CN112326641A - 一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法及试剂盒 - Google Patents
一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的检测方法及试剂盒。检测方法为将待测样品与反应液混合；然后利用Fe3+‑Cu2+‑铁氰化钾显色鉴别样品中有否含有痰液成分；反应液的组成为：可溶性还原剂、锌粉或锡粉、二价阳离子、缓冲剂，pH值为6.5‑6.9。本发明方法简便易行，可在2分钟之内完成检测，结果清晰易判断，灵敏度高、特异性和可重复性好，所用试剂均为常规试剂，具有很好的安全性。本发明试剂盒可长期存放和便于携带使用，使用后可密封处理保护环境，适用于唾液与痰液的即时收集和快速即时检测(POCT)。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种简便易用、安全性好的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法及试剂盒。
背景技术
咳嗽是一种常见现象，也是呼吸系统疾病的常见症状表现，但特异性较低，各种因素都可能导致发生咳嗽。咳痰是呼吸系统疾病的重要症状，具有很高的特异性和诊断应用价值，慢性支气管炎、肺炎等肺部疾病在早期即可诱发咳痰。流感、感冒等上呼吸道感染在后期侵染到下呼吸道后、哮喘发作或吸入刺激性物质等因素也可诱发咳痰，但都属于有明显可判断区分的情况，且后续经过核酸检测，即可进一步地鉴别，不会造成错判。因此，在无明显可感受刺激或无发烧等其它症状的情况下，常规咳痰指示慢性支气管炎、肺炎等肺部疾病的早期存在，应认真对待，及时进行深入检查诊断。医学定义的痰液，是由气管、支气管、肺支气管和细小支气管等下呼吸道在病理刺激的情况下过量产生的分泌物。人体处于健康状态下，正常支气管黏膜仅常规分泌少量粘液，以保证呼吸道黏膜的湿润，一般并不导致咳痰，当肺和下呼吸道发生炎症病变时，下呼吸道局部过度产生和分泌以MUC5AC为代表的粘蛋白为主要成分的粘液，同时，肺部细胞表面离子通道的变化使得其气道表面液pH值降低，气道表面液呈现酸性化，促进病变上皮细胞与基底膜分离脱落，并诱发纤毛摆动汇聚形成痰液。痰液中可包含脱落上皮细胞、癌细胞、炎症细胞，并可在痰中出现红细胞、细菌、寄生虫等改变。痰液通过支气管纤毛运动从下呼吸道向上推动，引发正常咳嗽反射从气管经过口腔咳出排出体外。
慢性支气管炎(简称：慢支)，是因吸烟、大气污染、寒冷、过敏原刺激、感染等各种因素引起的气管、支气管黏膜及周围组织的慢性非特异性炎症。该病在中国的发病率高达3％-5％，且随着年龄的增长而增长。50岁以上人群的发病率高达24％。临床症状以咳嗽、咳痰为主，并以反复发作的慢性过程为特征，但咳嗽属于非特异性现象，而慢支早期少量痰液易混入唾液中与普通唾液难以直观区分，导致咳痰症状被忽视而延误诊治。慢支经快速检测确诊，积极治疗，并消除吸烟、寒冷、过敏原等诱发因素防止复发，预后良好。若忽视延误，病因持续存在，可使病情发展至不可逆的慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺、COPD)阶段，疾病晚期可引起阻塞性肺气肿和慢性肺源性心脏病，危及生命。
痰液检测具有无损伤和取样便捷等巨大优势，对于慢支等肺部疾病诊断具有重要的病理意义和应用价值。然而，当前缺乏便捷快速的痰液鉴别检测手段，不利于肺部疾病的早期患者及时接受痰液检测。影响因素主要有2点：(1)痰液在咳出过程中均经过口腔，易与唾液混合而一同吐出。唾液是由口腔周围的唾液腺所分泌的液体，俗称为口水，具有润滑口腔粘膜、溶解食物和便于吞咽的作用，其中还含有淀粉酶和溶菌酶，能帮助消化和具有杀菌作用。唾液一般并不能指示肺呼吸道病理状况，虽俗称为口水和痰，但并不具有痰液的病理意义。在肺部疾病的早期，痰液量较少，少量痰液混入唾液中与普通的唾液难以直观区分，导致咳痰症状被忽视。(2)在肺部疾病发生早期尚未出现明显病症的情况下，患者咳痰多属于偶发，且多并不身处在专业机构，也不便于收集送检，常直接吐掉而不送检，不仅可能造成诊疗延误，而且可能造成环境污染和呼吸道病原体的传播扩散。
目前，痰液与唾液的鉴别方法主要有：性状目测法、镜检法、蛋白测定法、唾液淀粉酶法、铁粉还原显色法等。性状目测法是临床上常用的便捷方法，依靠专业人士逐一指导教育患者通过清水漱口清除唾液，深咳收集咳出液，再目测判断样品是否为合格痰液；该过程耗费患者和专业人士的大量时间精力，大大降低了痰液检测的依从性、适用性和通量性。同时，即使按规程漱口后深咳采集，仍有较大几率收集到即时分泌的唾液，与混有痰液的咳出液性状难以区分，容易出现误判。镜检法是在性状目测基础上，对采集到的咳出液取样涂片进行显微镜检查计数，若鳞状上皮细胞数量＞20％，提示标本主要来源于口腔而非下呼吸道，不属于合格痰液。该过程更为繁琐专业。蛋白测定法是根据痰液相比唾液含有更多的蛋白质，可用考马斯亮蓝法等对咳出液样品进行液化测定蛋白质含量来判断，蛋白质含量显著超出唾液样品常规值可判断含有痰液成分。该方法需要专业人员操作使用专用仪器设备如分光光度计等，且液化过程可能干扰蛋白质测定，造成结果不准确。唾液淀粉酶法是根据唾液中的淀粉酶可水解淀粉利用碘的显色反应来测定。我们在实验过程中发现，由于唾液淀粉酶的活性很强，该方法难以分辨普通唾液与混有痰液的唾液。我们团队提交的中国发明专利申请案二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒(申请号：202010311902.2)简称铁粉还原显色法，通过铁粉还原痰液粘蛋白二硫键产生Fe2+，与铁氰化钾试纸条反应显色来鉴别指示样品中痰液。该法需要持续6分钟的震荡或搅拌操作以促进铁粉与粘蛋白充分反应，且需要保持较快的震荡或搅拌速率以防止过量铁粉堵塞溶液上行导致的显色失败，这严重影响了该方法推广使用。
发明内容
综上所述，目前缺少一种简便易用、快速即时、依从性好的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法及试剂盒，这不利于痰液检测的普及推广和环境保护。
为此，本发明提供一种简便易用、快速即时、依从性好、适合普及的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法及试剂盒。本方法和试剂盒可在2分钟内完成全部操作，并指示结果。
本发明技术方案：
本发明提供一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法，将待测样品与反应液混合；然后利用Fe3+-Cu2+-铁氰化钾显色鉴别样品中有否含有痰液成分；
反应液包括可溶性还原剂、二价阳离子、缓冲剂，反应液的pH值为6.5-6.9，反应液中还加入锌粉或锡粉中的一种或两种。
进一步，所述可溶性还原剂为2-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等巯基试剂、三(2-羧乙基)膦或维生素C中的一种或几种。
进一步，所述二价阳离子为锌离子、钙离子中的一种或两种。
进一步，所述缓冲剂为3-吗啉丙磺酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷、柠檬酸-柠檬酸钠中的一种或多种。
进一步，利用Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸条显色指示；试纸条上干燥有0.2mol/m2-0.44mol/m2铁氰化钾，0.007mol/m2-0.07mol/m2三氯化铁和0.007mol/m2-0.07mol/m2硫酸铜。
具体操作步骤为：将待测样品置于容量管中，倒入反应液，以取样勺充分搅拌混合0.5-1分钟，将Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸条下端浸入样品液中接近但不超过样品控制线(试纸条下端相距约1mm的双线条)，然后静置约30秒，观察试纸条上结果指示区的颜色显示，蓝色指示样品为唾液，黄色指示样品为痰液。
我们收集测试了分别采自健康志愿者和慢支确诊患者的唾液和痰液样品，测试结果完全符合预期。我们进一步进行唾液与痰液按不同比例混合的实验测试，发现：当样品中混合加入的痰液比例＜15％(v/v)时，显色结果均为蓝色；当样品中混合加入的痰液比例＞20％(v/v)，显色均为黄色；当样品中混合加入的痰液比例＝18％(v/v)，显色结果蓝色与黄色的比例呈现为1:1，因此，本发明方法不仅能够区分唾液和痰液，而且能够判别所收集的咳出样品有否包含较多的痰液成分。
其中容量管用于收集样品，并能容纳反应液，其特征组成为容量大于5ml的洁净可密封的塑料管。
其中反应液的组成包含可溶性还原剂、锌粉或锡粉、二价阳离子、缓冲剂，pH为6.5-6.9。待测样本为2ml痰液，加入反应液3ml，此时锌粉或锡粉的用量为：0.05g-0.2g。如待测样本量加大，可按比例增加反应液的体积，反应液的成分也相应按比例调整。
进一步，所述反应液中的缓冲剂为3-吗啉丙磺酸(MOPS)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、柠檬酸-柠檬酸钠中的一种或多种。
进一步，所述反应液中的缓冲剂的浓度为20mM-40mM，可提供足够的缓冲能力使得混合样品后的体系处于pH 6.5-6.9，不干扰还原反应和显色反应。
进一步，所述可溶性还原剂为2-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等巯基试剂、TCEP或维生素C(VC)中的一种或几种组合，浓度为：1mM-10mM。
进一步，所述二价阳离子为钙离子和锌离子中的一种或两种。本发明的不同实施方式中，所述二价阳离子采用氯化钙、氯化锌中的一种或两种，浓度为：10-20mM。
本发明的试纸条，用于吸滤样品液进行巯基测定。试纸条上面分别干燥有Fe3+、Cu2 +以及铁氰化钾。
本发明其中一个实施例，其中试纸条为长度显著大于容量管高度、宽度显著小于容量管直径的试纸条；距试纸条底部约2-5mm处，标记有相距约1mm的双线条为样品控制线，用于指示试纸条的使用方向及浸入样品液的深度；在样品控制线上方约1mm为Fe3+、Cu2+区域，干燥有Fe3+和Cu2+；在样品控制线上方约3-5mm处，标有虚线条的铁氰化钾线，虚线及上方约5mm区域干燥有铁氰化钾。
作为一种改进，上述试纸条可以在铁氰化钾线上方约5mm处，标有短线条的质控指示线，质控指示线上方为质控指示区。在试纸条使用前，该区域不显示颜色。在试纸条使用时，显示由过量的铁氰化钾迁移形成的黄色，指示样品和操作合格，结果可靠。若在试纸条使用前，该区域已经显示颜色，说明试纸条已经变质，不建议继续使用。该质控设置可以排除缓冲剂或试纸条变质、样品体积过少、没有充分混匀等误操作而导致的假阴性。
作为一种改进，上面所述的试纸条在背部贴合塑料底板条，以利于将试纸条更平直地放在容量管内。
作为一种改进，上面所述的试纸条在顶端可设计为可折叠，以便于将试纸条挂在容量管内。
作为一种改进，上面所述的试纸条可以密封包装保存，室温稳定性可达12个月以上。
本发明还提供一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的试剂盒，包括收集管、管盖和检测杆，收集管为可密闭的透明离心管；检测杆为中空棒，内置Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸条，检测棒还设有结果指示窗和质控指示窗；收集管中可事先放置反应液，也可在加入待测样品后加入反应液，反应液包括可溶性还原剂、锌粉或锡粉、二价阳离子、缓冲剂。
进一步，可溶性还原剂为2-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等巯基试剂、三(2-羧乙基)膦或维生素C中的一种或几种。
进一步，所述二价阳离子为锌离子、钙离子中的一种或两种；所述缓冲剂为3-吗啉丙磺酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷、柠檬酸-柠檬酸钠中的一种或多种。
进一步，Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸条上干燥有0.2mol/m2-0.44mol/m2铁氰化钾，0.007mol/m2-0.07mol/m2三氯化铁和0.007mol/m2-0.07mol/m2硫酸铜。
根据本发明方法建立的一种痰液快速检测试剂盒，主要特征组成包括收集管、检测杆、反应液。所述收集管含旋盖，所述检测杆上端与收集管旋盖可拆卸连接固定，内部固定置有试纸条，试纸条的大小根据检测杆的大小来确定。检测杆下端设置有过滤层，功能是过滤除去样品溶液中的不溶性异物以及吸附样品本身颜色，减弱去除样品本身颜色对检测干扰。检测杆外部与试纸条结果指示区域以及质控指示区域的相应位置设有结果指示标识窗口。该试剂盒可用于唾液和痰液等咳出液样品检测，具体使用步骤为：(1)打开收集管，将管盖放置一边；(2)深呼吸，用力咳嗽5-8次，向收集管内吐入咳出液，并尽量让咳出液靠近管内底部，再加入反应液；(3)盖紧收集管，摇晃约10秒，使得咳出液与反应液混合均匀；(4)静置，启动30秒倒计时；(5)计时结束，立即查看收集管窗口。结果观察窗(检测杆靠下端的窗口，即2号窗)显示蓝色为阴性，指示无痰；黄色为阳性，指示有痰。
上面所述的收集管为透明塑料离心管，口径：2.5cm高度：11.5cm，可立，带有旋盖，可旋紧密封。在样品检测过程结束后，试剂盒整体与样品溶液一起处于盖紧密封状态，可保护环境，防范潜在的病原体扩散。
上面所述的检测杆和旋盖采用可拆卸连接，其在生产装配时处于相互分离状态，便于将试纸条和过滤层装入到检测杆中；其在检测使用过程中处于相互连接状态，便于利用旋盖旋紧固定检测杆的位置。
作为一种改进，所述检测杆上部设置有一个直径略小于收集管内部直径的固定环，所述固定环和检测杆之间连接设置有多根连接杆；固定环的存在使得检测杆始终与收集管平行且位于管内正中央，防止检测杆在检测过程中掉落。
作为一种改进，所述盖朝向收集管内部一侧凹陷设置有与检测杆顶部形状相匹配的凹槽，通过将检测杆顶部插入凹槽内对检测杆进行固定；采用嵌入的方式进行固定，操作方便，且固定效果好。
作为一种改进，所述收集管和管盖通过螺旋盖紧固定，螺旋固定较扣盖制作成本小，生产技术成熟，密封性效果也好。
作为一种改进，所述的检测杆的过滤层由厚度为1厘米的过滤嘴海绵组成。
作为一种改进，考虑到操作性、成本、标准化生产等问题，检测杆试纸条由尺寸(长×宽)为20mm×5mm试纸条及背部支撑塑料条组成。在滤纸上干燥有分别滴加的0.2M氯化铁和0.2M硫酸铜混合液及饱和铁氰化钾溶液(1.09M)。氯化铁和硫酸铜混合液滴加样品控制线上方1mm处，用量1μL，铁氰化钾溶液滴加在样品控制线上方5mm处，用量5μL，氯化铁和硫酸铜混合液位置与铁氰化钾位置两者相距2mm。在检测杆中距过滤嘴上端约9mm处设有宽约2mm结果指示窗，此窗口与试纸条结果指示区对应，若样品中不含痰液，则可在此窗口观察到明显蓝色。
作为一种改进，在检测杆距过滤嘴上端约16mm处设有宽约2mm质控指示窗(1号窗)，位于结果观察窗的上方，试纸条质控指示区对应。在检测使用前，该区域不显示颜色，在使用时显示由过量的铁氰化钾迁移形成的黄色，指示样品和操作合格，结果可靠。若在使用前，该区域已经显示颜色，说明检测杆试纸条已经变质，不建议继续使用。若在检测使用后，该区域仍不显示颜色，说明样品或操作不合格，结果不可靠。
上面所述的反应液的组成为：30mM 2-巯基乙醇、0.1g锌粉、12mM ZnCl2、3ml 5mMpH6.8MOPS水溶液。
本发明，利用Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸与可溶性还原剂显色反应进行蛋白质二硫键的反向检测。痰液富含粘蛋白等蛋白质，其二硫键消耗反应体系中的可溶性还原剂而延阻其对Fe3+、Cu2+的还原，维持试纸条铁氰化钾带的黄色；同时，在试纸条上含有的Cu2+可随溶液上行，与铁氰化钾结合生成土黄色，进一步强化黄色的深度。唾液蛋白质含量低，反应体系中的可溶性还原剂能够快速还原Fe3+，生成Fe2+，结合铁氰化钾带而显现蓝色；同时，在试纸条上含有的Cu2+也被反应液中的可溶性还原剂还原生成铜黑，进一步强化蓝色的深度。
该原理主要基于痰液与唾液蛋白质组成差异：(1)痰液蛋白质含量较高，总蛋白质含量一般≥10mg/ml，而唾液蛋白质含量较低，总蛋白质含量一般≤2.5mg/ml。痰液蛋白质含量为唾液的4倍以上。由于蛋白质通常都含有二硫键，因此，蛋白质含量的差别可以通过二硫键的差别进行检测。(2)痰液富含粘蛋白MUC5AC，而唾液缺乏MUC5AC。人MUC5AC蛋白由5627个氨基酸残基组成，包含293个半胱氨酸残基，通过二硫键形成广泛的分子内和分子间胱氨酸，使得二硫键构成痰液与唾液区分的重要特征。二硫键的检测可以通过其对可溶性还原剂的氧化反应进行。(3)粘蛋白富含多聚阴离子黏多糖的粘附性和吸附性。由于痰液中粘蛋白含量显著高于唾液中，能粘附和吸附可溶性还原剂，进一步放大了痰液与唾液消耗可溶性还原剂的速度差别。我们将饱和浓度的铁氰化钾和高浓度(≥0.1M)的Fe3+和Cu2+分别干燥固定在滤纸介质上下相邻的2个区域，并以含二价阳离子的pH 6.5-6.9反应液控制Fe3+和Cu2+的氧化性和可溶性，制作得到滤纸显色体系，可用于常见可溶性还原剂的快速测定，显色反应过程可在30秒之内完成，呈现蓝色条带指示样品中可溶性还原剂的存在，检测限可达6mM。该体系能很稳定地控制本底，精密度能控制在10％以内。我们实验发现，向滤纸显色体系同时加入取自慢性支气管炎患者的痰液和浓度相当于检测限5倍(30mM)的可溶性还原剂，反应时间延长至1min，也不能使得滤纸显示蓝色，而向该体系同时加入取自健康志愿者的唾液和浓度相当于检测限5倍(30mM)的可溶性还原剂，30秒的反应时间，滤纸已显示蓝色。结果验证了利用本发明滤纸-可溶性还原剂体系进行检测，慢支患者的痰液与健康志愿者的唾液的差异度高达5倍以上，因此，利用该体系从咳出液样品中检测有否包含痰液成分，能够快速分辨慢支患者与健康个体。
本发明主要发明点为：第一，创造性地将非可溶且还原性更强的还原剂锌粉或锡粉加入到含有可溶性还原剂的溶液体系中消耗去除初始溶解氧，以保护可溶性还原剂不被溶液中的溶解氧氧化变质，同时将溶液体系密封，隔绝外界空气对溶解氧的补充，使得含有可溶性还原剂的溶液体系得以长期稳定保质。由于可溶性还原剂在溶液体系中容易被溶解氧氧化变质，不利于相关产品的保质储存，这是此类方法和相关产品必须解决的技术难点。第二，在试纸条制作中，创造性加入了Cu2+，与Fe3+同时使用，能分别增强加深阴性结果的蓝色和阳性结果的黄色，使得显色更明显，与常规的可溶性还原剂-Fe3+-铁氰化钾法相比，更有利于结果判读。第三，简单的5步操作，30秒快速显色，即可分辨唾液与痰液，达到了即时快速检测的效果。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法，使用本发明方法及试剂盒能够在2分钟内完成唾液、痰液等咳出液样品的显色检测，能从咳出液样品中检测有否包含痰液成分，能够即时快速分辨慢支患者与健康个体，显著优于各种传统方法。本发明的试剂盒成本较低，能实现标准化生产，成品体积较小、方便携带，使用操作简单，检测结果易判读，并能自行密封防止样品扩散污染环境的问题，具备良好的安全性。本发明并且创造性地解决了溶液体系中可溶性还原剂的保质储存问题，有利于试剂盒产品生产储运。本方法和试剂盒使用，不需要专业设备设施或专业技能，也不需要特别培训和学习过程，普通人员能很快上手完成，使用过程不会给使用者造成任何不适，因此，具备良好的依从性，适于普及推广。本发明方法及试剂盒能够帮助肺炎和慢性支气管炎早期患者尽早接受深入检查诊断，早诊早治，恢复健康。
下表是本发明方法与传统鉴别痰液与唾液方法比对
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明：
图1为试纸条示意图。
图2为试纸条成品以及检测结果示意图。
图3为管盖的俯视图。
图4为检测杆和固定圈、管盖结合的立体图
图5试剂盒的爆炸图
图6试剂盒一体化设计示意图
图7试剂盒成品以及检测结果示意图
1：收集管；2：管盖；4：检测杆；5：固定环；6：凸杆；7：凹槽；8：反应液与咳出液的混合物；9：样品量控制线；41：过滤层；42：试纸条；43：结果检测窗；44：质控指示窗。
421：结果指示区，422：铁氰化钾线，423铁氰化钾点样区域，424：质控指示区，425：样品控制线。426:Fe3+-Cu2+区域
具体实施方式
以下以具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。本文所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。
实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规手段。
实施例中所采用的试剂，如无特别说明，均为市场购买得到。
图1为试纸条示意图。本实施例的试纸条42上设有结果指示区421，在该区域内能出现蓝色则表明样品为阳性；铁氰化钾线422，铁氰化钾区域的最下端，在此线附近出现出现蓝色，为阳性；铁氰化钾点样区域423，此区域内滴加铁氰化钾；质控指示区424，在试纸条使用前，该区域已经显示颜色，说明试纸条已经变质，不建议继续使用。若在试纸条使用后，该区域仍不显示颜色，说明操作不当，结果不可靠；样品控制线425，样品体积不能超过此线；和:Fe3+-Cu2+区域，该区域滴加有:Fe3+-Cu2+混合液。
图2为试纸条成品以及检测结果示意图，421：结果指示区，422：铁氰化钾线，423铁氰化钾点样区域，424：质控指示区，425：样品控制线，425：Fe3+-Cu2+区域。
用试纸条测试待测样品，将试纸条下端浸入样品液中接近但不超过样品控制线(试纸条下端相距约1mm的双线条)，然后静置约30s，观察结果指示区是否有蓝色出现。出现蓝色条带，为阳性结果，指示样品中还原剂含量大于6mM；否则，为阴性结果。
如图3－图6所示，根据本发明方法建立的一种痰液快速检测试剂盒，主要包括收集管1、管盖2、检测杆4。
本发明一个实施例中收集管1为透明塑料离心管，口径：2.5cm高度：11.5cm，可立，带有管盖，可旋紧密封。在样品检测完成后，试剂盒整体与样品溶液一起处于盖紧密封状态，避免污染环境。本实施例中，所述收集管1和管盖2通过螺旋固定，螺旋固定较扣盖制作成本小，生产技术成熟，密封性好。
检测杆4上端与收集管的管盖2可拆卸连接固定。检测杆4内固定置有试纸条42，试纸条42的大小根据检测杆的大小来确定。本发明的试纸条42为Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸条。
检测杆4和管盖2采用可拆卸连接，其在生产装配时处于相互分离状态，便于将试纸条42和过滤层43装入到检测杆4中；其在检测使用过程中处于相互连接状态，便于利用管盖2旋紧固定检测杆4的位置。
一个实施例中，管盖2朝向收集管1内部一侧凹陷设置有与检测杆4顶部形状相匹配的凹槽7，通过将检测杆4顶部插入凹槽7内对检测杆4进行固定。采用嵌入的方式进行固定，操作方便，且固定效果好。
所述检测杆4上部设置有一个直径略小于收集管内部直径的固定环5，固定环5的存在使得检测杆4始终与收集管1平行且位于管内正中央，防止检测杆4在检测过程中掉落。
所述固定环5和检测杆4之间连接设置有多根凸杆6；所述凸杆6位于固定环内侧壁上，径向向内延伸。凸杆6均匀设置，本实施例中设有三根，可以更好的卡住检测杆4。
收集管1在检测时还需要加入反应液，如图6所示，收集管1中加入反应液和咳出液混合物8。本实施例中，所述反应液为pH为6.5-6.9，体积为，组成为5mM-30mM的2-巯基乙醇、0.1g-0.5g锌粉、5-15mM ZnCl2、5mM-15mM 3-吗啉丙磺酸的水溶液。
检测杆4下端置有过滤层41，过滤层41功能是过滤除去样品溶液中的不溶性异物以及吸附样品本身颜色，排除对检测的干扰。本发明一个实施例中所述过滤层41由总厚度为1厘米的过滤嘴海绵中间填充皂土组成。
本实施例中试纸条42放置在检测杆4内，可不设置样品控制线。
本实施例中，检测杆4内置的试纸条42由尺寸(长×宽)为20mm×5mm滤纸条及背部支撑塑料条组成。在距试纸条下端9mm处，干燥有5μL饱和铁氰化钾溶液(1.09M)，距试纸条下端5mm处，干燥有体积1μL，浓度0.2mM三氯化铁和0.2mM硫酸铜混合液。
检测杆4上与试纸条42结果指示区域以及质控指示区域的相应位置设有结果指示窗口和质控指示窗。在结果指示区域是一条5mm长度的铁氰化钾区域。
在检测杆4中距过滤层上端9mm处设有宽2mm结果指示窗43，此窗口与试纸条的结果指示区421对应。若样品含有痰液，则检测完成后在此窗口观察到明显蓝色条带。
在检测杆距过滤嘴上端约16mm处设有宽约2mm质控指示窗44，与试纸条的质控指示区424对应。在检测使用前，该区域不显示颜色，在使用时显示由过量的铁氰化钾迁移形成的黄色，指示样品和操作合格，结果可靠。若在使用前，该区域已经显示颜色，说明检测杆的试纸条已经变质，不建议继续使用。若在检测使用后，该区域仍不显示颜色，说明样品或操作不合格，结果不可靠。
以上实施例中的各种结构的尺寸均不构成对本发明的唯一限定，可根据样品的检测需要和检测产品的形状性能等选择合适的尺寸。
该试剂盒主要用于检测咳出液中有无痰液成分，具体使用步骤为：(1)打开收集管，将管盖放置一边；(2)深呼吸，用力咳嗽5-8次，向收集管内吐入咳出液，并尽量让咳出液靠近管内底部，再加入反应液；(3)盖紧收集管，摇晃约10秒，使得咳出液与反应液混合均匀；(4)静置，启动30秒倒计时；(5)计时结束，立即查看收集管窗口。结果观察窗(检测杆靠下端的窗口，即2号窗)显示蓝色为阴性，指示无痰；黄色为阳性，指示有痰。。
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：氯化铁和硫酸铜混合液使用浓度对检测影响
(1)试纸条制备及溶液配制
距试纸条底部约3mm处，标记有相距约1mm的双线条为样品控制线，在样品控制线上方约1mm为Fe3+-Cu2+区域，干燥有1μL三氯化铁和硫酸铜混合液，氯化铁+硫酸铜浓度分别为0.1M+0.1M、0.2M+0.2M、0.3M+0.3M；在样品控制线上方约5mm处，标有虚线条的铁氰化钾线，虚线及上方约5mm区域干燥有5μL 1M铁氰化钾。试纸条长×宽为20mm×5mm切割。记为1-6号，每个号各重复制备3个。配制30mM 2-巯基乙醇溶液，各取2mL。
(2)试纸条检测
将上步所得的试纸条放入2ml 30mM 2-巯基乙醇溶液或水中测试，结果见下表：
结果显示，三氯化铁和硫酸铜混合液浓度对检测有影响，三氯化铁和硫酸铜混合液浓度太高，会使本底显色，浓度太低则检测巯基的灵敏度低。使用三氯化铁和硫酸铜混合液0.2M+0.2M较为合适。
实施例2：金属粉末测试
(1)试纸条、反应液制备
试纸条制备：距试纸条底部约3mm处，标记有相距约1mm的双线条为样品控制线，在样品控制线上方约1mm为Fe3+-Cu2+区域，干燥有0.2M三氯化铁和0.2M硫酸铜混合液共1μL；在样品控制线上方约5mm、(即Fe3+-Cu2+区域与铁氰化钾区域间距离相聚2mm)，标有虚线条的铁氰化钾线，虚线及上方约5mm区域干燥有5μL饱和铁氰化钾，在铁氰化钾线上方约5mm处，标有短线条的质控指示线。试纸条长×宽为20mm×5mm切割。
反应液：配制反应液中氯化锌12mM，MOPS 5mM，2-巯基乙醇30mM，金属粉末分别为0g,0.1g锌粉，0.1g锡粉。室温放置一周/两周分别测试。
(2)试纸条检测
将上述室温放置一周/两周的反应液，用试纸条测试，结果显示，不加金属粉末的缓冲液放置一周，用试纸条测试淡蓝色，0.1g锌粉缓冲液以及0.1g锡粉缓冲液试纸条测试显蓝色；不加金属粉末的缓冲液放置两周，用试纸条测试无色，0.1g锌粉缓冲液以及0.1g锡粉缓冲液试纸条测试显蓝色。加入锌粉和锡粉可有效保护缓冲液中巯基。
实施例3：反应液中锌粉的用量
(1)试纸条、反应液制备
试纸条制备如实施例2
反应液：配制反应液氯化锌12mM，MOPS 5mM，2-巯基乙醇用量分别为30mM，分别加入锌粉0.05g、0.1g、0.2g，配置完反应液室温放置0、2、4、6、8、10、12个月。
(1)试纸条检测
将在室温放置0、2、4、6、8、10、12个月反应液用试纸条测试，结果如下表：
结果显示，0.1g锌粉足够保持反应液中还原剂活性。
实施例4：本发明从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法及试剂盒的生产
生产组分：收集管、管盖、检测杆、反应液
痰液收集管为可密闭的透明塑料离心管，近底部标有样品控制线；
试纸条按实施例2制作。
检测杆为中空棒，设有结果指示窗和质控指示窗，与内置的铁氰化钾试纸条上的结果指示区、质控指示区分别对应，检测杆下端内置过滤层；
反应液配制：3000ml体系，氯化锌4.91g，MOPS取3.14g，NaOH溶液调pH至6.8，2-巯基乙醇6.29ml，用水补足体积至3000ml。反应液按3ml/管分装。锌粉0.1g每管。
研制生产批号：202001001
质量检测：
(1)性状：包装完好，组分齐全；盛装试剂的离心管及反应液、锌粉无泄漏，无破损；品名、批号和有效期清楚；标签字迹清晰；说明书清晰完整。
(2)密封性：随机抽取20个产品进行产品密封性测定，每个产品的密封性均良好。
(3)阴阳性符合率：随机抽取20个产品，对阴性参考品和阳性参考品分别进行10次检测。阴性符合率为100％，符合阴性参考品的检测结果均为阴性的要求。阳性符合率为100％，符合阳性参考品的检测结果均为阳性的要求。
实施例5：健康人群咳出液检测
(1)实验试剂及样品
痰液快速检测试剂盒按实施例4研制生产提供。
咳出液样本：无吸烟史，年龄在20-50岁的健康志愿者。收集即时分泌的咳出液。
性状判断。性状判断由专业医生指导进行。首先通过目测性状进行判断，较透明且无粘稠的标本直接判断为唾液，当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量＞20％细胞总数，判断为唾液。
样本由20位志愿者提供，每位志愿者连续提供3次咳出液。通过性状判断，判断均为唾液，即阴性样品。
(2)样品试验
分别将60组咳出液样本分别转移至收集管，将反应液倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约10次，静置1min，观察结果指示窗，出现蓝色条带判断为阴性(-)，无蓝色条带为阳性(+)。结果见下表：
| 样本 | 结果 | 样本 | 结果 | 样本 | 结果 | 样本 | 结果 |
| 1 | - | 16 | - | 31 | - | 46 | - |
| 2 | - | 17 | - | 32 | - | 47 | - |
| 3 | - | 18 | - | 33 | - | 48 | - |
| 4 | - | 19 | - | 34 | - | 49 | - |
| 5 | - | 20 | - | 35 | - | 50 | - |
| 6 | - | 21 | - | 36 | - | 51 | - |
| 7 | - | 22 | - | 37 | - | 52 | - |
| 8 | - | 23 | - | 38 | - | 53 | - |
| 9 | - | 24 | - | 39 | - | 54 | - |
| 10 | - | 25 | - | 40 | - | 55 | - |
| 11 | - | 26 | - | 41 | - | 56 | - |
| 12 | - | 27 | - | 42 | - | 57 | - |
| 13 | - | 28 | - | 43 | - | 58 | - |
| 14 | - | 29 | - | 44 | - | 59 | - |
| 15 | - | 30 | - | 45 | - | 60 | - |
采集自健康人群的60份咳出液标本，通过本发明痰液快速检测试剂盒检测的结果全部为阴性，与体检及镜检结果一致。
实施例6：慢性支气管炎患者人群咳出液试剂盒检测
(1)实验试剂及样品
痰液快速检测试剂盒按实施例4研制生产提供。
咳出液样本：年龄在40-65周岁的慢性支气管炎患病志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。
性状判断。性状判断由专业医生指导进行。首先通过目测性状进行判断，不透明且呈粘稠的标本直接判断为痰液，当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量≤20％细胞总数，判断为痰液。
样本由20位志愿者提供，每位志愿者连续提供3次咳出液。通过性状判断均为痰液，即阳性样品。
(2)样品试验
分为60组，分别将60组咳出液样本转移至收集管，通过目测其粘稠度来判断是否存在痰液，分别用“-”和“+”表示阴性和阳性；将反应液倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约10次，静置1min，观察结果指示窗，出现蓝色条带判断为阴性(-)，无蓝色条带为阳性(+)。结果见下表：
| 样本 | 结果 | 样本 | 结果 | 样本 | 结果 | 样本 | 结果 |
| 1 | + | 16 | + | 31 | + | 46 | + |
| 2 | + | 17 | + | 32 | + | 47 | + |
| 3 | + | 18 | + | 33 | + | 48 | + |
| 4 | + | 19 | + | 34 | + | 49 | + |
| 5 | + | 20 | + | 35 | + | 50 | + |
| 6 | + | 21 | + | 36 | + | 51 | + |
| 7 | + | 22 | + | 37 | + | 52 | + |
| 8 | + | 23 | + | 38 | + | 53 | + |
| 9 | + | 24 | + | 39 | + | 54 | + |
| 10 | + | 25 | + | 40 | + | 55 | + |
| 11 | + | 26 | + | 41 | + | 56 | + |
| 12 | + | 27 | + | 42 | + | 57 | + |
| 13 | + | 28 | + | 43 | + | 58 | + |
| 14 | + | 29 | + | 44 | + | 59 | + |
| 15 | + | 30 | + | 45 | + | 60 | + |
采集自慢性支气管炎患者的60份咳出液标本，通过本发明痰液快速检测试剂盒检测的结果是全部为阳性，与临床诊断及镜检结果一致。
实施例7：重度吸烟人群咳出液的检测和比对
(1)实验试剂及样品
实验试剂盒由实施例4生产的痰液快速检测试剂盒提供
咳出液样本：志愿者为年龄大于40周岁，吸烟年限超过10年，每天吸烟数量≥20支，有慢性咳嗽和咳痰历史的志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。样本由50位志愿者提供，每位志愿者连续提供3次咳出液。
性状判断/镜检法。性状判断由专业医生指导进行。首先进行目测判断，不透明且呈粘稠的标本直接判断为痰液(阳性，+)，较透明且无粘稠的标本直接判断为唾液(阴性，-)；当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量≤20％细胞总数，判断为痰液(阳性，+)，否则判断为唾液(阴性，-)。
(2)样品试验
分为150组，分别将150组咳出液样本转移至收集管，通过目测其粘稠度来判断是否存在痰液，分别用“-”和“+”表示阴性和阳性；将反应液倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约10次，静置1min，观察结果指示窗，出现蓝色条带判断为阴性(-)，无蓝色条带为阳性(+)。结果见下表：
本试剂盒VS.性状/镜检
根据上表计算，
Po＝(92+42)/150＝0.893
Pe＝(92×108+58×42)/150×150＝0.550
Kappa＝(Po-Pe)/(1-Pe)＝0.762
运用kappa法验证两种方法的具有高度的一致性，两种方法的检测结果一致性较高。
实施例8：感冒患者人群咳出液试剂盒检测
(1)实验试剂及样品
实验试剂盒由实施例4生产的痰液快速检测试剂盒提供
咳出液样本：年龄在20-50周岁的感冒志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。样本由20位志愿者提供，每位志愿者连续提供3次咳出液。
性状判断。性状判断由专业医生指导进行。首先进行目测判断，不透明且呈粘稠的标本直接判断为痰液(阳性，+)，较透明且无粘稠的标本直接判断为唾液(阴性，-)；当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量≤20％细胞总数，判断为痰液(阳性，+)，否则判断为唾液(阴性，-)。
(2)样品试验
分为60组，分别将60组咳出液样本转移至收集管，通过目测其粘稠度来判断是否存在痰液，分别用“-”和“+”表示阴性和阳性；将反应液倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约10次，静置1min，观察结果指示窗，出现蓝色条带判断为阴性(-)，无蓝色条带为阳性(+)。结果见下表：
本试剂盒VS.性状/镜检
根据上表计算，
Po＝(17+38)/60＝0.917
Pe＝(17×22+44×38)/(60×60)＝0.568
Kappa＝(Po-Pe)/(1-Pe)＝0.808
运用kappa法验证两种方法的具有高度的一致性，两种方法的检测结果一致性较高.
实施例9：本专利与中国发明专利申请案二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒(申请号：202010311902.2)比对
(1)实验试剂及样品
痰液快速检测试剂盒按实施例4研制生产提供。
咳出液样本：年龄在40-65周岁的慢性支气管炎患病志愿者。按取痰标准方法漱口后深咳收集。
性状判断。性状判断由专业医生指导进行。首先通过目测性状进行判断，不透明且呈粘稠的标本直接判断为痰液，当目测难以判断时，通过涂片显微镜检查，选择3个区域进行细胞计数，鳞状上皮细胞数量≤20％细胞总数，判断为痰液。
样本由20位志愿者提供，共20份咳出液。通过性状判断均为痰液，即阳性样品。
(2)样品试验
分为20组，分别将20组咳出液样本转移至收集管，通过目测其粘稠度来判断是否存在痰液，分别用“-”和“+”表示阴性和阳性；将反应液倒入收集管中，将检测杆与管盖连接，放入收集管内，盖紧，摇晃约10次，静置1min，观察结果指示窗，出现蓝色条带判断为阴性(-)，无蓝色条带为阳性(+)。结果见下表：
| 样本 | 本试剂盒 | 样本 | 二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒 |
| 1 | + | 11 | + |
| 2 | + | 12 | + |
| 3 | + | 13 | + |
| 4 | + | 14 | + |
| 5 | + | 15 | + |
| 6 | + | 16 | + |
| 7 | + | 17 | 无法显色 |
| 8 | + | 18 | + |
| 9 | + | 19 | + |
| 10 | + | 20 | + |
采集自慢阻肺患者的20份咳出液标本，通过本发明痰液快速检测试剂盒检测10例，结果全部10例全为阳性，通过二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒(申请号：202010311902.2)检测10例，9例为阳性，1例因铁粉堵塞溶液上行导致显色失败。结合操作等各项情况看，二硫键检测方法及含二硫键的痰液检测试剂盒(申请号：202010311902.2)需要持续6分钟的震荡或搅拌操作，操作耗时、费力，查看结果时会存在过量铁粉堵塞溶液上行导致显色失败。本试剂盒仅需摇晃10s，静置30s，操作简便、快速，结果易判读。
Claims (10)
1.一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法，其特征在于，将待测样品与反应液混合；然后利用Fe3+-Cu2+-铁氰化钾显色鉴别样品中有否含有痰液成分；
反应液包括可溶性还原剂、二价阳离子、缓冲剂，反应液的pH值为6.5-6.9，反应液中还加入锌粉或锡粉中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法，其特征在于，所述可溶性还原剂为2-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等巯基试剂、三(2-羧乙基)膦或维生素C中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法，其特征在于，所述二价阳离子为锌离子、钙离子中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法，其特征在于，所述缓冲剂为3-吗啉丙磺酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷、柠檬酸-柠檬酸钠中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的方法，其特征在于，利用Fe3 +-Cu2+-铁氰化钾试纸条显色指示；试纸条上干燥有0.2mol/m2-0.44mol/m2铁氰化钾，0.007mol/m2-0.07mol/m2三氯化铁和0.007mol/m2-0.07mol/m2硫酸铜。
6.一种从咳出样品中快速鉴别痰液成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括收集管、管盖和检测杆，收集管为可密闭的透明离心管；检测杆为中空棒，内置Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸条，检测棒还设有结果指示窗和质控指示窗；收集管中可事先放置反应液，也可在加入待测样品后加入反应液，反应液包括可溶性还原剂、锌粉或锡粉、二价阳离子、缓冲剂。
7.根据权利要求6所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的试剂盒，其特征在于，可溶性还原剂为2-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等巯基试剂、三(2-羧乙基)膦或维生素C中的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的试剂盒，其特征在于，所述二价阳离子为锌离子、钙离子中的一种或两种；所述缓冲剂为3-吗啉丙磺酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、双(2-羟基乙胺基)三(羟甲基)甲烷、柠檬酸-柠檬酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的试剂盒，其特征在于，Fe3+-Cu2+-铁氰化钾试纸条上干燥有0.2mol/m2-0.44mol/m2铁氰化钾，0.007mol/m2-0.07mol/m2三氯化铁和0.007mol/m2-0.07mol/m2硫酸铜。
10.根据权利要求6所述的从咳出样品中快速鉴别痰液成分的试剂盒，其特征在于，所述反应液pH为6.5-6.9，组成为5mM-30mM的2-巯基乙醇、0.1g-0.5g锌粉、5-15mM ZnCl2、5mM-15mM 3-吗啉丙磺酸的水溶液。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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