JP6961611B2 - 導入遺伝子の効率的な標的指向化のための構成物及び方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／２７０，１８０号及び２０１６年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３６４，７１５号の利益を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に援用する。

発明の分野
本発明は、総じて、農業、植物バイオテクノロジー及び分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、除草剤に対する耐性または抵抗性を呈する遺伝子導入植物を生産するための構成物及び方法に関する。

配列表の組込み
コンピュータ可読形式の配列表は、本願と共に電子出願され、その全体が参照により本願に援用される。配列表は、ＭＯＮＳ３８９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられたファイルの中に入っており、それは、（オペレーティングシステムＭＳ Ｗｉｎｄｏｗｓの測定で）大きさが１２２キロバイトであり、２０１６年１２月１９日に作成されたものである。

関連技術の説明
新規遺伝子導入植物の生産は、有益な形質、例えば強化された雑草抑制方策を可能にするための向上した除草剤耐性を呈する、大幅に改善された作物植物の潜在性を提案する。しかしながら、作物において有益な形質を生じさせるのに有用なタンパク質が知られているものの、遺伝子導入植物細胞におけるこれらの組換えタンパク質の効果的な細胞内局在化（標的指向化として知られる）及びプロセシングは大きな障壁であり続けている。それゆえ、組換えタンパク質を効果的に植物細胞内で局在させることができる新規な輸送ペプチドが必要とされている。

本発明の一態様は、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするＤＮＡ配列に機能可能に繋げられた葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、ＣＴＰが、配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含む、組換えＤＮＡ分子に関する。特定の実施形態では、ＣＴＰをコードするＤＮＡ配列は、配列番号７〜１４からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、ＤＭＯまたはＰＰＯは、配列番号１８〜２７及び４０〜５９からなる群から選択されるポリペプチドを含む。一実施形態において、ＤＭＯまたはＰＰＯをコードするＤＮＡ配列は、配列番号２８〜３７及び６１〜１０２からなる群から選択される配列を含む。具体的な実施形態において、ＤＭＯまたはＰＰＯは、植物細胞において発現された場合に除草剤耐性を付与することができる除草剤耐性タンパク質として定義される。特定の実施形態では、除草剤耐性タンパク質がＤＭＯタンパク質でありかつＣＴＰが配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むか、または除草剤耐性タンパク質がＰＰＯでありかつＣＴＰが配列番号１及び２からなる群から選択される配列を含む。

別の態様において、本発明は、植物細胞で機能する異種プロモーターに機能可能に繋げられた本明細書に記載の組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換された遺伝子導入植物、植物細胞、植物部分または種子を提供する。具体的な実施形態において、植物は単子葉植物である。本発明に関して使用され得る単子葉植物としては、限定されないが例えば、トウモロコシ植物またはコムギ植物が挙げられる。別の実施形態では、植物は双子葉植物である。本発明に関して使用され得る双子葉植物としては、限定されないが例えば、ダイズ植物、ワタ植物またはＢｒａｓｓｉｃａ植物が挙げられる。

さらに別の態様では、非生物の植物材料中に存在する本発明の組換えＤＮＡ分子を提供する。一例を挙げると、植物細胞が本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するならばその植物細胞は本発明の範囲内にある。一実施形態において、そのような植物細胞は、再生可能植物細胞であってもよいし、植物へと再生されることができない非再生可能植物細胞であってもよい。

さらに別の態様において、本発明は、検出可能な量の本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生産品（それによって生産された産物を含む）を生産する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明によって提供される生産品は、生育能力のない種子またはその部分、脱水植物組織、凍結植物組織、加工植物組織、粗挽き粉、粉末、フレーク、ブラン及び繊維を含む。生産品は、生育能力があってもなくてもよい。生育能力のない生産品としては、限定されないが例えば、生育能力のない種子及び穀物；加工された種子、種子部分及び植物部分；脱水植物組織、凍結植物組織及び加工植物組織が挙げられる。本発明の生産品は、検出可能な量の本明細書に記載の組換えＤＮＡ分子を含有する。本発明の組換えＤＮＡ分子を検出する方法は当該技術分野においてよく知られている。

さらなる態様において、本発明は、除草剤耐性植物を生産する方法であって、ａ）本発明のＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換するステップと、ｂ）ＤＮＡ構築物を含む形質転換植物細胞から植物を再生するステップとを含む、当該方法を提供する。方法の一実施形態において、再生された植物は、ジカンバ及びＰＰＯ阻害剤からなる群から選択される除草剤に対して耐性である。

さらに別の態様において、本発明は、除草剤耐性植物を生産する方法であって、ａ）本発明の組換えＤＮＡ分子を含む親植物とそれ自体または第２植物とを交配して１つ以上の子孫植物を生産するステップと、ｂ）上記ＤＮＡ分子を含んでいる子孫植物を選抜するステップとを含む、当該方法を提供する。方法の一実施形態において、子孫植物は、ジカンバ及びＰＰＯ阻害剤からなる群から選択される除草剤に対して耐性である。

さらに別の態様において、本発明は、植物細胞においてＰＰＯまたはＤＭＯを発現させる方法であって、本発明の組換えＤＮＡ分子を植物細胞に導入することを含む、当該方法を提供する。本発明の一実施形態において、組換えＤＮＡ分子を導入することは、植物細胞を形質転換することを含む。

別の態様において、本発明は、作物栽培環境における雑草生育を抑制する方法であって、ａ）本発明の植物または種子を作物栽培環境に植付けるステップと、ｂ）雑草生育を抑制するのに有効な量のジカンバまたはＰＰＯ阻害剤除草剤を作物栽培環境に散布するステップとを含む、当該方法を提供する。具体的な実施形態において、除草剤散布は、発芽前または発芽後に行う。一実施形態において、除草剤の量は、植物または種子を害さない量である。方法の特定の実施形態では、植物または種子は、単子葉の植物または種子、例えば、トウモロコシまたはコムギの植物または種子である。他の実施形態では、植物または種子は、双子葉の植物または種子、例えば、ダイズ植物、ワタ植物またはＢｒａｓｓｉｃａ植物である。さらなる実施形態において、除草剤はジカンバまたはＰＰＯ阻害剤である。

Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８において施す０．０３６ポンド活性成分／エーカーのＳ−３１００の除草剤散布処理の後での、ＡＰＧ６（配列番号１）または１２Ｇ０８８６００ＴＰ（配列番号３８）に機能可能に繋げられたＨ＿Ｎ１０（配列番号４３）を発現している遺伝子導入Ｆ１トウモロコシ植物である。

配列の簡単な説明
配列番号１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアルビノ薄緑（ＡＰＧ６）ＣＴＰのアミノ酸配列である。

配列番号２は、配列番号１のＡＰＧ６ ＣＴＰのアミノ末端最適化変異型のアミノ酸配列である。

配列番号３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ９０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＣＲ８８）ＣＴＰのアミノ酸配列である。

配列番号４は、Ｐｈ．ＳｈｋＧ−ＣＴＰ４ ＣＴＰのアミノ酸配列である。

配列番号５は、Ｐｓ．ＲｂｃＳ−３Ｃ ＣＴＰのアミノ酸配列である。

配列番号６は、Ｏｓ．Ｗａｘｙ ＣＴＰのアミノ酸配列である。

配列番号７〜１１は、単子葉発現または双子葉発現のために最適化された、配列番号１のＡＰＧ６ ＣＴＰをコードする核酸配列である。

配列番号１２は、配列番号２のＡＰＧ６ ＣＴＰをコードする核酸配列である。

配列番号１３及び１４は、それぞれ双子葉発現及び単子葉発現のために最適化された、Ａｔ．ＣＲ８８ ＣＴＰをコードする核酸配列である。

配列番号１５〜１７は、それぞれ配列番号４〜６をコードする核酸配列である。

配列番号１８〜２７は、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）変異型をコードするアミノ酸配列である。

配列番号２８〜３７は、それぞれ配列番号１８〜２７のＤＭＯ変異型をコードする核酸配列である。

配列番号３８は、双子葉発現のために最適化されたワタ１２Ｇ０８８６００ＴＰ葉緑体輸送ペプチドのアミノ酸配列である。

配列番号３９は、配列番号３８をコードする核酸配列である。

配列番号４０は、Ｈ＿Ｎ９０のアミノ酸配列である。

配列番号４１は、Ｈ＿Ｎ２０のアミノ酸配列である。

配列番号４２は、Ｈ＿Ｎ６０のアミノ酸配列である。

配列番号４３は、Ｈ＿Ｎ１０のアミノ酸配列である。

配列番号４４は、Ｈ＿Ｎ３０のアミノ酸配列である。

配列番号４５は、Ｈ＿Ｎ４０のアミノ酸配列である。

配列番号４６は、Ｈ＿Ｎ５０のアミノ酸配列である。

配列番号４７は、Ｈ＿Ｎ７０のアミノ酸配列である。

配列番号４８は、Ｈ＿Ｎ１００のアミノ酸配列である。

配列番号４９は、Ｈ＿Ｎ１１０のアミノ酸配列である。

配列番号５０〜５６は、それぞれ配列番号４０、４１、４３、４４、４５、４６及び４８に対応する、開始メチオニンを欠くアミノ酸配列である。

配列番号５７〜５８は、配列番号５０のアミノ酸変異型である。

配列番号５９は、配列番号５６のアミノ酸変異型である。

配列番号６０は、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ（ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＷＨ＿ＰＰＯ）のアミノ酸配列である。

配列番号６１〜７０は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化された、それぞれ配列番号４０〜４９をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号７１〜８０は、双子葉発現のためにコドン最適化された、それぞれ配列番号４０〜４９をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号８１〜８７は、双子葉発現のためにコドン最適化された、それぞれ配列番号５０〜５６をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号８８及び９１は、それぞれ配列番号５０及び５１のヌクレオチド変異型である。

配列番号８９、９０及び９２は、それぞれ配列番号５７〜５９をコードするヌクレオチド配列である。

配列番号９３〜１０２は、単子葉発現のためにコドン最適化された、それぞれ配列番号４０〜４９をコードするヌクレオチド配列である。

詳細な説明
除草剤耐性タンパク質を細胞内で局在させるための葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）は当該技術分野において既知であるが、ＣＴＰと除草剤耐性タンパク質とのいかなる組み合わせについても、細胞内局在化及びプロセシングの効果的な度合いを予測することは困難である。局在化及びプロセシングは、除草剤耐性タンパク質の発現レベル及び機能を決定付け、したがって当該タンパク質を含む遺伝子導入細胞、植物または種子の除草剤耐性表現型に影響を与える。遺伝子導入植物において、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を含めた有用な除草剤耐性タンパク質を使用して様々なＣＴＰが試験されてきた。しかしながら、タンパク質の不十分または不完全なプロセシング及び局在化がみられることが多い。

本発明は、改善された葉緑体局在性及びプロセシングをもたらすことのできる新規な組換えＤＮＡ分子、ならびにこれらを使用するための構成物及び方法を提供することによってこれらの障壁を打開する。本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＤＭＯまたはＰＰＯに機能可能に繋げられたＣＴＰをコードするＤＮＡ配列を含む。本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＤＭＯまたはＰＰＯの葉緑体局在化及び、組換えＤＮＡ分子を含む植物のジカンバまたはＰＰＯ除草剤に対する向上した耐性をもたらす。

特定の実施形態では、本発明は、除草剤耐性タンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能可能に繋げられた、配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むＣＴＰをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＭＯタンパク質、例えば配列番号１８〜２７からなる群から選択される配列を有するＤＭＯタンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能的に繋げられた、配列番号１〜３からなる群から選択される配列を有するＣＴＰなどのＣＴＰをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、ＰＰＯタンパク質、例えば配列番号４０〜６０からなる群から選択される配列を有するＰＰＯタンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能的に繋げられた、配列番号１〜３からなる群から選択される配列を有するＣＴＰなどのＣＴＰをコードするＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を提供する。

組換えＤＮＡ分子
本明細書中で使用する場合、「組換え」という用語は、遺伝子操作の成果である、したがって自然界では通常見つからないものである、人間の介入によって作り出された非天然のＤＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、細胞、種子または植物を指す。「組換えＤＮＡ分子」は、天然に生じない、人間の介入の結果であるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、例えば、互いに異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子の一例は、配列番号１８〜２７からなる群から選択される配列を含むＤＭＯタンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能可能に繋げられた、配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むＣＴＰをコードするＤＮＡ分子である。ＤＭＯタンパク質の例を以下の表１に示す。
表１．ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）

組換えＤＮＡ分子の別の例は、配列番号４０〜６０からなる群から選択される配列を含むＰＰＯタンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能可能に繋げられた、配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むＣＴＰをコードするＤＮＡ分子である。組換え細胞、種子または植物は、遺伝子導入ＤＮＡを含む細胞、種子または植物、例えば、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子導入細胞、種子、植物または植物部分である。ＰＰＯタンパク質の例を以下の表２に示す。
表２．プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）

本発明に従って使用され得るＣＴＰ配列の例を以下の表３に示す。
表３．葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）

本明細書中で使用する場合、「単離ＤＮＡ分子」という用語は、ＤＮＡ分子がその天然環境にあるのではなく、単独で、または他の構成物と組み合わさって存在している、ということを意味する。例えば、タンパク質コード配列及び異種ＣＴＰ配列を含む組換えＤＮＡ分子は、遺伝子導入植物、細胞または種子のゲノムに存在している場合に単離ＤＮＡ分子である、というのも、その組換えＤＮＡ分子の構成要素はその天然環境（つまり各構成要素が初めて観察された生物のゲノム中）に存在していないからである。遺伝子導入植物ゲノムに存在している組換えＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子がその植物ゲノムにおいて天然には見つからず、それゆえその天然環境から単離される限り、単離ＤＮＡ分子である。

本明細書中で使用する場合、「遺伝子操作」という用語は、人間の介入による、天然に通常見つからないＤＮＡ、タンパク質または生物の創作を指す。遺伝子操作は、生物工学、例えば、分子生物学、タンパク質生化学、細菌形質転換及び植物形質転換の技法のうちの１つ以上を用いて着想され実験室で作出されたＤＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、細胞、種子または植物を生産するために用いることができる。例えば、配列番号１８〜２７からなる群から選択される配列を含むＤＭＯタンパク質に機能可能に繋げられた配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むＣＴＰをコードするＤＮＡ分子を含み、場合によって植物細胞で機能する異種プロモーターをさらに含み得る、キメラ遺伝子を作出するために遺伝子操作を用いることができる。別の例を挙げると、配列番号４０〜６０からなる群から選択される配列を含むＰＰＯタンパク質に機能可能に繋げられた配列番号１〜３からなる群から選択される配列を含むＣＴＰをコードするＤＮＡ分子を含み、場合によって植物細胞で機能する異種プロモーターをさらに含み得る、キメラ遺伝子を作出するために遺伝子操作を用いることができる。そのようなキメラ遺伝子は、分子生物学の技法のうちの１つ以上、例えば、遺伝子クローニング、ＤＮＡライゲーション及びＤＮＡ合成を用いて作られ得る。

「導入遺伝子」という用語は、人間の介入の結果として、例えば植物形質転換方法によって生物のゲノム内に人工的に組み込まれたＤＮＡ分子を指す。本明細書中で使用する場合、「遺伝子導入」という用語は、導入遺伝子を含むことを意味し、例えば、「遺伝子導入植物」は、そのゲノム中に導入遺伝子を含む植物を指し、「遺伝子導入形質」は、植物ゲノムの中に組み込まれた導入遺伝子の存在によって移されるかまたは与えられる特徴または表現型を指す。そのようなゲノム改変の結果として、遺伝子導入植物は、関連する野生型植物とは明らかに異なるものであり、遺伝子導入形質は、野生型植物に天然に見受けられない形質である。本発明の遺伝子導入植物は、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子を含む。

本明細書中で使用する場合、「異種」という用語は、異なる供給源に由来しておりそれゆえに通常は性質の関連がない２つ以上の物質同士の関係を指す。例えば、ＤＭＯタンパク質は、機能可能に繋がれているＣＴＰに関して、そのような組み合わせが天然に通常見受けられないならば、異種である。別の例を挙げると、ＤＭＯタンパク質に機能可能に繋げられたＣＴＰをコードする組換えＤＮＡ分子は、機能可能に繋げられ植物細胞で機能するプロモーターに関して、そのような組み合わせが天然に通常見受けられないならば、異種である。特定の組換えＤＮＡ分子は、それが挿入される細胞、種子または生物に関しても、その特定の細胞、種子または生物においてそれが天然に存在しない場合に、異種であり得る。

本明細書中で使用する場合、「タンパク質コードＤＮＡ分子」または「ポリペプチドコードＤＮＡ分子」という用語は、タンパク質またはポリペプチド、例えば、除草剤耐性または害虫抑制力を付与するためのタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を指す。「タンパク質コード配列」または「ポリペプチドコード配列」は、タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。「配列」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の連続的な並びを意味する。タンパク質コード配列またはポリペプチドコード配列の境界は、普通は５’末端にある翻訳開始コドンと３’末端にある翻訳停止コドンとによって決定される。タンパク質コード分子またはポリペプチドコード分子は、タンパク質またはポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。本明細書中で使用する場合、「導入遺伝子発現」、「導入遺伝子の発現」、「タンパク質発現」、「ポリペプチド発現」、「タンパク質の発現」及び「ポリペプチドの発現」は、ＤＮＡ分子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写してｍＲＮＡを最終的にタンパク質へと折りたたまれ得るポリペプチド鎖に翻訳するプロセスによる、タンパク質またはポリペプチドの産生を意味する。タンパク質コードＤＮＡ分子またはポリペプチドコードＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞でタンパク質またはポリペプチドを発現させるのに用いられるＤＮＡ構築物において、異種プロモーターに機能可能に繋げられ得る。本明細書中で使用する場合、「機能可能に繋げられ」とは、２つのＤＮＡ分子が、一方が他方の機能に影響を与え得るように繋げられていることを意味する。機能可能に繋げられたＤＮＡ分子は、単一の連続分子の部分であり得、また、隣り合っていてもいなくてもよい。例えば、ＤＮＡ構築物において、プロモーターと、タンパク質コードＤＮＡ分子またはポリペプチドコードＤＮＡ分子とは、導入遺伝子の発現にプロモーターが影響を与え得るように２つのＤＮＡ分子が配置されている場合に、機能可能に繋がっている。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＣＴＰ配列に機能可能に繋げられたＤＭＯをコードするＤＮＡ配列を含む。本明細書中で使用する場合、「ジカンバモノオキシゲナーゼ」すなわち「ＤＭＯ」は、ジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸）の３，６−ジクロロサリチル酸（３，６−ＤＣＳＡ）への分解を酵素的に触媒することができるオキシゲナーゼ、例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ由来のデメチラーゼ（ｄｍｏ）遺伝子によってコードされるジカンバモノオキシゲナーゼを意味する。ジカンバモノオキシゲナーゼは当該技術分野において既知であり、配列番号１８〜２７として提供され表１において識別されるタンパク質配列を含む。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＣＴＰ配列に機能可能に繋げられたＰＰＯをコードするＤＮＡ配列を含む。本明細書中で使用する場合、「プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ」すなわち「ＰＰＯ」は、プロトポルフィリノーゲンＩＸをプロトポルフィリンＩＸへと酵素的に変換することができるオキシダーゼを意味する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは当該技術分野において既知であり、配列番号４０〜６０として提供され表２において識別されるタンパク質配列を含む。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明によって提供されるタンパク質コードＤＮＡ分子に機能可能に繋げられたＣＴＰ配列をコードするＤＮＡ配列を含み、それによってＣＴＰは組換えタンパク質分子の細胞内での局在化を促進する。ＣＴＰは当該技術分野においてシグナル配列、標的指向性配列、標的指向性ペプチド及び局在化配列としても知られる。葉緑体は当該技術分野において色素体としても知られる。タンパク質の細胞内での局在化を促進することによってＣＴＰは、最適な酵素活性のためにタンパク質の葉緑体への局在化を保証し、また、組換えタンパク質の蓄積を増大させ得、タンパク質をタンパク質分解から保護し得る。葉緑体内への移動に際してＣＴＰは、典型的にはタンパク質から開裂する（プロセシングとも呼ばれる）。ＣＴＰプロセシングは、（ＣＴＰがタンパク質のアミノ末端から完全に開裂するという意味で）完全である場合も、（ＣＴＰの１つ以上のアミノ酸がタンパク質のアミノ末端に残留するという意味で）不完全である場合も、タンパク質のアミノ末端からの１つ以上のアミノ酸の除去をもたらす場合もある。ＤＭＯタンパク質からのＣＴＰの完全なプロセシングは、タンパク質蓄積のレベルを向上させ、それによってジカンバ耐性を高め、除草剤散布後の遺伝子導入細胞、種子または生物の損傷のレベルを低減する。ＣＴＰは配列番号１〜６及び３８として提供され、表３において識別される。各ＣＴＰをコードする、双子葉類及び単子葉類における発現のために最適化されたＤＮＡ配列は、配列番号７〜１７及び３９として提供される。

本開示の組換えＤＮＡ分子は、ＤＮＡ操作に有用な配列（例えば、制限酵素認識部位または組換えに基づくクローニング部位）、植物に好適な配列（例えば、植物コドン用配列またはコザック共通配列）、またはＤＮＡ構築物設計に有用な配列（例えばスペーサー配列またはリンカー配列）をもたらすことが望ましい場合には特に、当該技術分野において既知の方法によって完全あるいは部分的に合成及び改変され得る。本開示の組換えＤＮＡ分子は、本明細書において提供されるＤＮＡ配列と同じアミノ酸配列をコードする変性ＤＮＡ配列を含む。変性ＤＮＡ配列は、当該技術分野において既知の方法及びＤＮＡコドン表を用いて作ることができる。本発明は、本明細書において提供されるいずれかの組換えＤＮＡ分子またはポリペプチドの配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、及び少なくとも９９％の配列同一性を有する、組換えＤＮＡ分子及びタンパク質を含む。例えば、本発明の組換えＤＮＡ分子は、配列番号７〜１４からなる群から選択される配列に対して、または配列番号２８〜３７及び６１〜１０２からなる群から選択される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、ＤＮＡ配列を含み得る。本発明の組換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜３からなる群から選択される配列に対して、または配列番号１８〜２７及び４０〜５９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、タンパク質配列をコードし得る。

本明細書中で使用する場合、「配列同一性パーセント」または「配列同一性％」という用語は、２つの配列を最適に（比較窓において合計で基準配列の２０パーセント未満である、ヌクレオチドまたはアミノ酸の適切な挿入、欠失またはギャップを伴って）整列させる場合に試験（「対象」）配列（またはその相補鎖）と比較して基準（「クエリー」）配列（またはその相補鎖）の直鎖状のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列において同一である、ヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率を指す。比較窓を整列させるための配列の最適なアラインメントは当該技術分野においてよく知られており、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法などのツールによって、ならびにデフォルトパラメータを有してＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＥＧＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳｔａｒ Ｉｎｃ．，１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５）及びＭＵＳＣＬＥ（バージョン３．６）（Ｅｄｇａｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２−７，２００４）などの配列解析ソフトウェアパッケージの一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって、行われ得る。試験配列及び基準配列の整列セグメントについての「同一性率」は、整列させた２つの配列によって共有されている同一構成要素の数を、基準配列セグメントの構成要素の全数、すなわち基準配列全体または基準配列のより小さい画定部分で除したものである。配列同一性パーセントは、同一性率に１００を掛けたものとして表される。１つ以上の配列の比較は、完全長配列またはその一部に対するものであってもよいし、より長い配列に対するものであってもよい。

本明細書中で使用する場合、「ＤＮＡ構築物」は、２つ以上の異種ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、導入遺伝子発現に有用であり、ベクター及びプラスミドの中に含まれることができる。ＤＮＡ構築物は、遺伝子導入植物及び細胞の生産のために形質転換、つまり宿主細胞内への異種ＤＮＡの導入を目的としてベクターにおいて使用されることができ、それゆえに遺伝子導入植物、種子、細胞または植物部分の色素体ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの中に含まれることができる。本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、植物形質転換を目的として使用され得る任意の組換えＤＮＡ分子を意味する。配列表に明記されている組換えＤＮＡ分子は、例えば、植物において組換えＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現に影響を与える機能をする遺伝子発現エレメントに機能可能に繋げられた組換えＤＮＡ分子を有する構築物の一部として、ベクター内に挿入されることができる。ＤＮＡ構築物及びベクターを構築する方法は当該技術分野において既知である。ＤＮＡ構築物の構成要素、またはＤＮＡ構築物を含んでいるベクターは、通常、転写されることができるＤＮＡ配列に機能可能に繋げられた、１つ以上の遺伝子発現エレメント、例えば以下のもの：機能可能に繋がっているＤＮＡを発現させるためのプロモーター、機能可能に繋がっているタンパク質コードＤＮＡ分子、及び３’非翻訳領域を含む。本発明の実施に有用な遺伝子発現エレメントは、限定されないが、以下のタイプのエレメントのうちの１つ以上を含む：プロモーター、５’非翻訳領域、エンハンサー、リーダー、シスエレメント、イントロン、３’非翻訳領域、及び選択可能な１つ以上のマーカー導入遺伝子。

本発明のＤＮＡ構築物は、本発明によって提供されるタンパク質コードＤＮＡ分子に機能可能に繋げられたプロモーターを含み得、それによってプロモーターは組換えタンパク質分子の発現を推進する。本発明の実施に有用なプロモーターは、機能可能に繋げられたポリヌクレオチドの発現のために細胞で機能するもの、例えば細菌プロモーターまたは植物プロモーターを含む。植物プロモーターは様々であり、当該技術分野においてよく知られており、誘導性のもの、ウイルス性のもの、合成のもの、常時発現型のもの、時間的に調節されるもの、空間的に調節されるもの及び／または、空間的かつ時間的に調節されるものを含む。

本明細書中で使用する場合、「陰性対照」及び「陽性対照」は、比較目的のために設計された実験対照を意味する。例えば、遺伝子導入植物の分析において、陰性対照または陽性対照は、実験植物（つまり、試験される植物）と同じ種類ではあるが実験植物の遺伝子導入挿入物、組換えＤＮＡ分子またはＤＮＡ構築物を含有していない、植物であり得る。遺伝子導入トウモロコシ植物との比較に有用な植物の一例は、非遺伝子導入型ＬＨ２４４トウモロコシ（米国特許第６，２５２，１４８号）または非遺伝子導入型０１ＤＫＤ２トウモロコシ（米国特許第７，１６６，７７９号）であり、遺伝子導入ダイズ植物との比較に有用な植物の一例は、非遺伝子導入型Ａ３５５５ダイズ（米国特許第７，７００，８４６号）または非遺伝子導入型Ａ３２４４ダイズ（米国特許第５，６５９，１１４号、ＰＶＰ９６００２４６）であり、遺伝子導入型のキャノーラまたはＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物との比較に有用な植物の一例は、非遺伝子導入型Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ品種６５０３７稔性回復系統であり、遺伝子導入コムギ植物との比較に有用な植物の一例は、非遺伝子導入型コムギ品種Ｓａｍｓｏｎ生殖細胞質（ＰＶＰ１９９４）であり、遺伝子導入ワタ植物との比較に有用な植物の一例は、非遺伝子導入型ＤＰ３９３（米国特許第６，９３０，２２８号 ＰＶＰ２００４００２６６）である。

遺伝子導入植物
本発明の一態様は、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子を含んでいる遺伝子導入植物細胞、遺伝子導入植物組織、遺伝子導入植物及び遺伝子導入種子を含む。組換えＤＮＡ分子を含むこれらの細胞、組織、植物及び種子は、除草剤に対する耐性を呈する。

遺伝子導入ＤＮＡ（「導入遺伝子」として知られる）を植物のゲノムに挿入することは、植物形質転換の行為によって成し遂げられ得、「事象」として知られる新しい遺伝子導入ゲノム分子配列の作出をもたらす。各事象は固有のものであり、事象のＤＮＡ配列はその事象に特異なものである。本発明に関して使用するための宿主植物細胞の形質転換に適した方法は、実質的には、ＤＮＡを細胞の中に導入することができる任意の方法（例えば、組換えＤＮＡ構築物を安定的に植物染色体中に組み入れるもの）を含み、当該技術分野においてよく知られている。植物の中に組換えＤＮＡ構築物を導入する典型的方法に入れる、組換えＤＮＡ構築物としては、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換系及びＤＮＡ粒子衝突が挙げられ、それらは両方とも当業者によく知られている。植物の中に組換えＤＮＡ構築物を導入する別の典型的方法は、部位特異的組込みの方法による植物ゲノムの所定部位での組換えＤＮＡ構築物の挿入である。部位特異的組込みは、当該技術分野において知られている任意の方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、人工または天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）の使用によって成し遂げられ得る。その後、植物細胞培養の方法によって形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生することができる。導入遺伝子に関してホモ接合型である遺伝子導入植物（つまり、導入遺伝子の２つの対立遺伝子コピー）は、導入遺伝子の単一対立遺伝子を含有する遺伝子導入植物と、それ自体、例えばＲ０植物との自家受粉（自殖）によって得ることができ、Ｒ１種子を産生する。産生されたＲ１種子の４分の１が導入遺伝子に関してホモ接合体となる。Ｒ１種子を発芽させることによって栽培した植物は、典型的にはＳＮＰアッセイ、ＤＮＡ配列決定または、接合性アッセイと呼ばれヘテロ接合体とホモ接合体との区別を可能にする熱増幅アッセイを用いて、接合性に関して試験することができる。

本発明によって提供される植物、種子、植物部分、植物組織及び細胞は、ジカンバに対する除草剤耐性を呈し得る。ジカンバは、雑草生育を防止することを含めた雑草抑制のための方法として本発明によって提供される植物及び種子を含んでいる植物栽培領域に散布され得る。本発明によって提供される植物及び種子は、除草剤耐性形質を含んでおり、それゆえにジカンバの散布に対して耐性である。除草剤散布は、推奨商用量（１Ｘ）またはその何分の一かもしくは数倍、例えば推奨商用量の２倍（２Ｘ）であってもよい。ジカンバ散布量は、１ポンド１エーカーあたりの酸当量（ポンド酸当量／エーカー）または１グラム１ヘクタールあたりの酸当量（ｇ酸当量／ヘクタール）として表され得る。植物栽培領域は、除草剤散布の時点で雑草植物を含んでいてもいなくてもよい。雑草を抑制するための領域で使用するためのジカンバの除草剤として有効な用量は、生育期にわたって表示量（複数可）の約０．１Ｘ〜約３０Ｘの範囲からなるべきである。ジカンバの１Ｘ表示量は０．５ポンド酸当量／エーカーである。除草剤量は、英国式とメートル法との間で、（ポンド活性成分／エーカー）×１．１２＝（ｋｇ活性成分／ヘクタール）、及び（ｋｇ活性成分／ヘクタール）×０．８９＝（ポンド活性成分／エーカー）と換算することができる。

植物、種子、植物部分、植物組織及び細胞は、１つ以上のＰＰＯ阻害剤（ＰＰＯ除草剤と呼ばれる）に対する耐性を呈し得る。雑草生育を防止することを含めた雑草抑制のための方法として本発明によって提供される植物及び種子を含んでいる植物栽培領域に１つ以上のＰＰＯ除草剤を散布してもよい。本発明によって提供される植物及び種子は、除草剤耐性形質を含んでおり、それゆえに１つ以上のＰＰＯ除草剤の散布に対して耐性である。除草剤散布は、推奨商用量（１Ｘ）またはその何分の一かもしくは数倍、例えば推奨商用量の２倍（２Ｘ）であってもよい。植物栽培領域は、除草剤散布の時点で雑草植物を含んでいてもいなくてもよい。雑草を抑制するための領域で使用するためのＰＰＯ除草剤の除草剤として有効な用量は、生育期にわたって表示量（複数可）の約０．１倍〜約３０倍の範囲からなるべきである。ＰＰＯ除草剤は当該技術分野においてよく知られており、市販されている。ＰＰＯ除草剤の例としては、限定されないが例えば、ジフェニルエーテル（例えば、アシフルオルフェン、その塩及びエステル、アクロニフェン、ビフェノックス、その塩及びエステル、エトキシフェン、その塩及びエステル、フルオロニトロフェン、フリルオキシフェン、ハロサフェン、クロメトキシフェン、フルオログリコフェン、その塩及びエステル、ラクトフェン、その塩及びエステル、オキシフルオルフェン、ならびにホメサフェン、その塩及びエステル）；チアジアゾール（例えばフルチアセットメチル及びチジアジミン）；ピリミジンジオンまたはフェニルウラシル（例えば、ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、エチル［３−２−クロロ−４−フルオロ−５−（１−メチル−６−トリフルオロメチル−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−３−イル）フェノキシ］−２−ピリジルオキシ］アセテート（ＣＡＳ登録番号は３５３２９２−３１−６であり、本明細書中ではＳ−３１００と呼ばれる）、フルプロパシル、サフルフェナシル及びチアフェナシル）；フェニルピラゾール（例えば、フルアゾレート、ピラフルフェン及びピラフルフェンエチル）；オキサジアゾール（例えばオキサジアルギル及びオキサジアゾン）；トリアゾリノン（例えば、アザフェニジン、ベンカルバゾン、カルフェントラゾン、その塩及びエステル、ならびにスルフェントラゾン）；オキサゾリジンジオン（例えばペントキサゾン）；Ｎ−フェニルフタルイミド（例えば、シニドンエチル、フルミクロラック、フルミクロラックペンチル及びフルミオキサジン）；ベンゾオキサジノン誘導体（例えば、１，５−ジメチル−６−チオキソ−３−（２，２，７−トリフルオロ−３，４−ジヒドロ−３−オキソ−４−プロパ−２−イニル−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−６−イル）−１，３，５−トリアジナン−２，４−ジオン）；フルフェンピル及びフルフェンピルエチル；ピラクロニル；ならびにプロフルアゾールが挙げられる。

除草剤散布は、いくつかの除草剤のうちの１つ、２つもしくは組み合わせまたはその他の任意の適合する除草剤を連続的に、またはタンクで混合したものであってもよい。幅広い種類の双子葉雑草、単子葉雑草またはその両方を抑制するための本発明の遺伝子導入植物を含んでいる領域に対して、合剤または単独での、１つの除草剤または２つ以上の除草剤の多数回散布、例えば、２回散布（例えば、植付け前散布と発芽後散布、または、発芽前散布と発芽後散布）または３回散布（例えば、植付け前散布と発芽前散布と発芽後散布、または、発芽前散布と２回の発芽後散布）を栽培期間にわたって用いてもよい。

本明細書中で使用する場合、「耐性」または「除草剤耐性」は、除草剤の散布されたときの毒性作用に耐える植物、種子または細胞の能力を意味する。植物、種子、植物組織、植物部分または細胞の除草剤耐性は、植物、種子、植物組織、植物部分または細胞を適切な実験対照と比較することによって測られ得る。例えば、除草剤耐性は、除草剤耐性を付与することができるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含む植物（試験植物）と、除草剤耐性を付与することができるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含んでいない同じ種の植物（陰性対照植物）とに除草剤を散布すること、及びその後に２つの植物の植物損傷を比較することによって測るかまたは評価してもよく、試験植物の除草剤耐性は、陰性対照植物の損傷率と比較したときの損傷率の低下によって指し示される。除草剤耐性植物、種子、植物組織、植物部分または細胞は、陰性対照植物、種子、植物組織、植物部分または細胞と比較して、除草剤の毒性作用に対する減少した応答を呈する。本明細書中で使用する場合、「除草剤耐性形質」は、陰性対照植物と比較して向上した除草剤耐性を植物に付与する、遺伝子導入形質である。

本発明の遺伝子導入植物、子孫、種子、植物細胞及び植物部分はさらに、１つ以上の追加遺伝子導入形質を含んでいてもよい。追加遺伝子導入形質は、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子を含んでいる導入遺伝子を含有する植物と、追加遺伝子導入形質（複数可）を含有する別の植物とを交配することによって導入され得る。本明細書中で使用する場合、「交配」は、２つの別個の植物の育種を行って子孫植物を生産することを意味する。２つの遺伝子導入植物はこのように交配されて遺伝子導入形質を含んだ子孫を産生し得る。本明細書中で使用する場合、「子孫」は、親植物の任意の世代の子を意味し、遺伝子導入子孫は、少なくとも一方の親植物から受け継いだ本発明によって提供されるＤＮＡ構築物を含む。あるいは、追加遺伝子導入形質（複数可）のためのＤＮＡ構築物と、本発明によって提供される組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物とを（例えば全てのＤＮＡ構築物が植物形質転換用の同じベクターの部分として存在している状態で）共形質転換することによって、または、本発明によって提供されるＤＮＡ構築物を含む遺伝子導入植物に追加形質（複数可）を（例えば、遺伝子導入植物または植物細胞に対していずれかの植物形質転換方法を用いることにより）挿入することもしくはその逆によって、その追加遺伝子導入形質（複数可）を導入してもよい。そのような追加遺伝子導入形質としては、限定されないが例えば、向上した害虫抵抗性、向上した水使用効率、向上した収穫高性能、向上した耐乾燥性、向上した種子品質、向上した栄養質、雑種種子産生、及び除草剤耐性が挙げられ、その形質は野生型植物に関して測られる。そのような追加遺伝子導入形質は、当業者に既知であり、例えば、そのような形質の一覧は米国農務省（ＵＳＤＡ）の動植物検疫局（ＡＰＨＩＳ）によって提供されている。

本発明によって提供される、遺伝子導入形質を含んでいる遺伝子導入植物及び子孫は、当該技術分野において一般的に知られているいかなる育種方法で使用してもよい。２つ以上の遺伝子導入形質を含んでいる植物系統では、遺伝子導入形質は、無関係に別個のものであってもよいし、関連を有していてもよいし、両者が、３つ以上の遺伝子導入形質を含んでいる植物系統において組み合わさっていてもよい。栄養繁殖と同様に、親植物に対する戻し交配、及び非遺伝子導入型植物との異系交配も企図される。様々な形質及び作物のために通常用いられる育種方法に関する解説書は当業者によく知られている。特定の植物または種子における導入遺伝子（複数可）の存在を確認するために様々なアッセイを行ってよい。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＰＣＲならびにＤＮＡ配列決定などの、分子生物学アッセイ、タンパク質産物の存在を例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によるかまたは酵素機能によって検出することなどの、生化学的アッセイ、葉または根のアッセイなどの、植物部分アッセイ、さらには、植物体全体の表現型の分析によるアッセイが挙げられる。特定の遺伝子導入植物または種子におけるＣＴＰプロセシングを分析するには、遺伝子導入細胞、植物または種子から得られた組換えＤＭＯまたはＰＰＯタンパク質に対するエドマン分解配列決定または質量分析などのアッセイを行ってその結果生じる配列データをそれぞれＤＭＯまたはＰＰＯタンパク質の配列と比較してもよい。

植物遺伝子型への遺伝子導入形質の遺伝子移入は、戻し交配転換のプロセスの結果として達成される。遺伝子導入形質が遺伝子移入されている植物遺伝子型は、戻し交配転換された遺伝子型、系統、近交系または雑種と呼ばれることがある。同様に、所望の遺伝子導入形質を欠く植物遺伝子型は、転換されていない遺伝子型、系統、近交系または雑種と呼ばれることがある。

本明細書中で使用する場合、「含む」という用語は、「限定されないが、含む」ということを意味する。

以下の実施例は、本発明の実施形態を実証するために含まれている。当業者であれば、本開示に鑑みて、提供されている具体的実施形態に多くの変更を加えることができ、依然として本発明の範囲及び概念範囲から逸脱せず類似または同様の結果を得ることができる、ということを理解するはずである。より具体的には、同じまたは同様の結果を得ながら、本明細書に記載の薬剤の代わりに化学的または生理学的に関連する特定薬剤が使用され得ることは明らかであろう。当業者にとって明らかなそのような同様の置き換え及び改変は全て、本発明の範囲及び概念に含まれているとみなされる。

実施例１：ＣＴＰ−ＤＭＯの発現及びダイズプロトプラストにおける局在化
ダイズプロトプラストアッセイを用いて、ＤＭＯ配列（配列番号２７）に機能可能に繋げられた５つのうち１つのＣＴＰを含んでいる組換えタンパク質の相対的な葉緑体指向効率を評価した。組換えタンパク質のサイトゾル及び葉緑体での分布を監視するために、組換えのＣＴＰとＤＭＯとの組み合わせ（本明細書においてＣＴＰ−ＤＭＯと呼ぶ）をコードするカセットに緑色蛍光タンパク質コード配列を、緑色蛍光タンパク質がＤＭＯのカルボキシ末端と融合するように追加した。

プロトプラストは、マメ子葉（生殖細胞質Ａ３２４４）から作製した。未熟なダイズ種子鞘を採取し、滅菌技法を用いて種子（長さ４〜６ｍｍ）を取り出した。各種子からの子葉を手作業で取り出し、横に１ｍｍの薄片に切り、０．７Ｍのマンニトールを含むＣＰＷ緩衝液（ｐＨ５．８）中で２４〜２６℃で１時間、４０ＲＰＭで振盪しながら暗所でインキュベートした。その後、緩衝液を除去して酵素緩衝液（４％のセルラーゼ「オノズカ」Ｒ−１０、２％のヘミセルラーゼ、０．３％のマセロザイムＲ−１０、ＣＰＷ緩衝液中（ｐＨ５．８、０．４９Ｍのマンニトールを含む））で置き換えた。子葉組織を回転式振盪器上で５０ｒｐｍで２時間２４〜２６℃でインキュベートした。このインキュベーションの最後に、プレートを手作業で回し、懸濁液を６０ｕｍのナイロン製メッシュの二重層で５０ｍＬ円錐管内へと濾過することにより、ダイズプロトプラストが子葉組織から遊離した。プロトプラストを再懸濁及び遠心分離によって穏やかに１回洗浄した。最終ペレットを緩衝液（４ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５Ｍのマンニトール）中に再懸濁させ、氷上で１時間休めた。その後、プロトプラストを遠心分離し、ペレットを形質転換用緩衝液（０．４Ｍのマンニトール、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７））中に再懸濁させた。体積を調節して１×１０，０００，０００プロトプラスト／ｍｌにした。形質転換は、各構築物に対して１２．５μｇのＤＮＡを混合することによって成し遂げられた。ＤＮＡを穏やかに１．５×１，０００，０００プロトプラストと混ぜ、次いで等しい体積のＰＥＧ緩衝液を添加した。これを５分間インキュベートし、その後、３００μｌのＷ５緩衝液（１５４ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ_２、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７））で徐々に希釈した。これを５〜１０分インキュベートし、その後、９００μｌのＷ５緩衝液を徐々に添加した。プロトプラストをペレットにし、ＷＩ緩衝液（０．５Ｍのマンニトール、４ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、２０ｍＭのＫＣｌ）中に再懸濁させ、２４〜２６℃で暗所にてインキュベートした。クリプトン−アルゴンイオン（４５８、４８８ｎｍ）レーザー、緑色（５４３ｎｍ）ヘリウム−ネオンレーザーならびにＦＩＴＣ及びＴｅｘａｓ ｒｅｄフィルターセットを装備したＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡレーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を使用して顕微鏡分析を行った。画像の取得及び解析は、ＺＥＮ２０１２ ｖ．８．１（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）及び４０Ｘの水浸１．２開口数対物レンズを使用して行った。使用した励起波長は、４８８ｎｍ（ＧＦＰ）及び５４３ｎｍ（葉緑体自家蛍光）であり、出射フィルターは５００〜５３０ｎｍ（ＧＦＰ）及び６３０〜７００ｎｍ（葉緑体自家蛍光）であった。各構築物につき少なくとも５０個の個々の細胞を構築物の局在性について採点した：サイトゾル、色素体、またはサイトゾルと色素体との両方。結果は、分析した細胞の全数のうちサイトゾルまたは色素体（またはそれらの両方）に局在しているタンパク質を有する細胞の百分率として記録し、表４に示す。
表４．ダイズプロトプラスト指向性アッセイ

分析した５つのＣＴＰ−ＤＭＯの組み合わせのうちＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）のみが、色素体のみへのタンパク質の局在化を示す１００％の細胞をもたらした。Ａｔ．ＣＲ８８ ＣＴＰ（配列番号３）は、色素体のみへのタンパク質の局在化を示す９４％の細胞ならびに、サイトゾル及び色素体へのタンパク質の局在化を示す６％の細胞をもたらした。「Ａ」ＣＴＰは、色素体のみへのタンパク質の局在化を示す７９％の細胞ならびに、サイトゾル及び色素体への局在化を示す２１％の細胞をもたらした。「Ｂ」ＣＴＰは、色素体のみへのタンパク質の局在化を示す９％の細胞ならびに、サイトゾル及び色素体への局在化を示す９１％の細胞をもたらした。「Ｃ」ＣＴＰは、色素体のみへのタンパク質の局在化を示す１８％の細胞ならびに、サイトゾル及び色素体への局在化を示す８２％の細胞をもたらした。ＣＴＰなしでは、タンパク質はサイトゾル中にのみ存在した。これらの結果は、ＡＰＧ６ ＣＴＰが１００％の効率でＣＴＰ−ＤＭＯを色素体に対して標的指向化したこと、及びＡｔ．ＣＲ８８ ＣＴＰが９４％の効率でＣＴＰ−ＤＭＯを色素体に対して標的指向化したことを指し示している。

実施例２：遺伝子導入コムギにおけるＣＴＰ−ＤＭＯプロセシング
ＤＭＯに機能可能に繋げられた別個の４つのうち１つのＣＴＰをコードする組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物で形質転換された遺伝子導入コムギ植物を使用して、タンパク質発現の評価及びＣＴＰプロセシングの判定を行った。

遺伝子導入コムギ植物は、プロモーターに機能可能に繋げられたＤＭＯタンパク質に機能可能に繋げられた異なる４つのうち１つのＣＴＰを含有するＤＮＡ構築物を各々が含んでいる４つの異なる植物形質転換用ベクターを使用して生産した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用し、当業者に知られている方法を用いて、Ｓａｍｓｏｎ生殖細胞質（ＰＶＰ１９９４）のコムギ由来の前培養した未熟胚を形質転換し、遺伝子導入小植物体を生産した。各々の固有の事象のゲノム中の導入遺伝子コピー数を確認する分子分析のために葉の試料を採取し、導入遺伝子のコピーを１つ有するＲ０植物を自殖してＲ１種子を採集した。

種子（５０ｇ）を粉砕し、次いでそれを２５０ｍｌの抽出用緩衝液（１ｘＴＢＥ（８９ｍＭのトリス−ホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．４）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、５ｍＭのベンズアミジン、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ））に添加し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）で約２０秒間均質化し、次いで４℃で１〜２時間、振盪しながらインキュベートした。混合物を４℃で２５分間９，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を１０％及び５５％の飽和硫酸アンモニウム（ＡＳ）で順次沈殿させ、各沈殿ステップにおいて１８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離をした。１０％ＡＳ沈殿からのペレットは廃棄した。

１０〜５５％画分からのペレットを３０ｍｌのＰＢＳ（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ）中に１錠のｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤と共に溶かした。溶解したペレットを遠心分離し、上清を０．２２ｕｍの膜で濾過した。ＤＭＯに対するヤギポリクローナル抗体血清をＰｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＡ／Ｇアガロース樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の１：１懸濁液と混合し、１．５時間後に、抗ＤＭＯ Ａｂで負荷されたプロテインＡ／Ｇアガロース樹脂をＰＢＳで３回洗浄し、約３０ｍｌの１０〜５５％ＡＳ濾過済み画分に添加した。インキュベート後に樹脂を遠心沈降させ、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、微量遠心分離管へ移して再びペレット化した。

最終ペレットを２ＸのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中に再懸濁させ、５分間煮沸し、トリス−グリシン緩衝液中１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに１８５Ｖ（一定）で試料を流した。４℃及び１００Ｖで３０分間、ＣＡＰＳトランスファー緩衝液を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜へ移した。ＰＶＤＦ膜に結合したタンパク質をクーマシーブルーで約３０秒間染色し、１０〜５５％ＡＳ画分中の各ＤＭＯタンパク質に対応するバンドをＰＶＤＦブロットから切り出してアミノ末端タンパク質配列解析に使用した。アミノ末端タンパク質配列決定は自動化エドマン分解化学によって行い、各解析は自動化エドマン分解化学を用いて１５サイクル実施した。１４０Ｃ微小勾配ポンプ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ２００ ＵＶ／可視検出器を備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４９４ Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）配列決定システムをＰｒｏｃｉｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（バージョン２．１）ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で制御して解析に使用した。ＳｅｑｕｅｎｃｅＰｒｏ（登録商標）（バージョン２．１）タンパク質配列解析ソフトフェアを使用してクロマトグラフィーデータを収集した。各タンパク質について予測タンパク質の予測配列と一致する少なくとも８つのアミノ酸が認められた場合に同一性を成立させた。アミノ末端配列決定の結果を表５に示す。
表５．組換えタンパク質のアミノ末端配列決定

ＤＭＯ、ＤＭＯ＋１、ＤＭＯ＋１０及びＤＭＯ＋１２という名称は、プロセシング後にＣＴＰのそれぞれ０、１、１０または１２個のアミノ酸がＤＭＯのアミノ末端に残留していることがタンパク質配列決定によって示されたことを指し示すために使用した。ＤＭＯ−１という名称は、プロセシング後にＤＭＯの最初のメチオニンが除去されたことを指し示すために使用した。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）について２つの固有の事象を試験した。両試料とも、プロセシング後にＤＭＯのアミノ末端に残留しているＣＴＰの１つのアミノ酸を示した（ＤＭＯ＋１）。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡｔ．ＣＲ８８ ＣＴＰ（配列番号３）について３つの固有の事象を試験した。３つの試料は全て、プロセシング後にＤＭＯのアミノ末端に残留しているＣＴＰの０個または１つのアミノ酸を示した（ＤＭＯ及びＤＭＯ＋１）。ＤＭＯ（配列番号１９）に機能可能に繋げられたＣＴＰ４（配列番号４）から試験した事象は、プロセシング後にＤＭＯのアミノ末端に残留しているＣＴＰの１２個のアミノ酸を示した（ＤＭＯ＋１２）。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＯｓ．Ｗａｘｙ ＣＴＰ（配列番号６）について２つの固有の事象を試験した。１つの試料は、プロセシング後にＤＭＯのアミノ末端に残留しているＣＴＰの１０個のアミノ酸を示し（ＤＭＯ＋１０）、１つは、プロセシング後にＤＭＯの最初のメチオニンが除去されたことを示した（ＤＭＯ−１）。これらの結果は、遺伝子導入植物において発現した場合にＡＰＧ６ ＣＴＰ及びＡｔ．ＣＲ８８ ＣＴＰがＤＭＯから効率的にプロセシングされることを指し示している。

実施例３：遺伝子導入Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓにおけるＣＴＰ−ＤＭＯ発現
ＤＭＯに機能可能に繋げられた別個の３つのうち１つのＣＴＰをコードする組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物の、ジカンバ耐性をもたらす能力を、遺伝子導入Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物で評価した。

遺伝子導入Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物は、プロモーターに機能可能に繋げられたＤＭＯに機能可能に繋げられた異なる３つのうち１つのＣＴＰを含有するＤＮＡ構築物を各々が含んでいる３つの異なる植物形質転換用ベクターを使用して生産した。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ品種６５０３７稔性回復系統をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のために使用し、Ｒ０植物を温室で栽培した。固有の事象を導入遺伝子のコピー数に関して選別した。導入遺伝子のコピーを１つ有するＲ０植物を自殖してＲ１種子を採取した。

ベクター鎖による１コピーの導入遺伝子、または２コピーの導入遺伝子を有するＲ０植物を使用してジカンバ耐性を評価した。ジカンバ耐性は、温室条件下で２０％以下のジカンバ損傷として示される。植木鉢に入ったＲ０事象を３つの群に分け、ジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ（登録商標））を３つの量：（１）ジカンバなし、（２）１ポンド酸当量／エーカーのジカンバ（２Ｘ量）、または（３）２ポンド酸当量／エーカーのジカンバ（４Ｘ量）のうちの１つで散布した。遺伝子導入植物に噴霧し、２１日後に損傷評価を記録した。ＤＭＯ（配列番号２１）に機能可能に繋げられた「Ａ」ＣＴＰを含有する植物は、ジカンバに耐性である事象を示さなかった。ＤＭＯ（配列番号２１）に機能可能に繋げられたＲｂｃＳ ＣＴＰ（配列番号５）を含有する植物は、２Ｘ量のジカンバ対する耐性を有する、９個のうち８個の事象及び、４Ｘ量のジカンバに対する耐性を有する、７個のうち７個の事象を示した。ＤＭＯ（配列番号２０）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）を含有する植物は、２Ｘ量のジカンバ対する耐性を有する、１４個のうち７個の事象及び、４Ｘ量のジカンバに対する耐性を有する、１８個のうち６個の事象を示した。結果を表６に示す。
表６．Ｒ０のＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓにおけるジカンバ耐性

１コピーの導入遺伝子を有するＲ０植物においてジカンバ耐性を評価した。温室内で植物にジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ）を１ポンド酸当量／エーカー（２Ｘ量）で噴霧し、ジカンバ耐性を１４〜２１日後に判定した。ＤＭＯ（配列番号２０）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰを含有する植物は、ジカンバに対する耐性を有する、３１個のうち１３個の事象を示した。ＤＭＯ（配列番号２１）に機能可能に繋げられたＲｂｃＳ ＣＴＰを含有する植物は、ジカンバに対する耐性を有する、１７個のうち１３個の事象を示した。ＤＭＯ（配列番号２１）に機能可能に繋げられた「Ａ」ＣＴＰを含有する植物は、ジカンバに対する耐性を有する、１８個のうち７個の事象を示した。結果を表７に示す。
表７．Ｒ０のＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓにおけるジカンバ耐性

ＤＭＯ（配列番号２０）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰ（ＡＰＧ６＋ＤＭＯ）を含有する２８個のＲ１植物の各々からの１０個の種子及び、ＤＭＯ（配列番号２１）に機能可能に繋げられたＲｂｃＳ ＣＴＰ（ＲｂｃＳ＋ＤＭＯ）を含有する１７個のＲ１植物の各々からの１０個の種子を温室内で栽培した。植付け日に２ポンド酸当量／エーカーのジカンバ（４Ｘ）、それに続いてＶ３段階に１ポンド酸当量／エーカーのジカンバ（２Ｘ）、そして第１開花期（植物の９０％超が抽苔したとともに約２５％が少なくとも１つの開いた花を有することとして定義される）に１ポンド酸当量／エーカーのジカンバ（２Ｘ）を、植物に噴霧した。各噴霧から７日後に損傷評価を行い、噴霧された対照と比較したときの損傷率として表した。ＡＰＧ６＋ＤＭＯを含有する植物では、３回の評価期の各々においてジカンバ損傷評価が２０％以下である２つの事象からの子孫が合計９つあった。ＲｂｃＳ＋ＤＭＯを含有する植物では、３回の評価期の各々において２０％未満のジカンバ耐性を有する植物が１６個の事象をまたいで７７個あった。

Ｒ０事象から採取した葉を使用してタンパク質特性評価を行った。葉の組織を液体窒素中ですり潰し、１０％の２−メルカプトエタノールと５ｍＭのＤＴＴとを含有する２ＸのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）２回分を使用して抽出した。試料を煮沸し、１０μｌを４〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）プレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に装填し、２５０Ｖで４５分間トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液で流した。ゲル中のタンパク質を４００ｍＡで３０分間、２０％のメタノールを含有するトリス／グリシン緩衝液中でＰＶＤＦ膜へ移した。ポリクローナルウサギ抗ＤＭＯ抗血清とＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体とを使用してＤＭＯタンパク質を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して信号を検出した。ＡＰＧ６−ＤＭＯを含有する３つの事象の各々において、完全にプロセシングされたＤＭＯタンパク質の予測される大きさである約３８ｋＤａの単一のバンドが存在していた。ＲｂｃＳ−ＤＭＯを含有する６つの事象の各々において、約３８ｋＤａ及び約４１ｋＤａの２つのバンドが存在していた。４１ｋＤａのバンドは、ＤＭＯ＋２７と一致し、ＲｂｃＳ−ＤＭＯを含有するダイズにおいて以前に報告されている（米国特許第７，８３８，７２９号）。「Ａ」ＣＴＰ−ＤＭＯを含有する全ての事象においてはＤＭＯタンパク質の発現は非常に低く、長い間露光した後に検出された信号は約５０ｋＤａのバンドと約３９ｋＤａのバンドであった。５０ｋＤａのバンドは、プロセシングされていない「Ａ」ＣＴＰ−ＤＭＯの予測される大きさの近似である。これらの結果は、ＡＰＧ６−ＤＭＯが、完全にプロセシングされたＤＭＯと一致する予測される大きさの単一のバンドを生じさせた、ということを指し示している。

組換えタンパク質を、ＡＰＧ６−ＤＭＯまたはＲｂｃＳ−ＤＭＯを含有するＲ０植物の葉の組織から精製した。記載したエドマン分解化学を用いてアミノ末端配列解析を実施した。アミノ末端配列解析は、ウェスタンブロットで見受けられたＤＭＯバンドの大きさと一致する、ＲｂｃＳ−ＤＭＯを含有する植物に存在しているＤＭＯ＋２７及びＤＭＯ−１のＤＭＯアミノ末端配列の存在を裏付けた。アミノ末端配列解析は、ウェスタンブロットで見受けられたＤＭＯバンドの大きさと一致する、ＡＰＧ６−ＤＭＯを含有する植物において唯一のＤＭＯアミノ末端配列ＤＭＯ＋１の存在を裏付けた。この結果は、ＡＰＧ６ ＣＴＰの使用が植物において機能可能に繋げられたＤＭＯの完全なプロセシングをもたらすことを裏付けている。

実施例４：遺伝子導入トウモロコシにおけるＣＴＰ−ＤＭＯ発現
ＤＭＯに機能可能に繋げられた別個の２つのＣＴＰのうちの１つをコードする組換えＤＮＡ分子を含んでいるＤＮＡ構築物の発現を、遺伝子導入トウモロコシ細胞及び植物において分析した。

トウモロコシ葉肉プロトプラストの一過性形質転換を用いて、ＣＴＰ−ＤＭＯの２つの組み合わせの相対ＤＭＯ発現を評価した。ＤＮＡ構築物は、ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＣＴＰがＡＰＧ６（配列番号１）またはＣＴＰ４（配列番号４）のどちらかであることを別とすれば同一であった。プロトプラストは、本質的には実施例１に記載されているとおりに作製した。形質転換後に細胞を採取し、ＤＭＯタンパク質レベルを酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で決定した。ＣＴＰ−ＤＭＯの各組み合わせについて、４つの形質転換プロトプラスト試料からのタンパク質を、１ミリグラム（ｍｇ）の全タンパク質あたりのナノグラム（ｎｇ）ＤＭＯとして測定した。ＡＰＧ６−ＤＭＯで形質転換されたプロトプラストは、ＣＴＰ４−ＤＭＯで形質転換されたプロトプラストと比較してＤＭＯのレベルが約４倍高かった。データを表８に示す。

ＤＮＡ構築物を使用して遺伝子導入トウモロコシ植物を生産し、Ｒ０植物を栽培した。８つの固有の単一コピー事象に相当するＲ０植物から葉の試料を採集し、ＤＭＯレベルを測定する定量的ＥＬＩＳＡのために使用した。ＡＰＧ６−ＤＭＯを含有する事象において、Ｒ０の葉の組織におけるＤＭＯ発現は、ＣＴＰ４−ＤＭＯを含有する事象と比較して約４倍高かった。データを表８に示す。

遺伝子導入トウモロコシ植物において発現したＤＭＯに関してアミノ末端配列決定を行った。ＣＴＰ４−ＤＭＯまたはＡＰＧ６−ＤＭＯを発現している遺伝子導入トウモロコシ植物からタンパク質を精製し、本質的には実施例２に記載されているとおりにエドマン分解配列決定のために準備した。アミノ末端配列解析は、ＣＴＰ４−ＤＭＯを含有する植物において存在しているＤＭＯ＋６、ＤＭＯ＋７及びＤＭＯ＋１２のＤＭＯアミノ末端配列を裏付けた。アミノ末端配列解析は、ＡＰＧ６−ＤＭＯを含有する植物において存在しているＤＭＯ及びＤＭＯ＋１のＤＭＯアミノ末端配列を裏付けた。これらの結果は、ＤＭＯのアミノ末端に残留しているＣＴＰアミノ酸がより少ないことから立証されるように、ＣＴＰ４と比較してＡＰＧ６ではＣＴＰのプロセシングがより完全であることを指し示している。データを表８に示す。
表８．トウモロコシにおけるＤＭＯタンパク質発現

ＡＰＧ６−ＤＭＯまたはＣＴＰ４−ＤＭＯのどちらかをコードする組換えＤＮＡ分子を含有するＤＮＡ構築物を使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換により、当業者に知られている方法を用いて遺伝子導入トウモロコシを生産した。ジカンバ耐性は、遺伝子導入Ｆ１雑種植物の圃場試験において評価した。圃場試験は、各々２回繰り返される、２つの場所での４つの処理を含んでいた。４つの処理は、（１）Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８での２ポンド酸当量／エーカー（４Ｘ）のジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ（登録商標）の散布）、（２）Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８での４ポンド酸当量／エーカー（８Ｘ）のジカンバの散布、（３）Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８での８ポンド酸当量／エーカー（１６Ｘ）のジカンバの散布、ならびに（４）Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８での１６ポンド酸当量／エーカー（３２Ｘ）のジカンバの散布であった。処理から十日後に作物損傷を評価してＶ段階ごとの作物損傷率（ＣＩＰＶ２、ＣＩＰＶ４またはＣＩＰＶ８）として測定した。期間の最後に穀粒を採取し、収穫高をブッシェル／エーカーとして測定した。ＣＩＰＶ評価と収穫高との両方について、確率５％（ｐ＝０．０５）での最小有意差（ＬＳＤ）を計算した。ＡＰＧ６−ＤＭＯを含有するＦ１雑種植物に散布した最も高いジカンバ量（１６Ｘ及び３２Ｘ）は、ＣＴＰ４−ＤＭＯを含有する植物と比較してより少ない生長損傷及びより高い穀粒収穫高を示した。データを表９に示す。
表９．Ｆ１雑種のジカンバ損傷及び収穫高についての圃場試験

実施例５：遺伝子導入ワタ及びダイズにおけるＣＴＰ−ＤＭＯ発現
タンパク質翻訳効率（タンパク質合成）を増強しかつタンパク質蓄積を増大させるべくＡＰＧ６ ＣＴＰを最適化した。最適化されたＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号２）は、ＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）の位置３及び４においてスレオニン（Ｔ）からセリン（Ｓ）へのアミノ酸変更を有する。ダイズにおいて各々ＤＭＯに機能可能に繋げられた２つのＣＴＰを比較するために、ＤＮＡ構築物を作った。

ＡＰＧ６ ＣＴＰを除けば同一である２つのＤＮＡ構築物を使用して、遺伝子導入ダイズ植物を生産した。１つ目のＤＮＡ構築物は、ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）を有していた。２つ目のＤＮＡ構築物は、ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられた最適化ＡＰＧ６（配列番号２）を有していた。各ＤＮＡ構築物を使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換方法によってＡ３５５５ダイズを形質転換した。形質転換後、導入遺伝子の単一のコピーを含有するＲ０遺伝子導入植物をＰＣＲアッセイによって同定した。単一コピーＲ０植物を温室内で栽培し、Ｒ１種子を採取した。２つのＤＮＡ構築物を各々使用して生産した４つの事象について１つの事象あたり１０個のＲ１種子と、ＡＧ３５５５種子とを、標準的温室栽培条件下での発芽後ジカンバ処理に対する作物耐性の評価のために植付けた。Ｖ４段階においてジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ）を１１２０ｇ活性成分／ヘクタールで散布した。処理から１０日後に作物損傷評価を行った。組換えタンパク質レベル測定及びアミノ末端配列解析のためにジカンバ耐性ダイズ植物からの葉の試料を得た。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）を有する単一コピージカンバ耐性Ｒ１遺伝子導入ダイズ植物については、ＤＭＯタンパク質レベルが１３．３５±２．７ｎｇ／ｍｇであることがＥＬＩＳＡによって判明した。最適化ＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号２）を有する単一コピージカンバ耐性Ｒ１遺伝子導入ダイズ植物については、ＤＭＯタンパク質レベルが１８．５５±３．１ｎｇ／ｍｇであることがＥＬＩＳＡによって判明した。陰性対照Ａ３５５５ダイズ葉組織ではＤＭＯタンパク質は検出されなかった。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）を有する単一コピーＲ１遺伝子導入ダイズ植物のジカンバ損傷評価は３．６％であった。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられた最適化ＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号２）を有する単一コピーＲ１遺伝子導入ダイズ植物のジカンバ損傷評価は２．７％であった。陰性対照Ａ３５５５ダイズのジカンバ損傷評価は９９．８％であった。単一コピージカンバ耐性Ｒ１遺伝子導入ダイズ植物からの葉の試料を（実施例２及び４に記載されているような）アミノ末端配列決定のために使用した。アミノ末端配列解析は、ＡＰＧ６−ＤＭＯ及び最適化ＡＰＧ６−ＤＭＯのプロセシングがＤＭＯタンパク質のアミノ末端からのＣＴＰの完全なプロセシングをもたらしたことを裏付けた。ＤＭＯレベル、ジカンバ損傷及びＡＰＧ６−ＤＭＯプロセシングは、ＤＭＯに機能可能に繋げられた場合にＡＰＧ６及び最適化ＡＰＧ６がどちらもジカンバに対する耐性をもたらし、両ＣＴＰが植物において完全にプロセシングされる、ということを指し示した。データを表１０に示す。
表１０．Ｒ１ダイズ温室試験

ＡＰＧ６ ＣＴＰを別とすれば同一である２つのＤＮＡ構築物を使用して遺伝子導入ワタ植物を生産した。１つ目のＤＮＡ構築物は、ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）を有していた。２つ目のＤＮＡ構築物は、ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられた最適化ＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号２）を有していた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって各ＤＮＡ構築物を当業者に知られている方法を用いてワタに形質転換した。形質転換後、導入遺伝子の単一のコピーを含有するＲ０ワタ遺伝子導入植物をＰＣＲアッセイによって同定し、温室内で栽培し、Ｒ１種子を採取した。各構築物について１０の事象から１つの事象あたり１０個のＲ１種子と、ＤＰ３９３ワタからの種子とを、ジカンバの発芽後散布に対する作物耐性の評価のために植付けた。Ｖ４段階において、ジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ）を１１２０ｇ活性成分／ヘクタールで散布した。処理から９日後に作物損傷率評価を行った。タンパク質レベル測定及び、ＡＰＧ６−ＤＭＯまたは最適化ＡＰＧ６−ＤＭＯのアミノ末端配列解析のために、耐性ワタ植物からの葉の試料を使用した。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）を有する単一コピージカンバ耐性Ｒ１遺伝子導入ワタ植物では、ＥＬＩＳＡによって検出されたＤＭＯタンパク質レベルが１７６．２±１０３ｎｇ／ｍｇであった。最適化ＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号２）を有する単一コピージカンバ耐性Ｒ１遺伝子導入ワタ植物では、ＥＬＩＳＡによって検出されたＤＭＯタンパク質レベルが１３６．５±５８．６ｎｇ／ｍｇであった。陰性対照ＤＰ３９３ワタ葉組織においてはＤＭＯタンパク質は検出されなかった。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号１）を有する単一コピーＲ１遺伝子導入ワタ植物のジカンバ損傷は２．６％であった。ＤＭＯ（配列番号１８）に機能可能に繋げられた最適化ＡＰＧ６ ＣＴＰ（配列番号２）を有する単一コピーＲ１遺伝子導入植物のジカンバ損傷は２．２％であった。陰性対照ＤＰ３９３ワタの損傷は８５％であった。単一コピージカンバ耐性Ｒ１植物からの葉の試料を（実施例２及び４に記載されているような）アミノ末端配列決定のために使用した。アミノ末端配列解析は、ＡＰＧ６−ＤＭＯ及び最適化ＡＰＧ６−ＤＭＯのプロセシングがＤＭＯタンパク質のアミノ末端からのＣＴＰの完全なプロセシングをもたらしたことを裏付けた。ＤＭＯタンパク質発現レベル、ジカンバ損傷ならびに、ＡＰＧ６−ＤＭＯ及び最適化ＡＰＧ６−ＤＭＯのアミノ末端プロセシングは、ＤＭＯに機能可能に繋げられた場合にＡＰＧ６及び最適化ＡＰＧ６がどちらもジカンバに対する耐性をもたらし、両ＣＴＰが植物において完全にプロセシングされる、ということを指し示した。データを表１１に示す。
表１１．Ｒ１ワタ温室試験

実施例６：遺伝子導入トウモロコシにおけるＣＴＰ−ＰＰＯ発現
除草剤細菌スクリーニング系を使用して、ＰＰＯ除草剤に対して耐性である新規ＰＰＯを同定した。このスクリーニング系は、ＰＰＯ除草剤に対して感受性でないＰＰＯを同定するために、ＰＰＯ除草剤を含むＬＢ液体培地でのノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の増殖アッセイを用いるものであった。

確立されたＰＰＯ活性を含んでいる細菌発現用ベクターでノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換し、ＬＢ液体培地で培養した。精製された結晶形態にある、３つの異なるＰＰＯ化学サブクラスを表す５つの異なるＰＰＯ除草剤（アシフルオルフェン（１ｍＭ）、フルミオキサジン（０．５ｍＭ）、ラクトフェン（０．５ｍＭ）、ホメサフェン（１ｍＭ）及びＳ−３１００（１００μＭ））のうちの１つを培地に添加した。組換えタンパク質を発現させ、Ｅ．ｃｏｌｉ増殖速度を測定した。ゼロ時間から２４時間まで、選択された時点においてＰＰＯ除草剤の存在下及び非存在下で種々の変異型について増殖曲線（ＯＤ６００）を測定した。形質転換されたノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株の、ＰＰＯ除草剤の存在下でのＬＢ培地での増殖は、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に使用した遺伝子が除草剤非感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｉＰＰＯ）をコードしていることを指し示した。

配列番号４０〜４９として提供される１０個のＰＰＯは全て、ＰＰＯ除草剤の存在下でＬＢ培地中のノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株に対して正常な増殖速度を与えることが分かり、これらのタンパク質が除草剤非感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｉＰＰＯ）であることを指し示していた。ＷＨ＿ＰＰＯ（配列番号６０）を発現しているノックアウトＥ．ｃｏｌｉ株は、５つのＰＰＯ除草剤全てに対して感受性であり、アッセイは各除草剤について感受性ＰＰＯと非感受性ＰＰＯとを区別することができるということが確認された。

植物内でＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）を発現させるために４つの植物形質転換用ベクターを作出した。形質転換用構築物１及び１１は、プロモーターとリーダーとイントロンとの同じ組み合わせ、同じ３’ＵＴＲ配列、同じＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）を有していたが、ＣＴＰ配列が異なっており、ダイズの形質転換に使用した。形質転換用構築物６及び１６は、プロモーターとリーダーとイントロンとの同じ組み合わせ、同じ３’ＵＴＲ配列、同じＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）を有していたが、ＣＴＰ配列が異なっており、トウモロコシの形質転換に使用した。表１２に、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０植物形質転換用構築物の構成を示す。
表１２．ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０を有する構築物の構成

遺伝子導入トウモロコシ植物においてＰＰＯ酵素を発現させ、遺伝子導入植物をＰＰＯ除草剤耐性に関して分析した。配列番号４０〜５９として提供されるＰＰＯ酵素のうちの１つをコードする組換えＤＮＡ分子を含んでいる植物形質転換用ベクターを構築した。ＰＰＯ酵素をコードするＤＮＡ配列は、開始コドンとして一般的に知られているメチオニンのコドンを５’末端に含んでいてもよく、または、コード配列の５’末端に葉緑体輸送ペプチド配列を機能可能に繋げることを容易にするためにこのコドンが除去されてもよい。アミノ末端にメチオニンを含有するＰＰＯ酵素タンパク質配列の例は配列番号４０〜４９として提供される。アミノ末端にメチオニンを含んでいないＰＰＯ酵素タンパク質配列の例は配列番号５０〜５９として提供される。植物形質転換のために、推定上のＰＰＯ酵素をコードするヌクレオチド配列を双子葉発現または単子葉発現に最適化した。形質転換用ベクター内のＰＰＯ酵素のタンパク質配列及びヌクレオチド配列に対応する配列番号を表２に示してある。

トウモロコシ植物内試験のために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び当該技術分野において知られている標準的方法を用いてトウモロコシ（ＬＨ２４４）を形質転換した。２つの構築物構成のうちの１つにおいてＨ＿Ｎ１０（配列番号４３）を発現している単一コピーＲ０植物を異系交配することによって生じた遺伝子導入Ｆ１植物を、除草剤耐性に関して温室内で試験した。植物をＶ３生育段階において４０グラム／ヘクタールのＳ−３１００で処理し、処理から７日後に損傷評価を行った。構築物６の構成（ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１））でＨ＿Ｎ１０（配列番号４３）を発現している遺伝子導入トウモロコシ植物は、１８個のうち１３個の、高耐性植物（１０％以下の損傷）を生む事象をもたらしたが、構築物１６の構成（ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられた１２Ｇ０８８６００ＴＰ（配列番号３８））は、高耐性植物を生む事象を全くもたらさなかった。

２つの構築物構成（構築物６及び１６）のうちの１つにおいてＨ＿Ｎ１０（配列番号４３）を発現している単一コピーＲ０植物を異系交配させることによって生産した遺伝子導入Ｆ１植物を除草剤耐性に関して圃場で試験した。このＦ１集団は分離していた（５０％はヘミ接合体、５０％は欠失）ので、遺伝子導入植物の選抜は損傷評価の前には行わなかった。そのような集団の全体平均損傷評価は、非遺伝子導入型植物と遺伝子導入植物との区別が難しいため、同質の遺伝子導入集団と比較してより高くなると予測される。試験は、２つの場所で１つの構築物あたり３つの処理を２回繰り返し行うものであった。非遺伝子導入型トウモロコシ植物を陰性対照として使用した。除草剤散布処理は以下のとおりであった：処理１は、Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８での０．０３６ポンド活性成分／エーカーのＳ−３１００の散布であり、処理２は、Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８での０．０７２ポンド活性成分／エーカーのＳ−３１００の散布であり、処理３は、Ｖ２及びその後のＶ４及びその後のＶ８での０．１４４ポンド活性成分／エーカーのＳ−３１００の散布であった。Ｖ２生育段階（ＣＩＰＶ２）及びＶ４生育段階（ＣＩＰＶ４）において処理後５〜７日目に作物損傷率評価を行った（誤差Ｖ２及び誤差Ｖ４は、最小有意差（ＬＳＤ）の半分である）。両方の場所での作物損傷評価をまとめ合わせた。非遺伝子導入型植物及び、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられた構築物１６（１２Ｇ０８８６００ＴＰ（配列番号３８）を使用して生じさせた事象を有する植物は全て、３つの処理の各々においてＶ２及びＶ４のどちらの除草剤散布の後でも９４．６〜９９．５％の損傷を示した。構築物６（ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１））を使用して生じさせた事象を有する植物は、Ｖ２除草剤散布後にたった３０〜５０％の損傷しか示さず、Ｖ４除草剤散布後には全く損傷を示さなかった。データを表１３に示す。
表１３．ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）を含有するＦ１トウモロコシの有効性圃場試験

Ｆ１遺伝子導入トウモロコシの温室及び圃場でのデータから、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられた１２Ｇ０８８６００ＴＰ（配列番号３８）が遺伝子導入植物において発現した場合の損傷率と比較して、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）は、遺伝子導入植物において発現した場合に損傷率の低減をもたらす、ということが実証された。図１を参照されたい。

ＡＰＧ６（配列番号１）、ＣＴＰ Ｄ、またはＣＴＰ Ｅに機能可能に繋げられた、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ４０（配列番号５４）かまたはＰＰＯ Ｈ＿Ｎ９０（配列番号５０）かのどちらかを植物内で発現させるために、植物形質転換用ベクターを作出した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ及び、当該技術分野において知られている標準的方法を用いて、トウモロコシ（０１ＤＫＤ２）を形質転換した。結果として生じるＲ０植物から採取した葉の試料をＰＣＲによって分析して、導入遺伝子挿入物のコピー数を決定した。固有の形質転換事象を含有する各Ｒ０植物に、４０ｇ活性成分／ヘクタールまたは８０ｇ活性成分／ヘクタールのＳ−３１００をおおよそのＶ５生育段階において噴霧し、処理から４〜７日後に損傷評価を行った。噴霧した植物の全数のうち、１０％以下の損傷（高耐性）または２０％以下の損傷（耐性）を有する植物の数を記録した。単一コピー事象であると判定されかつ２０％以下の損傷で噴霧を経た植物を自殖及び異系交配へと進めた。データを表１４に示す。
表１４．遺伝子導入トウモロコシにおけるＣＴＰ−ＰＰＯ除草剤耐性評価

結果は、Ｈ＿Ｎ４０（配列番号５４）またはＨ＿Ｎ９０（配列番号５０）に機能可能に繋げられた場合にＣＴＰ ＤまたはＣＴＰ Ｅで形質転換された植物と比較してＡＰＧ６（配列番号１）が一貫してより高い除草剤耐性をもたらしたことを示している。ＡＰＧ６は、Ｈ＿Ｎ４０に機能可能に繋げられた場合、８０ｇ活性成分／ヘクタールでのＳ−３１００に対して高耐性である２１．４〜４０．２％の遺伝子導入植物及び耐性である４１．１〜５８．９％の遺伝子導入植物をもたらした。ＡＰＧ６は、Ｈ＿Ｎ９０に機能可能に繋げられた場合、４０ｇ活性成分／ヘクタールでのＳ−３１００に対して高耐性である４９．１％の遺伝子導入植物及び耐性である５６．３％の遺伝子導入植物をもたらした。ＣＴＰ Ｄは、Ｈ＿Ｎ４０に機能可能に繋げられた場合、８０ｇ活性成分／ヘクタールでのＳ−３１００に対して高耐性である０％の遺伝子導入植物及び耐性である２．２％の遺伝子導入植物をもたらした。ＣＴＰ Ｅは、Ｈ＿Ｎ４０に機能可能に繋げられた場合、より低い除草剤量である４０ｇ活性成分／ヘクタールでのＳ−３１００に対して高耐性である０〜８％の遺伝子導入植物及び耐性である１２．９〜３２．１％の遺伝子導入植物をもたらした。

ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０に機能可能に繋げられたＡＰＧ６を発現している遺伝子導入Ｆ１雑種トウモロコシを、異なる７つの様々なＰＰＯ除草剤：Ｓ−３１００、ホメサフェン、アシフルオルフェン、ラクトフェン、フルミオキサジン、スルフェントラゾン及びサフルフェナシルに対する耐性について評価した。陰性対照としての雑種トウモロコシ種子と共に、５つの固有の事象を表す貯蔵種子を温室内の植木鉢に植付けた。

発芽前の除草剤耐性について試験するために、次の２つの量のうちの一方でＰＰＯ除草剤を個別に散布することを１処理あたり６回繰り返した：Ｓ−３１００（８０または１６０ｇ活性成分／ヘクタール）、ホメサフェン（Ｒｅｆｌｅｘ（登録商標）、８４０または１６８０ｇ活性成分／ヘクタール）、フルミオキサジン（Ｖａｌｏｒ（登録商標）ＳＸ、２１０または４２０ｇ活性成分／ヘクタール）、スルフェントラゾン（Ｓｐａｒｔａｎ（登録商標）４Ｌ、８４０または１６８０ｇ活性成分／ヘクタール）及びサフルフェナシル（Ｓｈａｒｐｅｎ（登録商標）、２００または４００ｇ活性成分／ヘクタール）。処理から２０日後に作物損傷率について植物を評価し、トウモロコシ種子を陰性対照として含めた。ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０に機能可能に繋げられたＡＰＧ６を有する遺伝子導入植物は、発芽前に散布した種々のＰＰＯ除草剤についての損傷評価が０〜５．８％の範囲であり、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０に機能可能に繋げられたＡＰＧ６が５つ全てのＰＰＯ除草剤についてどちらの除草剤量においてもトウモロコシに優れた発芽前耐性をもたらすことを指し示した。陰性対照トウモロコシ植物の損傷評価は、サフルフェナシルを除けば（それはこの除草剤が従来のトウモロコシ植物用に市販されていることから予想される）、１７．５〜９４．２％の範囲であった。標準誤差を＋／−として示してデータを表１５に示す。
表１５．トウモロコシにおけるＰＰＯ除草剤発芽前損傷評価

発芽後（Ｖ３〜Ｖ４）除草剤耐性について試験するために、次の３つの量のうちの１つでＰＰＯ除草剤を個別に散布することを１処理あたり６回繰り返した：Ｓ−３１００（４０、８０または１６０ｇ活性成分／ヘクタール）、ホメサフェン（Ｒｅｆｌｅｘ（登録商標）、４２０、８４０または１６８０ｇ活性成分／ヘクタール）、アシフルオルフェン（Ｕｌｔｒａ Ｂｌａｚｅｒ（登録商標）、４２０、８４０または１６８０ｇ活性成分／ヘクタール）、ラクトフェン（Ｃｏｂｒａ（登録商標）、２２０、４４０または８８０ｇ活性成分／ヘクタール）、フルミオキサジン（Ｖａｌｏｒ（登録商標）ＳＸ、１０５、２１０または４２０ｇ活性成分／ヘクタール）、スルフェントラゾン（Ｓｐａｒｔａｎ（登録商標）４Ｌ、４２０、８４０または１６８０ｇ活性成分／ヘクタール）及びサフルフェナシル（Ｓｈａｒｐｅｎ（登録商標）、１００、２００または４００ｇ活性成分／ヘクタール）。処理から１４日後に作物損傷率について植物を評価し、従来の雑種トウモロコシ種子を陰性対照として含めた。ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０に機能可能に繋げられたＡＰＧ６を有する遺伝子導入植物の、発芽後に散布した種々のＰＰＯ除草剤についての損傷評価は、損傷評価が１３．８％であった１６８０ｇ活性成分／ヘクタールのホメサフェンを除けば、０．５〜５．８％の範囲であり、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０に機能可能に繋げられたＡＰＧ６が７つ全てのＰＰＯ除草剤について全ての除草剤量においてトウモロコシに優れた発芽後耐性をもたらすことを指し示した。陰性対照トウモロコシ植物の損傷評価は３６．７〜１００％の範囲であった。標準誤差を＋／−として示してデータを表１６に示す。
表１６．トウモロコシにおけるＰＰＯ除草剤発芽後損傷評価

実施例７：遺伝子導入ダイズにおけるＣＴＰ−ＰＰＯ発現
種々のＣＴＰに機能可能に繋げられたＰＰＯ酵素を遺伝子導入ダイズ植物において発現させ、遺伝子導入植物をＰＰＯ除草剤耐性について分析した。

ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられた１２Ｇ０８８６００ＴＰ（配列番号３８）か、またはＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）かのどちらかを植物内で発現させるために、植物形質転換用ベクターを作出した。これらの植物形質転換用ベクターとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用し、当該技術分野において知られている標準的方法を用いて、ダイズＡ３５５５を形質転換した。再生されたＲ０遺伝子導入小植物体を温室内で栽培し、自殖させ、Ｒ１種子を採集した。温室内で遺伝子導入Ｒ１植物に対して、Ｖ４及びＲ１において施す３つの除草剤処理：（１）５グラム活性成分／ヘクタールのＳ−３１００、（２）１０グラム活性成分／ヘクタールのＳ−３１００、または（３）３０グラム活性成分／ヘクタールのＳ−３１００のうちの１つによって噴霧を行った。処理から１０日後に作物損傷評価を行った。ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）を発現している遺伝子導入植物の損傷評価は、５、１０及び３０ｇ活性成分／ヘクタールの量でそれぞれ、Ｖ４段階での４．２％、７．８％及び９．４％から、Ｒ１段階での３％、６．５％及び１５．７％までの範囲であった。ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられた１２Ｇ０８８６００ＴＰ（配列番号３８）を発現している遺伝子導入植物の平均損傷評価は、５、１０及び３０ｇ活性成分／ヘクタールの量でそれぞれ８２．７％、９２．７％及び９８．２％であり、Ｒ１段階での評価には生き残らなかった。陰性対照植物の平均損傷評価は、５、１０及び３０ｇ活性成分／ヘクタールの量でそれぞれ同程度の８９％、９８％及び１００％であり、Ｒ１段階での評価には生き残らなかった。データを表１７に示す。
表１７．Ｒ１ダイズのＰＰＯ除草剤試験

ＡＰＧ６（配列番号１）、ＣＴＰ Ｆ、及びＣＴＰ Ｈの３つの異なるＣＴＰのうちの１つに機能可能に繋げられたＰＰＯ Ｈ＿Ｎ９０（配列番号４７）を植物内で発現させるために、植物形質転換用ベクターを作出した。これらの植物形質転換用ベクター及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用し、当該技術分野において知られている標準的方法を用いて、ダイズＡ３５５５を形質転換した。再生されたＲ０遺伝子導入小植物体を温室内で栽培し、結果として生じるＲ０植物から採取した葉の試料をＰＣＲで分析して、事象の単一のコピーを含有する植物を同定した。温室内で、各々が固有の事象に相当している遺伝子導入単一コピーＲ０植物に対して、おおよそのＶ３段階で施す２０ｇ活性成分／ヘクタールのＳ−３１００の除草剤処理によって噴霧を行った。処理から１４日後に損傷評価を高耐性（１０％以下の損傷）または耐性（２０％以下の損傷）とみなされる数値として得た。ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ９０（配列番号４７）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）を発現している遺伝子導入植物は、高耐性である２１．４％の個別の事象と耐性である５７．１％とをもたらした。ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ９０（配列番号４７）に機能可能に繋げられたＣＴＰ Ｆを発現している遺伝子導入植物は、高耐性である１１．７％の個別の事象と耐性である４１．１％とをもたらした。ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ９０（配列番号４７）に機能可能に繋げられたＣＴＰ Ｈを発現している遺伝子導入植物は、高耐性または耐性である固有の事象を全くもたらさなかった。データを表１８に示す。
表１８．Ｒ０ダイズにおけるＳ−３１００有効性評価

このデータは、ＰＰＯ酵素に機能可能に繋げられた特異的なＣＴＰが除草剤耐性の獲得に極めて重要であることを実証し、かくして、ＣＴＰの選択の重要性及び、除草剤耐性遺伝子導入植物の生産における使用のためにＡＰＧ６ ＣＴＰが他のＣＴＰよりも予想外に優れていることが示された。

実施例８：遺伝子導入ワタにおけるＣＴＰ−ＰＰＯ発現
ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）を遺伝子導入ワタ植物において発現させるために、植物形質転換用ベクターを作出し、遺伝子導入植物をＰＰＯ除草剤耐性について分析した。植物形質転換用ベクター及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを当該技術分野において知られている標準的方法と共に用いて、ワタＤＰ３９３を形質転換した。再生されたＲ０遺伝子導入小植物体を温室内で栽培し、結果として生じるＲ０植物から採取した葉の試料をＰＣＲで分析して、事象の単一のコピーを含有する植物を同定した。温室内で、各々が固有の事象に相当している遺伝子導入単一コピーＲ０植物に対して、Ｖ２段階で施す２０ｇ活性成分／ヘクタールのＳ−３１００の除草剤処理によって噴霧を行った。さらに、温室内で遺伝子導入多コピー（２コピー／植物以上）に対して、Ｖ２段階で施す２０ｇ活性成分／ヘクタールのＳ−３１００の除草剤処理によって噴霧を行った。処理から３日後に損傷評価を行った。

陰性対照であるワタＤＰ３９３は、２０ｇ活性成分／ヘクタールのＳ−３１００による除草剤処理から３日後に損傷が１００％であった。これとは対照的に、２１個の単一コピーＲ０植物は平均損傷が２６．７％であった。２１個の単一コピーＲ０植物の損傷の分布は次のとおりであった：３つの植物は損傷なし、３つの植物は１０％の損傷、３つの植物は１５％の損傷、２つの植物は２０％の損傷、７つの植物は３０％の損傷、３つの植物は４０％の損傷。多コピーＲ０植物については、１４個の植物が除草剤処理を受け、平均損傷は１０．４％であった。１４個の多コピー植物の損傷の分布は次のとおりであった：５つの植物は損傷なし、３つの植物は５％の損傷、１つの植物は１０％の損傷、２つの植物は１５％の損傷、１つの植物は２０％の損傷、１つの植物は３０％の損傷、１つの植物は４０％の損傷。このデータは、ＰＰＯ Ｈ＿Ｎ１０（配列番号４３）に機能可能に繋げられたＡＰＧ６（配列番号１）を発現しているＲ０遺伝子導入ワタが、Ｖ２段階で施された２０ｇ活性成分／ヘクタールの除草剤Ｓ−３１００の散布に対して耐性であったことを実証する。

Claims (27)

1. ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするＤＮＡ配列に機能可能に繋げられた葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子であって、前記ＣＴＰが、配列番号１および２からなる群から選択される配列を含む、前記組換えＤＮＡ分子。
2. 前記ＣＴＰをコードする前記ＤＮＡ配列が、配列番号７〜１２からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
3. 前記ＤＭＯまたはＰＰＯが、配列番号１８〜２７及び４０〜５９からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
4. ＤＭＯまたはＰＰＯをコードする前記ＤＮＡ配列が、配列番号２８〜３７及び６１〜１０２からなる群から選択される配列を含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
5. 前記ＣＴＰが、ＤＭＯタンパク質に機能可能に繋げられており、前記ＣＴＰが、配列番号１および２からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
6. 前記ＣＴＰが、ＰＰＯタンパク質に機能可能に繋げられており、前記ＣＴＰが、配列番号１及び２からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
7. 植物細胞内で機能する異種プロモーターに機能可能に繋げられた請求項１に記載のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物。
8. 請求項１に記載のＤＮＡ分子を含んでいる、遺伝子導入植物、植物細胞、植物部分または種子。
9. 前記植物が単子葉植物である、請求項８に記載の遺伝子導入植物、植物細胞、植物部分または種子。
10. 前記植物がトウモロコシ植物またはコムギ植物である、請求項９に記載の遺伝子導入植物、植物細胞、植物部分または種子。
11. 前記植物が双子葉植物である、請求項８に記載の遺伝子導入植物、植物細胞、植物部分または種子。
12. 前記植物がダイズ植物、ワタ植物またはＢｒａｓｓｉｃａ植物である、請求項１１に記載の遺伝子導入植物、植物細胞、植物部分または種子。
13. 除草剤耐性植物を生産する方法であって、
    ａ）植物細胞を請求項７に記載のＤＮＡ構築物で形質転換するステップと、
    ｂ）前記ＤＮＡ構築物を含んでいる形質転換植物細胞から植物を再生するステップと
    を含む、前記方法。
14. 再生された植物が、ジカンバ及びＰＰＯ阻害剤からなる群から選択される除草剤に対して耐性である、請求項１３に記載の方法。
15. 除草剤耐性植物を生産する方法であって、
    ａ）請求項１に記載のＤＮＡ分子を含んでいる親植物をそれ自体または第２植物と交配して１つ以上の子孫植物を生産するステップと、
    ｂ）前記ＤＮＡ分子を含んでいる子孫植物を選抜するステップと
    を含む、前記方法。
16. 前記子孫植物が、ジカンバ及びＰＰＯ阻害剤からなる群から選択される除草剤に対して耐性である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記子孫植物が、Ｓ−３１００、ホメサフェン、アシフルオルフェン、ラクトフェン、フルミオキサジン、スルフェントラゾン及びサフルフェナシルからなる群から選択されるＰＰＯ阻害剤除草剤に対して耐性である、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１に記載のＤＮＡ分子を植物細胞内に導入することを含む、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を発現させる方法。
19. 導入することが、前記植物細胞を形質転換することを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 作物栽培環境における雑草生長を抑制する方法であって、
    ａ）請求項８に記載の植物または種子を作物栽培環境に植付けるステップと、
    ｂ）雑草生育を抑制するのに有効な量のジカンバまたはＰＰＯ阻害剤除草剤を前記作物栽培環境に散布するステップと
    を含む、前記方法。
21. 前記除草剤が前記植物または種子を害さない、請求項２０に記載の方法。
22. 前記植物または種子が単子葉の植物または種子である、請求項２０に記載の方法。
23. 前記植物がトウモロコシ植物またはコムギ植物である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記植物または種子が双子葉の植物または種子である、請求項２０に記載の方法。
25. 前記植物がダイズ植物、ワタ植物またはＢｒａｓｓｉｃａ植物である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記除草剤がジカンバである、請求項２０に記載の方法。
27. 前記除草剤がＰＰＯ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。

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