CN108548854A - 一种唾液酸电化学试纸及其制备与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种唾液酸电化学试纸及其制备与检测方法，所述唾液酸电化学试纸包括绝缘基片、导电电极、绝缘隔离层、反应层、前处理层、虹吸导样槽和粘合隔片，反应层为酶反应膜，所述酶反应膜覆盖于反应区的参比电极及工作电极表面，位于绝缘隔离层的反应区端；前处理层设置在反应层的前端；反应层和前处理层设置在虹吸导样槽内；酶反应膜包括与唾液酸反应的酶和一种电子传递介体；前处理层的浆液中含有唾液酸水解剂。本发明使用直接电化学生物传感器原理检测唾液酸方法，通过设置样品前处理结构，结合酶层中的酶对血液中结合唾液酸快速完全分解成游离唾液酸，提高唾液酸测试灵敏度，实现准确、快速、简单、低成本检测唾液酸的方法。

Description

一种唾液酸电化学试纸及其制备与检测方法

技术领域

本发明涉及电化学试纸及电化学检测领域，具体是一种唾液酸电化学试纸及其制备与检测方法。

背景技术

唾液酸(Sialic acid，SA)，是一类含9个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的总称，在人体的唾液酸主要为N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸两种，大多由葡萄糖代谢生成。血清唾液酸来源于细胞表面，以糖结合唾液酸和脂结合唾液酸两种形式存在。

机体发育阶段各种组织唾液酸表达水平均较高，而在成年人的组织中则为低表达，如成人组织中出现唾液酸化水平升高，则提示发生病变的可能。上世纪七十年代，国外学者们通过动物实验及人体肿瘤研究，证实了一些恶性肿瘤个体血清唾液酸水平异常升高。到上世纪九十年代，唾液酸开始作为血清肿瘤标志物应用于临床。

众多的研究提示恶性肿瘤患者血清唾液酸升高程度较非肿瘤性病变的大，所以尽管血清唾液酸对恶性肿瘤的诊断并非特异性，但具有较高的敏感性，联合检测血清唾液酸及其他肿瘤标记物对恶性肿瘤的筛查、早期诊断有很大的临床意义。有文献报道,血清唾液酸水平与肿瘤恶性程度、肿瘤临床分期相关,分化越低，分期越晚血清SA水平越高；作有效治疗后血清唾液酸可下降，肿瘤复发、转移后又上升，提示血清唾液酸不但可作为恶性肿瘤辅助诊断的指标，还可作为病情发展、肿瘤消长的监测指标。

目前，检验血液唾液酸的主要方法有：高效液相色谱法、化学发光法、光化学比色法。在这些方法中，高效液相色谱法和化学发光法检测过程繁琐，获得分析结果所需时间较长；光化学比色法取血量大，并且需要专用的生化分析仪，价格昂贵。未见能家用或床旁使用的快速检测唾液酸电化学法及产品报道。

检测血液唾液酸，需要一种测试灵敏度高、结果准确、抗干扰能力强、成本低、操作简单的方法。

发明内容

本发明解决目前唾液酸检测方法的技术不足，提供一种唾液酸电化学试纸及其制备与检测方法，使用直接电化学生物传感器原理检测唾液酸方法，通过设置样品前处理结构，结合酶层中的酶对血液中结合唾液酸快速完全分解成游离唾液酸，提高唾液酸测试灵敏度，实现准确、快速、简单、低成本检测唾液酸的方法。

实现本发明目的的技术方案是：

一种唾液酸电化学试纸，包括

绝缘基片；

导电电极，所述导电电极包括设置在绝缘基片上的三条条状导电电极，分别为工作电极、参比电极和短路电极，其中设置在导电电极传导区一端的短路电极与工作电极或参比电极相接；

绝缘隔离层，所述绝缘隔离层局部覆盖于导电电极上，绝缘隔离层的一端露出导电电极的反应区，另一端露出导电电极的传导区；

反应层，所述反应层为酶反应膜，所述酶反应膜覆盖于反应区的参比电极及工作电极表面，位于绝缘隔离层的反应区端；

前处理层，所述前处理层设置在反应层的前端，覆盖于反应区的参比电极及工作电极表面；

虹吸导样槽，所述反应层和前处理层设置在虹吸导样槽内；虹吸导样槽的前端为采样口；

粘合隔片，所述粘合隔片与绝缘隔离层、前处理层、反应层和虹吸导样槽的上端面叠接；

所述酶反应膜包括与唾液酸反应的酶和一种电子传递介体，所述酶为神经氨酸苷酶、神经氨酸醛缩酶、酮胺氧化酶或过氧化物酶中的一种或组合，其中，神经氨酸苷酶含量为1％-3％、神经氨酸醛缩酶含量为0.1％-1％、酮胺氧化酶含量为0.5％-2％，过氧化物酶0.5％-2％；所述电子传递介体为亚铁氰化钾，含量为3％(m/m)-10％(m/m)；

所述前处理层的浆液中含有唾液酸水解剂，所述唾液酸水解剂含量为2.0％-8.5％。

所述虹吸导样槽的后端与绝缘隔离层之间形成与外界相通的导气孔，所述的采样口、虹吸导样槽和导气孔三者相互连通。

所述酶反应膜还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂，所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液或柠檬酸缓冲液；所述粘合剂采用淀粉、糊精、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述表面活性剂为TritonX-100或TW-20。

所述唾液酸水解剂为pH值低于2的非挥发性酸，所述非挥发性酸包括磺基水杨酸、3-羧基苯磺酸中的一种或组合。

所述前处理层的浆液纵还包括粘合剂及表面活性剂，所述粘合剂包括羧甲基纤维素，其重量百分比为1％；所述表面活性剂包括TritonX-100，其重量百分比为0.1％。

上述唾液酸电化学试纸的制备方法，包括如下步骤：

1)采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料基片上制作工作电极、参比电极和短路电极，工作电极、参比电极和短路电极，采用由Acheson公司购买的导电碳墨制作。通过丝网印刷将导电油墨在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到80℃烘箱中烘干60min；

2)采用丝网印刷技术在印好电极系统的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘隔离层，绝缘漆由Acheson公司购买。通过丝网印刷将绝缘漆在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到紫外烘干机一分钟烘干。

3)用点酶机在电极表面固定酶反应膜用于血液唾液酸的检测。所取酶反应液的各组分及其重量百分比见表1：

表1

材料	重量(w/v)
		神经氨酸苷酶	1.5％
神经氨酸醛缩酶	0.5％
		酮胺氧化酶	1.0％
过氧化物酶	0.8％
		亚铁氰化钾	5.0％
羧甲基纤维素	1.0％
		柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)	90.0％
吐温-20	0.2％

取4μL酶反应液滴加到电极表面，50℃烘干20min，备用。

4)用点酶机在前处理区表面固定前处理层用于对样品中的结合唾液酸进行水解。所取前处理层浆液的各组分及其重量百分比见表2：

表2

材料	重量(w/v)
		磺基水杨酸	3.5％
羧甲基纤维素	1％
		3-羧基苯磺酸	3％
TritonX-100	0.1％
		水	92.4％

取4μL前处理层浆液滴加到前处理区绝缘基片表面，50℃烘干20min，备用。

5)前处理层浆液固定后，用粘合隔片将表面封装片、PET基片粘合，粘合隔片上设有开槽，对应于电极反应区域，及暴露电极上有酶反应试剂的一端，以及参比电极和短路电极。PET基片、粘合隔片和表面封装片组成虹吸导样槽及采样口。

一种唾液酸电化学检测方法，包括上述的唾液酸电化学试纸，所述方法包括如下步骤：

一、制作线性曲线图：

收集压积比为45％的新鲜血液，配制唾液酸浓度为0.5，1.0，1.5，3.0，5.0和7.0mmol/L的血液样品；

将唾液酸电化学试纸，置于多参数分析仪中并在唾液酸电化学试纸的工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

用吸管取血液样品接触所述唾液酸电化学试纸的采样口，血液通过虹吸导样槽自动吸取约2μL样品，经过前处理区水解部分结合唾液酸，到达反应区与酶反应膜中试剂反应形成电流，在多参数分析仪上可快速检测出与唾液酸浓度相对应的电流值；

以唾液酸的浓度值为横坐标，电流值为纵坐标，绘制出唾液酸浓度与电流值的线性关系图；

二、测量被测样品的唾液酸浓度值：

将唾液酸电化学试纸，置于多参数分析仪中并在唾液酸电化学试纸的工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

用吸管取被测样品接触所述唾液酸电化学试纸的采样口，被测样品血液通过虹吸导样槽自动吸取约2μL样品，在多参数分析仪上检测出与被测样品唾液酸浓度相对应的电流值；

该电流值对应的唾液酸浓度可直接从上述线性关系图上得出，从而得到被测样品的唾液酸浓度值。

用上述步骤定标后，将得到的线性曲线输入到多参数分析仪的存储设备中；被测样品的唾液酸浓度可以直接从多参数分析仪中读出。

本发明电化学生物传感器检测唾液酸原理如下：

本发明所述的唾液酸试纸，是一种利用电子介体及酶反应系统分析样品中唾液酸浓度的电流型电化学生物传感器。该唾液酸试纸具有较高的灵敏度及较宽的线性范围，因此能快速的检测生物液体比如血液中唾液酸浓度。

同时，本发明的唾液酸试纸在酶反应膜前设置酸水解分解结合唾液酸的前处理层，样品进入前处理层，其中的结合唾液酸被酸水解大部分，酸水解后的样品到达反应层时，酶层中的神经氨酸苷酶进一步分解在前处理层未分解的唾液酸，使样品中的结合唾液酸分解的更完全速度更快，由于前反应区已经使大部分结合唾液酸分解为游离唾液酸，因此，但酸水解后的样品进入到反应区，其中游离的唾液酸即可直接进行氧化还原反应，从而提高反应速度使灵敏度得到提高。

本发明的另一目的，是提供一种唾液酸电化学检测方法，其对样品中的唾液酸进行测定，该方法包括：将样品注入唾液酸试纸中，样品中结合唾液酸经过前处理层的酸水解及酶反应膜的酶分解后变成游离唾液酸，游离唾液酸与酶反应膜中生物试剂反应产生微弱电流，由多参数分析仪读出唾液酸浓度。

测试样品溶液经过唾液酸试纸前处理层，进入覆盖有反应层的电化学电极反应区，与电子介体或电子介体及氧化还原酶等进行反应。

本发明提高唾液酸测量准确度和实现快速检测的方法在于，样品经虹吸导样槽经过前处理区进入反应区与反应膜中的试剂反应形成电流，在电化学生物传感器检测系统上可快速检测出唾液酸浓度。

血液样品中唾液酸来源于细胞表面，以糖结合唾液酸和脂结合唾液酸两种形式存在。水解是一种使结合唾液酸释放成游离唾液酸的有效方法,但释放和破坏之间的平衡应达到最优化。采用唾液酸苷酶来酶解可以避免损失。然而,仅用唾液酸苷酶处理不可能从样品中释放所有的唾液酸。因此,酸处理可能在优化神经氨酸酶处理的方法方面提供更好的解决方法。在O-乙酰基团已经被去除和酶具有广泛的连接特异性的条件下,神经氨酸酶处理可能为样品唾液酸含量提供一个准确的评价。

目前未见用于家庭及个人检测使用的快速床边检测唾液酸方法及检测试纸报道。为了解决检测灵敏度问题，本发明人经过深入研究完成此发明。与现有技术相比，本发明所述的唾液酸检测方法，由于酶反应膜前设置有酸水解结合唾液酸为游离唾液酸的前处理层，加快了反应层中的酶解速度，从而大大提高了电化学生化传感器检测唾液酸反应时间及灵敏度，实现电化学生物传感器检测临床样品中的唾液酸含量。电化学生化传感器检测唾液酸，保持快速检测优点的同时，也使大规模生产及低检测成本得以实现。该唾液酸试纸与唾液酸分析仪配套使用，可以实时以数字定量显示唾液酸测试结果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中：

图1为本发明实施例中唾液酸试纸的结构分解示意图；

图2为本发明实施例中唾液酸试纸设置有样品前处理层测试血液唾液酸浓度-电流曲线和比较例中唾液酸试纸未设置有样品前处理层测试血液唾液酸浓度-电流曲线比较图。

图中标示：1.绝缘基片 2-1.工作电极 2-2.参比电极 2-3.短路电极 3.绝缘隔离层 4.酶反应膜 5.前处理层 6.虹吸导样槽 7.采样口 8.粘合隔片 9.导气孔。

具体实施方式

参照图1所示，一种唾液酸电化学试纸，包括

绝缘基片1；

导电电极，所述导电电极包括设置在绝缘基片上的三条条状导电电极，分别为工作电极2-1、参比电极2-2和短路电极2-3，其中设置在导电电极传导区一端的短路电极2-3与工作电极2-1或参比电极2-2相接；

绝缘隔离层3，所述绝缘隔离层3局部覆盖于导电电极上，绝缘隔离层3的一端露出导电电极的反应区，另一端露出导电电极的传导区；

反应层，所述反应层为酶反应膜4，所述酶反应膜4覆盖于反应区的参比电极2-2及工作电极2-1表面，位于绝缘隔离层3的反应区端；

前处理层5，所述前处理层5设置在反应层的前端，覆盖于反应区的参比电极2-2及工作电极2-1表面；

虹吸导样槽6，所述反应层和前处理层5设置在虹吸导样槽6内；虹吸导样槽6的前端为采样口7；

粘合隔片8，所述粘合隔片8与绝缘隔离层3、前处理层5、反应层和虹吸导样槽6的上端面叠接；

所述酶反应膜4包括与唾液酸反应的酶和一种电子传递介体，所述酶为神经氨酸苷酶、神经氨酸醛缩酶、酮胺氧化酶或过氧化物酶中的一种或组合，其中，神经氨酸苷酶含量为1％-3％、神经氨酸醛缩酶含量为0.1％-1％、酮胺氧化酶含量为0.5％-2％，过氧化物酶0.5％-2％；所述电子传递介体为亚铁氰化钾，含量为3％(m/m)-10％(m/m)；

所述前处理层5的浆液中含有唾液酸水解剂，所述唾液酸水解剂含量为2.0％-8.5％。

所述虹吸导样槽6的后端与绝缘隔离层3之间形成与外界相通的导气孔9，所述的采样口7、虹吸导样槽6和导气孔9三者相互连通。

所述酶反应膜4还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂，所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液或柠檬酸缓冲液；所述粘合剂采用淀粉、糊精、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述表面活性剂为TritonX-100或TW-20。

所述唾液酸水解剂为pH值低于2的非挥发性酸，所述非挥发性酸包括磺基水杨酸、3-羧基苯磺酸中的一种或组合。

所述前处理层5的浆液纵还包括粘合剂及表面活性剂，所述粘合剂包括羧甲基纤维素，其重量百分比为1％；所述表面活性剂包括TritonX-100，其重量百分比为0.1％。

本文中所说的绝缘基片1，系指具有平直的表面及电绝缘特性的薄层片。根据本发明的一较佳实施，该绝缘基片为PC或PET片。

本文中所说的电极系统，系指包括至少有二条分离且互不相接触的电极，分别形成工作电极2-1和参比电极2-2。根据本发明的一较佳实施，电极系统系以电绝缘层局部覆盖，使裸露于电绝缘隔离层一端，分别形成工作电极2-1和参比电极2-2与电化学电极反应区相连，而另一端则形成工作电极2-1和参比电极2-2的接头，可与检测样品在电化学反应时产生电效应的检测装置相连。较佳地，该电极系统的材料可选用适合网版印刷的导电性浆状材质，包括但不限于碳胶、金胶、银胶、碳银混合胶、挥发性石墨或铜胶或其组合(例如以网印先印银胶后再印碳胶)，或其它任何适合网版印刷的导电性浆状材料。

本文中所说的绝缘隔离层3，系指以具有电绝缘性质的材质所形成的薄层。较佳地，该电绝缘隔离层3的材料可选用适合网版印刷的电绝缘性浆状材质或电绝缘性胶带，例如热干燥型或紫外光干燥型的绝缘漆，或PVC或PET材质的绝缘胶带。较佳地，该电绝缘层具有厚度为0.1至0.25毫米。

根据本发明的一较佳实施，该电绝缘隔离层3局部覆盖于绝缘基片1上的电极系统，使得在未覆盖绝缘隔离层3所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区及导气孔9。

本文中所说的反应层，系指位于上述电化学电极反应区，含有与被测物质反应的生物试剂。反应层中包括与被测物质反应的酶和一种电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂的调配物薄层。较佳地，该调配物可以涂覆或滴加的方式加至该反应层后，于60℃下干燥。

本文中所说检测唾液酸浓度所选用的酶为神经氨酸苷酶、神经氨酸醛缩酶、酮胺氧化酶、过氧化物酶。

本文中所说的电子介体，系指可与经前述氧化还原酶作用所产生的物质反应后，本身可由氧化状态还原成还原状态得物质。当电子介体变成还原状态时，可藉由施加一外加电压于电极试纸上，促使电子介体由还原状态逆反应恢复为氧化状态，此时化学反应的电位、电阻或电流变化，可由电极系统的工作电极与参比电极传导至电极系统另一端的接头。当此接头与一讯号接收装置连接时，可将前述化学反应的电位、电阻或电流变化接收，并藉由一显示装置将讯号转换成检测标的物的浓度。电子传递介体为亚铁氰化钾。较佳地，该电子介体的含量为3％(m/m)至10％(m/m)。

本文中所说的缓冲液、粘合剂及表面活性剂，系指可助于氧化还原酶及电子介体干燥后附着于绝缘基片上的物质，或可保护氧化还原的物质。所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液组成的组中的一种；所述粘合剂采用淀粉、糊精、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述表面活性剂为TritonX-100、TW-20。将酶反应膜固定到电极上的方法可以是吸附法、交联法、溶胶-凝胶法、粘合剂法等。

本发明的一个较优实例的唾液酸试纸显示在图1，图1是唾液酸试纸的结构示意图。本发明的唾液酸试纸包括绝缘基片1，绝缘基片1上设置有三条条状导电电极，分别为工作电极2-1、参比电极2-2和短路电极2-3，其中的短路电极2-3与工作电极2-1或参比电极2-2相接，在导电电极的上部分设置有绝缘隔离层3，以使导电电极前端的电极传导部裸露在外。短路电极2-3用于感测到有被测样品存在而启动测量仪器；所有电极可以采用丝网印刷技术或溅射技术制备。

酶反应膜4覆盖于参比电极2-2及工作电极2-1表面；酶反应膜4含有与被测物质反应的生物试剂包括与被测物质反应的酶和一种电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂；酶与唾液酸反应而得到电子并转移给电子传递媒体，电子传递媒体在电极表面发生氧化而产生电流，仪器检测所产生的电流并换算出唾液酸的浓度。

在酶反应膜4前端粘贴有前处理层5；前处理层5含有能使前处理层pH值低于2的酸，并且酸是非挥发性的。这样的酸包括磺基水杨酸、3-羧基苯磺酸。前处理层5同时还含有粘合剂及表面活性剂。

在所述的绝缘隔离层3的上方设有一粘合隔片8，该隔片与绝缘隔离层3上及酶反应膜4的相应位置处开设有条形的虹吸导样槽6，该虹吸导样槽6靠近电极传导部的一端开设有一导气孔9，以作血样在进入虹吸导样槽6时排出气体用，该导气孔9为条形槽，贯穿粘合隔片8的窄端；该虹吸导样槽6远离电极传导部的一端开设有一采样口7，所述的采样口7、虹吸导样槽6和导气孔9三者相互连通；

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明实施例做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。任何熟悉此项技术的人士可轻易做到的修饰及改变均包含于本案所附申请专利权利要求的范围内。

实施例1：

本实施例提供一唾液酸试纸的制备实例，从而说明本发明的唾液酸试纸及制备方法。

首先，采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料基片即绝缘基片1上制作工作电极2-1、参比电极2-2和短路电极2-3，采用由Acheson公司购买的导电碳墨制作，通过丝网印刷将导电油墨在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到80℃烘箱中烘干60min；

其次，采用丝网印刷技术在印好电极系统的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘隔离层3，绝缘漆由Acheson公司购买，通过丝网印刷将绝缘漆在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到紫外烘干机烘干1分钟；

接着，用点酶机在电极表面固定酶反应膜4用于血液唾液酸的检测，所取酶反应液的各组分及其重量百分比见表1：

表1

材料	重量(w/v)
		神经氨酸苷酶	1.5％
神经氨酸醛缩酶	0.5％
		酮胺氧化酶	1.0％
过氧化物酶	0.8％
		亚铁氰化钾	5.0％
羧甲基纤维素	1.0％
		柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)	90.0％
吐温-20	0.2％

取4μL酶反应液滴加到电极表面，50℃烘干20min，备用；

接着，用点酶机在前处理区表面固定前处理层5用于对样品中的结合唾液酸进行水解，所取前处理层浆液的各组分及其重量百分比见表2：

表2

材料	重量(w/v)
		磺基水杨酸	3.5％
羧甲基纤维素	1％
		3-羧基苯磺酸	3％
TritonX-100	0.1％
		水	92.4％

取4μL前处理层浆液滴加到前处理区绝缘基片表面，50℃烘干20min，备用；

前处理层浆液固定后，用粘合隔片将表面封装片、PET基片粘合，粘合隔片上设有开槽，对应于电极反应区域，及暴露电极上有酶反应试剂的一端，以及参比电极2-2和短路电极2-3，PET基片、粘合隔片8和表面封装片组成虹吸导样槽6及采样口7。

比较例1：

本比较例制备唾液酸试纸，除了前处理层5不滴加前处理层浆液外，其它与实施例1相同。

实施例2：

本实施例举例说明唾液酸浓度与电流线性关系，以及使用实施例1制备的唾液酸试纸构建定标曲线方法。

收集压积比为45％的新鲜血液，配制唾液酸浓度为0.5，1.0，1.5，3.0，5.0和7.0mmol/L的血液样品，将实施例1制备的唾液酸试纸，置于多参数分析仪中并在工作电极2-1和参比电极2-2两端施加300mV工作电压；用吸管取血液接触采样口7，血液通过虹吸导样槽6自动吸取约2μL样品，经过前处理层5水解部分结合唾液酸，到达反应区与酶反应膜4中试剂反应形成电流，在多参数分析仪上可快速检测出与唾液酸浓度相对应的电流，以唾液酸的浓度值为横坐标，多参数分析仪检测出的电流值为纵坐标，绘制出唾液酸浓度与电流值的线性关系图，唾液酸浓度与电流的线性关系见图2。

用上述方法定标后，将得到的线性曲线输入到配套多参数分析仪的存储设备中，未知样品的唾液酸浓度可以直接从配套多参数分析仪中读出。

比较例2：

本比较例举例说明唾液酸浓度与电流线性关系，以及使用比较例1制备的唾液酸试纸构建定标曲线方法。构建定标曲线的方法，除了使用的定标试纸是比较例1制备的唾液酸试纸外，其它与实施例2相同。唾液酸浓度与电流的线性关系见图2。

从图2可以看出，用实施例1制作的唾液酸试纸定标所得曲线的斜率比用比较例1制作的唾液酸试纸定标所得曲线的斜率大很多，也就是说实施例1制作得到的试纸测试唾液酸灵敏度大大提高了。而比较例1制作的唾液酸试纸无法区分高低浓度唾液酸样品。

由以上可知，本发明的唾液酸试纸在试纸上设置有前处理层5，对检测样品先通过酸水解使大部分结合唾液酸分解为游离唾液酸，当样品到达反应区后，未分解的部分结合唾液酸继续被酶反应层中的酶分解，在前处理层5分解得到的游离唾液酸到达反应区后可快速反应，大大的提高了检测灵敏度。不但反应速度快了，通过设置前处理层5，前处理层5对样品的水解，使结合唾液酸的分解更加完全彻底，避免单单通过酶在反应区分解结合唾液酸不完全且速度慢导致测试不准确问题。本发明的检测唾液酸试纸能快速、简便的检测唾液酸含量，灵敏度高、准确、可靠，且试纸的制作方法简单，适合大批量生产。

以上举例仅为举例性，并非限制性。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改和变更，包含但不限定将本发明实施例中所述原件以软体或硬体或韧体或其任何组合，均应包含于本发明的权利范围内。

Claims (7)

1.一种唾液酸电化学试纸，其特征在于，包括

绝缘基片；

导电电极，所述导电电极包括设置在绝缘基片上的三条条状导电电极，分别为工作电极、参比电极和短路电极，其中设置在导电电极传导区一端的短路电极与工作电极或参比电极相接；

绝缘隔离层，所述绝缘隔离层局部覆盖于导电电极上，绝缘隔离层的一端露出导电电极的反应区，另一端露出导电电极的传导区；

反应层，所述反应层为酶反应膜，所述酶反应膜覆盖于反应区的参比电极及工作电极表面，位于绝缘隔离层的反应区端；

前处理层，所述前处理层设置在反应层的前端，覆盖于反应区的参比电极及工作电极表面；

虹吸导样槽，所述反应层和前处理层设置在虹吸导样槽内；虹吸导样槽的前端为采样口；

粘合隔片，所述粘合隔片与绝缘隔离层、前处理层、反应层和虹吸导样槽的上端面叠接；

所述酶反应膜包括与唾液酸反应的酶和一种电子传递介体，所述酶为神经氨酸苷酶、神经氨酸醛缩酶、酮胺氧化酶或过氧化物酶中的一种或组合，其中，神经氨酸苷酶含量为1％-3％、神经氨酸醛缩酶含量为0.1％-1％、酮胺氧化酶含量为0.5％-2％，过氧化物酶0.5％-2％；所述电子传递介体为亚铁氰化钾，含量为3％(m/m)-10％(m/m)；

所述前处理层的浆液中含有唾液酸水解剂，所述唾液酸水解剂含量为2.0％-8.5％。

2.根据权利要求1所述的唾液酸电化学试纸，其特征在于，所述虹吸导样槽的后端与绝缘隔离层之间形成与外界相通的导气孔，所述的采样口、虹吸导样槽和导气孔三者相互连通。

3.根据权利要求1所述的唾液酸电化学试纸，其特征在于，所述酶反应膜还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂，所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液或柠檬酸缓冲液；所述粘合剂采用淀粉、糊精、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述表面活性剂为TritonX-100或TW-20。

4.根据权利要求1所述的唾液酸电化学试纸，其特征在于，所述唾液酸水解剂为pH值低于2的非挥发性酸，所述非挥发性酸包括磺基水杨酸、3-羧基苯磺酸中的一种或组合。

5.根据权利要求1所述的唾液酸电化学试纸，其特征在于，所述前处理层的浆液纵还包括粘合剂及表面活性剂，所述粘合剂包括羧甲基纤维素，其重量百分比为1％；所述表面活性剂包括TritonX-100，其重量百分比为0.1％。

6.权利要求1-5任一项所述的唾液酸电化学试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料基片上制作工作电极、参比电极和短路电极，通过丝网印刷将导电油墨在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到80℃烘箱中烘干60min；

2)采用丝网印刷技术在印好电极系统的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘隔离层，通过丝网印刷将绝缘漆在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到紫外烘干机烘干1分钟；

3)用点酶机在电极表面固定酶反应膜用于血液唾液酸的检测，所取酶反应液的各组分及其重量百分比见表1：

表1

材料 重量(w/v) 神经氨酸苷酶 1.5％ 神经氨酸醛缩酶 0.5％ 酮胺氧化酶 1.0％ 过氧化物酶 0.8％ 亚铁氰化钾 5.0％ 羧甲基纤维素 1.0％ 柠檬酸缓冲液(pH＝6.0) 90.0％ 吐温-20 0.2％

取4μL酶反应液滴加到电极表面，50℃烘干20min，备用；

4)用点酶机在前处理区表面固定前处理层用于对样品中的结合唾液酸进行水解，所取前处理层浆液的各组分及其重量百分比见表2：

表2

材料 重量(w/v) 磺基水杨酸 3.5％ 羧甲基纤维素 1％ 3-羧基苯磺酸 3％ TritonX-100 0.1％ 水 92.4％

取4μL前处理层浆液滴加到前处理区绝缘基片表面，50℃烘干20min，备用；

5)前处理层浆液固定后，用粘合隔片将表面封装片、PET基片粘合，粘合隔片上设有开槽，对应于电极反应区域，及暴露电极上有酶反应试剂的一端，以及参比电极和短路电极，PET基片、粘合隔片和表面封装片组成虹吸导样槽及采样口。

7.一种唾液酸电化学检测方法，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的唾液酸电化学试纸，所述方法包括如下步骤：

一、制作线性曲线图：

收集压积比为45％的新鲜血液，配制唾液酸浓度为0.5，1.0，1.5，3.0，5.0和7.0mmol/L的血液样品；

将唾液酸电化学试纸，置于多参数分析仪中并在唾液酸电化学试纸的工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

用吸管取血液样品接触所述唾液酸电化学试纸的采样口，血液通过虹吸导样槽自动吸取约2μL样品，在多参数分析仪上可快速检测出与唾液酸浓度相对应的电流值；

以唾液酸的浓度值为横坐标，电流值为纵坐标，绘制出唾液酸浓度与电流值的线性关系图；

二、测量被测样品的唾液酸浓度值：

将唾液酸电化学试纸，置于多参数分析仪中并在唾液酸电化学试纸的工作电极和参比电极两端施加300mV工作电压；

用吸管取被测样品接触所述唾液酸电化学试纸的采样口，被测样品血液通过虹吸导样槽自动吸取约2μL样品，在多参数分析仪上检测出与被测样品唾液酸浓度相对应的电流值；

该电流值对应的唾液酸浓度可直接从上述线性关系图上得出，从而得到被测样品的唾液酸浓度值。