ES2667859T3 - Modulación de la maduración de frutos de solanáceas - Google Patents

Abstract

Un método para producir una planta transgénica con velocidad aumentada de maduración de los frutos en comparación con frutos de una planta no transformada en el estado verde maduro, que comprende regenerar una planta a partir de una célula hospedadora que expresa un vector que comprende una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de a); c) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de cualquiera de las secuencias de nucleótidos a) a b); y d) una secuencia de nucleótidos que es el complemento de las secuencias de nucleótidos de una cualquiera de a) a c). en el que la planta es de tomate, preferiblemente Solanum Iycopersicum o de pimiento, preferiblemente Capsicum annuum.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCIÓN

Modulación de la maduración de frutos de solanáceas INTRODUCCIÓN

Las solanáceas, también llamadas solanos, comprenden más de 3000 especies, muchas de las cuales evolucionaron en Sudamérica en hábitats drásticamente variables incluyendo selvas tropicales y desiertos.

Las solanáceas son económicamente el tercer taxón de plantas más importante y el más valioso en términos de cultivos de hortalizas. Son las más variables en términos de utilidad agrícola e incluyen varias hortalizas que albergan frutos tales como tomates y pimientos.

Los cultivos de solanáceas se han sometido a selección humana intensiva. Esto ha permitido su uso como modelos para estudiar la interfaz evolutiva entre plantas y personas. Algunas plantas solanáceas son sistemas de modelo importantes para biología; estos incluyen tomate para la maduración de frutos y la defensa de las plantas, tabaco para la defensa de las plantas y petunia para la biología de pigmentos de antocianina.

El tomate es un sistema de modelo importante para estudiar la maduración de los frutos debido a recursos genéticos y genómicos amplios. La recolección de los frutos del tomate cuando se ha establecido la maduración haría que la determinación de la madurez fuera más fácil que basándose en el color visible de la piel y aseguraría un desarrollo de calidad completo. Después de la recolección, continúa la maduración y avanza el ablandamiento, aumentando la susceptibilidad del fruto a daños por manipulación y limitando el periodo de comercialización.

Los mutantes de maduración en tomate tales como sin maduración incoloro e inhibidor de maduración han proporcionado importantes ideas sobre una estructura genética emergente que regula la maduración y modula la firmeza del fruto (Thompson et al., 1999; Vrebalov et al., 2002; Eriksson et al., 2004; Manning et al., 2006). El retardo en la maduración y el ablandamiento puede conseguirse empleando envasado en atmósfera modificada (MAP) que se ha estudiado ampliamente como método simple y barato de prolongar la vida útil de muchos frutos y hortalizas incluyendo el tomate (Batu y Thompson, 1998, Exama et al., 1993, Geeson et al., 1985), sin embargo, aumenta el coste del envasado y la manipulación de los frutos.

Los métodos existentes para modular la maduración de los frutos en programas de mejoramiento de plantas convencionales dependen del cribado de frutos recogidos desde plantas maduras. Cualquier identificación de maduración alterada en este escenario dependerá en gran medida de la casualidad. Actualmente no es económicamente viable o eficaz el mejoramiento para maduración alterada debido al coste y la complejidad del cultivo y fenotipado de grandes cantidades de plantas.

Las especies silvestre de tomate ofrecen una fuente rica y enormemente inexplorada de nueva variación genética para los obtentores. Tanksley y Zamir (Frary et al., 2000; Fridman et al., 2004) han demostrado que esta fuente de diversidad genética puede usarse para comprender la base molecular de rasgos de calidad importantes de los frutos y para proporcionar nuevo material para el mejoramiento.

Los obtentores están interesados en aprender acerca del proceso de desarrollo de la maduración de los frutos para producir nuevas variedades de frutos y hortalizas con fenotipos alterados previos y posteriores a la recolección. La manipulación de la maduración de los frutos ofrece el potencial de ampliar las ventanas de recolección y la vida útil, reduciendo de este modo las pérdidas previas y posteriores a la recolección en la cadena de producción.

En los tomates, la profundidad de la pigmentación de los frutos de tomate es muy importante para el interés y la salud y la nutrición del consumidor. Por lo tanto, existe una necesidad de descubrir genes que permitan una selección más eficaz de fenotipos de maduración temprana o retardada en frutos de tomate. Además, existe una necesidad de selección de genotipos que produzcan frutos con gran contenido de pigmentos en el estado verde maduro. Dichos genes podrían servir como marcador molecular para fenotipos de maduración de los frutos (velocidad hasta madurez, contenido de pigmentos) y ofrecen el potencial de manipular la velocidad hasta la maduración y el contenido de pigmentos en los frutos de tomate.

Los frutos de pimiento (Capsicum annuum L.) se han usado desde tiempos ancestrales como fuente de pigmentos para aumentar o cambiar el color de productos alimenticios, haciéndolos más atractivos y aceptables para el consumidor. El pimiento usado como colorante alimenticio tradicionalmente ha estado en forma de pimentón (polvo molido), aunque hoy en día se usan ampliamente las oleorresinas. Puede encontrarse información adicional respecto a los tipos de pimientos, en particular, los tipos de pimiento dulce, en Huh et al. (2001).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un factor de transcripción, y homólogos del mismo que están implicados en la modulación de la maduración de los frutos en la familia de las solanáceas. En el tomate, el factor de transcripción en cuestión (Le005930) se encontró por análisis de redes neurales artificiales en un conjunto de datos de matriz de tomate. El análisis posterior demostró que este factor de transcripción tenía un perfil específico de maduración en

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

tomate que aumentaba drásticamente entre 40 dpa (días posantesis) y 49 dpa. Le005930 tiene un alto grado de homología con un regulador 2 de respuesta de dos componentes (APRR2) de Arabidopsis thaliana. El gen que codifica Le005930 (a partir de ahora en este documento también conocido como APRR2 de tomate o de tipo APRR2 de tomate) está representado en la SEQ ID NO: 1. Las plantas de tomate que sobreexpresan el gen que se muestra en la SEQ ID NO: 1 han demostrado en este documento presentar propiedades de maduración potenciada de los frutos mientras que las plantas de tomate que tienen niveles regulados por disminución del gen presentan propiedades de maduración más lenta.

Para encontrar el gen homólogo en pimiento (en este documento mencionado como APRR2 de pimiento o de tipo APRR2 de pimiento), se usó la secuencia EST de tomate (SGN-U585565) para someter a BLAST una base de datos de EST de pimiento. Pueden encontrarse detalle adicionales del aislamiento de la secuencia de tipo APRR2 de pimiento en la sección de ejemplos. El análisis ha revelado la importancia del gen de tipo APRR2 de pimiento en el proceso de maduración del pimiento. La secuencia de ADNc de APRR2 de pimiento puede encontrarse en la SEQ ID NO: 2.

La presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de a); c) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de cualquiera de las secuencias de nucleótidos a) a b); y d) una secuencia de nucleótidos que es el complemento a las secuencias de nucleótidos de una cualquiera de a) a c). En una realización, la secuencia de nucleótidos de la etapa b) es al menos un 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos de a).

En una realización, la secuencia de nucleótidos aislada está en la orientación codificante. En otra realización, la secuencia de nucleótidos aislada está en la orientación no codificante.

También se proporciona una célula hospedadora que expresa un vector de la invención.

También se proporciona una planta transgénica o parte de la misma que comprende una célula hospedadora de la invención. En una realización, la planta transgénica o parte de la misma es una monocotiledónea. En otras realización, la planta o parte de la misma es una dicotiledónea, por ejemplo, un tomate, preferiblemente Solanum lycopersicum o un pimiento, preferiblemente Capsicum annuum.

También se proporciona un método para producir una planta transgénica que comprende regenerar una planta a partir de una células hospedadora de acuerdo con la invención.

También se proporciona una planta cultivada o parte de la misma producida por un método de acuerdo con la invención.

También se proporciona un método de manipulación de la velocidad de maduración de los frutos en frutos de una planta solanácea transgénica, preferiblemente una planta de tomate o de pimiento, que comprende transformar dicha planta con un vector de la invención. En una realización, la velocidad de maduración de los frutos está aumentada en comparación con frutos de una planta no transformada. En otra realización, la velocidad de maduración de los frutos está disminuida en comparación con frutos de una planta no transformada. En una realización, la velocidad de maduración de los frutos se mide a 40 hasta 49 dpa. En una realización, la velocidad de maduración de los frutos se mide en el estado verde maduro de la planta transformada. En una realización, la velocidad de maduración de los frutos se mide en el estado de color inmaduro en pimiento.

También se proporciona un método de manipulación del contenido de pigmentos de los frutos en frutos de una planta solanácea transgénica, que comprende transformar dicha planta con un vector de la invención. En una realización, el contenido de pigmentos del fruto está aumentado en una planta transformada en comparación con el fruto de una planta no transformada. En una realización, el contenido de pigmentos del fruto está disminuido en comparación con el fruto de una planta no transformada. En una realización, el contenido de pigmentos del fruto se mide a 40 hasta 49 dpa. En una realización, el pigmento del fruto se mide en el estado verde maduro de la planta transformada. En una realización, el contenido de pigmentos del fruto se mide en el estado de color inmaduro en pimiento.

También se proporciona una planta de tomate o parte de la misma obtenida por cualquier método de la invención.

También se proporciona un método de detección de marcadores genéticos indicativos de la velocidad de maduración o del contenido de pigmentos del fruto de una planta de la familia de las solanáceas, que comprende aislar ADN de dicha planta y de uno o ambos progenitores de dicha planta; cribar los marcadores genéticos en una región de dicho ADN en o cerca de la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, y determinar la herencia conjunta de dichos marcadores de uno o ambos progenitores a dicho individuo.

También se proporciona un marcador genético detectable por un método de la invención.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

También se proporciona el uso de un marcador genético de la invención para la producción de una planta solanácea cultivada, preferiblemente una planta de tomate o pimiento que puede albergar frutos.

También se proporciona una planta solanácea cultivada o parte de la misma producida por un método de la invención.

También se proporciona el uso de una planta solanácea cultivada o parte de la misma de acuerdo con la invención en el mercado de productos frescos o para el procesamiento de alimentos.

También se proporciona el uso de una secuencia de nucleótidos aislada de la invención en la manipulación de la velocidad de maduración o del contenido de pigmentos del fruto de una planta, preferiblemente una planta de tomate o pimiento, donde dicha manipulación se logra por modificación genética de dicha planta.

También se proporciona el uso de un método de acuerdo con la invención, donde dicha modificación genética se introduce por TiLlING.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Valores medios para la expresión de Le 005930 en mutantes de tomate (A) WT, (B) RIN, (C) NOR y (D) CNR. Las barras de error son E.T.M., dpa = días posantesis, ua = unidades arbitrarias.

Figura 2. Datos de qtPCR que muestran la expresión relativa de líneas de tomate que sobreexpresan Le5390 (TP229, TP232 y TP264) en diferentes estados del desarrollo en comparación con el tipo silvestre (WT). IMG = estado verde inmaduro; MG = estado verde maduro; y B = fase de irrupción.

Figura 3. Datos de índice de color de tomate para líneas que sobreexpresan Le5390 en diferentes estados del desarrollo en comparación con el tipo silvestre. Abreviaturas iguales que para la figura 2.

Figura 4. Datos del ensayo de textura de tomate para A) frutos que sobreexpresan Le5930 y B) frutos iARN Le5930 en comparación con el tipo silvestre en el estado verde maduro.

Figura 5. Datos del contenido de clorofila total en el pericarpio exterior e interior para líneas de tomate que sobreexpresan Le5930 en el estado del desarrollo verde maduro en comparación con el tipo silvestre.

Figura 6. Datos de contenido de carotenoides total para líneas de tomate de sobreexpresión de Le5930 TP224, TP229, TP231, TP232 y TP264 en comparación con el tipo silvestre.

Figura 7. Fotografías que representan fruto de tomate que sobreexpresa Le5930 (TP232) y fruto de tipo silvestre en

A) el estado verde inmaduro, B) el estado verde maduro y C) el estado de irrupción. El fruto TP232 y el fruto de tipo silvestre se muestran en la izquierda y derecha de cada foto respectivamente.

Figura 8. A) perfil de expresión del gen de tipo APRR2 en líneas de pimiento progenitoras de frutos rojos y blancos y

B) suma de todos los transcritos de proteína de unión a clorofila.

Figura 9. Análisis de la presencia de A) el gen de tipo APRR2 y B) el gen PSY1 de las líneas de pimiento progenitoras blanca y roja a través de la población de cartografiado de color maduro. La frecuencia de la presencia de alelo se muestra en el eje de ordenadas. El color del fruto se muestra en el eje de abscisas. DG = verde oscuro; LG = verde claro; MG = verde maduro; y W = blanco.

Figura 10. Análisis de qRTPCR de la expresión del gen de tipo APRR2 en la población de pimiento de color maduro en la fase inmadura (inm) y de irrupción. Las barras representan la media de varios puntos de datos. Las secuencia génica completa se representa por APRR2+. La secuencia génica truncada en que el mensaje codifica un codón de parada se representa por APRR2-.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un factor de transcripción que puede expresarse en una planta solanácea transgénica para modular la maduración de un fruto que crece en dicha planta. En tomate, este factor de transcripción se encontró como resultado del análisis de redes neurales artificiales en un conjunto de datos de matriz de tomate. El homólogo de APRR2 de tomate también se encontró en pimiento (véase la sección de ejemplos). En particular, la invención se refiere a un vector que comprende una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 (correspondiente a la secuencia de ADNc de APRR2 de tomate). En otra realización, la secuencia de nucleótidos puede ser al menos un 80% idéntica, preferiblemente al menos un 90% idéntica, más preferiblemente al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 97%, mucho más preferiblemente al menos un 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de a). En otra realización, la secuencia de nucleótidos de la invención puede hibridar en condiciones rigurosas con el complemento de cualquiera de las secuencias de nucleótidos a) a b). En otra realización, la secuencia de nucleótidos de la invención puede ser el complemento de las secuencias de nucleótidos de una cualquiera de a) a c).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Pueden usarse diversas construcciones de vectores de ADN para obtener un fenotipo de maduración de frutos modulada de acuerdo con la presente invención. La construcción de ADN o un vector de expresión que comprende la misma puede comprender además elementos reguladores incluyendo, aunque sin limitación, un promotor, un potenciador y una señal de terminación. Entre los promotores más habitualmente usados están el promotor de la nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al., 1987), el promotor de la octapina sintasa (OCS), promotores de caulimovirus tales como el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Lawton et al., 1987), el promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985) y el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de rubisco, el Adh, el promotor de la sacarosa sintasa, el promotor del complejo génico R y el promotor génico de la proteína de unión a clorofila a/b, etc. Otros promotores usados habitualmente son los promotores para los genes ADPGPP de tubérculo de patata, el promotor de la sacarosa sintasa, el promotor del gen Brittle, el promotor de la sintasa de almidón unido a gránulo, el promotor del gen de la glutelina, el promotor de Waxy de maíz y el promotor de Shrunken 2, el promotor del gen de la quitinasa ácida y promotores del gen de ceína. Muchos promotores se describen en la solicitud de patente WO 00/18963.

La expresión "secuencias no codificantes 3'" se refiere a secuencias de ADN que están ubicadas en dirección 3' de una secuencia codificante y se entiende que también incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras que pueden afectar al procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación habitualmente se caracteriza por afectar a la adición de tramos de poli(ácido adenílico) al extremo 3' del precursor de ARNm.

Los expertos en la materia apreciarán que los componentes de las secuencias de ácido nucleico y los vectores de transformación descritos en este documento están unidos de forma funcional, para provocar la expresión de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico. Las técnicas para unir de forma funcional los componentes de las construcciones y vectores de la presente invención son bien conocidas para los expertos en la materia e incluyen el uso de conectores, tales como conectores sintéticos que incluyen, por ejemplo, uno o más sitios de enzima de restricción. El vector podría ser un vector de alto rendimiento binario Gateway mejorado como se describe en Nakagawa et al. (2007), por ejemplo, el vector pGWB405 que es adecuado para su uso como un vector de sobreexpresión y se describe en el ejemplo 3. En una realización, el gen para la sobreexpresión puede clonarse delante del promotor 35S de CaMV. Otros promotores que se divulgan en este documento también pueden ser adecuados. Para la producción de construcción de iARN, un fragmento de secuencia codificante debe clonarse preferiblemente en un vector adecuado. El vector puede ser, en algunas realizaciones, un vector de iARN de sistema Gateway. En una realización, el vector puede ser pK7GWIWG2.

También se proporciona un vector como se describe en este documento, donde la secuencia de nucleótidos aislada está en orientación codificante o no codificante, preferiblemente en la orientación codificante. También se proporciona una célula hospedadora que expresa el vector como se describe en este documento.

También se proporciona una planta transgénica o parte de la misma que comprende la célula hospedadora como se describe en este documento. El experto en la materia estaría bien familiarizado con métodos para transformar una célula vegetal con secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El término "transformación" o "transformar", como se usa en este documento, describe un proceso por el que un ADN foráneo, tal como una construcción de ADN, entra y cambia una célula destinataria en una célula transformada, modificada genéticamente o transgénica. La transformación puede ser estable, donde la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma de la planta y por tanto representa un rasgo estable y hereditario, o transitoria, donde la secuencia de ácido nucleico se expresa por la célula transformada, pero no se integra en el genoma. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención se transforma de forma estable en una célula vegetal. Los expertos en la materia conocen diversos métodos para introducir genes foráneos tanto en plantas monocotiledóneas como en dicotiledóneas (por ejemplo, Shimamoto K. et al., 1989). La transformación eficaz de pimiento dulce mediada por el factor de transcripción bAbY BOOM se ha descrito recientemente por Heidmann et al., 2011.

Los métodos mejor conocidos de la integración estable de ADN exógeno en ADN genómico vegetal implica dos estrategias principales.

La primera de dichas estrategias es la captación directa de ADN. Existen diversos métodos para la transferencia directa de ADN en células vegetales. En electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un fuerte campo eléctrico, abriendo miniporos para permitir la entrada del ADN. En microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente de forma directa en las células usando micropipetas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe sobre microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente en células o tejidos vegetales. La segunda estrategia es la transferencia génica media por Agrobacterium. El sistema mediado por Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían dependiendo de las especies de las plantas y el sistema de suministro de Agrobacterium. Una estrategia ampliamente usada es el procedimiento de disco foliar, que puede realizarse con cualquier explante de tejido que proporcione una buena fuente para el inicio de diferenciación de la planta completa. Una estrategia complementaria emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente útil en la generación de plantas dicotiledóneas transgénicas.

La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos vegetales individuales o de diversos explantes transformados son bien conocidos para los expertos en la materia. El proceso típicamente incluye las etapas de selección de células transformadas, cultivo de esas células individualizadas a través de fases habituales del desarrollo embrionario a través de la fase de plántula con raíces. Las semillas y embriones transgénicos se regeneran de una manera similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan posteriormente en un medio de cultivo vegetal adecuado tal como tierra.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen exógeno foráneo que codifica una proteína de interés es bien conocido en la técnica. Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas. De lo contrario, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas que han crecido a partir de semillas de líneas agronómicamente importantes, o el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que tiene un fenotipo de maduración de los frutos modulada puede cultivarse usando métodos bien conocidos para los expertos en la materia.

En una realización, la planta transgénica de la invención o parte de la misma puede ser una monocotiledónea. En otra realización, la planta transgénica de la invención puede ser una dicotiledónea. En una realización, una planta transgénica dicotiledónea de la invención es una planta de tomate, preferiblemente S. lycopersicum o una planta de pimiento, preferiblemente C. annuum.

También se proporciona un método para producir una planta transgénica, que comprende regenerar una planta a partir de la célula hospedadora de acuerdo con la invención. Por ejemplo, puede transferirse una secuencia de ácido nucleico cruzando una planta donadora con una planta destinataria, es decir, por introgresión, por transformación, por fusión de protoplastos, por una técnica de haploide duplicado, por rescate de embriones o por cualquier otro sistema de transferencia de ácido nucleico, seguido de selección de plantas de la descendencia que comprenden uno o más de los QTL divulgados en la presente y que muestran firmeza aumentada de los frutos. Para métodos transgénicos de transferencia, una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen implicado en la modulación de la firmeza de los frutos puede aislarse de la planta donadora usando métodos conocidos en la técnica, y la secuencia de ácido nucleico así aislada puede transferirse a la planta destinataria por métodos transgénicos, por ejemplo, mediante un vector, en un gameto o en cualquier otro elemento de transferencia adecuado, tal como una partícula balística recubierta con la secuencia de ácido nucleico.

La transformación de plantas generalmente implica la construcción de un vector de expresión que funcionará en células de plantas. En el asunto divulgado en la presente, dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada de la invención, que es un vector que puede comprender un gen que confiere un fenotipo de maduración de los frutos aumentada que está bajo el control de, o unido de forma funcional a, un elemento regulador tal como un promotor. El vector de expresión puede contener una o más de dichas combinaciones de gen/elemento regulador unidos de forma funcional, con la condición de que al menos uno de los genes contenido en las combinaciones potencie la velocidad de maduración. El vector o vectores pueden estar en forma de un plásmido y pueden usarse en solitario o en combinación con otros plásmidos para proporcionar plantas transgénicas que tengan velocidad de maduración potenciada usando métodos de transformación conocidos en la técnica, tales como el sistema de transformación de Agrobacterium como se describe en este documento. También se proporciona una planta cultivada o parte de la misma producida por un método de acuerdo con la invención.

También se proporciona un método de manipulación de la velocidad de maduración de los frutos en frutos de una planta solanácea transgénica, que comprende transformar dicha planta con un vector de la invención.

En una realización, la velocidad de maduración de los frutos está aumentada en comparación con frutos de una planta no transformada. En una realización, el fruto de una planta transformada, preferiblemente una planta de tomate, alcanza el estado verde maduro significativamente antes que la planta de control no transformada. En una realización, el fruto de una planta transformada, preferiblemente una planta de pimiento, alcanza el estado de color inmaduro significativamente antes que el fruto de una planta no transformada.

En una realización, la velocidad de maduración de los frutos está disminuida en comparación con frutos de una planta no transformada.

En una realización, la velocidad de maduración de los frutos se mide a 40 hasta 49 dpa. En una realización, la velocidad de maduración de los frutos se mide en el estado verde maduro de la planta transformada. En una realización, la velocidad de maduración de los frutos de pimiento se mide en el estado de color inmaduro de la planta transformada.

También se proporciona un método de manipulación del contenido de pigmentos de los frutos en frutos de una planta solanácea transgénica, que comprende transformar dicha planta con el vector de la invención.

En una realización, el contenido de pigmentos del fruto está aumentado en comparación con el fruto de una planta no transformada.

En una realización, el contenido de pigmentos del fruto está disminuido en comparación con el fruto de una planta no transformada.

En una realización, el contenido de pigmentos del fruto se mide a 40 hasta 49 dpa. En una realización, el contenido de pigmentos del fruto se mide en el estado verde maduro de la planta transformada. En una realización, el contenido de pigmentos del fruto se mide en el estado de color inmaduro en pimiento.

También se proporciona una planta solanácea o parte de la misma obtenida por cualquiera de los métodos de la invención.

También se proporciona un método de detección de marcadores genéticos indicativos de la velocidad de maduración o del contenido de pigmentos del fruto de una planta de la familia de las solanáceas, que comprende a) aislar ADN de dicha planta y de uno o ambos progenitores de dicha planta; b) cribar los marcadores genéticos en una región de dicho ADN en o cerca de la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, y c) determinar la herencia conjunta de dichos marcadores de uno o ambos progenitores a dicho individuo.

Los expertos en la materia entenderán que es adecuada una muestra de casi cualquier tejido vegetal para ensayos de ADN genómico. Por ejemplo, las muestras convenientes incluyen tejidos obtenidos de raíces, hojas, tallos y frutos y partes de los mismos. Los ensayos de ADNc o ARNm implican obtener una muestra tisular de un órgano en que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

se expresa el ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la muestra de ADN genómico se obtiene de hojas o raíces y, en algunos casos, se procesa adicionalmente antes de la etapa de detección, por ejemplo, el ADN en la muestra celular o tisular puede separarse de otros componentes de la muestra, o puede amplificarse, etc.

En general, si la alteración está ubicada en un gen, puede estar en una región no codificante o codificante del gen. Si está ubicada en una región codificante, la alteración puede provocar una alteración de aminoácido. Dicho cambio puede tener o no un efecto sobre la función o actividad del polipéptido codificado. Si el cambio está ubicado en una región no codificante puede causar corte y empalme alternativo, que también puede tener o no un efecto sobre la actividad o función de la proteína codificada.

Debe entenderse que la identificación de marcadores asociados con el fenotipo de maduración de los frutos modulada detectando uno o más productos génicos variantes también está incluida dentro del alcance de la presente invención. Un "producto génico variante", como se usa en este documento, se refiere a un producto génico que está codificado por un gen alterado que codifica APRR2 de tomate incluyendo, aunque sin limitación, un producto génico de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO: 1 o codificado por un gen alterado que codifica APRR2 de pimiento incluyendo, aunque sin limitación, un producto génico de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO: 2; un producto génico esencialmente de longitud completa del mismo, un fragmento biológicamente activo del producto génico y un producto génico biológicamente inactivo. Debe entenderse que los fragmentos biológicamente activos incluyen cualquier parte del polipéptido de longitud completa que inicia la transcripción comparable al tipo silvestre. Un producto génico variante también pretende indicar productos génicos que tienen niveles de expresión o patrones de expresión alterados que están causados, por ejemplo, por el alelo variante de una o más secuencias reguladoras. Como se usa en este documento, la expresión "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula hospedadora y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). En algunas realizaciones, la alteración se identifica en una región no codificante tal como un intrón, un sitio de poliadenilación y/o una secuencia líder. En algunas otras realizaciones, la alteración se identifica en una secuencia reguladora. La detección de alteraciones en el ADN examinado normalmente requiere la amplificación del ADN recogido de la planta candidata. Los métodos para la amplificación de ADN son bien conocidos para los expertos en la materia. El método más habitualmente usado para la amplificación de ADN es PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Métodos adicionales de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por transcripción y replicación de secuencia autosostenida, y amplificación de secuencia basada en ácido nucleico (NASBA). Los dos últimos métodos de amplificación implican reacciones isotérmicas basadas en transcripción isotérmica, que producen tanto ARN monocatenario (ARNmc) como ADN bicatenario (ADNbc) como productos de amplificación en una relación de aproximadamente 30 o 100 a 15, respectivamente.

De acuerdo con ciertas realizaciones, la identificación de la al menos una alteración se realiza por una técnica seleccionada del grupo que consiste en: secuenciación de terminador, digestión de restricción, reacción de la polimerasa específica de alelo, análisis de polimorfismos conformacionales monocatenarios, análisis de pequeñas partes genéticas, electroforesis en gel con gradiente de temperatura, reacción en cadena de la ligasa y análisis de pequeñas partes genéticas con ligasa/polimerasa.

En ciertas realizaciones, la alteración en la secuencia génica codificada por la secuencia de ADNc de APRR2 de tomate expuesta en la SEQ ID NO: 1 se identifica empleando nucleótidos con una característica detectable seleccionada del grupo que consiste en masa inherente, marca de masa, carga eléctrica, molécula de hapteno, espín eléctrico, molécula bioluminiscente de tipo isotipo radiactivo, molécula quimioluminiscente, molécula de ácido nucleico marcada, molécula proteínica, molécula de dispersión de luz/desplazamiento de fase y molécula fluorescente.

También se proporciona un marcador genético detectable por el método de la invención.

También se proporciona el uso de un marcador genético de la invención para la selección de una planta solanácea cultivada, preferiblemente una planta de tomate o pimiento que puede albergar frutos.

También se proporciona una planta de tomate o pimiento cultivada o parte de la misma seleccionada por un método de la invención.

También se proporciona el uso de una planta de tomate o pimiento cultivada o parte de la misma de acuerdo con la invención en el mercado de productos frescos o para el procesamiento de alimentos.

También se proporciona el uso de la secuencia de nucleótidos aislada de la invención en la manipulación de la velocidad de maduración o del contenido de pigmentos del fruto de una planta, preferiblemente una planta de tomate o pimiento, donde dicha manipulación se logra por modificación genética de dicha planta.

También se proporciona el uso de acuerdo con la invención, donde dicha modificación genética se introduce por un método seleccionado de la lista que consiste en TILLING.

DEFINICIONES

A las expresiones y términos técnicos usados dentro del alcance de esta solicitud generalmente se les da el significado habitualmente aplicado a los mismos en la técnica relevante de mejoramiento y cultivo de plantas si no se indica lo contrario en este documento a continuación.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen sus plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia "una planta" incluye una o más plantas y la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, tejidos y similares.

Como se usa en este documento, se entiende que el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor o a una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración o porcentaje, abarca variaciones de, en algunas realizaciones ±20%, en algunas realizaciones ±10%, en algunas realizaciones ±5%, en algunas realizaciones ±1%, en algunas realizaciones ±0,5% y en algunas realizaciones ±0,1% de la cantidad especificada, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar el método divulgado.

Se entiende dentro del alcance de la invención que un "alelo" se refiere a formas alternativas o variantes de diversas unidades genéticas idénticas o ligadas a diferentes formas de un gen o de cualquier tipo de elemento genético identificable, que son alternativas en herencia porque están situadas en el mismo locus en cromosomas homólogos. Dichas formas alternativas o variantes pueden ser el resultado de polimorfismos mononucleotídicos, inserciones, inversiones, traslocaciones o eliminaciones, o la consecuencia de la regulación génica causada por, por ejemplo, modificación química o estructural, regulación de la transcripción o modificación/regulación postraduccional. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen o elemento genético dado típicamente ocupan los locus correspondientes en un par de cromosomas homólogos.

Un alelo ligado a un rasgo cuantitativo puede comprender formas alternativas o variantes de diversas unidades genéticas incluyendo las que son idénticas o están ligadas a un único gen o múltiples genes o sus productos o incluso un gen que se altera o está controlado por un factor genético que contribuye al fenotipo presentado por dicho QTL.

Como se usa en este documento, el término "reproducción", y variantes gramaticales del mismo, se refieren a cualquier proceso que genere un individuo de la descendencia. La reproducción puede ser sexual o asexual, o cualquier combinación de las mismas. Los tipos no limitantes ejemplares de reproducción incluyen cruces, autopolinización, generación de derivados haploides duplicados y combinaciones de los mismos.

Como se usa en este documento, el término "construcción" se refiere a una molécula de ácido nucleico ensamblada artificialmente o aislada que incluye el gen de interés. Una construcción puede incluir el gen o genes de interés, un gen marcador (que en algunos casos también puede ser el gen de interés) y secuencias reguladoras adecuadas. La inclusión de secuencias reguladoras en una construcción a veces es opcional, por ejemplo, dichas secuencias pueden no ser necesarias en situaciones donde tienen que usarse las secuencias reguladoras de una célula hospedadora. El término construcción incluye vectores pero no debe interpretarse como limitado a ello.

Se entiende dentro del alcance de la invención que una "planta de tomate cultivada" o "planta de pimiento cultivada" se refiere a una planta que ya no está en el estado natural, sino que se ha desarrollado mediante cuidados humanos y para uso y/o consumo de seres humanos. Se entiende además que "plantas cultivadas" excluye aquellas especies de tipo silvestre que comprenden el rasgo que es objeto de esta invención como un rasgo natural y/o parte de su genética natural.

Como se usa en este documento, el término "gen" se refiere a una unidad hereditaria que incluye una secuencia de ADN que ocupa una localización específica en un cromosoma y que contiene la instrucción genética para una característica o rasgo particular en un organismo.

"Manipulación genética", "transformación" y "modificación genética" se usan todas en este documento como sinónimos para la transferencia de genes aislados y clonados en el ADN, normalmente el ADN cromosómico o genoma, de otro organismo.

Como se usa en este documento, las expresiones "marcador genético", "marcador de ADN" o "marcador molecular" son intercambiables y se refieren a una característica del genoma de un individuo (por ejemplo, un nucleótido o una secuencia polinucleotídica que está presente en el genoma de un individuo) que está ligada a uno o más locus de interés. En algunas realizaciones, un marcador genético es polimórfico en una población de interés, o el locus ocupado por el polimorfismo, dependiendo del contexto. Los marcadores genéticos incluyen, por ejemplo, polimorfismos mononucleotídicos (SNP), indels (es decir, inserciones/eliminaciones), repeticiones de secuencia simple (SSR), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ADN polimórficos amplificados aleatoriamente (RAPD), marcadores de secuencia polimórfica amplificada y escindida (CAPS), marcadores de tecnología de matrices de diversidad (DArT) y polimorfismos de longitud de fragmento amplificado (AFLP) entre muchos otros ejemplos. Los marcadores genéticos pueden usarse, por ejemplo, para localizar locus genéticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuye a variabilidad de rasgos fenotípicos. La expresión "marcador genético" también puede referirse a una secuencia polinucleotídica complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de un ácido nucleico usado como sonda. Un marcador genético o molecular puede estar físicamente ubicado en una posición en un cromosoma que está distal o proximal a los locus genéticos con los que está ligado (es decir, es intragénico o extragénico, respectivamente). Indicado de otra manera, mientras que los marcadores genéticos típicamente se emplean cuando la ubicación en un cromosoma del gen o de una mutación

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

funcional, por ejemplo, dentro de un elemento de control fuera de un gen, que corresponde al locus de interés no se ha identificado y hay una tasa muy baja de recombinación entre el marcador genético y el locus de interés, el asunto divulgado en la presente también puede emplear marcadores genéticos que están físicamente dentro de los límites de un locus genético (por ejemplo, dentro de una secuencia genómica que corresponde a un gen tal como, aunque sin limitación, un polimorfismo dentro de un intrón o un exón de un gen). En algunas realizaciones del asunto divulgado en la presente, el uno o más marcadores genéticos comprenden entre uno y diez marcadores, y en algunas realizaciones el uno o más marcadores genéticos comprenden más de diez marcadores genéticos.

Como se usa en este documento, el término "genotipo" se refiere a la constitución genética de una célula u organismo. El "genotipo para un conjunto de marcadores genéticos" de un individuo incluye los alelos específicos para uno o más locus marcadores genéticos, presentes en el haplotipo de un individuo. Como se sabe en la técnica, un genotipo puede estar relacionado con un único locus o con múltiples locus, pudiendo estar los locus relacionados o no relacionados y/o ligados o no ligados. En algunas realizaciones, el genotipo de un individuo se refiere a uno o más genes que están relacionados, en que el uno o más genes están implicados en la expresión de un fenotipo de interés (por ejemplo, un rasgo cuantitativo como se define en este documento). Por tanto, en algunas realizaciones, un genotipo comprende un sumario de uno o más alelos presentes dentro de un individuo en uno o más locus genéticos de un rasgo cuantitativo. En algunas realizaciones, un genotipo se expresa en función de un haplotipo (definido en este documento a continuación).

Se entiende dentro del alcance de la invención que "heterocigótico" se refiere a alelos diferentes en uno o más locus correspondientes en cromosomas homólogos.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "homocigótico" se refiere a alelos similares en uno o más locus correspondientes en cromosomas homólogos.

Como se usa en este documento, el término "híbrido" en el contexto de reproducción de plantas se refiere a una planta que es la descendencia de progenitores genéticamente diferentes producidos por el cruce de plantas de diferentes líneas o variedades o especies, incluyendo, aunque sin limitación, el cruce entre dos líneas endogámicas.

El término "hibridar", como se usa en este documento, se refiere a condiciones convencionales de hibridación, preferiblemente a condiciones de hibridación en que se usa SSPE 5x, SDS al 1%, solución de Denhardt 1x como una solución y/o las temperaturas de hibridación están entre 35°C y 70°C, preferiblemente 65°C. Después de la hibridación, el lavado se realiza preferiblemente en primer lugar con SSC 2x, SDS al 1% y posteriormente con SSC 0,2x a temperaturas entre 35°C y 75°C, particularmente entre 45°C y 65°C, pero especialmente a 59°C (respecto a la definición de SSPE, SSC y solución de Denhardt, véase Sambrook et al. (2001)). Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001), son particularmente preferidas. Las condiciones rigurosas de hibridación particularmente preferidas están presentes, por ejemplo, si la hibridación y el lavado se produce a 65°C como se indica anteriormente. Las condiciones de hibridación no rigurosas, por ejemplo, con hibridación y lavado realizados a 45°C son menos preferidas y a 35°C incluso menos.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "aumento en la firmeza de los frutos" y "firmeza de los frutos aumentada" significan frutos de tomate o pimiento que tienen un valor de carga máxima aumentado, estadísticamente significativo a P < 0,05 o P < 0,01 en comparación con frutos de una planta no transformada de control. La carga máxima se define como el valor que representa la carga mayor (en Newton (N)) requerida para causar el fallo de la integridad tisular.

Como se usa en este documento, la expresiones "introgresión", "sometido a introgresión" y "someter a introgresión" se refieren al proceso por el que los genes, un QTL o haplotipo de una especie, variedad o variedad de cultivo se mueven al genoma de otra especie, variedad o variedad de cultivo, por cruce de esas especies. El cruce puede ser natural o artificial. El proceso puede completarse opcionalmente por retrocruzamiento con el progenitor recurrente, en cuyo caso la introgresión se refiere a la infiltración de los genes de una especie en la combinación de genes de otra a través de retrocruzamiento repetido de un híbrido interespecífico con uno de sus progenitores. Una introgresión también puede describirse como un material genético heterólogo integrado de forma estable en el genoma de una planta destinataria.

El término "aislado", como se usa en este documento, significa a) separado de al menos algunos de los componentes con que está habitualmente asociado en la naturaleza; b) preparado o purificado por un proceso que implica intervención humana; y/o c) no encontrado en la naturaleza. En particular, "aislado" se usa en este documento para describir un polinucleótido de la invención que se ha separado hasta algún grado de otros compuestos incluyendo, aunque sin limitación, otros ácidos nucleicos, carbohidratos y proteínas (tales como las enzimas usadas en la síntesis del polinucleótido) o la separación de polinucleótidos covalentemente "cerrados" de polinucleótidos lineales. Un polinucleótido está sustancialmente aislado cuando al menos aproximadamente un 50%, más preferiblemente entre un 60 y un 75% de una muestra presenta una única secuencia polinucleotídica y conformación (una conformación lineal frente a una covalentemente cerrada). El grado de aislamiento u homogeneidad polinucleotídica puede indicarse por varios medios bien conocidos para los expertos en la materia, tales como electroforesis en agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra, seguida de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

visualización de una única banda polinucleotídica en un gel teñido. Además puede proporcionarse mayor resolución usando HPLC u otros medios bien conocidos para los expertos en la materia.

Como se usa en este documento, el término "ligamiento" y variantes gramaticales del mismo, se refiere a la tendencia de alelos en diferentes locus en el mismo cromosoma de segregar juntos más a menudo que lo que se esperaría por probabilidad si su transmisión fuera independiente, en algunas realizaciones como una consecuencia de su proximidad física. El ligamiento se mide por el porcentaje de recombinación entre locus (centimorgan, cM).

Se entiende dentro del alcance de la invención que "locus" se refiere a una región en un cromosoma, que comprende un gen o cualquier otro elemento genético o factor que contribuye a un rasgo.

Como se usa en este documento, la expresión "alelo marcador" se refiere a una forma alternativa o variante de una unidad genética como se define en este documento anteriormente, cuando se usa como un marcador para ubicar locus genéticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuyen a la variabilidad de los rasgos genotípicos.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "selección basada en marcador" se refiere a, por ejemplo, el uso de marcadores genéticos para detectar uno o más ácidos nucleicos de la planta, donde el ácido nucleico está ligado a un rasgo deseado para identificar plantas que portan genes, QTL o haplotipos para rasgos deseables (o indeseables), de modo que esas plantas puedan usarse (o evitarse) en un programa de mejoramiento selectivo.

"Selección asistida por marcador" se refiere al proceso de selección de un rasgo deseado o rasgos deseados en una planta cultivada o plantas cultivadas detectando uno o más ácidos nucleicos de la planta cultivada, donde el ácido nucleico está ligado al rasgo deseado.

Como se usa en este documento, "locus marcador" se refiere a una región en un cromosoma, que comprende un nucleótido o una secuencia polinucleotídica que está presente en el genoma de un individuo y que está ligada a uno o más locus de interés, que puede comprender un gen o cualquier otro elemento genético o factor que contribuye a un rasgo. "Locus marcador" también se refiere a una región en un cromosoma, que comprende una secuencia polinucleotídica complementaria a una secuencia genómica, tal como una secuencia de un ácido nucleico usado como sonda.

"Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido" o equivalentes gramaticales de los mismos usados en este documento significan al menos dos nucleótidos unidos covalentemente juntos. Los oligonucleótidos típicamente son de aproximadamente 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 40, 50 o hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos y polinucleótidos son polímeros de cualquier longitud, incluyendo longitudes más largas, por ejemplo, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10 000, etc. Un ácido nucleico de la presente invención generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos se incluyen análogos de ácido nucleico que pueden tener estructuras alternativas que comprenden, por ejemplo, enlaces fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato u O-metilfosforoamidita (véase, Eckstein, 1991) y estructuras y enlaces de ácido peptidonucleico. Pueden usarse mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos. Los análogos particularmente preferidos para los oligonucleótidos son ácidos peptidonucleicos (PNA).

Se entiende dentro del alcance de la invención que "PCR (reacción en cadena de la polimerasa)" se refiere a un método de producción de cantidades relativamente grandes de regiones específicas de ADN o uno o más subconjuntos del genoma, haciendo posible de ese modo diversos análisis que se basan en esas regiones.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "cebador de PCR" se refiere a fragmentos relativamente cortos de ADN monocatenario usados en la amplificación por PCR de regiones específicas de ADN.

Como se usa en este documento, la expresión "fenotipo" o "rasgo fenotípico" se refiere al aspecto u otra característica detectable de un individuo, producido por la interacción de su genoma, proteoma y/o metaboloma con el entorno.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier fase de desarrollo, en particular, una planta seminal.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una única célula aislada o de una célula cultivada, o formar parte de una unidad con una organización superior tal como, por ejemplo, un tejido vegetal, un órgano vegetal o una planta entera.

El "cultivo de células vegetales" significa cultivos de unidades vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diferentes fases de desarrollo.

Como se usa en este documento, la expresión "parte de una planta" se refiere a una parte de una planta, incluyendo células individuales y tejidos celulares tales como células vegetales que están intactas en plantas, grupos celulares y cultivos tisulares a partir de los cuales pueden regenerarse las plantas. Los ejemplos de partes de plantas incluyen,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

aunque sin limitación, células individuales y tejidos de polen, óvulos, hojas, embriones, raíces, puntas radiculares, anteras, flores, frutos, tallos, brotes y semillas; así como retoños, rizomas, protoplastos, callos y similares.

"Tejido vegetal", como se usa en este documento, se refiere a un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional. Se incluye cualquier tejido de una planta en la planta o en cultivo. Esta expresión incluye, aunque sin limitación, plantas enteras, órganos vegetales, semillas de plantas, cultivo tisular y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de esta expresión junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal, como los enumerados anteriormente o que esté contemplado de otra manera por esta definición, no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido vegetal.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "polimorfismo" se refiere a la presencia en una población de dos o más formas diferentes de un gen, marcador genético o rasgo hereditario o un producto génico obtenible, por ejemplo, a través de corte y empalme alternativo, metilación del ADN, etc.

Como se usa en este documento, el término "población" significa un conjunto genéticamente heterogéneo de plantas que comparten una derivación genética común.

La expresión "sonda" o "sonda de hibridación", como se usa en este documento define un segmento de ácido nucleico (o segmento de análogo nucleotídico, por ejemplo, polinucleótido como se define en este documento) que puede usarse para identificar una secuencia polinucleotídica específica presente en muestras. El segmento de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia polinucleotídica específica a identificar por hibridación. "Sondas" o "sondas de hibridación", como se usa en este documento, son ácidos nucleicos que pueden unirse de una manera específica de bases a una hebra de ácido nucleico complementaria. Dichas sondas incluyen ácidos peptidonucleicos, como se describe en Nielsen et al. (1991). Las hibridaciones habitualmente se realizan en "condiciones rigurosas", como se define en este documento.

Como se usa en este documento, el término "descendencia" se refiere al descendiente o descendientes de un cruce particular. Típicamente, la descendencia resulta de la reproducción de dos individuos, aunque algunas especies (particularmente algunas plantas y animales hermafroditas) pueden autopolinizarse (es decir, la misma planta actúa como donadora de gametos tanto masculinos como femeninos). El descendiente o los descendientes pueden ser, por ejemplo, de la generación F1, la generación F2 o cualquier generación posterior.

La expresión "planta de tomate destinataria" o "planta de pimiento destinataria" se usa en este documento para indicar una planta que tiene que recibir ADN obtenido de una planta donadora que comprende un QTL para la modulación de la maduración de los frutos. Dicha "planta destinataria" puede comprender ya o no uno o más QTL para la modulación de la maduración de los frutos, en cuyo caso la expresión indica una planta que tiene que recibir un QTL adicional.

La expresión "fondo genético natural" se usa en este documento para indicar el fondo genético original de un QTL. Dicho fondo puede ser, por ejemplo, el genoma de una incorporación de tomate silvestre.

En esta solicitud, se entiende que un "evento de recombinación" significa un cruce meiótico.

"Homología de secuencia" o "identidad de secuencia" se usa en este documento indistintamente. Las expresiones "idéntico" o "porcentaje de identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o proteína, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácido o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual, si dos secuencias que tienen que compararse entre sí difieren en la longitud, la identidad de secuencia se refiere preferiblemente al porcentaje de los restos nucleotídicos de la secuencia más corta que son idénticos a los restos nucleotídicos de la secuencia más larga. La identidad de secuencia puede determinarse de forma convencional con el uso de programas informáticos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wl 53711). Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) para encontrar el segmento que tiene la máxima identidad de secuencia entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit u otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia en particular tiene, por ejemplo, un 95% de identidad con una secuencia de referencia de la presente invención, los parámetros se ajustan preferiblemente de manera que el porcentaje de identidad se calcule para la longitud total de la secuencia de referencia y que se permitan brechas de homología de hasta un 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Cuando se usa Bestfit, los denominados parámetros opcionales se dejan en sus valores preestablecidos ("por defecto"). Las desviaciones que aparecen en la comparación entre una secuencia dada y las secuencias descritas anteriormente de la invención pueden estar causadas, por ejemplo, por adición, eliminación, sustitución, inserción o recombinación. Dicha comparación de secuencias también puede realizarse preferiblemente con el programa fasta20u66" (versión 2.0u65, septiembre de 1998 por William R. Pearson y la University of Virginia; véase también W. R. Pearson (1990), ejemplos adjuntos y
http://workbench.sdsc.edu/). Para este fin, se usan los ajustes de parámetros "por defecto".

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones rigurosas. La expresión "que hibrida específicamente con" se refiere a la unión,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

formación de dúplex o hibridación de una molécula únicamente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, celular total). La expresión "que se une o unen sustancialmente a" se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico que actúa como sonda y un ácido nucleico diana, y abarca las faltas de coincidencia de poca importancia que pueden ajustarse reduciendo la rigurosidad del medio de hibridación para alcanzar la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico diana.

Un "polimorfismo mononucleotídico" (SNP) es una variación de secuencia de ADN que se produce cuando un único nucleótido A, C, G, T en el genoma (u otras secuencias compartidas como ADN mitocondrial) difiere entre un conjunto de cromosomas (por pares) de un individuo o difiere entre miembros de una especie.

La expresión "condiciones de invernadero convencionales" y "condiciones convencionales" se refieren a las condiciones de luz, humedad, temperatura, etc. en las que se cultivan o incuban las plantas, por ejemplo, con fines de caracterización fenotípica de la maduración de los frutos, que es convencional. Más en general, las expresiones se refieren a condiciones de crecimiento convencionales y de referencia con un fotoperiodo de 16 h (flujo de fotones fotosintéticos (PPF) 50 a 1000 pmol nv2 s1), preferiblemente un régimen de 8 horas de oscuridad, una temperatura del aire de aproximadamente 20°C durante el día y 18°C en la noche, un déficit de presión de vapor de agua de aproximadamente 4,4 g m3 correspondiente a una humedad relativa (RH) de aproximadamente un 60%-85%, a concentración de oxígeno atmosférica y a presión de aire atmosférica (generalmente 1008 hPa). El agua y los nutrientes pueden proporcionarse por goteo cerca del tallo, o en forma de pulverización o bruma.

Las "condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las hibridaciones de Southern y Northern, dependen de la secuencia y son diferentes para parámetros ambientales distintos. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Se encuentran directrices amplias sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte 1 capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York. En general, se seleccionan condiciones de lavado y de hibridación altamente rigurosas para que sean aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. Normalmente, en "condiciones rigurosas" hibridará una sonda con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

La Tm es la temperatura (a un pH y una fuerza iónica definidos) en la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, realizándose la hibridación durante una noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy rigurosas es NaCl 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con SSC 0,2x a 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook, infra, para una descripción del tampón SSC). A menudo, un lavado de rigurosidad alta va precedido por un lavado de rigurosidad baja para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es SSC 1x a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es SSC 4-6x a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas típicamente implican concentraciones salinas de menos de aproximadamente 1,0 M de concentración de iones Na, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a pH 7,0 hasta 8,3 y la temperatura típicamente es de al menos aproximadamente 30°C. Las condiciones rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2 veces (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético.

Como se usa en este documento, el término "tomate" preferiblemente significa Solanum lycopersicum pero también puede significar cualquier planta, línea o población antiguamente conocida en el nombre de género de Lycopersicon incluyendo, aunque sin limitación L. cerasiforrne, L. cheesmanii, L. chilense, L. chmielewskii, L. esculentum (ahora S. pennellii), L. hirsutum, L. parviborum, L. pennellii, L. peruvianum, L. pimpinellifolium o S. lycopersicoides. El nombre científico recién propuesto para L. esculentum es S. pennellii. Asimismo, los nombres de las especies silvestres pueden alterarse. L. pennellii se ha convertido en S. pennellii, L. hirsutum puede convertirse en S. habrochaites, L. peruvianum puede dividirse en S. N peruvianum' y S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum, y S. corneliomuelleri, L. parviflorum puede convertirse en S.neorickii, L. chmielewskii puede convertirse en S. chmielewskii, L. chilense puede convertirse en S. chilense, L. cheesmaniae puede convertirse en S. cheesmaniae o S. galapagense, y L. pimpinellifolium puede convertirse en S. pimpinellifolium (Knapp (2005)).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se entiende dentro del alcance de la invención que "rasgo" se refiere a una característica o fenotipo, por ejemplo, modulación de la maduración de los frutos. Un rasgo puede heredarse de una manera dominante o recesiva, o puede ser monogénico o poligénico.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "dominante" se refiere a un alelo que determina el fenotipo cuando está presente en estado heterocigótico u homocigótico.

Un alelo "recesivo" se presenta únicamente cuando está presente en estado homocigótico.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "isogénico" se refiere a plantas cultivadas que son genéticamente idénticas, excepto que pueden diferir por la presencia o ausencia de una secuencia de ADN heteróloga.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "fase de recolección" significa la fecha de recolección, es decir, la fecha en que se retira el fruto de la planta.

"Estado de color inmaduro" con respecto al pimiento se define como el color inicial desarrollado cuando el fruto ha alcanzado el tamaño completo. En pimiento, el color inmaduro se define como el color antes del estado de irrupción.

"Color maduro" en pimiento es el color que finalmente desarrolla el fruto. El pimiento pasa a través de colores intermedios que son iguales al estado de irrupción en tomate (véase a continuación).

"Estado de irrupción" en pimiento es cuando el color empieza a cambiar desde el color inmaduro.

"Estado de maduración" en pimiento es cuando el pimiento alcanza su color final.

"Estado verde inmaduro" con respecto a tomates se define cuando los frutos están inmaduros y aún están creciendo en tamaño. Se entiende que este estado es el primer estado en el proceso de maduración.

"Estado verde maduro" con respecto a tomates se define cuando el fruto está desarrollado completamente expandido, pero inmaduro y sigue el "estado verde inmaduro" en el proceso de maduración. Los tomates verdes maduros tienen una "estrella" blanca a amarilla en el extremo de la flor. Los tomates tradicionales recogidos en el estado verde maduro son los más adecuados para el mercado de productos frescos comerciales porque toleran la manipulación tosca mejor que los estados de maduración y mantienen su forma el máximo tiempo en almacenamiento, transporte y en el estante del supermercado; sin embargo, de alguna manera carecen de aroma y sabor completo.

"Estado de irrupción" con respecto a los tomates se define como el primer signo de color rojo en el fruto, típicamente se produce en 24 horas desde el estado verde maduro. Los tomates que se recolectan en el "estado de irrupción" habitualmente tienen mejor aroma y sabor pero tienen firmeza reducida y son ligeramente menos adecuados para la manipulación, envase y transporte que los tomates en el estado verde maduro.

"Estado de maduración rojo" con respecto a los tomates se define cuando los frutos están completamente rojos, sin signos de color verde. Estos frutos han alcanzado su óptimo en sabor y aroma, pero no pueden transportarse a causa de su ausencia de firmeza y no toleran mucha manipulación.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "elemento genético" y "elemento genético o parte del mismo" significan un gen o parte del mismo que puede contribuir a la firmeza de los frutos de la planta influyendo en la expresión del rasgo de firmeza al nivel del propio ADN, al nivel de la traducción, transcripción y/o activación de un producto polipeptídico final, es decir, para regular el metabolismo en la pulpa del tomate que da lugar a la expresión fenotípica del genotipo.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "pericarpio interior" y "pericarpio exterior" significan el tejido del fruto donde el pericarpio exterior es la capa (aproximadamente 2 mm) inmediatamente por debajo de la epidermis exterior y por encima de la capa de tejido vascular. El pericarpio interior es de 3 mm hasta 10 mm por debajo de la capa vascular y antes de la epidermis interior.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "brecha de recolección" significa el periodo de tiempo desde la fase de recolección hasta cuando el fruto está demasiado maduro para recolectarse con fines de escala comercial. Típicamente, la brecha de recolección empieza en el estado verde maduro y continua hasta el estado de irrupción más dos a cinco días, dependiendo de la variedad de cultivo y las condiciones ambientales.

Se entienden dentro del alcance de la invención que "ligado a" y "caracterizado por" o "asociado con" al menos uno de los marcadores de ADN de la presente invención significan una secuencia de ADN que está genéticamente ligada al gen de interés responsable de la modulación del rasgo de maduración de los frutos y donde una secuencia marcadora específica está ligada a un alelo particular de ese gen. Cuando se dice que dos marcadores/secuencias están ligadas genéticamente, la frecuencia de recombinación entre los dos marcadores/secuencias es baja y puede esperarse que estos dos marcadores/secuencias se hereden conjuntamente. Para la población de plantas descrita en este documento, los marcadores denominados como ligados a los QTL están a una distancia de 1 cM o menos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

de separación. Los marcadores que están separados por una distancia de 1 cM entre sí tienen una probabilidad de un 1% de separarse entre sí debido a un evento de recombinación en una única generación.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "aumento" o "disminución" en la maduración de los frutos significa un fruto que tiene un índice de color aumentado/disminuido (por ejemplo, como se describe en la sección de ejemplos), o una textura del fruto aumentada/disminuida estadísticamente significativa a P < 0,05 o P < 0,01 en comparación con un fruto de una planta no transformada de control.

La carga máxima se define como el valor que representa la carga mayor (en Newton (N)) requerida para causar el fallo de la integridad tisular.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "planta de tomate de control" o "planta de pimiento de control" significa una planta que tiene el mismo fondo genético que la planta cultivada de la presente invención, donde la planta de control no sobreexpresa los elementos genéticos - o parte de los mismos - de la presente invención ligados a la modulación de la maduración de los frutos. En particular, una planta de control es una planta que pertenece a la misma variedad de planta que la planta transformada. La planta de control se cultiva durante el mismo periodo de tiempo y en las mismas condiciones que la planta cultivada de la presente invención. La variedad de planta en este documento se entiende de acuerdo con la definición de UPOV. Por tanto, una planta de control puede ser una línea endogámica o un híbrido con la condición de que tengan el mismo fondo genético que la planta de la presente invención excepto que la planta de control no sobreexpresa el elemento genético - o parte del mismo - de la presente invención ligado a la modulación de la maduración de los frutos.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "antesis" significa el periodo durante el que la flor está completamente abierta y se libera polen.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "alimento procesado" significa alimento que se ha alterado de su estado natural. Los métodos usados para procesar alimentos incluyen, aunque sin limitación, enlatado, congelación, refrigeración, deshidratación y procesamiento aséptico.

Se entiende dentro del alcance de la invención que "mercado de productos frescos" significa hortalizas en el mercado que se han procesado mínimamente.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar en mayor grado algunas realizaciones de la invención. Sin embargo, no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del amplio alcance de la invención.

Ejemplo 1

Identificación de genes de tomate e inferencia de redes

El gen Le005930_at (en este documento también mencionado como APRR2 de tomate o de tipo APRR2 de tomate) se identificó como resultado de un análisis de redes neurales en el conjunto de datos de matriz de tomate. Se prepararon muestras de ARN de Ailsa Craig de tipo silvestre y alelos mutantes nor, rin y Cnr en un fondo Ailsa Craig en diferentes fases del desarrollo de los frutos de tomate. La maduración se realizó de acuerdo con métodos convencionales. Los valores de expresión de Le005930_at se obtuvieron usando el genochip de tomate 23k Affymetrix personalizado de Syngenta. Los datos de la micromatriz se normalizaron en el entorno estadístico R por el método de RMA (Irizarry et al. 2003) disponible en el paquete affy Bioconductor (Gautier et al. 2004) que se ejecuta mediante el paquete affylmGUI (Smyth 2005).

Se seleccionaron factores de transcripción para análisis posterior. Se encontró que Le005930_at tenía un perfil de expresión específico de maduración que aumenta drásticamente entre 40 dpa y 49 dpa (figura 1a) que corresponde con el primer aspecto o coloración roja. Este aumento no estaba presente en ninguna de las 3 líneas mutantes (figura 1a-c), donde la expresión nunca alcanzaba los niveles observados en el tipo silvestre. El análisis de redes neurales artificiales (ANN) se realizó en 2 puntos temporales de datos (40 dpa and 54 dpa). Se detectó Le005930_at como un núcleo.

Se midieron los cambios de expresión génica en las que sobreexpresaban Le005930. El análisis de la serie de desarrollo completa en los estados de crecimiento verde maduro (MG) y de irrupción (B) frente a los frutos de tipo silvestre en los mismos estados reveló que una gran cantidad de genes estaban regulados por aumento y disminución en las líneas transgénicas. De los genes regulados por aumento muchos están relacionados con la maduración de los frutos, pero se expresaban antes en las líneas de sobreexpresión. Por ejemplo, en el estado MG LeEXP1 tiene una expresión casi 20 veces mayor y la poligalacturonasa 10 veces mayor que en MG WT. La expresión del factor de transcripción NOR es 19 veces mayor que MG WT. Los genes que codifican enzimas de la pared celular que se expresan normalmente en su nivel máximo en frutos verdes maduros, por ejemplo, algunos miembros de la familia de xiloglucano endotransglucosilasa/hidrolasa (Solyc02g091920, XTH7) muestran expresión reducida en transgénicos MG en comparación con el tipo silvestre. Estos datos indican que la regulación por

5

10

15

20

25

30

35

aumento del gen de tipo APRR2 del cromosoma 8 en tomate induce de forma masiva la expresión de genes relacionados con la maduración.

Tabla 1

ID Sol

Nota Expresión factorial diferencial en la de sobreexpresión (log FC) Comentarios respecto a la maduración normal

Solyc04g071650

Celulosa sintasa -1,78468 Máxima en verde maduro

Solyc07g052980

XTH16 -1,94747 Máxima en verde maduro

Solyc03g093080

XTH3 y 4 copias en la misma región -2,06438 Máxima irrupción y maduración roja

Solyc02g088100

LeEXP5 -2,17115 Máxima en verde maduro

Solyc10g005960

FLA -2,1184 Máxima en verde maduro

Solyc02g091920

XTH7 -3,28676 Máxima en verde maduro

Globalmente, los datos de la matriz muestran que muchos genes que normalmente están asociados positivamente con la maduración están regulados por aumento en la sobreexpresora del gen APRR2 de tomate muy temprano (es decir, en el estado verde maduro) o en algunos casos los genes que están regulados por disminución en el estado verde maduro parecen suprimirse en el estado verde maduro hasta un grado mayor en la sobreexpresora. Por ejemplo, NOR que normalmente se expresa poco en verde maduro se fuerza en la sobreexpresora. Esta es una evidencia muy fuerte de que el gen APRR2 de tomate fuerza la maduración temprana cuando se sobreexpresa.

Ejemplo 2

Información de la secuencia del gen de tipo APRR2 de tomate

La secuencia de la sonda de Le005930 fue idéntica a SGN Unigene SGN-U585565. El gen representado por Le005930 se identificó como muy estrechamente relacionado con un regulador de respuesta de dos componentes - de tipo APRR2 de Arabidopsis thaliana.

Ejemplo 3

Generación de plantas transgénicas de tomate

Construcción y detalles del vector

Se generaron construcciones para que sobreexpresaran y regularan por disminución este gen relacionado con APRR2. La secuencia de las construcciones de sobreexpresión e iARN se proporcionan es la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, respectivamente.

SEQ ID NO: 1 -

GACCCACCTAACTATAATCAACAAACGACCCTTAAAAGAAGAAGAAAAAACAAGAACAGATGAGCTAAGTCTTCT

TCATTTCCCAAGAGATACAGGATTGAATAGTTAATGACTGATTAAAAAGTGACCGAGTTGGAGGGACTAAAAAGG

ATGCCTTTTTAGAAATGATTTGCATTGAGAATGAATTATTGGGTTGGAAAGATTTCCCAAAGGGGCTTAAAGTCCT

ACTTCTTGATGAAGATAGCAACTCTGCTGCTGAGATGAAATCAAGGCTTGAGAAAATGGACTACATAGTCTACTC

GTTCTGCAACGAGAGCGAAGCTTTGACTGCAATCTCAAGCAAATCCGAGGGCTTTCATGTTGCCATTGTGGAGG

TAAGTGCAGGCAACAGTGATGGGGTTCTACGGTTTCTTGAAAGTGCCAAAGATCTACCAACTATAATGACATCAA

ATATACATTCTCTTAGTACCATGATGAAATGTATTGCGCTAGGCGCAGTTGAGTTCCTTCAGAAACCATTGTCAGA

TGATAAACTCAAAAATATATGGCAGCATGTAGTTCACAAGGCATTCAATACTAGAAAGGATGTGTCCAAATCACTT

GAGCCGGTAAAAGATTCTGTCCTCTCGATGCTGCAGTTACAACTAGAAATGGGTGAAGCAGATGACAAAAGTTC

AAATGGAACAGAACCTCCCACTGCAGTAGCGGAAAGCAATACTGAACAGTCATCGGGCTGTGATAAATACCCTG

CTCCCTCAACCCCACAATTGAAACAAGGAGTGCGATCCGTCGATGATGGTGACTGCCATGATCATACTATCTTCT

CAACTGACCAAGACAGTGGGGAACATGATGCTGACACTAAATCCGTCGAAACTACTTATAACAATTCACTTGCTG

AGAATAATGTCCAAACAAGTCCTACTGTACAGCAAGGAGATATTATTTTGAAAGAGGATAATGTTTCATCTCCTGA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

TCTAAAGACGGAGACTGATATCGCTACCACTTCACGAAGTAACGACTGCCCTGACAATAGCATTATGCATTCTGC

TGAACCTAGTAAAGCATCTGGTCCTCATAGTTCAAATGGGACTAAATCCAATAGGAAGAAGATAAAGGTAGATTG

GACACCTGAACTACACAAGAAGTTTGTTCAAGCAGTAGAGCAACTCGGTATAGATCAAGCCATTCCTTCTCGAAT

ACTGGACCTGATGAAAGTAGAGGGCTTAACGAGACATAACGTAGCTAGCCATCTCCAGAAATACAGAATGCATC

GAAAGCAAATTTTGCCAAAGGAAGTAGAAAGAAGATGGCCTAATCCGCAACCAATAGATTCAGTCCAAAGAAGTT

ACTATCCTCATAAACCTATCATGACATTCCCACAATATCATTCTAATCATGTTGCCCCAGGTGGTCAGTTCTATCC

TGCTTGGGTAACACCAGCAAGTTATCCGAACGGTTTACAAGTGTGGGGTTCACCTTACTATCCGGGATGGAAAC

CTGCAGAGACTTGGCACTGGACGCCTCGTCCAGAGCTGCATGCTGATACATGGGGCTCCCCTATCATGTCACC

GTCGCTTGGATCATATCCACCATATCCTCAGAATGCTGGAGTGTACCGGCCACATGGAACACATAACAGATATAG

CATGCTAGAGAAGTCGTTTGATCTTCACCCGGCGGATGAGGTGATTGATAAAGTAGTAAAAGAGGCAATAACCA

AACCATGGTTACCACTTCCTTTGGGCCTAAAAGCTCCTTCAACGGAGAGCGTTCTTGACGAACTTTCTAGACAAG

GGATCTCAACCATTCCTTCACAAATCAACGACTCCCGTTGTCGGAGATGAGATGACATGTCATTCTAATTTTTTTT

GGGTCCCATAGTTGGTGCATGTCAAAAAAAAATAATAATCTCCAATTACTTGATGGACATATGTACCATGACATTA

CCCAGTGACCCGAGTGACCCACGCGTATGGCATTGACTCGACGGTCAAAATCGAGTTGTTGTAAATAATGGACC

CAAATATGGGTTTTCCCTTTTTTGTTGGCCCAATTTTAGATGTTTGGGCCGATGAGTGTGCTCCATT

SEQ ID NO: 3 -

CACAATATCATTCTAATCATGTTGCCCCAGGTGGTCAGTTCTATCCTGCTTGGGTAACACCAGCAAGTTATCCGA

ACGGTTTACAAGTGTGGGGTTCACCTTACTATCCGGGATGGAAACCTGCAGAGACTTGGCACTGGACGCCTCGT

CCAGAGCTGCATGCTGATACATGGGGCTCCCCTATCATGTCACCGTCGCTTGGATCATATCCACCATATCCTCA

GAATGCTGGAGTGTACCGGCCACATGGAACACATAACAGATATAGCATGCTAGAGAAGTCGTTTGATCTTCACC

CGGCGGATGAGGTGATTGATAAAGTAGTA

El vector de sobreexpresión usado fue pGWB405 (Nakagawa T, Suzuki T, Murata S at al. Improved Gateway Binary Vectors: High- performance Vectors for CREATION of Fusion Constructs in Transgenic Analysis of Plants. Bioscience biotechnology Biochemistry, 71(8)2095-2010, 2007). Para la producción de sobreexpresión, se clonaron 2090 pb de la secuencia de Le005930 correspondiente a la fase de lectura abierta completa delante del promotor 35S de CaMV usando el sistema de clon Gateway que evita la necesidad de sitios de restricción. La secuencia attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) (SEQ ID NO: 4) y attB2

(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) (SEQ ID NO: 5) se añadió al extremo 5' de cebadores directos e inversos por separado. La construcción también contenía el terminador de CaMV en el extremo opuesto. Para la producción de la construcción de iARN, se clonó un fragmento de 326 pb de la secuencia codificante 3' única para el gen Le005930 en el vector de iARN del sistema Gateway pK7GWIWG2(I). El fragmento de 326 pb de la secuencia codificante 3' usado en este ejemplo empieza desde CACAATATCATTCTAATCAT y finaliza con AGGTGATTGATAAAGTAGTA.

Transformación genética de tomate (Micro-Tom)

Se obtuvieron semillas de tomate Micro-Tom del Dr. Andrew Thompson, Warwick HRI, RU. Estas semillas de tomate también están disponibles al público del Tomato Genetics Resource Centre, Davis, California. Las semillas se esterilizaron durante 30 s en etanol al 70%, se aclararon 3 veces en agua estéril seguida por 10 minutos en lejía al 50% y se aclararon con agua estéril 5-7 veces. Las semillas (50-100 semillas) después se sembraron en medio A MS y se dejaron durante 7/8 días en una cámara de cultivo a 25°C.

En el día antes de la transformación (D - 1), el cultivo Agrobacterium se generó de la siguiente manera: Se inocularon 10 ml de LB líquido + antibióticos dependiendo de la resistencia a plásmidos/bacterias con una colonia bacteriana o solución madre de glicerol, seguido por incubación durante 24 h a 48 h a 28°C con agitación (250 r.p.m.). Los cotiledones se prepararon el mismo día cortándolos en ambos extremos y poniéndolos temporalmente en KCMS. Los cotiledones cortados entonces se recuperaron y se depositaron sobre placas de Petri de KCMS sólido (cara superior sobre el medio). Las placas de Petri entonces se colocaron en la oscuridad a 25°C en una cámara de cultivo durante 24 h.

En el día de la transformación (día D), se centrifugó la suspensión de Agrobacterium durante 10 min a 3000 r.p.m. El sedimento bacteriano entonces se resuspendió en KCMS líquido hasta una densidad óptica cercana a 1. El cultivo entonces se diluyó en un tubo Falcon estéril hasta una densidad óptica entre 0,05 y 0,08 (volumen final de 30 ml). Para la transformación, los cotiledones se recogieron de la placa de KCMS y se impregnaron en la suspensión bacteriana (0,05-0,08 DO) durante 30 min con agitación. Los cotiledones entonces se secaron en papel Whatman estéril (Kleenex estéril) y se depositaron de nuevo sobre la placa de Petri con KCMS sólido. Las placas de Petri se incubaron en la oscuridad durante 48 h en cámara de cultivo a 25°C.

Dos días después de la transformación (día D+2), los cotiledones se depositaron sobre medio 2Z con 400 mg/l de Augmentin (Co-amoxiclav) + kanamicina 75 mg/l durante 15 días para la regeneración de las plántulas. El medio se cambió cada 15 días o más frecuentemente en caso de contaminación. Habitualmente, la concentración de Augmentin se redujo hasta 200 mg/l (o hasta 400 mg/l en el caso de desarrollo de Agrobacterium). Se seleccionaron 38 plantas transgénicas independientes por kanamicina. Cuando las plántulas estaban bien desarrolladas, se picaron en medio de enraizamiento hasta su aclimatación en el invernadero.

Componentes de medio Tabla 1

KCMS líquido KCMS sólido 2Z Medio de enraizamiento MS 1/2

Volumen

1l 1l 1l 1l 1l

MS (sal basal, Duchefa MO221)

2,2 g

MS (incluyendo vitaminas, Duchefa, MO222)

4.4 g 4.4 g 4.4 g 2.2 g

Sacarosa

20 g 20 g 30 g 10 g 15 g

KH2PO4

200 mg. 200 mg.

pH

5,8 5,7 5,8 5,8 5,9

Agar

8 g 8 g 7 g 8 g

Autoclave Autoclave Autoclave Autoclave Autoclave

Tiamina

0,9 mg/l 0,9 mg/l

Acetosiringona

100 pM 100 pM

2.4D

200 pg/l

Kinetina

100 pg/l

Vitaminas R3

500 pl

Vitaminas Nitsch x1000

1 ml 1 ml

Ribósido de ceatina

2 mg/l

IAA

0,87 mg/l

Kanamicina

75 mg/l 50 mg/l

Augmentin

400 mg/l después 200 mg/l 200 mg/l

La composición de las vitaminas R3 fue la siguiente: tiamina 1 g/l, ácido nicotínico 0,5 g/l y piridoxina 0,5 g/l. La 5 composición de las vitaminas Nitsch fue la siguiente: biotina 0,05 mg/l, ácido fólico 0,5 mg/l, glicina 2 mg/l, mioinositol 100 mg/l, ácido nicotínico 5 mg/l, piridoxina HCl 0,5 mg/l y tiamina HCl 0,5 mg/l.

Las inserción de ADN-T en el genoma de la planta Micro-Tom se confirmó por análisis de PCR para la presencia del gen npt II, que confiere resistencia a kanamicina durante cultivo tisular (datos no mostrados). El análisis de PCR se realizó usando un kit de PCR directo en plantas Phire® con los cebadores npt II-directo (5'- 10 CACCATGATATTCGGCAAGCAG-3') (SEQ ID NO: 6) y npt II-inverso (5'- TGTGCTCGACGTTGTCACTGAA-3') (SEQ ID NO: 7) usando los siguientes componentes y condiciones:

Mezcla maestra Phusion® 2x 10 pl

5930-5F(10 pmol/l) 0,5 pl

5930-5R(10 pmol/l) 0,5 pl

15 ADN polimerasa de inicio en caliente Phire®0,4 pl

5

10

15

20

25

30

35

Muestras foliares 0,5 mm

ddH2O Hasta 20 pl

98°C 5 min

98°C 5 s

60°C 5 s

72°C 20 s

40 ciclos

72°C 1 min

Ejemplo 4

Análisis de qPCR en tomate

Se midió la expresión de Le005930 respecto a un gen constitutivo, en este caso un factor de elongación (número de acceso a GenBank: X14449). El análisis de qPCR se realizó sobre frutos de tipo silvestre (Alisa Craig) y transgénicos (tomate grande). El gen constitutivo LeELF-a se usó como control (número de acceso a GenBank: X14449). Se usaron los siguientes cebadores en el análisis de los niveles de LeELF-a y Le5930:

LeELF-F: 5'-ACCTTTGCTGAATACCCTCCATTG-3' (SEQ ID NO: 8)

LeELF-R: 5'-CACACTTCACTTCCCCTTCTTCTG-3' (SEQ ID NO: 9)

LeELF-sonda: (FAM)5'-TCGTTTTGCTGTGAGGGACATGAGGCA-3'(TAMARA) (SEQ ID NO: 10)

5930-Q-F: 5'-TTGCCCCAGGTGGTCAGTTCTAT -3' (SEQ ID NO: 11)

5930-Q-R: 5'-CAGTGCCAAGTCTCTGCAGGTTT -3' (SEQ ID NO: 12)

5930-Q-sonda:(FAM)5'-ATCCGAACGGTTTACAAGTGTGGGGTT-3' (TAMARA) (SEQ ID NO: 13)

Componentes de reacción y condiciones:

Mezcla maestra de PCR Universal Taqman 2x 7,5 pl

Cebador-F (10pmol/l) 0,45 pl

Cebador-R (10pmol/l) 0,45 pl

Sonda (10pmol/l) 0,3 pl

ADNc 5,0 pl

Agua (calidad molecular) 1,3 pl

Volumen final 15 pl

95°C 10 min

95°C 10 s

60°C 50 s

72°C 1 s

45 ciclos 40°C 10 min

Estos resultados demuestran que el gen Le005930 tenía una expresión significativamente aumentada en comparación con WT en las 3 líneas transgénicas seleccionadas en el estado verde inmaduro, verde maduro y de irrupción de desarrollo de los frutos.

Ejemplo 5

Mediciones del índice de color de tomate

Las mediciones del índice de color de tomate (TCI) se hicieron usando una máquina de medición de color MINOLTA para obtener 3 parámetros de color L, a y b. Para calcular el TCI se usó la siguiente fórmula: (2000 a)/(L*(a2 + b2)0,5). Los resultados de TCI muestran que el color del fruto de plantas que sobreexpresan Le005930 era significativamente más oscuro que los frutos de tipo silvestre en el estado de crecimiento inmaduro (figura 3). Esto 5 puede visualizarse en un experimento diferente que compara la línea TP232 que sobreexpresa Le005930 frente a tomate de tipo silvestre en diferentes estados de crecimiento (figura 7).

Ejemplo 6

Ensayo de textura del tomate

Los ensayos de textura se realizaron usando una máquina de ensayo de textura Stable MicroSystems. Se permitió 10 que una sonda de diámetro de 2 mm entrara en contacto con la superficie del fruto a 5 mm/s y se registró la fuerza requerida para aplastar la superficie del fruto 2 mm. Los resultados mostraron que los frutos que sobreexpresan Le005930 tenían un fenotipo de textura coherente con tener propiedades mejoradas de maduración (figura 4A). Por otro lado, los frutos de iARN que no expresaban Le005930 tenían una maduración disminuida (figura 4B).

Ejemplo 7

15 Mediciones de clorofila en tomate

Para las mediciones de clorofila, se cortó una sección de la epidermis y el pericarpio de un área por encima de un lóculo en una tira de 5 mm de anchura alrededor del ecuador del fruto verde maduro y de maduración, se pesó y se molió en un mortero y mano de mortero con arena lavada con ácido (Sigma-Aldrich Company Ltd, RU) y unos pocos ml de hexano:acetona al 60:40%. El hexano:acetona se eliminó y se almacenó en un frasco de vidrio universal 20 envuelto en lámina de aluminio y se remplazó repetidamente con líquido nuevo hasta que ya no perdía color moliendo el fruto. Inmediatamente se midió la absorbancia óptica de las muestras en un espectrofotómetro de barrido Phillips PU 8720 y se calcularon los contenidos de clorofila y carotenoides con las siguientes ecuaciones: clorofila total mg ml_1 = 8,02(DO663)+ 20,2(DO645) y carotenoide total mg ml_1 = (DO450)/0,25 (Fray y Grierson, 1993). Se recogieron muestras tisulares individuales de 1-3 frutos para cada línea (Forth y Pyke, 2006). Los 25 resultados muestran que las líneas que sobreexpresan Le005930 tienen más clorofila cuando están verdes maduras (TP229, TP232 y TP264) y que justifica el color más oscuro de las líneas de sobreexpresión - véase la figura 5, mientras que la línea de iARN (TP262) tiene mucho menos en comparación frutos de tipo silvestre (datos no mostrados).

Ejemplo 8

30 Recuento de plastidios de frutos de tomate

Para obtener células individuales, se separaron células del pericarpio exterior e interior de frutos de tomate (secciones de 1 mm2) y se fijaron inmediatamente después de la escisión con una cuchilla de afeitar estéril en solución de glutaraldehído al 3,5% durante una hora en la oscuridad. Los frutos verdes se alteraron como se describe previamente y de la siguiente manera: Se trataron con calor a 65°C en una solución de ácido 35 etilendiaminatetraacético de disodio (0,1 M, pH 9,0) durante hasta 20 min seguido por maceración con fórceps limpios sobre portaobjetos de microscopio de vidrio (Pyke y Leech, 1991). El pericarpio de frutos en maduración se alteró en una solución de ácido etilendiaminatetraacético de disodio (0,1 M, pH 9,0) a temperatura ambiente. El tejido se almacenó a 4°C en solución de EDTA-Na2 durante hasta seis meses. Para el recuento de plastidios, se fijaron células individuales del pericarpio exterior o interior en el portaobjetos. El recuento de plastidios se hizo en 40 microscopio Leica (CTR5000) con un objetivo 20X. El número de plastidios en el pericarpio exterior fue significativamente mayor en las líneas que sobreexpresan el gen Le005930 en comparación con el tipo silvestre

(p<0,001).

Ejemplo 9

Análisis del tamaño de cloroplastos en tomate

45 Se retiró una sección cortada a mano de 1 cm3 de grosor del punto central de cada fruto de pimiento cultivado en invernadero fresco. Cada sección se montó en agua en un portaobjetos de microscopio de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos de vidrio. Los cloroplastos se visualizaron dentro de cada sección usando un microscopio confocal de barrido láser BioRad Radiance 2100. Se usaron los siguientes ajustes: línea de láser de iones de argón de 488 nm, energía del 50%, objetivo 40x, resolución 1024x 1024, sin aumento, velocidad de barrido de 50 lps. Se tomaron 50 imágenes de tres campos aleatorios de visión dentro de cada sección, es decir, se capturaron 3 campos de visión por fruto. Las imágenes se exportaron como TIF y se analizó el tamaño de los cloroplastos en Image J. Para las líneas tanto TP (de sobreexpresión) como WT (tipo silvestre), los cloroplastos ubicados en el pericarpio interior parecían mayores que los ubicados en el tejido del pericarpio exterior. No hubo diferencias de tamaño fácilmente observables entre los cloroplastos presentes en el pericarpio interior de líneas TP frente a WT. Los cloroplastos 55 ubicados en los tejidos del pericarpio exterior de líneas TP parecían más grandes que los cloroplastos ubicados en los tejidos del pericarpio exterior de WT.

5

10

15

20

25

30

35

40

Ejemplo 10

Perfil de expresión de transcritos génicos de pimiento

Se obtuvo un progenitor de pimiento blanco de Paul Bosland, University of New México. El progenitor de pimiento rojo se desarrolló de forma interna por Syngenta. Se realizó un experimento piloto usando secuencia de ARNm. Las muestras eran plantas de pimiento cultivadas en campo, y se combinaron muestras de 3 réplicas. Los resultados indican que la abundancia relativa de transcrito de ARNm de tipo APRR2 de pimiento es elevada en el estado inmaduro en el progenitor rojo, pero baja en el progenitor blanco en el mismo estado (figura 8a). También se midió la suma de todos los transcritos de proteína de unión a clorofila a/b. La suma de todos los detectados (28 en total) indica que la expresión de tipo APRR2 refleja la expresión de la maquinara de clorofila. (Figura 8b).

Ejemplo 11

Generación y análisis de una sustitución G-A responsable del truncamiento de la proteína en el gen de tipo APRR2 de pimiento

Para encontrar el homólogo de APRR2 de pimiento, se usó una secuencia EST de tomate (SGN-U585565) para someter a BLAST una base de datos de eSt de pimiento. El mejor acierto con homología de un 90% sobre 263 bases fue KS19056B05. Como este EST era únicamente una secuencia parcial y también parecía ser quimérico, se generó una sonda P32 a partir del extremo 3' de la secuencia EST usando los cebadores 5' GGTTTACAAGTGTGGGGTTCACC 3' (SEQ ID NO: 17) y 5' CATCGAATGACTTCTCTAGCATGCTA 3' (SEQ ID NO: 18) usando un kit de marcaje Amersham Rediprime II. Se hibridó un filtro de biblioteca BAC de Capsicum frutescens (cv BG2816) de Cornell University con la sonda usando protocolos de hibridación convencionales encontrados en el sitio web de Clemson University Genomics Institute. Se recuperó BAC 85L18 del tamiz de la biblioteca y se secuenció usando paseo de cebador con un secuenciador ABI3730XL.

La secuencia de APRR2 de pimiento de tipo silvestre genómica generada fue la siguiente (SEQ ID NO: 14):

>1553

TTTCCCCTAAAAAAGATCTATTACATGGGGTTTTTTCTGTTTTATGTTGG

TTCTTATTTAAAGCTGAAAATAGTCTTTGTCTCTTTCCTTTTTTGTTAGA

TGATGTTGAAGATTCAAGCTTGAAAAAGTGTGTCAGAAGGAGTGGGGGGG

GGGGGGGTTGATTTTTTTTGTTTATTTTGAGACATGTACTATTATTATGA

GTGATATTTACTGTAAGGTTTAAGAGGGATTTTGCTAAAGGTTGAATTTT

TAATGTAAATCTGAGGGGAATTCCTTTTTGGATGTGCAGATTCAATTGGT

AATGACTGATTAAGTGACTGTTTTTGGAGGCACTAATTTGGCTGACCTAA

AAAGGATGCCTTTTTAGAAATGATTTGCATTGAGGATGAATTATTGGGTT

GGAAAGATTTCCCAAAGGGGCTTAAAGTCCTCCTCCTTGATGAAGATAGC

AGCTCTGCTGCTGAGATGAAATCAAGGCTTGAGAAAATGGACTATATAGG

TAAGTAGTTGTAACCCAGTCTAAAAATACTTACTCGCACCCGGTGTTTAT

GTTTTTTTTTTTTCTTTTGGTTTTGCTCATTCCTTTTGGTGTTGCCTGTA

AAGTTGCTGCAATATGACTAGGAGGTCAGAAACAGCCTCTTGCTGAAATG

CAAGGTAAGGCTGCGTACAATAAACTCATGTAGTTCGACACTTTCCTATG

CATATCGGGAGTTTTGGTGCACGGGGCTGCCCTCATCCCTTTTGGTACAA

AATTTTTTGGTTTAGTCACTTTCTGTTTTGCAAGTTAGTTGTGCATTTCT

TGGTCTGTTTCTTTGTTGATTTCTCCTTATATAGAAGTTCCTTTACATTT

ATTACTTAGGGAAAATAGAGTATTCTGATTCATCTTTTCTATTTTAAGAC

AAAACATTTAAGTGGTTCAGGATTCATACTTCTACCTTTTCCTGGAATGC

TGCAGAGGTCCTCTAACAAGATAGAATTTGAACTTCCCTTTATGGTTCTT

YZ

VIOOIIVIVOIOOOVOOIVIOVWOIVOIOOIOIVOIIOOIWOVOOVOV WOIIIIWIVIVOWOWOWOOOOIOOIOOIOWIVWOOIOIOVIW OVOIOOIIOVOIIWOWIVIIOVIOVWOOIOOOIVWIOVOVOIOOIV se OIVOOVOOOOIWOVOWOOVOIOWOIOIIOIVIOVIVOIVOIVOOOIO VOIOVIVOIVOOIOVOIOOOOIOVOOWOVWOIIWOIOOOOWOIOOO

looiooovivwivoioioooooivoiovowoooviwowovooooii

OVOOIIVOIOIOOWOVOWOOIVWOIIOWWOVOIVOVOOWOIOOO WWOVOOWOVIOOVOVIOOIVOOIIIOUOIOIWOWWIOOOOOVO oe IIOVOOVOOOOIOIOIVOOVWOVIOOIWOIIVOOOVOWOOIIOOIIV IIOIVOIOOIVWOOWWOIVIVIIVIIOOIVIOVOIVWOIIIOHOV IIOOVOIWOVOVOIIOVWOOIWIOIIIOOWOVOHOVIOIVOOVOO OIVIVIVWWOIOVWOVOIVOVOIVIIVOOVWOVOIIOOIIOVOHO VOOlOOllOOVOOllllVIVOOllOOlWOllOlVOVWOlOlOlVllW QZ 10010111010W1001V0111V01111VW010000011010W01000 OIIVIOIOWOIVOIWOVOOVOIOIOIIVOIIVIVWOIVOVOIOVOOI OOllOVlllOlllOOVOOOWlOlVlVOWlVlOOOVWlllOlVWOll OlOllOOllllVlWOOllOWOlOVOOVOVIOOVOlVlOWOOllOlOV VIIOIWOVIOOIOWOVIIOVOVOOOIIVIOVIVOIVIVOVOOVOIHO oz VIIOVOIIOWOOIIVIOOOOIOWIWWWOOVIVIVIVIOOIOVOIO WIVIOWOOVIOIVWWOOOIOVWOIIOIIIWOOIOOIOOOOIVOI WIVOOOOVOOIOWIOOVOVOVOIIWOIVIOIOIIIWOIVOIIOIOV VIOIIVIIOIWOVOOOOVOVOWOIVIWWOWOIVOHVIVIWWO WOlVOllVlOVOWlOOlVlllOOVOllVlVOOlllOVWOllOVllll S l IVOVllOVlOVlOOVOOlOllVOOOllOlVOlllOOOOVOOOlVWOOVl OIOIWOOIOIOIIIOOWOIOVOVOIWOOIOIIOOVOVIOIOVOOIIV VIOIVOOVOOOVWIVIOOIVIVOIIVIVIIVIIVOIOOVWOIOOIIOI VOOOOOlllVOlllOlllWOllOllOllWWOVOOllllllllOllOO VllOOlOVOlOOllllVOVOlVOOVllVOlVllllVllOWOWOOWOl 01 IIOIIIOVIVIWOOOOVIOVOIOIWIOWOIIIOOWIIIOIIIOHV OlllllOlllVWOlVllOVlOOOVllWOlOlOOlWOllOlOVOllVO IWOllVlVOVOOVllVOVOllOOllOVllWllOOOlllWWOlllOl VOIVIIIVIOIVIWOOOVOIOVWOIIVWIVWOWWIOOWIVOW VIOVWIIOIOOIOIIOIWOIOIOVOIVWIOVWOWIIIOWOOVOV s OllOVOlllOOlOOOOOOlVOOlOOlVWOllOOWOVOOOVOOVOllW OOVWlOOllllllllOVOWOOVlOOlOOllVOOllVOOlOlVOlOWO

loooovoiwoowoovoiiooiooooooivooiooivovioovoooooo

OVOlOVOllOOOOlOlOlllOlllWOlllOOOlOOOlOVIVlllOWOO

zz

loooivovoooiwiioiiovoiioooiioiovooiwoioivoinviv

0V011O110OWOV01V1WO1101V11111V1V0V110OOOOOVO1V1V 1WO0011VO110V0100VOOOO1V1VOOVOO1V10O1V001110O1VOO se VOO01VO101OOOO1O00001VOV1V01O011O01O0VO01W1W1011 1101V11OVWW1OOVOVOOV1VW00V1O100V1111V1V00VOVO11 1V1VOWO101V1OO01VO011VOVOOV0V11OOO1111111OOVW100 00VOO1VO1OO0W001OVO0011OV0V0VO01OO0VO001V000OO1V1

OV11OOVO1100001010WOV111001W0OO1VH0V1O00OOVOOV1 oe

00011O01OO1V1101WO1001O0VOOOO0O101VO1W1O11VO1V1V OOVOOO11VOV01VO101OOVW1VO1OO1V1OV11W00VWOV10VO1 1V0V0V1OOWO0OO1VOOOO001V0V00VW0010W000WOO01111 VWO00V00O1VO01W0VOV1VW0VO0WOO111WO111OOVO1V10 V1WOW1110OO11111V1W1V01101V00110WWWOV1O01011 QZ 0VO0V1V10V101V0000V0011OO1V1VOO111V1V0111VO11V1VW 1V0V110WO1OOVO001101OO0VO1111VOOV011O1VW1OV10V1V 0O0OWW000011VOW1O1101VW1V1W11O101V0VW01O0011 1WO0W00O10O0VO0011101V1O011101V1W01W11O1V1VO11 1O1O01O110V01011100VOO1O1VOO0V1O0V1VOVV1VOV0V0OW1 oz 1O000V0010VW01V010OV0V1OV1W0O1O11OO11VOO0WO1V0V 1V100O1OWO0V0V10VO0WO1101110VWWOVOV1OW01OOVOV 0011V0V100VO11V00111OO111V1001110W1V00000VO111010 O011W01110W0O11O11VO01O11WOVW0100O0VO0V01OV011 0V101VW11OO0VO111V000011010110V0V1O0V111W00V1V10 S l

VO1W1001V1W1V1O1W01V10100OVWO1O11OW01110W0O1 O1V1101111VO1O00V0O01W01V0W111OOVO0VW11O01O11V0 WO111O1V0010VOV11WO1V111V01V1O10O111VOO110WO111 1OO1VOW0V1VO1V1O001VO11OW0V0V11O110W1101OW01V1 1OO0V111W0OVV11VO011O1OO1O111O1V1010O011VO00101VO O l

V11V1V0W01V0V01V0000WW1V1O111O11O1O1V111V110111 1O100OV1VO10VO1VO1O011O1O11O011V01VO11101VOWW11O 11VO01VO0O111OW1VO01101VV0W1V100W0OO11001OV1O10 111101V11VOO01W0WOO1010V11V1W10OO100OWO1OVO0OV 1OW10W01W1WOV10V1VO1O1100111OV1V01VW0W001V0V s V100W0100VWW0W1WOO1VW1OV00010WO1O0V1VOOOO10 01O11O0VW10V1OOW01O01O11VO10V11VO0V1WOV01OOO01O V0VW10VWOVO11O1OOV1OV1O011V1V01O00V00OV0WWO1VO 1OO1O1VO11001V010V1WOV01O0O01OV01W11VWOVO1111OO

5

10

15

20

25

30

35

TGGATGATGCAGAATGCTGGAATGTACCAGTCTCACGGAATGCATAACAG

ATATAGCATGCTAGAGAAGTCATTCGATGTTCACCCGGTAAGATTGTAGA

TCCTATTTCAGACCGACAAACTTCTTTATACATAAATGCACTAGGAGATT

ATTCATATTCCAGTTTCGTTTTCCCTTTTGGAGCTACAAAGGAAAAACAC

AACGTAAATGTTTTATGGCTTATGTTGTATTAAGTGAAGGAAAATGTTTT

TCAATTTTTCGATGTTCCACTGGTCAAAAGTTTTGAAAAATATTTTCTCT

AGAAAAATAAGTTGCTTGAAAAATGAGAAAAATGACATTTCTAGTGGAAG

TAAGGAAAACAAGTTCCACCTGTGGCATTCCACATTGATTGTGTTCTCAT

TCCTCCCAATACTCCAACACACTTCATCTTCACCCCTACCCTCGTAGCTC

CATGCCCACCGTCCATAATATTCTCTAGATTATATACAAATACTTTAAGG

ACAATGTTTTTTTGTTTACGTGCCGAACACTAGAAAATAAGTAAGAACCG

AACATAAGAAAGTACGTTTCTAAGTAAGAAACTCACTCATTTTCCTAGAA

AATATTTTCCACGAAAACATTGTTCGTGGAAAACATTTTCCTTCATACCA

AACACACCCTTAGCCCTAGAATTCATTCGATAATCGTGCCAAAACTACAT

ATGTGTAATGAAGGGGAGGCACTGGGTTAAACTTGACCAATCATCTCCAA

AATGGATCTAAATTACATACAATACAACTACACTGCTAACGTACTCAGTG

CAATCTCATGAGTGGCTAAATTACATACAATCACCGGGTAAAAAGAGAAT

ATATTATTTGACTAGTATGTATAATTAGTTGTCACATTGGTTTAAGAAGG

GGTTATAGTGTCTTGGACAACCCTTACCATGCTAGCTTTTGAGGTTTGAT

TAGGCCTAAGGTCCATTTTATCATAACTAGATTATCGACCCCCACCCCCC

CGGTACACTATAGCTAGTATTGGTCTCCTAGTAACTTGATAGTATAAAAT

TTTTTATTGGTTAAGTTTTGGTTGGTGGTGTGTGCAG

A partir de esto, puede predecirse una secuencia de ADNc de APRR2 de pimiento (SEQ ID NO: 2): >1553CDS

atgatttgcattgaggatgaattattgggttggaaagatttcccaaaggggcttaaagtectectecttg

atgaagatagcagctctgctgctgagatgaaatcaaggcttgagaaaatggactatatagtctacacgtt

ctgcaatgagagtgaagctttgtctgcaatctctagcaaatccgagggctttcatgttgccattgtggag

gtaagtgcaggcgataatgatggggtcctccaatttcttgaaagtgccaaaaatctaccaactataatga

catcaaatattcattctctcagcacaatgatgaagtgtattgcgcttggtgcagttgagttccttcagaa

accattatcagatgacaaactcaaaaatatatggcagcatgtagttcacaaggcattcaatgctagaaag

gatgtgtccggaccacttgagccggtaaaagaatctcttctttcgatgctacagctacaaccagaaaagg

gtgaaccagatgacaaaagttcaaatggaacagaacctctcattgcagttgcggacaacaataccgaaca

gtcatcgggctgtgataaataccctgctccctcaacccctcaattgaaacaaggagtgcggtcagtggat

gatagtgactgccatgatcatactatcttctcaactgaccaagacaatggggagcatgatggtgacacta

aatccgtcgaaactacttataacaattcacttgctgagaatactgtccaaataagtcctcctgggcaaca

agaagatataattttgaaagaggagaatggttcatctcctcatcaaactatggaggctgatattactacc

tcttcacaaagtaaagactgccctgacaatagcattagtcattctgctgaacctagtaaagcttctggtc

5

10

15

20

25

30

35

cccatagctcaagtgggactaaatccaataagaaaaaggtgaaggtagattggacacctgaactacacaa

aaagtttgttcaagcagtagagcaactcggtatagatcaagccattccttctcgaatactagacgtgatg

aaagtggagggcttaacgagacataacatagctagccatctccagaaatacagaatgcatcggaggcaaa

ttttgccaagggaagtggaaaggagatggccccatccgcaacctagagattcagtacaaaggaattacta

tcctcataaacctgtcatgacattcccaccatatcattctaatcatgtcgccccagctggtcaatgttat

cctgcttgggtaccaccggctagttatccgaatggtttacaagtgtggggttcaccttactatccgggat

ggcagcctgcagagacttggcactggaagcctcatccagggctgcttgctgatacatggggctcccctgt

catgccaccatcgtttggatcgtatccaccatatccccagaatgctggaatgtaccagtctcacggaatg

cataacagatatagcatgctagagaagtcattcgatgttcacccg

La secuencia de ADNc de APRR2 de pimiento truncada comprende la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 15): >16113CDS

atgatttgcattgaggatgaattattgggttggaaagatttcccaaaggggcttaaagtectectecttg

atgaagatagcagctctgctgctgagatgaaatcaaggcttgagaaaatggactatatagtctacacgtt

ctgcaatgagagtgaagctttgtctgcaatctctagcaaatccgagggctttcatgttgccattgtggag

gtaagtgcaggcgataatgatggggtcctccaatttcttgaaagtgccaaaaatctaccaactataatga

catcaaatattcattctctcagcacaatgatgaagtgtattgcgcttggtgcagttgagttccttcagaa

accattatcagatgacaaactcaaaaatatatggcagcatgtagttcacaaggcattcaatgctagaaag

gatgtgtccggaccacttgagccggtaaaagaatctcttctttcgatgctacagctacaaccagaaaagg

gtgaaccagatgacaaaagttcaaatggaacagaacctctcattgcagttgcggacaacaataccgaaca

gtcatcgggctgtgataaataccctgctccctcaacccctcaattgaaacaaggagtgcggtcagtggat

gatagtgactgccatgatcatactatcttctcaactgaccaagacaatggggagcatgatggtgacacta

aatccgtcgaaactacttataacaattcacttgctgagaatactgtccaaataagtcctcctgggcaaca

agaagatataattttgaaagaggagaatggttcatctcctcatcaaactatggaggctgatattactacc

tcttcacaaagtaaagactgccctgacaatagcattagtcattctgctgaacctagtaaagcttctggtc

cccatagctcaagtgggactaaatccaataagaaaaaggtgaaggtagattggacacctgaactacacaa

aaagtttgttcaagcagtagagcaactcggtatagatcaagccattccttctcgaatactagacgtgatg

aaagtggagggcttaacgagacataacatagctagccatctccagaaatacagaatgcatcggaggcaaa

ttttgccaagggaagtggaaaggagatggccccatccgcaacctagagattcagtacaaaggaattacta

tcctcataaacctgtcatgacattcccaccatatcattctaatcatgtcgccccagctggtcaatgttat

cctgcttgggtaccaccggctagttatccgaatggtttacaagtgtggggttcaccttactatccgggat

ggcagcctgcagagacttgacactggaagcctcatccagggctgcttgctgatacatggggctcccctgt

catgccaccatcgtttggatcgtatccaccatatccccagaatgctggaatgtaccagtctcacggaatg

cataacagatatagcatgctagagaagtcattcgatgttcacccg

La secuencia genómica de APRR2 de pimiento truncada es la siguiente (SEQ ID NO: 16):

>16113

TTTCCCCTAAAAAAGATCTATTACATGGGGTTTTTTCTGTTTTATGTTGG

TTCTTATTTAAAGCTGAAAATAGTCTTTGTCTCTTTCCTTTTTTGTTAGA

SZ

OVIIOVOIIOWOOIIVIOOOOIOWIWWWOOVIVIVIVIOOIOVOI OWIVIOWOOVIOIVWWOOOIOVWOIIOIIIWOOIOOIOOOOIVO IWIVOOOOVOOIOWIOOVOVOVOIIWOIVIOIOIIIWOIVOIIOIO se WIOIIVIIOIWOVOOOOVOVOWOIVIVVWOWOIVOHVIVIWW OWOlVOllVlOVOWlOOlVlllOOVOllVlVOOlllOVWOllOVlll IIVOVIIOVIOVIOOVOOIOIIVOOOIIOIVOIHOOOOVOOOIVWOOV

loioiwooioiomoowoiovovoiwooioiioovovioiovooii

WIOIVOOVOOOVWIVIOOIVIVOIIVIVIIVIIVOIOOVWOIOOIIO oe IVOOOOOlllVOlllOlllWOllOllOllWWOVOOllllllllOllO OVllOOlOVOlOOllllVOVOlVOOVllVOlVllllVllOWOWOOWO IIIOIIIOVIVIWOOOOVIOVOIOIWIOWOIIIOOVVIIIOIIIOH V0111110111VW01V110V1000V11W0101001W011010V011V OlWOllVlVOVOOVllVOVOllOOllOVllWllOOOlllWWOlllO QZ IVOIVIIIVIOIVIWOOOVOIOVWOIIVWIVWOWWIOOWIVOV WIOVWIIOIOOIOIIOIWOIOIOVOIVWIOVWOWIIIOWOOVO VOllOVOlllOOlOOOOOOlVOOlOOlVWOllOOWOVOOOVOOVOllV VOOVWlOOllllllllOVOWOOVlOOlOOllVOOllVOOlOlVOlOW OIOOOOVOIWOOWOOVOIIOOIOOOOOOIVOOIOOIVOVIOOVOOOOO oz OOVOlOVOllOOOOlOlOlllOlllWOlllOOOlOOOlOVIVlllOWO OllOllOOlVlllOOOllOWOlllWOVlVOWOWlOlOOlOOVOVOO lOOlWOOlOOllllOOVIOllOVIVOllVOOVOllOOlOWlllVOVW VOVOWllllVlOllllOlVOllVOlOllVlOVOVlWWOOOVllOVll VlllVOVlllOOllOWOVlVlVllOOlOlllVOllOlllOlllOlOlOO SL

11O111VO010110V110WO0111101O111OVO10V11100111111V VWOV1001111OOO1VO1OOO01O0000OVO010011110V000O1V1V O01V1OO111OVOV0O110V101VO1OVW1WOV10O01O00W100W O01VW01O011O1OO0VOVW0VO100V00V1OV01V1WO01O0110V

W101OO01101001111OO11VO1O01111001111O111111111111 O l

01V1110100OOOVO0O1OV11OV1VWW1O10VOOOW10110V10W 100V1V1V1OV001WW0V011O00WO1VW01V0V01O01O01O1O0 VO0V1V0W01V011OO1OO1OO10VW11O0000VWOOO111V0VW0 01100011V11W01V00V011VO0111V01VW0V11111OO01V00W VW1OOV01O00111W1OVO00V001111101OV010W11V01OV01V s V10011WO11V0VO0101V0011111OO11W0000V01O1VW101W 11111W01100VW1O01111V000V0W11100W101OV111V1V01 0V01V11V11V1OV101VOV0V01111V111011111111V011000000 000000010V00W0VO101010VWW011O0WO11V0W01101V01

9Z

IIOOOOVOOIOVWOIVOIOOVOVIOVIWOOIOIIOOIIVOOOWOIVO VIVIOOOIOWOOVOVIOVOOWOIIOIHOVWWOVOVIOWOIOOVO VOOllVOVlOOVOllVOOlllOOlllVlOOlllOWlVOOOOOVOlllOl se OOOllWOlllOWOOllOllVOOlOllWOVWOlOOOOVOOVOlOVOl lOVlOlVWllOOOVOlllVOOOOllOlOUOVOVlOOVlllWOOVlVl OVOIWIOOIVIWIVIOIWOIVIOIOOOVWOIOIIOWOIIIOWOO lOlVllOllllVOlOOOVOOOlWOlVOWlllOOVOOVWllOOlOUV OWOlllOlVOOlOVOVllWOlVlllVOlVlOlOOlllVOOllOWOll oe IIOOIVOWOVIVOIVIOOOIVOIIOWOVOVIIOIIOWUOIOWOIV IIOOOVIIIWOOWIIVOOIIOIOOIOIIIOIVIOIOOOUVOOOIOIV OVllVlVOWOlVOVOlVOOOOWWlVlOlllOllOlOlVlllVllOll IIOIOOOVIVOIOVOIVOIOOIIOIOIIOOIIVOIVOIIIOIVOWWH OllVOOlVOOOlllOWlVOOllOlWOWlVIOOWOOOllOOlOVIOl QZ OllllOlVllVOOOlWOWOOlOllVllVlWlOlOllOOWOlOVOOO VIOWIOWOIWIWOWOVIVOIOIIOOIIIOVIVOIVWOWOOIVO WIOOWOIOOVWWOWIWOOIVWIOVOOOIOWOIOOVIVOOOOI OOIOIIOOVWIOVIOOWOIOOIOIIVOIOVIIVOOVIWOVOIOOOOI OVOVWIOVWOVOIIOIOOVIOVIOOIIVIVOIOOOVOOOVOWWOIV oz OlOOlOlVOllOOlVOlOVIWOVOlOOOOlOVOlWllVWOVOllllO OVIOOIIVIVOIOOOVOOIVIOVWOIVOIOOIOIVOIIOOIWOVOOVO VWOIIIIWIVIVOWOWOWOOOOIOOIOOIOWIVWOOIOIOVIV VOVOIOOIIOVOIIWOWIVIIOVIOVWOOIOOOIVWIOVOVOIOOI VOIVOOVOOOOIWOVOWOOVOIOWOIOIIOIVIOVIVOIVOIVOOOI S l

OVOIOVIVOIVOOIOVOIOOOOIOVOOWOVWOIIWOIOOOOWOIOO OIOOIOOOVIVWIVOIOIOOOOOIVOIOVOWOOOVIWOWOVOOOOI

lovooiivoioioovvovowooivwoiiowwovoivovoowoioo

OWWOVOOWOVIOOVOVIOOIVOOIIIOUOIOIWOWWIOOOOOV OllOVOOVOOOOlOlOlVOOVWOVlOOlWOllVOOOVOWOOllOOll 01

VIIOIVOIOOIVWOOWWOIVIVIIVIIOOIVIOVOIVWOIIIOHO VllOOVOlWOVOVOllOVWOOlWlOlllOOWOVOllOVIOlVOOVO OOIVIVIVWWOIOVWOVOIVOVOIVIIVOOVWOVOIIOOIIOVOH OVOOlOOllOOVOOllllVIVOlllOOlVVOllOlVOVWOlOlOlVllV VIOOlOlllOlOWlOOlVOlllVOllllVWOlOOOOOllOlOWOlOO s OOIIVIOIOWOIVOIWOVOOVOIOIOIIVOIIVIVWOIVOVOIOVOO

looiioviiioiiioovooowioivivowiviooovwinoivwoi

loioiiooiiiiviwooiiowoiovoovovioovoiviowoonoio

WllOlWOVlOOlOWOVllOVOVOOOllVlOVlVOlVlVOVOOVOlll

IIVOIIIOOVOIIIIOOVIOOIVOOVIIOOOWOVOOIIOIOIOVIVUO OOOWOWlllOOllVOVOlOllOVllWlVlOlVlOVlOVOlllVllVl VIWOVOVWWIOOOOOVOIWOVIVOVIIVWIOOOIOVOIVOIOIW se O010VO1OV10OW1OV1OVOWOWOV1WOV1VOV11VVV1O1V001V VWOO1O1VO1WOOV011OVW110001OVO00V0000W01W10101 V1VOV1OWWOO010O1W1V0O11VO11W0V1OOO0V11OOOVOVOV WOOV1VO11OO1111VOWW0010O11011VOWW0OVOO1111V1V VW0V1OO1111VO1OVO1OVW0W10VV1O1110OV10VW0W1VOV oe V0OOW0W10W1WW0V1OVOW0OO010OV1110111111101WO V00W111OV1VWOV1V1V11V0V1O1O11V1W1VOO10OOVOOO01V OO1O0V10O1OOOV1OOOOVO11O1VO11OVOVOWOO1OV1WOOO1OO 11VO1O1101011V011VOVOO11VO00101OOVOO110WOWW00W 10W0010V1O111VOV01WWV0V01VWW011O0110W1VWW0 QZ V1O1O1111V1VWW011110WWO1001OVOO1101V0O11111WO 1111101WW00W010W11V101101V11O001V111101VW10OV VOVOVWW00VWOV1O0V001111OOO11110O1110VOO11V1VO11 V11V0V00V1OVO01VW1VOV1V111O11OVWOV0OOV0VO111V1OO 1V0V1011V0W100OOOVO1101V0O11VO10W0V0V1O01VO0V1V1 oz V0VOW1VO01W00OVO1O10VOOV101W001O01W0VO01V01V00 1100O1VOVO001W11O110V01100011O1OVO01W0101VO111V1 V0V011O110OWOV01V10VO1101V11111V1V0V110OOOOOVO1V1 V1WO0011VO110V0100VOOOO1V1VOOVOO1V10O1V001110O1VO OVOO01VO101OOOO1O00001VOV1V01O011O01O0VO01W1W101 S l

11101V11OVWW1OOVOVOOV1VW00V1O100V1111V1V00VOVO1 11V1VOWO101V1OO01VO011VOVOOV0V11OOO1111111OOVW10 000VOO1VO1OO0W001OVOV011OV0V0VO01OO0VO001V000OO1V 1OV11OOVO1100001010WOV111001W0OO1V110V1O00OOVOOV 100011O01OO1V1101WO1001O0VOOOO0O101VO1W1O11VO1V1 O l

VOOVOOO11VOV01VO101OOVW1VO1OO1V1OV11W00VWOV10VO 11V0V0V1OOWO0OO1VOOOO001V0V00VW0010W000WOO0111 1VWO00V00O1VO01W0VOV1VW0VO0WOO111WO111OOVO1V1 0V1WOW1110OO11111V1W1V01101V00110WWWOV1O0101 10VO0V1V10V101V0000V0011OO1V1VOO111V1V0111VO11V1W s V1V0V110WO1OOVO001101OO0VO1111VOOV011O1VW1OV10V1 V0O0OWW000011VOW1O1101VW1V1W11O101V0VW01O001 11WO0W00O10O0VO0011101V1O011101V1W01W11O1V1VO1 11O1O01O110V01011100VOO1O1VOO0V1O0V1VOW1VOV0V0OW

5

10

15

20

25

30

35

40

AGGCCTAAGGTCCATTTTATCATAACTAGATTATCGACCCCCACCCCCCC

GGTACACTATAGCTAGTATTGGTCTCCTAGTAACTTGATAGTATAAAATT

TTTTATTGGTTAAGTTTTGGTTG

Se diseñaron cebadores para secuenciar el BAC. La secuencia de BAC se ensambló usando el programa de ensamblaje Sequencher 4.9 de Genecodes Inc. Para determinar las regiones codificantes del gen, las secuencias EST de tomate y pimiento se sometieron a análisis BLAST frente a la secuencia genómica de pimiento usando el algoritmo BLAST2. Se generó un mapa de la secuencia genómica usando Vector NTI de Invitrogen.

Para recuperar la secuencia de las líneas de pimiento 16113 y 1553A, se extrajo el ADN de tejido foliar joven usando el método CTAB (Doyle y Doyle, 1990). Entonces se usó un subconjunto de los cebadores anteriores para amplificar regiones de ambas líneas de pimiento. Los productos de amplificación se secuenciaron por el método de Sanger en el ABI3730XL, y se alinearon usando Sequencher.

La secuenciación del gen de tipo APRR2 de pimiento de progenitores con frutos rojos y blancos de la población cartografiada reveló evidencias de un polimorfismo entre estos 2 genotipos. Al alinear la secuencia de ADNc disponible con la secuencia genómica fue posible identificar una sustitución G-A que produce un codón de parada en el progenitor blanco:

CDS

APRR2consensus-F7 100.0^ Ser T yr

CTATCCTCAT AAACCTGTCA TGACATTCCC ACCATATCAT TCTAATCATG TCGCCCCAGC TGGTCAATGT TATCCTGCTT GGGTACCACC AGCAAGTTAT

GATAGGAGTA TTTGGACAGT ACTGTAAGGG TGGTATAGTA AGATTAGTAC AGCGGGGTCG ACCAGTTACA ATAGGACGAA CCCATGGTGG ICGTTCAATA

___________AFRR2-F15 ___________ G/A substitution

____________________________________________________________________________________CDS____________________________________________________________________________________

APRR2consensus-F7 100.0^

Pro Asn Gly Leu Gln Val Trp Glij Ser Pro Tyr Tyr Pro Glij Trp Gln Pro Ala Glu Thr Trp His Trp Lys Pro His Pro Gly

CCGAACGGTT TACAAGTGTG GGGTTCACCT TACTATCCGG GATGGCAGCC TGCAGAGACT ^^CACTGGA AGCCTCATCC AGGGGTAAAC CTTTTTTTCC

GGCTTGCCAA ATGTTCACAC CCCAAGTGGA ATGATAGGCC CTACCGTCGG ACGTCTCTGA * ¡GTGACCT TCGGAGTAGG TCCCCATTTG GAAAAAAAGG

CDS

La secuencia del pimiento de tipo silvestre y mutante de truncamiento se muestra en la SEQ ID NO: 14 y 16,

respectivamente. Por lo tanto, se concluye que el gen está truncado en el progenitor blanco. Un análisis de

secuencia adicional del gen APRR2 en todos los individuos en la población de color maduro revela que todos los genotipos que tienen frutos inmaduros blancos contienen el codón de parada. La distribución de los genes truncados en otros tipos es menos clara. No se encontraron frutos inmaduros blancos que no tuvieran el truncamiento, de

modo que se cree que es necesario para el fenotipo blanco. El fenotipo de color blanco causado por la sustitución G-

A se hereda de forma recesiva.

Ejemplo 12

Frecuencia de la presencia de alelos rojos y blancos en pimiento

El análisis de la presencia del alelo del tipo APRR2 del progenitor blanco y rojo en toda la población de cartografiado de color maduro revela una correlación entre el alelo rojo o blanco y verde claro, o el color de fruto inmaduro blanco dentro de la población (véase la figura 9). La presencia del alelo PSY1 rojo o blanco se incluye para las comparaciones. Este gen no se correlaciona con los tipos de color inmaduro. Puede observarse que el alelo rojo está presente a alta frecuencia en frutos inmaduros de color verde claro. El alelo blanco está presente a alta frecuencia en frutos inmaduros blancos.

Ejemplo 13

Análisis de qRT-PCR de genes de pimiento

El ensayo a tiempo real basado en TaqMan se diseñó para su uso sobre máquinas de detección de secuencia ABI 7900HT usando el programa informático Primer Express. Se realizó una búsqueda BLAST del amplicón frente a las bases de datos de pimiento DFCI pública y de Syngenta patentada. Se encontró únicamente un acierto con una coincidencia de un 100% de la secuencia completa del amplicón. El ensayo se validó usando diluciones en serie de ARN extraído de tejido foliar y frutal combinado. La eficacia de reacción (1,01) y la fluorescencia máxima (3,5) pasaron ambas los parámetros de validación GM ADT. Las reacciones se combinaron en un volumen de 10 ul usando reactivos de RT-PCR de una etapa y ajustes del termociclador típicos.

Ejemplo 14

Análisis de expresión en toda la población de color maduro de pimiento

5

10

15

20

25

30

35

40

El análisis de qRT-PCR de la expresión del gen de tipo APRR2 en la población de color maduro reveló evidencias de un aumento en la expresión asociada con la secuencia génica completa (APRR2+) en comparación con el gen truncado (APRR2-) - véase la figura 10. La figura muestra la media de varios puntos de datos con un alto coeficiente de varianza. Estos datos apoyan los datos de secuencia de ARNm donde la expresión de APRR2 es máxima en el estado inmaduro.

Referencias

Batu, A. y Thompson, A.K. 1998, Tr. J. Agr. & Forestry, 22, 365-372.

Doyle JJ y Doyle JL (1990) Focus 12: 13-15.

Ebert et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:5745-5749.

Eckstein F (ed) (1991) Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach. Oxford Univ. Press, NY 1991.

Eriksson EM, Bovy A, Manning K, Harrison L, Andrews J, De Silva J, Tucker GA, Seymour GB, 2004 Plant Physiol.; 136(4):4184-97.

Exama, A., Arul, J., Lencki, R.W., Lee, L.Z. y Toupin, C. 1993. J. Food Sci. 58: 1365-1370.

Forth D. y Pyke K.A. Journal of Experimental Botany, Vol. 57, n.° 9, pág. 1971-1979, 2006.

Frary A, Nesbitt TC, Grandillo S, Knaap E, Cong B, Liu J, Meller J, Elber R, Alpert KB, Tanksley SD 2000. Science; 289(5476):85-8.

Fray y Grierson, 1993 Plant Mol Biol.;22(4):589-602.

Fridman E, Carrari F, Liu YS, Fernie AR, Zamir D. 2004 Science;305(5691):1786-9.

Gautier, L., et al. 2004 Bioinformatics 20307-315.

Geeson, J.D., Browne, K.M., Maddison, K.I., Shepherd, J. y Guaraldi, F. 1985. J. Food Technol. 20:339-349.

Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

Heidmann I, de Lange B, Lambalk J, Angenent G, Boutilier K (2011). Plant Cell Rep. Jun; 30 (6):1107-15.

Huh J.H., B. C. Kang, S. H. Nahm, S. Kim, K. S. Ha, M. H. Lee y B. D. Kim TAG Theoretical and Applied Genetics 102, n.° 4, 524-530.

Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP. (2003) Biostatistics. Abr; 4(2):249-64.

Knapp S (2005) New nomenclature for Lycopersicon
http://sgn.cornell.edu/ about/ solanum_nomenclature.pl Lawton et al, 1987 Plant Mol Biol. 9:315-324.

Manning K, Tor M, Poole M, Hong Y, Thompson AJ, King GJ, Giovannoni JJ, Seymour GB.

2006. Nat Genet.;38(8):948-52.

Nakagawa T, Suzuki T, Murata S at al., 2007 Biochemistry, 71(8)2095-2010.

Nielsen et al. (1991. Science 254:1497-1500).

Odell et al, 1985 Nature 313:810-812.

Pearson WR (1990) Methods in Enzymology 183: 63-98.

Pyke A y Leech R (1991) Plant Physiology, 96, 1193-1195.

Sambrook J, y Russell DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Nueva York, NY, EE. UU., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Shimamoto K. et al., 1989. Nature 338:274-276.

Smyth, G. K. (2005). Limma: Linear Models for microarray data. En: Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, R. Gentleman, V. Carey, S. Dudoit, R. Irizarry, W. Huber (eds.), Springer, Nueva York, pág. 397-420.

Smith T, Waterman M (1981) J. Mol. Biol: 147, 195-197.

Thompson, A.J., Tor, M., Barry, C.S., Vrebalov, J., Orfila, C., Jarvis, M.C., Giovannoni, J.J., Grierson, D. y Seymour, G.B. (1999). Plant Physiology 120:383-389.

Thompson AJ, Tor M, Barry CS, Vrebalov J, Orfila C, Jarvis MC, Giovannoni JJ, Grierson D, Seymour GB. Science. 5 2002; 296(5566):343-6.

Tijssen P (1993) Hybridization With Nucleic Acid Probes. Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation. En: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology.Elsevier.

Vrebalov J, Ruezinsky D, Padmanabhan V, White R, Medrano D, Drake R, Schuch W, Giovannoni J (2002) Science 296: 5566, 343 - 346.

10

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un método para producir una planta transgénica con velocidad aumentada de maduración de los frutos en comparación con frutos de una planta no transformada en el estado verde maduro, que comprende regenerar una planta a partir de una célula hospedadora que expresa un vector que comprende una secuencia de nucleótidos aislada seleccionada del grupo que consiste en:

   a) una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1;

   b) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de a);

   c) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de cualquiera de las secuencias de nucleótidos a) a b); y

   d) una secuencia de nucleótidos que es el complemento de las secuencias de nucleótidos de una cualquiera de a) a c).

   en el que la planta es de tomate, preferiblemente Solanum lycopersicum o de pimiento, preferiblemente Capsicum annuum.
2. 2. Un método de manipulación de la velocidad de maduración en frutos de una planta solanácea transgénica, que comprende transformar dicha planta con el vector de la reivindicación 1.
3. 3. El método de la reivindicación 2, en el que la velocidad de maduración de los frutos está aumentada en comparación con frutos de una planta no transformada en el estado verde maduro.
4. 4. Una planta cultivada o parte de la misma producida por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. 5. Un método de detección de marcadores genéticos indicativos de la velocidad de maduración de los frutos de una planta de la familia de las solanáceas, que comprende:

   a. aislar ADN de dicha planta y de uno o ambos progenitores de dicha planta;

   b. cribar los marcadores genéticos en una región de dicha secuencia de ADN correspondiente a la SEQ ID NO: 1; y

   c. determinar la herencia conjunta de dichos marcadores de uno o ambos progenitores a dicha planta.
6. 6. Un marcador genético detectable por el método de la reivindicación 5.
7. 7. Uso de un marcador genético de la reivindicación 6 para la selección de una planta solanácea cultivada, preferiblemente una planta de pimiento o tomate, que puede albergar frutos.
8. 8. Uso de las secuencias de nucleótidos aisladas SEQ ID NO: 1 en la manipulación de la velocidad de maduración de los frutos de una planta solanácea, preferiblemente una planta de tomate o una planta de pimiento, en el que dicha manipulación se logra por modificación genética de dicha planta y en el que dicha modificación genética se introduce por TILLING.