发明通过提供能够提供改进的叶绿体定位和加工的新颖重组DNA分子以及组合物和其使用方法克服了这些障碍。本发明的重组DNA分子包含编码可操作地连接至DMO或PPO的CTP的DNA序列。本发明的重组DNA分子在包含重组DNA分子的植物中提供DMO或PPO的叶绿体定位以及对麦草畏或PPO除草剂的改进的耐受性。
在某些实施方案中，本发明提供重组DNA分子，所述重组DNA分子包含编码包含选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列的CTP的DNA序列，所述DNA序列可操作地连接至编码除草剂耐受性蛋白质的DNA序列。在一些实施方案中，本发明提供重组DNA分子，所述重组DNA分子包含编码CTP(诸如具有选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列的CTP)的DNA序列，所述DNA序列可操作地连接至编码DMO蛋白(例如具有选自由SEQ ID NO:18-27组成的组的序列的DMO蛋白)的DNA序列。在其他实施方案中，本发明提供重组DNA分子，所述重组DNA分子包含编码CTP(诸如具有选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列的CTP)的DNA序列，所述DNA序列可操作地连接至编码PPO蛋白(诸如具有选自由SEQ ID NO:40-60组成的组的序列的PPO蛋白)的DNA序列。
重组DNA分子
如本文所用，术语“重组”是指作为基因工程化的结果并且因此将通常不存在于自然界中并且通过人为干预而形成的非天然DNA、多肽、蛋白质、细胞、种子或植物。“重组DNA分子”为所包含的DNA序列并非天然存在而是人为干预的结果的DNA分子，诸如包含彼此异源的至少两个DNA分子的组合的DNA分子。重组DNA分子的实例为编码包含选自由SEQ IDNO:1-3组成的组的序列的CTP的DNA分子可操作地连接至编码包含选自由SEQ ID NO:18-27组成的组的序列的DMO蛋白的DNA序列。下表1中提供了DMO蛋白的实例。
表1.麦草畏单加氧酶(DMO)
Figure BDA0004158883370000071
重组DNA分子的另一实例为编码包含选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列的CTP的DNA分子可操作地连接至编码包含选自由SEQ ID NO:40-60组成的组的序列的PPO蛋白的DNA序列。重组细胞、种子或植物为包含转基因DNA的细胞、种子或植物，例如包含本发明的重组DNA分子的转基因细胞、种子、植物、植物部分。下表2中提供了PPO蛋白的实例。
表2.原卟啉原氧化酶(PPO)
Figure BDA0004158883370000081
下表3中提供了可根据本发明使用的CTP序列的实例。
表3.叶绿体转运肽(CTP)
Figure BDA0004158883370000082
Figure BDA0004158883370000091
如本文所用，术语“分离的DNA分子”意味着DNA分子单独存在或与其他组合物组合存在，但不在其天然环境内。举例来说，当包含蛋白质编码序列和异源CTP序列的重组DNA分子存在于转基因植物、细胞或种子的基因组中时为分离的DNA分子，因为所述重组DNA分子的组分不在其天然环境(即最早观测到每个组分的有机体基因组)中。存在于转基因植物基因组中的重组DNA分子为分离的DNA分子，只要重组DNA分子不是天然存在于所述植物基因组中，并且因此与其天然环境分离即可。
如本文所用，术语“基因工程化”是指通过人为干预形成通常不会存在于自然界中的DNA、蛋白质或有机体。可使用基因工程化来产生在实验室中设想并且使用诸如分子生物学、蛋白质生物化学、细菌转化以及植物转化等生物技术中的一种或多种技术形成的DNA、多肽、蛋白质、细胞、种子或植物。举例来说，可使用基因工程化来形成嵌合基因，所述嵌合基因包含编码包含选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列的CTP的DNA分子，所述DNA分子可操作地连接至包含选自由SEQ ID NO:18-27组成的组的序列的DMO蛋白；并且任选可进一步包含在植物细胞中起作用的异源启动子。在另一个实例中，可使用基因工程化来形成嵌合基因，所述嵌合基因包含编码包含选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列的CTP的DNA分子，所述DNA分子可操作地连接至包含选自由SEQ ID NO:40-60组成的组的序列的PPO蛋白；并且任选可进一步包含在植物细胞中起作用的异源启动子。可使用诸如基因克隆、DNA连接以及DNA合成等分子生物学技术中的一种或多种来产生此类嵌合基因。
术语“转基因”是指由于人为干预，诸如通过植物转化方法而人工合并至有机体基因组中的DNA分子。如本文所用，术语“转基因”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指基因组中包含转基因的植物，并且“转基因性状”是指由合并至植物基因组中的转基因的存在所传递或赋予的特征或表型。由于此类基因组改变，转基因植物为与相关野生型植物明显不同的植物，并且转基因性状为不天然存在于野生型植物中的性状。本发明的转基因植物包含本发明提供的重组DNA分子。
如本文所用，术语“异源”是指源自于不同来源并且因此在自然界中通常不相关的两种或更多种物质之间的关系。举例来说，DMO蛋白就可操作地连接的CTP来说为异源的，如果这种组合在自然界中通常不存在。在另一个实例中，编码可操作地连接至DMO蛋白的CTP的重组DNA分子就可操作地连接的在植物细胞中起作用的启动子来说为异源的，如果这种组合在自然界中通常不存在。当特定重组DNA分子不会天然存在于其所插入的细胞、种子或有机体中时，它也可就所述特定细胞、种子或有机体来说为异源的。
如本文所用，术语“蛋白质编码DNA分子”或“多肽编码DNA分子”是指包含如下DNA序列的DNA分子，所述DNA序列编码蛋白质或多肽，诸如用于赋予除草剂耐受性或控制昆虫的蛋白质或多肽。“蛋白质编码序列”或“多肽编码序列”意指编码蛋白质或多肽的DNA序列。“序列”意指核苷酸或氨基酸的顺序排列。蛋白质编码序列或多肽编码序列的边界通常由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子确定。蛋白质编码分子或多肽编码分子可包含编码蛋白质或多肽序列的DNA序列。如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”、“多肽表达”、“表达蛋白质”以及“表达多肽”意指通过将DNA分子转录成信使RNA(mRNA)并且将mRNA翻译成可最终折叠成蛋白质的多肽链的过程来产生蛋白质或多肽。可使蛋白质编码DNA分子或多肽编码DNA分子可操作地连接至DNA构建体中的异源启动子，以用于在用重组DNA分子转化的细胞中表达蛋白质或多肽。如本文所用，“可操作地连接”意指两个DNA分子以使得一个DNA分子可影响另一个DNA分子的功能的方式连接。可操作地连接的DNA分子可为单个连续分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。举例来说，启动子与DNA构建体中的蛋白质编码DNA分子或多肽编码DNA分子可操作地连接，其中两个DNA分子被排列成使得启动子可影响转基因的表达。
本发明的重组DNA分子包括可操作地连接至CTP序列的编码DMO的DNA序列。如本文所用，“麦草畏单加氧酶”或“DMO”意指能够酶催化麦草畏(3,6-二氯-邻甲氧基苯甲酸)降解成3,6-二氯水杨酸(3,6-DCSA)的加氧酶，诸如由来自嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的脱甲基酶(dmo)基因编码的麦草畏单加氧酶。麦草畏单加氧酶为本领域中已知的并且包括在表1中以SEQ ID NO:18-27形式提供并且识别的蛋白质序列。
本发明的重组DNA分子包括可操作地连接至CTP序列的编码PPO的DNA序列。如本文所用，“原卟啉原氧化酶”或“PPO”意指能够将原卟啉原IX酶促转化为原卟啉IX的氧化酶。原卟啉原氧化酶为本领域中已知的并且包括在表2中以形式SEQ ID NO:40-60提供并且识别的蛋白质序列。
本发明的重组DNA分子包括编码CTP序列的DNA序列，所述DNA序列可操作地连接至本发明提供的蛋白质编码DNA分子，借此CTP有助于将重组蛋白质分子定位在细胞内。CTP在本领域中也被称为信号序列、靶向序列、靶向肽以及定位序列。叶绿体在本领域中也被称为质体。通过促进细胞内的蛋白质定位，CTP确保蛋白质定位于叶绿体以获得最佳酶活性，并且可增加重组蛋白质的积累并防止蛋白质发生蛋白水解降解。在易位至叶绿体中时，CTP典型地从蛋白质上裂解下来，也被称为加工。CTP加工可为完整的(意味着完整的CTP从蛋白质的氨基末端裂解)、不完整的(意味着CTP的一个或多个氨基酸保留在蛋白质的氨基末端)或导致从蛋白质的氨基末端去除一个或多个氨基酸。从DMO蛋白完整加工CTP使蛋白质积累的水平增加，由此使麦草畏耐受性增加并且使施用除草剂后转基因细胞、种子或有机体中的损伤水平降低。表3中以SEQ ID NO:1-6和38形式提供并且识别了CTP。以SEQ ID NO:7-17和39形式提供了针对在双子叶和单子叶中的表达优化的编码每个CTP的DNA序列。
可完全或部分地通过本领域中已知的方法来合成和修饰本公开的重组DNA分子，尤其是在希望提供适用于DNA操纵的序列(诸如限制性酶识别位点或基于重组的克隆位点)、植物优选序列(诸如植物密码子使用或Kozak共有序列)或适用于DNA构建体设计的序列(诸如间隔或接头序列)的情况下。本公开的重组DNA分子包括编码与本文提供的DNA序列相同的氨基酸序列的简并DNA序列。可使用本领域已知的方法和DNA密码子表来制备简并DNA序列。本发明包括与本文提供的重组DNA分子或多肽序列中的任一种具有至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性以及至少99％序列同一性的重组DNA分子和蛋白质。举例来说，本发明的重组DNA分子可包含与选自由SEQ ID NO:7-14组成的组的序列或与选自由SEQID NO:28-37和61-102组成的组的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的DNA序列。本发明的重组DNA分子可编码与选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列或与选自由SEQ ID NO:18-27和40-59组成的组的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的蛋白质序列。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“序列同一性％”是指在最佳比对两个序列(在比较窗内具有总计不到参考序列的20％的适当核苷酸或氨基酸插入、缺失或空位)时，与测试(“主题”)序列(或其互补链)相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或多肽序列中的相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗的最佳序列比对是本领域的技术人员所熟知的并且可通过诸如以下各项的工具来实施：Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，并且由这些算法的计算机化实现方式来实施，诸如使用默认参数的作为
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(Accelrys Inc.,San Diego,CA)、MEGAlign(DNAStar Inc.,1228S.Park St.,Madison,WI 53715)以及MUSCLE(3.6版)(Edgar,Nucleic AcidsResearch 32(5):1792-7,2004)的一部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共享的相同组分数目除以参考序列片段中组分总数，即整个参考序列或参考序列的较小限定部分。序列同一性百分比以同一性分数乘以100来表示。一个或多个序列的比较可以是针对全长序列或其一部分，或针对更长的序列。
如本文所用，“DNA构建体”为包含两个或更多个异源DNA序列的重组DNA分子。DNA构建体适用于转基因表达，并且可包含在载体和质粒中。可出于转化(即将异源DNA引入宿主细胞中)的目的将DNA构建体用于载体中，以便产生转基因植物和细胞，并且因此也可含于转基因植物、种子、细胞或植物部分的质粒DNA或基因组DNA中。如本文所用，“载体”意指可用于植物转化目的的任何重组DNA分子。可例如将如序列表中所阐述的重组DNA分子作为构建体的一部分插入载体中，所述构建体具有可操作地连接至基因表达元件的重组DNA分子，所述基因表达元件在植物中起作用以影响由重组DNA分子编码的蛋白质的表达。用于构建DNA构建体和载体的方法为本领域中熟知的。DNA构建体或包含DNA构建体的载体的组分通常包括可操作地连接至可转录DNA序列的一种或多种基因表达元件，诸如以下各项：用于表达可操作地连接的DNA的启动子、可操作地连接的蛋白质编码DNA分子以及3’非翻译区。适用于实践本发明的基因表达元件包括但不限于以下类型的元件中的一种或多种：启动子、5’非翻译区、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、3’非翻译区以及一个或多个可选择标记物转基因。
本发明的DNA构建体可包括可操作地连接至本发明提供的蛋白质编码DNA分子的启动子，借此启动子驱动重组蛋白分子的表达。适用于实践本发明的启动子包括那些在细胞中起作用以表达可操作地连接的多核苷酸的启动子，诸如细胞或植物启动子。植物启动子是多种多样的并且是本领域中熟知的，并且包括诱导型的、病毒的、合成的、组成型的、时间调控型的、空间调控型的和/或时空调控型的那些植物启动子。
如本文所用，“阴性对照”和“阳性对照”意指为比较目的而设计的实验对照。举例来说，转基因植物分析中的阴性对照或阳性对照可为类型与实验植物(即所要测试的植物)相同但不含实验植物的转基因插入片段、重组DNA分子或DNA构建体的植物。适用于与转基因玉米植物比较的植物的实例为非转基因LH244玉米(美国专利号6,252,148)或非转基因01DKD2玉米(美国专利号7,166,779)，适用于与转基因大豆植物比较的为非转基因A3555大豆(美国专利号7,700,846)或非转基因A3244大豆(美国专利号5,659,114，PVP 9600246)，适用于与转基因卡诺拉(canola)或甘蓝型油菜(Brassica napus)植物比较的为非转基因甘蓝型油菜品种65037恢复系，适用于与转基因小麦植物比较的为非转基因小麦品种Samson种质(PVP 1994)，并且适用于与转基因棉花植物比较的为非转基因DP393(美国专利号6,930,228PVP 200400266)。
转基因植物
本发明的一个方面包括包含本发明提供的重组DNA分子的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物以及转基因种子。这些包含重组DNA分子的细胞、组织、植物以及种子展现对除草剂的耐受性。
将转基因DNA(称为“转基因”)插入植物的基因组中可通过植物转化行为来实现并且引起新的转基因基因组分子序列的形成，称为“事件”。每个事件为独特的并且事件的DNA序列对事件具特异。适合用于转化用于本发明的宿主植物细胞的方法实际上包括可将DNA引入细胞中的任何方法(例如其中重组DNA构建体被稳定整合至植物染色体中)，并且为本领域中熟知的。插入中的重组DNA构建体用于将重组DNA构建体引入植物中的示例性方法包土壤杆菌属(Agrobacterium)转化系统和DNA粒子轰击，这两种方法均为本领域技术人员熟知的。用于将重组DNA构建体引入植物中的另一示例性方法是通过定点整合的方法将重组DNA构建体在预定位点插入植物基因组中。定点整合可通过本领域已知的任何方法，例如通过使用锌指核酸酶、工程化或天然的大范围核酸酶、TALE-内切核酸酶或RNA引导的内切核酸酶(例如CRISPR/Cas9系统)来完成。然后可通过植物细胞培养的方法从转化的植物细胞再生出转基因植物。可通过将含有单个转基因等位基因的转基因植物与自身(例如R0植物)自花授粉(自交)以产生R1种子来获得关于转基因纯合的转基因植物(即，转基因的两个等位基因拷贝)。所产生的R1种子中有四分之一关于转基因将为纯合的。典型地使用SNP分析、DNA测序或允许区分杂合子与纯合子的热扩增分析来测试从发芽的R1种子生长的植物的接合性，称为接合性分析。
本发明提供的植物、种子、植物部分、植物组织以及细胞可展现对麦草畏的除草剂耐受性。可向包含本发明提供的植物和种子的植物生长区域施用麦草畏作为控制杂草，包括防止杂草生长的方法。本发明提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状并且因此对麦草畏施用具耐受性。除草剂施用可为推荐的商业比率(1X)或其任何分数或倍数，诸如推荐商业比率的两倍(2X)。麦草畏施用比率可以每英亩每磅酸当量(lb ae/英亩)或每公顷每克酸当量(g ae/ha)来表示。在施用除草剂时，植物生长区可包括或可不包括杂草植物。用于在一个区域中控制杂草的麦草畏的除草有效剂量应在生长季节内由约0.1X至约30X标记比率的范围组成。麦草畏的1X标记比率为0.5lb ae/英亩。除草剂比率可如下在英制与公制之间转换：(lb ai/ac)*1.12＝(kg ai/ha)，以及(kg ai/ha)*0.89＝(lb ai/ac)。
植物、种子、植物部分、植物组织以及细胞可对一种或多种称为PPO除草剂的PPO抑制剂展现耐受性。可向包含本发明提供的植物和种子的植物生长区域施用一种或多种PPO除草剂作为控制杂草，包括防止杂草生长的方法。本发明提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状并且因此对一种或多种PPO除草剂的施用具耐受性。除草剂施用可为推荐的商业比率(1X)或其任何分数或倍数，诸如推荐商业比率的两倍(2X)。在施用除草剂时，植物生长区可包括或可不包括杂草植物。用于在一个区域中控制杂草的PPO除草剂的除草有效剂量应在生长季节内由约0.1X至约30X标记比率的范围组成。PPO除草剂为本领域中熟知的并且可商购获得。PPO除草剂的实例包括但不限于二苯醚(诸如三氟羧草醚(acifluorfen)、其盐和酯、苯草醚(aclonifen)、甲羧除草醚(bifenox)、其盐和酯、氟乳醚(ethoxyfen)、其盐和酯、氟除草醚(fluoronitrofen)、呋氧草醚(furyloxyfen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、其盐和酯、乳氟禾草灵(lactofen)、其盐和酯、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)以及氟磺胺草醚(fomesafen)、其盐和酯)；噻二唑(诸如嗪草酸甲酯(fluthiacet-methyl)和噻二唑草胺(thidiazimin))；嘧啶二酮或苯基尿嘧啶(诸如双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、[3-2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS注册号353292-31-6并且在本文中称为S-3100)、氟嘧苯甲酸(flupropacil)、苯嘧磺草胺(saflufenacil)以及汰芬那(tiafenacil))；苯基吡唑(诸如异丙吡草酯(fluazolate)、吡草醚(pyraflufen)以及吡氟苯草酯(pyraflufen-ethyl))；噁二唑(诸如丙炔噁草酮(oxadiargyl)和噁草酮(oxadiazon))；三唑啉酮(诸如唑啶草酮(azafenidin)、苯卡巴腙(bencarbazone)、唑草酮(carfentrazone)、其盐和酯以及甲磺草胺(sulfentrazone))；噁唑烷二酮(诸如环戊噁草酮(pentoxazone))；N-苯基邻苯二甲酰亚胺(诸如吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟烯草酸(flumiclorac)、氟亚胺草酯(flumiclorac-pentyl)以及丙炔氟草胺(flumioxazin))；苯并噁嗪酮衍生物(诸如1,5-二甲基-6-硫基(thioxo)-3-(2,2,7-三氟-3,4-二氢-3-氧代-4-丙-2-炔基-2H-1,4-苯并噁嗪-6-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二酮)；氟哒嗪草酮(flufenpyr)和氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)；双唑草腈(pyraclonil)；以及氟唑草胺(profluazol)。
除草剂施用可为依次进行的或者与若干除草剂中的一种、两种或组合或任何其他相容除草剂槽混。可在生长季节内对包含本发明的转基因植物的区域使用一种除草剂或两种或更多种除草剂组合或单独的多次施用以控制广谱双子叶杂草、单子叶杂草或两者，例如两次施用(诸如种植前施用和芽后施用或芽前施用和芽后施加)或三次施用(诸如种植前施用、芽前施用以及芽后施用或芽前施用和两次芽后施用)。
如本文所用，“耐受性”和“除草剂耐受性”意指植物、种子或细胞抵抗除草剂施用时的毒性作用的能力。可通过将植物、种子、植物组织、植物部分或细胞与合适的实验对照进行比较来测量植物、种子、植物组织、植物部分或细胞的除草剂耐受性。举例来说，可如下测量或评估除草剂耐受性：通过向包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组DNA分子的植物(测试植物)和不包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组DNA分子的相同种类的植物(阴性对照植物)施用除草剂，并且然后比较两种植物的植物损伤，其中测试植物的除草剂耐受性是由与阴性对照植物的损伤级别相比损伤级别降低来指示。当与阴性对照植物、种子、植物组织、植物部分或细胞相比时，除草剂耐受性植物、种子、植物组织、植物部分或细胞展现对除草剂的毒性作用的反应降低。如本文所用，“除草剂耐受性性状”为与阴性对照植物相比赋予植物改善的除草剂耐受性的转基因性状。
本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞以及植物部分还可含有一种或多种额外转基因性状。可通过使含有包含本发明提供的重组DNA分子的转基因的植物与含有额外转基因性状的另一植物杂交来引入额外转基因性状。如本文所用，“杂交”意指培育两种个别植物以产生子代植物。因此，可使两种转基因植物杂交以产生含有转基因性状的子代。如本文所用，“子代”意指亲本植物的任何传代的后代，并且转基因子代包含由本发明提供并且从至少一种亲本植物遗传的DNA构建体。或者，可通过用包含本发明提供的重组DNA分子的DNA构建体共转化DNA构建体以获得额外转基因性状(例如其中所有DNA构建体作为用于植物转化的同一载体的部分而存在)或通过将额外性状插入包含本发明提供的DNA构建体的转基因植物中或反之亦然(例如通过使用关于转基因植物或植物细胞的植物转化的任何方法)来引入所述额外转基因性状。此类额外转基因性状包括但不限于增加的昆虫抗性、增加的水利用效率、增加的产量性能、增加的抗旱性、增加的种子质量、改进的营养质量、杂交种子产生和除草剂耐受性，其中性状是相对于野生型植物而测量的。此类额外转基因性状为本领域的技术人员已知的；例如美国农业部(USDA，United States Department ofAgriculture)动物和植物健康检查服务中心(APHIS，Animal and Plant HealthInspection Service)提供了此类性状的列表。
含有本发明提供的转基因性状的转基因植物和子代可与本领域中通常已知的任何培育方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物系中，转基因性状可为独立分离的、相连的或者在包含三种或更多种转基因性状的植物系中为两者的组合。还考虑了与亲本植物回交以及与非转基因植物异型杂交，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的培育方法的描述是本领域的技术人员熟知的。为了证实转基因在特定植物或种子中的存在，可进行多种分析。此类分析包括例如分子生物学分析，诸如南方墨点法(Southernblotting)和北方墨点法(northern blotting)、PCR以及DNA测序；生物化学分析，诸如例如通过免疫学手段(ELISA和西方墨点法(Western blots))或通过酶功能来检测蛋白质产物的存在；植物部分分析，诸如叶或根分析；以及通过分析整株植物的表型。为了分析特定转基因植物或种子中的CTP加工，可对从转基因细胞、植物或种子获得的重组DMO或PPO蛋白进行诸如埃德曼降解测序(Edman degradation sequencing)或质谱分析等分析，并且将所得序列数据分别与DMO或PPO蛋白相比较。
作为回交转化过程的结果实现转基因性状种质渗入至植物基因型中。可将已种质渗入转基因性状的植物基因型称为回交转化的基因型、系、近交种或杂交种。类似地，可将缺乏所需转基因性状的植物基因型称为未转化的基因型、系、近交种或杂交种。
如本文所用，术语“包含”意指“包括但不限于”。
实施例
包括以下实施例以展示本发明的实施方案。根据本公开，本领域技术人员应当认识到，可在所提供的具体实施方案中作出许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果，而不会脱离本发明的范围和概念范围。更具体地说，将显而易见的是，可将化学和生理学相关的某些试剂用本文所描述的获得相同或相似的结果的试剂代替。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类替代和修改被认为在本发明的范围和概念以内。
实施例1：大豆原生质体中的CTP-DMO表达和定位
使用大豆原生质体分析来评估包含可操作地连接至DMO序列(SEQ ID NO:27)的五种CTP中的一种的重组蛋白的相对叶绿体靶向效率。为了监测重组蛋白质的胞液和叶绿体分布，将编码绿色荧光蛋白的序列添加至编码重组CTP和DMO组合(在本文中称为CTP-DMO)的盒中，使得绿色荧光蛋白融合至DMO的羧基末端。
从豆子叶(种质A3244)制备原生质体。收获未成熟的大豆种子荚并且使用无菌技术移去种子(4-6mm长)。手动移去每个种子的子叶，横向切成1mm碎片，并且在CPW缓冲液(pH5.8)中在存在0.7M甘露醇的情况下在24-26℃下在黑暗中孵育1小时，同时在40RPM下振荡。然后移去缓冲液并且用酶缓冲液(4％纤维素酶‘onozuka’R-10；2％半纤维素酶；0.3％离析酶R-10；于CPW缓冲液(pH 5.8；含0.49M甘露醇)代替。将子叶组织在旋转振荡器上在50rpm下在24-26℃下孵育2小时。在此孵育结束时通过手动旋转平板并且将悬浮液通过双层60um尼龙网过滤至50mL锥形管中来从子叶组织释放大豆原生质体。使用再悬浮和离心将原生质体轻轻洗涤一次。将最终的球粒再悬浮于缓冲液(4mM MES，pH 5.7；150mM NaCl；5mMCaCl2；0.5M甘露醇)中并且在冰上静置1小时。然后将原生质体离心，并且将球粒再悬浮于转化缓冲液(0.4M甘露醇；15mM MgCl2；4mM MES，pH 5.7)中。调节体积以允许每毫升1x 10,000,000个原生质体。通过将每种构建体的12.5μg DNA混合来完成转化。将DNA与1.5x 1,000,000个原生质体轻轻混合，随后添加相等体积的PEG缓冲液。将其孵育5分钟，然后用300μl的W5缓冲液(154mM NaCl；125mM CaCl2；5mM KCl；2mM MES，pH 5.7)缓慢稀释。将其孵育5-10分钟，并且然后缓慢添加900μl的W5缓冲液。使原生质体集结成粒并且将其再悬浮于WI缓冲液(0.5M甘露醇；4mM MES(pH 5.7)；20mM KCl)中并且在24-26℃下在黑暗中孵育。使用配备有氪氩离子(458,488nm)激光器、绿色(543nm)氦氖激光器以及FITC和德克萨斯红(Texas red)滤光片集合的Zeiss LSM510 META激光扫描显微镜(Carl ZeissMicroImaging,Inc.,Thornwood,NY)来进行显微镜分析。使用ZEN 2012v.8.1(Carl ZeissMicroImaging,Inc.,Thornwood,NY)和40X水浸1.2数值孔径物镜来进行图像采集和分析。所用的激发波长为488nm(GFP)和543nm(叶绿体自体荧光)，并且发射滤光片为500-530nm(GFP)和630-700nm(叶绿体自体荧光)。对于每种构建体，对至少50个个别细胞的构建体定位进行评分：胞液、质体或胞液与质体两者。以蛋白质定位在胞液或质体(或两者)中的细胞占所分析细胞总数目的百分比的形式来记录结果，并且在表4中提供。
表4.大豆原生质体靶向分析
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在所分析的五种CTP-DMO组合中，仅APG6 CTP(SEQ ID NO:1)使得100％的细胞显示蛋白质仅定位于质体。At.CR88 CTP(SEQ ID NO:3)使得94％的细胞显示蛋白质仅定位于质体，并且6％的细胞显示蛋白质定位于胞液和质体。‘A’CTP使得79％的细胞显示蛋白质仅定位于质体，并且21％的细胞显示定位于胞液和质体。‘B’CTP使得9％的细胞显示蛋白质仅定位于质体，并且91％的细胞显示定位于质体和胞液。‘C’CTP使得18％的细胞显示蛋白质仅定位于质体，并且82％的细胞显示定位于质体和胞液。没有CTP，蛋白质仅存在于胞液中。这些结果表明，APG6 CTP对于将CTP-DMO靶向至质体为100％有效的，并且At.CR88 CTP对于将CTP-DMO靶向至质体为94％有效的。
实施例2：转基因小麦中的CTP-DMO加工
使用用包含编码可操作地连接至DMO的四种独立CTP中的一种的重组DNA分子的DNA构建体转化的转基因小麦植物来评估蛋白质表达并且确定CTP加工。
使用四种不同的植物转化载体来产生转基因小麦植物，每种植物转化载体包含含有可操作地连接至与启动子可操作地连接的DMO的四种不同CTP中的一种的DNA构建体。使用本领域技术人员已知的方法使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)来转化预培养的Samson种质(PVP 1994)小麦的未成熟胚以产生转基因幼苗。取叶样品进行分子分析以确认每个独特事件的基因组中的转基因拷贝数，并且使具有一个转基因拷贝的R0植物自交并且收集R1种子。
将种子(50g)研磨成粉末，然后将其添加至250ml提取缓冲液(1xTBE(89mM Tris-硼酸盐，2mM EDTA，pH 8.4)、200mM NaCl、10％甘油、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5mM苯甲脒、2mM二硫苏糖醇(DTT)、cOmpleteTM蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics Corporation,Indianopolis,IN))中，并且用
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(VWR,Radnor,PA)均质化约20秒，然后在振荡下在4℃下孵育1至2小时。将混合物在4℃下在9,000rpm下离心25min并且将上清液依次用10％和55％饱和硫酸铵(AS)沉淀，每个沉淀步骤在18,000rpm下离心20分钟。将来自10％AS沉淀的球粒丢弃。
将来自10-55％级分的球粒与1片cOmpleteTM蛋白酶抑制剂一起溶解于30ml的PBS(0.1M磷酸钠，0.15M NaCl)中。将溶解的球粒离心，并且通过0.22um膜过滤上清液。将针对DMO的山羊多克隆抗体血清与PierceTM蛋白质A/G琼脂糖树脂(ThermoFischer Scientific,Grand Island,NY)的1:1悬浮液混合，在1.5小时后，将加载抗DMO Ab的蛋白质A/G琼脂糖树脂用PBS洗涤3次并且添加至约30ml的10％-55％AS过滤级分中。在孵育之后，将树脂旋转并且用PBS洗涤3次，然后再悬浮于1ml PBS中并且转移至微量离心管中并且再次使其集结成粒。
将最终的球粒再悬浮于2X利姆里缓冲液(Laemmli buffer)中，煮沸5分钟，并且使样品在10％SDS-PAGE凝胶上在Tris-甘氨酸缓冲液中在185V(恒定)下运行。使用CAPS转移缓冲液将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜，在4℃和100V下持续30min。将PDVF膜结合的蛋白质用考马斯蓝(Coomassie blue)染色约30秒，并且将对应于10％-55％AS级分中的每种DMO蛋白的条带从PVDF墨点上切下并且用于氨基末端蛋白质序列分析。通过自动埃德曼降解化学来进行氨基末端蛋白质测序，每次分析使用自动埃德曼降解化学进行15个循环。使用具有140C微梯度泵和珀金埃尔默系列(Perkin Elmer Series)200UV/Vis检测器的应用生物系统494
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测序系统来进行分析，使用Procise Control(2.1版)软件(ThermoFischer Scientific,Grand Island,NY)来控制。使用/>
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(2.1版)蛋白质测序分析软件收集色谱数据。如果观察到至少8个氨基酸与预期蛋白质的预测序列一致，那么确定每一种蛋白质的身份。表5中呈现了氨基末端测序的结果。
表5.重组蛋白的氨基末端测序
Figure BDA0004158883370000213
使用命名DMO、DMO+1、DMO+10以及DMO+12来指示蛋白质测序表明在加工之后CTP中分别有0、1、10或12个氨基酸保留在的DMO的氨基末端。使命名DMO-1来指示在加工后DMO的头一个甲硫氨酸被去除。针对可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的APG6 CTP(SEQ ID NO:1)测试了两个独特事件。两个样品均显示在加工后CTP的一个氨基酸保留在DMO的氨基末端(DMO+1)。针对可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的At.CR88 CTP(SEQ ID NO:3)测试了三个独特事件。全部三个样品均显示在加工后CTP的零或一个氨基酸保留在DMO的氨基末端(DMO和DMO+1)。所测试的来自可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:19)的CTP4(SEQ ID NO:4)的事件显示在加工后CTP的十二个氨基酸保留在DMO的氨基末端(DMO+12)。针对可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的Os.Waxy CTP(SEQ ID NO:6)测试了两个独特事件。一个样品显示在加工后CTP的十个氨基酸保留在DMO的氨基末端(DMO+10)，并且另一个显示DMO的头一个甲硫氨酸在加工后被去除(DMO-1)。这些结果表明，当在转基因植物中表达时，APG6 CTP和At.CR88CTP是从DMO有效加工的。
实施例3：转基因甘蓝型油菜中的CTP-DMO表达
使用转基因甘蓝型油菜植物来评估包含编码可操作地连接至DMO的三种独立CTP中的一种的重组DNA分子的DNA构建体提供麦草畏耐受性的能力。
使用三种不同的植物转化载体来产生转基因甘蓝型油菜植物，每种植物转化载体包含含有可操作地连接至与启动子可操作地连接的DMO的三种不同的CTP中的一种的DNA构建体。使用甘蓝型油菜品种65037恢复系来进行土壤杆菌属介导的转化，并且使R0植物在温室中生长。针对转基因拷贝数对独特事件进行筛选。使具有一个转基因拷贝的R0植物自交并且收集R1种子。
使用具有一个转基因拷贝加上载体骨架或两个转基因拷贝的R0植物来评估麦草畏耐受性。将麦草畏耐受性指定为在温室条件下20％或更低的麦草畏损伤。将豆荚中的R0事件分成三组并且按以下三种比率中的一种来施用麦草畏
Figure BDA0004158883370000221
(1)无麦草畏、(2)1lb ae/英亩麦草畏(2X比率)或(3)2lb ae/英亩麦草畏(4X比率)。喷洒转基因植物并且在21天后记录损伤评级。含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:21)的“A”CTP的植物显示无麦草畏耐受性事件。含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:21)的RbcS CTP(SEQ ID NO:5)的植物显示9个事件中有8个对2X比率的麦草畏具有耐受性，并且7个事件中有7个对4X比率的麦草畏具有耐受性。含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:20)的APG6 CTP(SEQ ID NO:1)的植物显示14个事件中有7个对2X比率的麦草畏具有耐受性，并且18个事件中有6个对4X比率的麦草畏具有耐受性。表6中提供了结果。
表6.R0甘蓝型油菜中的麦草畏耐受性
Figure BDA0004158883370000231
对具有一个转基因拷贝的R0植物评估麦草畏耐受性。在温室中用麦草畏(Clarity)按1lb ae/英亩(2X比率)喷洒植物，并且在14至21天后测定麦草畏耐受性。含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:20)的APG6 CTP的植物显示31个事件中有13个对麦草畏具有耐受性。含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:21)的RbcS CTP的植物显示17个事件中有13个对麦草畏具有耐受性。含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:21)的“A”CTP的植物显示18个事件中有7个对麦草畏具有耐受性。表7中提供了结果。
表7.R0甘蓝型油菜中的麦草畏耐受性
CTP DMO 2X耐受性事件
APG6(SEQ ID NO:1) SEQ ID NO:20 13/31
RbcS(SEQ ID NO:5) SEQ ID NO:21 13/17
A(构建体7) SEQ ID NO:21 7/18
使来自含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:20)的APG6 CTP(APG6+DMO)的28个R1植物中的每一个的十个种子以及来自含有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:21)的RbcS CTP(RbcS+DMO)的17个R1植物中的每一个的十个种子在温室中生长。种植当天用2lb ae/英亩麦草畏(4X)喷洒植物，随后在V3期用1lb ae/英亩麦草畏(2X)的麦草畏喷洒，并且在初花(定义为>90％的植物已结铃并且约25％具有至少一个开放的花朵)时用1lb ae/英亩麦草畏(2X)的麦草畏喷洒。每次喷洒后7天时进行损伤评级，并且将其表示为与喷洒的对照相比的损伤百分比。对于含有APG6+DMO的植物，有来自2个事件的总共9个子代在三个评级阶段中的每一个阶段麦草畏损伤评级≤20％。对于含有RbcS+DMO的植物，在16个事件中有77个植物在三个评级阶段中的每一个阶段麦草畏耐受性低于20％。
使用从R0事件收获的叶子来完成蛋白质表征。将叶组织在液氮中研磨并且用两体积的含有10％2-巯基乙醇和5mM DTT的2X利姆里缓冲液(BioRad,Hercules,CA)进行提取。将样品煮沸并且将10μl加载至4-20％CriterionTM预制凝胶(BioRad,Hercules,CA)上并且在Tris/甘氨酸/SDS缓冲液中在250V下运行45分钟。将凝胶中的蛋白质在400mA下在含有20％甲醇的Tris/甘氨酸缓冲液中转移至PVDF膜持续30分钟。使用多克隆兔抗DMO抗血清和HRP缀合的抗兔第二抗体来检测DMO蛋白。使用SuperSignalTMWest Pico化学发光试剂盒(ThermoFischer Scientific,Grand Island,NY)检测信号。对于含有APG6-DMO的三个事件中的每一个，存在约38kDa的单一条带，这是完整加工的DMO蛋白的预期大小。对于含有RbcS-DMO的六个事件中的每一个，存在约38kDa和约41kDa的两个条带。41kDa条带与DMO+27一致并且先前已在含有RbcS-DMO的大豆中有记录(美国专利号7,838,729)。在含有“A”CTP-DMO的所有事件中DMO蛋白的表达非常低，并且长时间暴露后检测到的信号是约50kDa的条带和约39kDa的条带。50kDa条带近似于未加工的“A”CTP-DMO的预期大小。这些结果表明，APG6-DMO产生与完全加工的DMO一致的预期大小的单一条带。
从含有APG6-DMO或RbcS-DMO的R0植物的叶组织中纯化重组蛋白。如所描述使用埃德曼降解化学进行氨基末端序列分析。氨基末端序列分析证实存在于含有RbcS-DMO的植物中的DMO+27和DMO-1的DMO氨基末端序列的存在，这与在西方墨点上看到的DMO条带的大小一致。氨基末端序列分析证实在含有APG6-DMO的植物中仅存在DMO氨基末端序列DMO+1，这与在西方墨点上看到的DMO条带的大小一致。此结果证实，使用APG6CTP在植物中产生可操作地连接的DMO的完整加工。
实施例4：转基因玉米中的CTP-DMO表达
在转基因玉米细胞和植物中对包含编码可操作地连接至DMO的两种独立CTP中的一种的重组DNA分子的DNA构建体的表达进行分析。
使用玉米叶肉原生质体瞬时转化来评估两种CTP-DMO组合的相对DMO表达。DNA构建体为相同的，除了可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的CTP为APG6(SEQ ID NO:1)或CTP4(SEQ ID NO:4)。基本上如实施例1所描述来制备原生质体。在转化后，收获细胞并且用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定DMO蛋白水平。对于每种CTP-DMO组合，以每毫克(mg)总蛋白的DMO纳克(ng)数的形式测量来自四种转化的原生质体样品的蛋白质。与用CTP4-DMO转化的原生质体相比，用APG6-DMO转化的原生质体具有高约4倍的DMO水平。表8中提供了数据。
使用DNA构建体产生转基因玉米植物，并且使R0植物生长。从代表八个独特单拷贝事件的R0植物收集叶样品并且用于定量ELISA以测量DMO水平。与含有CTP4-DMO的事件相比，在含有APG6-DMO的事件中R0叶组织中的DMO表达高约4倍。表8中提供了数据。
针对在转基因玉米植物中表达的DMO进行氨基末端测序。基本上如实施例2中所描述，从表达CTP4-DMO或APG6-DMO的转基因玉米植物纯化蛋白质并且准备好用于埃德曼降解测序。氨基末端序列分析证实在含有CTP4-DMO的植物中存在DMO+6、DMO+7以及DMO+12的DMO氨基末端序列。氨基末端序列分析证实在含有APG6-DMO的植物中存在DMO和DMO+1的DMO氨基末端序列。这些结果表明，与CTP4相比，如由更少的CTP氨基酸保留在DMO的氨基末端所证明，在APG6情况下CTP的加工更完整。表8中提供了数据。
表8.玉米中的DMO蛋白表达
Figure BDA0004158883370000251
/>
用含有编码APG6-DMO或CTP4-DMO的重组DNA分子的DNA构建体使用本领域技术人员已知的方法通过土壤杆菌属介导的转化来产生转基因玉米。在转基因F1杂交植物的田间试验中评估麦草畏耐受性。田间试验包括在两个地点进行四种处理，每种处理重复两次。这四种处理为：(1)依次在V2和V4和V8以2lb ae/英亩(4X)施用麦草畏
Figure BDA0004158883370000261
(2)依次在V2和V4和V8以4lb at/英亩(8X)施用麦草畏；(3)依次在V2和V4和V8以8lb at/英亩(16X)施用麦草畏；以及(4)依次在V2和V4和V8以16lb at/英亩(32X)施用麦草畏。在处理后十天时对作物损伤进行评级，并且以每个V-阶段(CIPV2、CIPV4或CIPV8)的作物损伤百分比的形式来测量。在季节结束时，收获谷粒并且以蒲式耳/英亩(bushel/acre)的形式测量产量。对于CIPV评级与产量，计算概率为5％(p＝0.05)时的最小显著差异(LSD)。向含有APG6-DMO的F1杂交植物施用的最高麦草畏比率(16X和32X)显示比含有CTP4-DMO的植物略微更少的营养损伤和更高的谷粒产量。表9中提供了数据。
表9.麦草畏损伤和产量的F1杂交种田间试验测试
Figure BDA0004158883370000262
实施例5：转基因棉花和大豆中的CTP-DMO表达
对APG6 CTP进行优化以提高蛋白质翻译功效(蛋白质合成)并且增加蛋白质的积累。优化的APG6 CTP(SEQ ID NO:2)在APG6 CTP(SEQ ID NO:1)的位置3和4处具有从苏氨酸(T)到丝氨酸(S)的氨基酸变化。制备DNA构建体以比较两种CTP，每种CTP与大豆中的DMO可操作地连接。
用除了APG6 CTP之外相同的两种DNA构建体来产生转基因大豆植物。第一DNA构建体具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的APG6(SEQ ID NO:1)。第二DNA构建体具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的优化的APG6(SEQ ID NO:2)。使用每种DNA构建体通过土壤杆菌属介导的转化方法来转化A3555大豆。在转化之后，通过PCR分析鉴定含有单一转基因拷贝的R0转基因植物。使单拷贝R0植物在温室中生长，并且收获R1种子。种植使用两种DNA构建体中的每一种产生的4个事件中每个事件的十个R1种子以及AG3555种子，以便在标准温室生长条件下评估作物对芽后麦草畏处理的耐受性。在V4阶段以1120g ai/ha施用麦草畏(Clarity)。在处理后10天时进行作物损伤评级。取麦草畏耐受性大豆植物的叶样品进行重组蛋白水平测量和氨基末端序列分析。对于具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的APG6 CTP(SEQ ID NO:1)的单拷贝麦草畏耐受性R1转基因大豆植物，通过ELISA检测到DMO蛋白水平为13.35±2.7ng/mg。对于具有优化的APG6CTP(SEQ ID NO:2)的单拷贝麦草畏耐受性R1转基因大豆植物，通过ELISA检测到DMO蛋白水平为18.55±3.1ng/mg。在阴性对照A3555大豆叶组织中未检测到DMO蛋白。具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的APG6CTP(SEQ ID NO:1)的单拷贝R1转基因大豆植物的麦草畏损伤评级为3.6％。具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的优化的APG6 CTP(SEQ ID NO:2)的单拷贝R1转基因大豆植物的麦草畏损伤评级为2.7％。阴性对照A3555大豆的麦草畏损伤评级为99.8％。将来自单拷贝麦草畏耐受性R1转基因大豆植物的叶样品用于氨基末端测序(如实施例2和4中所描述)。氨基末端序列分析证实APG6-DMO和优化的APG6-DMO的加工产生CTP从DMO蛋白的氨基末端的完全加工。DMO水平、麦草畏损伤以及APG6-DMO加工表明，APG6与优化的APG6当可操作地连接至DMO时均提供对麦草畏的耐受性，并且两种CTP在植物中均为完全加工的。表10中提供了数据。
表10.R1大豆温室测试
Figure BDA0004158883370000281
用除了APG6 CTP之外相同的两种DNA构建体来产生转基因棉花植物。第一DNA构建体具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的APG6(SEQ ID NO:1)。第二DNA构建体具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的优化的APG6 CTP(SEQ ID NO:2)。使用本领域技术人员已知的方法通过土壤杆菌属介导的转化将每种DNA构建体转化至棉花。在转化之后，通过PCR分析鉴定含有单一转基因拷贝的R0棉花转基因植物，使其在温室中生长，并且收获R1种子。种植来自每种构建体的10个事件的每个事件的十个R1种子和来自DP393棉花的种子，以评估作物对芽后麦草畏施用的耐受性。在V4阶段以1120g ai/ha施用麦草畏(Clarity)。在处理后9天时进行作物损伤百分比评级。将来自耐受性棉花植物的叶样品用于蛋白质水平测量和APG6-DMO或优化的APG6-DMO的氨基末端序列分析。对于具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的APG6 CTP(SEQ ID NO:1)的单拷贝麦草畏耐受性R1转基因棉花植物，通过ELISA检测到DMO蛋白水平为通过ELISA检测到DMO蛋白水平为176.2±103ng/mg。对于具有优化的APG6 CTP(SEQ ID NO:2)的单拷贝麦草畏耐受性R1转基因棉花植物，通过ELISA检测到DMO蛋白水平为136.5±58.6ng/mg。在阴性对照DP393棉花叶组织中未检测到DMO蛋白。具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的APG6 CTP(SEQ ID NO:1)的单拷贝R1转基因棉花植物的麦草畏损伤为2.6％。具有可操作地连接至DMO(SEQ ID NO:18)的优化的APG6 CTP(SEQ ID NO:2)的单拷贝R1转基因植物的麦草畏损伤为2.2％。阴性对照DP393棉花损伤为85％。将来自单拷贝麦草畏耐受性R1植物的叶样品用于氨基末端测序(如实施例2和4中所描述)。氨基末端序列分析证实APG6-DMO和优化的APG6-DMO的加工产生CTP从DMO蛋白的氨基末端的完全加工。DMO蛋白表达水平、麦草畏损伤以及APG6-DMO和优化的APG6-DMO氨基末端加工表明，APG6与优化的APG6当可操作地连接至DMO时均提供对麦草畏的耐受性，并且两种CTP在植物中均为完全加工的。表11中提供了数据。
表11.R1棉花温室测试
Figure BDA0004158883370000291
实施例6：转基因玉米中的CTP-PPO表达
使用除草剂细菌筛选系统来鉴定对PPO除草剂具耐受性的新颖PPO。此筛选系统使用敲除大肠杆菌菌株在含有PPO除草剂的LB液体培养基中的生长分析来鉴定对PPO除草剂不敏感的PPO。
用含有确定的PPO活性的细菌表达载体转化敲除大肠杆菌菌株并且在LB液体培养基中培养。将代表三种不同PPO化学亚类的五种不同PPO除草剂(三氟羧草醚(1mM)、丙炔氟草胺(0.5mM)、乳氟禾草灵(0.5mM)、氟磺胺草醚(1mM)以及S-3100(100μM)中的一种的纯化晶体形式添加至培养基中。使重组蛋白表达并且测量大肠杆菌生长速率。在存在和不存在PPO除草剂的情况下在零时间至二十四小时的所选时间点测量不同变体的生长曲线(OD600)。转化的敲除大肠杆菌菌株在PPO除草剂存在下在LB培养基中的生长表明，用于转化大肠杆菌的基因编码除草剂不敏感性原卟啉原氧化酶(iPPO)。
发现以SEQ ID NO:40-49形式提供的十种PPO全部在PPO除草剂存在下赋予敲除大肠杆菌菌株于LB培养基中的正常生长速率，表明这些蛋白质为除草剂不敏感性原卟啉原氧化酶(iPPO)。表达WH_PPO(SEQ ID NO:60)的敲除大肠杆菌菌株对所有五种PPO除草剂敏感，证实所述分析能够区分针对每种除草剂的敏感和不敏感PPO。
形成四种植物转化载体用于植物原位表达PPO H_N10(SEQ ID NO:43)。转化构建体1和11具有相同的启动子加前导序列加内含子组合、相同的3’UTR序列、相同的PPO H_N10(SEQ ID NO:43)，但CTP序列不同，并且在大豆转化中使用。转化构建体6和16具有相同的启动子加前导序列加内含子组合、相同的3’UTR序列、相同的PPO H_N10(SEQ ID NO:43)，但CTP序列不同，并且在玉米转化中使用。表12提供了PPO H_N10植物转化构建体的构型。
表12.含有PPO H_N10的构建体构型
Figure BDA0004158883370000302
使PPO酶在转基因玉米植物中表达，并且分析转基因植物的PPO除草剂耐受性。构建包含编码以SEQ ID NO:40-59形式提供的PPO酶中的一种的重组DNA分子的植物转化载体。编码PPO酶的DNA序列可在5’端包括关于甲硫氨酸的密码子，通常称为起始密码子，或者可消除此密码子以有助于叶绿体转运肽序列可操作地连接至编码序列的5’端。以SEQ IDNO:40-49形式提供在氨基末端含有甲硫氨酸的PPO酶蛋白质序列的实例。以SEQ ID NO:50-59形式提供在氨基末端不含甲硫氨酸的PPO酶蛋白质序列的实例。对于植物转化，将编码推定的PPO酶的核苷酸序列针对密码子双子叶或单子叶表达进行优化。表2提供了对应于转化载体中PPO酶的蛋白质和核苷酸序列的SEQ ID NO。
对于玉米植物原位测试，使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法来转化玉米(LH244)。在温室中针对除草剂耐受性对由使表达两种构建体构型中的一种中的H_N10(SEQ ID NO:43)的单拷贝R0植物异型杂交产生的转基因F1植物进行测试。在V3生长阶段用40克/ha S-3100处理植物，并且在处理后七天时进行损伤评级。表达构建体6构型(APG6(SEQ ID NO:1)可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43))中的H_N10(SEQ ID NO:43)的转基因玉米植物使得18个事件中有13个产生高度耐受性植物(10％或更少的损伤)，但构建体16构型(12G088600TP(SEQ ID NO:38)可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43))未产生产生高度耐受性植物的事件。
在田间针对除草剂耐受性对由使表达两种构建体构型(构建体6和16)中的一种中的H_N10(SEQ ID NO:43)的单拷贝R0植物异型杂交产生的转基因F1植物进行测试。此F1群体为分离的(50％半合子和50％裸)，并且在损伤评级之前未对转基因植物进行选择。由于难以辨别转基因植物与非转基因植物，所以预测这种群体的总体平均损伤评级高于均质转基因群体。在两个地点进行试验，每个试验重复两次，并且每个构建体3种处理。使用非转基因玉米植物作为阴性对照。除草剂施用处理如下：处理1为依次在V2和V4和V8施用0.036lbai/英亩S-3100；处理2为依次在V2和V4和V8施用0.072lb ai/英亩S-3100；处理3为依次在V2和V4和V8施用0.144lb ai/英亩S-3100。在V2生长阶段(CIPV2)并且在V4生长阶段(CIPV4)在处理后5至7天时评估作物损伤百分比评级(误差V2和误差V4为最小显著差异(LSD)的一半)。将这两个地点的作物损伤评级组合在一起。对于三种处理中的每一种来说，所有非转基因植物和使用构建体16(12G088600TP(SEQ ID NO:38)可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43))产生的事件情况下的植物在V2与V4除草剂施用之后显示94.6-99.5％之间的损伤。使用构建体6(APG6(SEQ ID NO:1)可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43))产生的事件情况下的植物仅在V2除草剂施用之后显示30％至50％的损伤并且在V4除草剂施用之后无损伤。表13中提供了数据。
表13.含有PPO H_N10(SEQ ID NO:43)的F1玉米的功效田间试验
Figure BDA0004158883370000311
Figure BDA0004158883370000321
F1转基因玉米温室和田间数据证明，与当可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43)的12G088600TP(SEQ ID NO:38)在转基因植物中表达时的损伤级别相比，当可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43)的APG6(SEQ ID NO:1)在转基因植物中表达时产生降低的损伤级别。参见图1。
形成植物转化载体来植物原位表达可操作地连接至APG6(SEQ ID NO:1)、CTP D或CTP E的PPO H_N40(SEQ ID NO:54)或PPO H_N90(SEQ ID NO:50)。使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法来转化玉米(01DKD2)。通过PCR对取自所得R0植物的叶样品进行分析以确定转基因插入物的拷贝数。约在V5生长阶段将各自含有独特转化事件的R0植物喷洒40g ai/ha或80g ai/ha的S-3100，并且在处理后4-7天时进行损伤评级。记录所喷洒的植物总数中损伤≤10％(高度耐受)或损伤≤20％(耐受)的植物数目。将被确定为单拷贝事件并且以≤20％的损伤通过喷洒的植物进一步用于自交和异型杂交。表14中呈现了数据。
表14.转基因玉米中的CTP-PPO除草剂耐受性评估
Figure BDA0004158883370000331
结果表明，当可操作地连接至H_N40(SEQ ID NO:54)或H_N90(SEQ ID NO:50)时，与用CTP D或CTP E转化的植物相比APG6(SEQ ID NO:1)始终产生更高的除草剂耐受性。对80g ai/ha的S-3100来说，当APG6可操作地连接至H_N40时产生21.4％至40.2％的高度耐受的转基因植物和41.1％至58.9％的耐受的转基因植物。对40g ai/ha的S-3100来说，当APG6可操作地连接至H_N90时产生49.1％的高度耐受的转基因植物和56.3％的耐受的转基因植物。对80g ai/ha的S-3100来说，当CTP D可操作地连接至H_N40时产生0％的高度耐受的和2.2％的耐受的转基因植物。对40g ai/ha的较低除草剂比率的S-3100来说，当CTP E可操作地连接至H_N40时产生0％至8％的高度耐受的和12.9％至32.1％的耐受的转基因植物。
评估表达可操作地连接至PPO H_N10的APG6的转基因F1杂交玉米对七种不同PPO除草剂的耐受性：S-3100、氟磺胺草醚、三氟羧草醚、乳氟禾草灵、丙炔氟草胺、甲磺草胺以及苯嘧磺草胺。将代表5种独特事件的汇集的种子与作为阴性对照的杂交玉米种子一起种植在温室中的盆中。
为了测试芽前除草剂耐受性，如下以两种比率中的一种个别地施用PPO除草剂，每种处理六次重复：S-3100(80或160g ai/ha)、氟磺胺草醚(
Figure BDA0004158883370000342
840或1680g ai/ha)、丙炔氟草胺(/>
Figure BDA0004158883370000343
SX，210或420g ai/ha)、甲磺草胺(/>
Figure BDA0004158883370000344
4L，840或1680g ai/ha)以及苯嘧磺草胺(/>
Figure BDA0004158883370000345
200或400gai/ha)。在处理后20天时对植物的作物损伤百分比进行评级，并且包括作为阴性对照的玉米种子。含有可操作地连接至PPO H_N10的APG6的转基因植物关于芽前施用的不同PPO除草剂具有在0％至5.8％范围内的损伤评级，表明可操作地连接至PPO H_N10的APG6在两种除草剂比率下为玉米提供针对全部五种PPO除草剂的优良芽前耐受性。阴性对照玉米植物的损伤评级在17.5％至94.2％范围内，除了苯嘧磺草胺，这是因为此除草剂是被出售用于常规玉米植物中而预测的。表15中呈现了数据，其中标准误差标示为+/-。
表15.玉米中的PPO除草剂芽前损伤评级
Figure BDA0004158883370000341
Figure BDA0004158883370000351
为了测试芽后(V3至V4)除草剂耐受性，如下以三种比率中的一种个别地施用PPO除草剂，每种处理六次重复：S-3100(40、80或160g ai/ha)、氟磺胺草醚(
Figure BDA0004158883370000352
420、840或1680g ai/ha)、三氟羧草醚(Ultra/>
Figure BDA0004158883370000353
420、840或1680g ai/ha)、乳氟禾草灵(
Figure BDA0004158883370000354
220、440或880g ai/ha)、丙炔氟草胺(/>
Figure BDA0004158883370000355
SX，105、210或420g ai/ha)、甲磺草胺(/>
Figure BDA0004158883370000356
4L，420、840或1680g ai/ha)以及苯嘧磺草胺(/>
Figure BDA0004158883370000357
100、200或400gai/ha)。在处理后14天时对植物的作物损伤百分比进行评级，并且包括常规杂交玉米种子作为阴性对照。含有可操作地连接至PPO H_N10的APG6的转基因植物关于芽后施用的不同PPO除草剂具有在0.5％至5.8％范围内的损伤评级，除了1680g ai/ha的氟磺胺草醚，其中损伤评级为13.8％，表明可操作地连接至PPO H_N10的APG6在所有除草剂比率下为玉米提供针对全部七种PPO除草剂的优良芽后耐受性。阴性对照玉米植物的损伤评级在36.7％至100％范围内。表16中呈现了数据，其中标准误差标示为+/-。
表16.玉米中的PPO除草剂芽后损伤评级
Figure BDA0004158883370000358
Figure BDA0004158883370000361
实施例7：转基因大豆中的CTP-PPO表达
使可操作地连接至不同CTP的PPO酶在转基因大豆植物中表达，并且分析转基因植物的PPO除草剂耐受性。
形成植物转化载体来植物原位表达可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43)的12G088600TP(SEQ ID NO:38)或可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43)的APG6(SEQ IDNO:1)。使用本领域中已知的标准方法使用这些植物转化载体和根癌土壤杆菌来转化大豆A3555。使再生的R0转基因幼苗在温室中生长，自交并且收集R1种子。在温室中以在V4和R1施用的三种除草剂处理中的一种喷洒转基因R1植物：(1)5克ai/ha S-3100、(2)10克ai/haS-3100或(3)30克ai/ha S-3100。在处理后十天时评估作物损伤评级。在5、10以及30g ai/ha比率下，表达可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43)的APG6(SEQ ID NO:1)的转基因植物的损伤评级在V4阶段分别在4.2％、7.8％以及9.4％范围内，并且在R1阶段分别在3％、6.5％至15.7％范围内。在5、10以及30g ai/ha比率下，表达可操作地连接至PPO H_N10(SEQID NO:43)的12G088600TP(SEQ ID NO:38)的转基因植物的平均损伤评级分别为82.7％、92.7％至98.2％，并且在R1阶段未存活而用于评级。阴性对照植物在5、10以及30g ai/ha比率下分别具有89％、98％以及100％的类似平均损伤评级，并且在R1阶段未存活而用于评级。表17中提供了数据。
表17：R1大豆的PPO除草剂测试
Figure BDA0004158883370000371
形成植物转化载体来植物原位表达可操作地连接至三种不同CTP中的一种、APG6(SEQ ID NO:1)CTP F以及CTP H的PPO H_N90(SEQ ID NO:47)。使用本领域中已知的标准方法使用这些植物转化载体和根癌土壤杆菌来转化大豆A3555。使再生的R0转基因幼苗在温室中生长，并且通过PCR对取自所得R0植物的叶样品进行分析以鉴定含有单个事件拷贝的植物。在温室中以约在V3阶段施用20g ai/ha S-3100的除草剂处理来喷洒各自代表独特事件的转基因单拷贝R0植物。在处理后14天时取得呈被认为是高度耐受(≤10％的损伤)或耐受(≤20％的损伤)的数字形式的损伤评级。表达可操作地连接至PPO H_N90(SEQ ID NO:47)的APG6(SEQ ID NO:1)的转基因植物产生21.4％的高度耐受的和57.1％的耐受的独特事件。表达可操作地连接至PPO H_N90(SEQ ID NO:47)的CTP F的转基因植物产生11.7％的高度耐受的和41.1％的耐受的独特事件。表达可操作地连接至PPO H_N90 PPO H_N90(SEQID NO:47)的CTP H的转基因植物未产生高度耐受或耐受独特事件。表18中呈现了数据。
表18.R0大豆中的S-3100功效评估
CTP PPO ≤10％的损伤 ≤20％的损伤
APG6 H_N90 3/14(21.4％) 8/14(57.1％)
F H_N90 2/17(11.7％) 7/17(41.1％)
H H_N90 0/22(0％) 0/22(0％)
该数据表明，可操作地连接至PPO酶的特定CTP对于实现除草剂耐受性是关键的，因此显示CTP选择的重要性以及与其他CTP相比APG6 CTP用于产生除草剂耐受性转基因植物的出人意料的优越性。
实施例8：转基因棉花中的CTP-PPO表达
形成植物转化载体以在转基因棉花植物中表达可操作地连接至PPO H_N10(SEQID NO:43)的APG6(SEQ ID NO:1)，并且分析转基因植物的PPO除草剂耐受性。使用本领域中已知的标准方法使用植物转化载体和根癌土壤杆菌来转化棉花DP393。使再生的R0转基因幼苗在温室中生长，并且通过PCR对取自所得R0植物的叶样品进行分析以鉴定含有单个事件拷贝的植物。在温室中以在V2阶段施用20g ai/ha S-3100的除草剂处理来喷洒各自代表独特事件的转基因单拷贝R0植物。此外，在温室中以在V2阶段施用20g ai/ha S-3100的除草剂处理来喷洒转基因多拷贝(≥2个拷贝/植物)。在处理后三天时进行作物损伤评级。
阴性对照棉花DP393在使用20g ai/ha S-3100的除草剂处理后三天时具有100％的损伤。相比之下，21个单拷贝R0植物的平均损伤为26.7％。这21个单拷贝R0植物的损伤分布为：3个植物无损伤；3个植物具有10％的损伤；3个植物具有15％的损伤；2个植物具有20％的损伤；7个植物具有30％的损伤；并且3个植物具有40％的损伤。对于多拷贝R0植物，14个植物接受除草剂处理并且平均损伤为10.4％。这14个多拷贝植物的损伤分布为：5个植物无损伤；3个植物具有5％的损伤；1个植物具有10％的损伤；2个植物具有15％的损伤；1个植物具有20％的损伤；1个植物具有30％的损伤；并且1个植物具有40％的损伤。该数据表明，表达可操作地连接至PPO H_N10(SEQ ID NO:43)的APG6(SEQ ID NO:1)的R0转基因棉花对在V2阶段以20g ai/ha施用除草剂S-3100的施用具有耐受性。

Claims (27)

1.一种重组DNA分子，其包含编码叶绿体转运肽(CTP)的DNA序列，所述DNA序列可操作地连接至编码麦草畏单加氧酶(DMO)或原卟啉原氧化酶(PPO)的DNA序列，其中所述CTP包含选自由SEQ ID NO:2-3组成的组的序列。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中编码所述CTP的所述DNA序列包含选自由SEQID NO:7-14组成的组的序列。
3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DMO或所述PPO包含选自由SEQ ID NO:18-27和40-59组成的组的多肽序列。
4.如权利要求3所述的重组DNA分子，其中所述编码DMO或PPO的DNA序列包含选自由SEQID NO:28-37和61-102组成的组的序列。
5.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述CTP可操作地连接至DMO蛋白，并且所述CTP包含选自由SEQ ID NO:2-3组成的组的序列。
6.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述CTP可操作地连接至PPO蛋白，并且所述CTP包含SEQ ID NO:2的序列。
7.一种DNA构建体，其包含如权利要求1所述的DNA分子，所述DNA分子可操作地连接至在植物细胞中起作用的异源启动子。
8.一种转基因植物、植物细胞、植物部分或种子，其包含如权利要求1所述的DNA分子。
9.如权利要求8所述的转基因植物、植物细胞、植物部分或种子，其中所述植物为单子叶植物。
10.如权利要求9所述的转基因植物、植物细胞、植物部分或种子，其中所述植物为玉米或小麦植物。
11.如权利要求8所述的转基因植物、植物细胞、植物部分或种子，其中所述植物为双子叶植物。
12.如权利要求11所述的转基因植物、植物细胞、植物部分或种子，其中所述植物为大豆、棉花或芸苔属植物。
13.一种产生除草剂耐受性植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用如权利要求7所述的DNA构建体转化植物细胞；以及
b)从包含所述DNA构建体的所转化的植物细胞再生出植物。
14.如权利要求13所述的方法，其中再生的植物对选自由麦草畏和PPO抑制剂组成的组的除草剂具耐受性。
15.一种产生除草剂耐受性植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使包含如权利要求1所述的DNA分子的亲本植物与自身或与第二植物杂交，以产生一个或多个子代植物；以及
b)选择包含所述DNA分子的子代植物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述子代植物对选自由麦草畏和PPO抑制剂组成的组的除草剂具耐受性。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述子代植物对选自由以下各项组成的组的PPO抑制剂除草剂具耐受性：S-3100、氟磺胺草醚、三氟羧草醚、乳氟禾草灵、丙炔氟草胺、甲磺草胺以及苯嘧磺草胺。
18.一种表达麦草畏单加氧酶(DMO)或原卟啉原氧化酶(PPO)的方法，所述方法包括将如权利要求1所述的DNA分子引入植物细胞中。
19.如权利要求18所述的方法，其中引入包括转化所述植物细胞。
20.一种控制作物生长环境中的杂草生长的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将如权利要求8所述的植物或种子种植在作物生长环境中；以及
b)向所述作物生长环境施用可有效控制杂草生长的量的麦草畏或PPO抑制剂除草剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述除草剂不会损害所述植物或种子。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述植物或种子为单子叶植物或种子。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述植物为玉米或小麦植物。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述植物或种子为双子叶植物或种子。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述植物为大豆、棉花或芸苔属植物。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述除草剂为麦草畏。
27.如权利要求20所述的方法，其中所述除草剂为PPO抑制剂。
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