CN115855924A

CN115855924A - 气道一氧化氮快速检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN115855924A
Application number: CN202211545905.8A
Authority: CN
Inventors: 徐逸丽; 陈燃
Original assignee: Zhejiang Jfk Biological Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Jfk Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明提供了一种气道一氧化氮快速检测方法及试剂盒。该方法过程为在清水漱口后，喝一口水，拍打前胸10次，深呼吸5次，用力咳6次，再将口内液体吐出收集后，与样本稀释液混合，再以固定有指示剂的试纸条吸滤测定样本溶出的亚硝酸盐，检测区显示紫红色为阳性结果，指示样本中亚硝酸盐含量达到或超过检测阈值，气道一氧化氮水平较高。本发明方法可在5分钟内完成检测，便利易用，操作过程及所用试剂均属常规，安全无创。基于本发明方法的试剂盒生产工艺简单，产品可长期存放和便于携带使用，使用后可密封处理保护环境，适用于气道粘液样本快速收集和气道一氧化氮即时检测(POCT)。

Description

气道一氧化氮快速检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种简便易用的气道一氧化氮快速检测方法及检测试剂盒。

背景技术

一氧化氮(NO)是一种气体状态下半衰期仅约3秒的脂溶性小分子自由基，可以自由透过细胞膜扩散，在人体内发挥着重要的生理调控功能。1991年首次证实呼出气存在内源性NO。人体的NO是在细胞一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸氧化脱氨基转化为瓜氨酸的过程中产生。鸟苷酸环化酶(sGC)是NO的主要作用靶点。NO结合激活sGC，致使细胞cGMP水平升高，进而引发一系列的生理效应。NOS有3种亚型，分别是神经元型(nNOS)、内皮细胞型(eNOS)、诱导型(iNOS)。nNOS和eNOS通常呈组成型表达于各器官组织，活性较低，受Ca²⁺、磷酸化和乙酰化等机制调控，产生低浓度的NO，参与调节多种基础生理病理过程，如平滑肌松弛、血管舒张、血浆渗出、血流调节、纤毛搏动频率、黏液分泌、神经传递和细胞免疫等。iNOS表达受炎症因子和各种刺激因素诱导，活性远高于nNOS和eNOS，不依赖于Ca²⁺，能够催化产生应激性高浓度NO，参与多种疾病和免疫过程。

iNOS来源的气道NO在呼吸系统疾病中发挥着重要作用。iNOS通常仅少量表达于气道上皮，而在炎症条件下显著表达上调，产生大量病理性NO，一方面具有抗感染的作用，另一方面，过量的NO也会介导促进气道炎症反应，造成细胞和组织损伤。气道NO检测尤其在哮喘研究中得到了重点关注。哮喘是一种以持续存在的慢性气道炎症及气道高反应性为特征的慢性肺病。2019年《柳叶刀》发文指出，中国哮喘疾病现状严峻，总患病率已达4.2％，患者数量约有4570万人；然而，71.2％的患者从未被专业诊断，仅有23.4％的患者进行过肺功能检查，高达94.4％的患者未接受过规范的吸入糖皮质激素治疗。造成这些现状的重要原因在于哮喘发病的隐蔽性和可逆性以及肺功能检查安全便利性的不足。哮喘大部分平时无症状，只有当遇到诱发因素时呈发作性加重，而诱发因素排除后又能回复正常，患者易轻视和怕麻烦而不就诊。肺功能检查干扰因素多，专业性强，效率偏低，不易普及，其中，支气管激发试验还存在刺激性和安全风险，不利于筛查和监测应用。在加强相关宣传教育的同时，提供安全无创、便利易用的体检早筛和监测工具是扭转哮喘严峻局面的关键。嗜酸性粒细胞在气道组织中的聚集活化是评价哮喘气道炎症和评估糖皮质激素治疗的重要指标。气道NO水平与气道嗜酸性粒细胞炎症及气道高反应(AHR)密切相关，可用于指示哮喘气道炎症变化和评估糖皮质激素治疗。研究显示，哮喘患者气道NO含量可达健康人群的2-5倍，在气道嗜酸性粒细胞炎症筛查和糖皮质激素治疗有效性预测等方面，气道NO检测的敏感性优于诱导痰嗜酸性粒细胞检测或肺功能检查。通过发展简便快速的气道NO检测方法和产品，有望为哮喘体检早筛和监测提供有力的普及工具。

现有的NO检测方法主要有吸光度法(比色法)、荧光探针法、化学发光法(鲁米诺法)、传感器法(电化学/光学)等。这些方法都存在专业性强、难以实现即时快检(POCT)而不利于普及的缺点。气道NO检测方法主要有诱导痰吸光度法和呼出气传感器法2种。吸光度法，例如：专利申请号201811580528.5《一种一氧化氮检测方法及其应用》和专利申请号202010901322.9《一种一氧化氮检测试剂盒及检测方法》所示的方法，需经过专业训练使用微量移液器和分光光度计等专业仪器设备进行精确定量操作，不能实现POCT。诱导痰测定还存在取样有刺激性和安全风险，标本量波动大、处理过程复杂而难以标准化等缺点，已逐渐被呼出气传感器法测定所取代。呼出气传感器法测定即呼出气一氧化氮(FeNO)检测，在临床上已得到较多应用，但受限于NO气体半衰期很短和气道NO绝大部分转化为亚硝酸盐(NO₂ ^-)存在于气道粘(黏)液中而非呼出气中的特性，存在干扰因素多、性能波动大、对非急性发作期患者检测的敏感性较低、需专业设备和专业指导等检测性能和便利性的不足：FeNO检测操作和质控过程复杂，受试者的理解配合程度、口腔压力、肺体积、呼出气体流速波动、仪器型号厂家等因素都会造成所测FeNO水平存在较大差异，不仅依赖于专业设备设施和专业操作指导质控，还需要进行专门的消毒步骤以避免交叉污染。这些因素严重阻碍了气道NO检测在哮喘体检早筛和患者居家/社区监测等场景的普及应用。

发明内容

综上所述，目前缺少一种可在居家、社区或体检等非医疗专业场景下使用的气道NO快速检测方法及产品。为此，本发明提供了一种安全无创、便利易用、性能可靠、可进行即时检测的气道NO检测方法及试剂盒。

本发明技术方案：

本发明建立用于气道NO快速检测的主动深咳气道粘(黏)液取样及亚硝酸盐吸滤显色定性测定方法。气道粘液是一种覆盖于气道内表面的体液和凝胶状保护层，主要由气道黏(粘)蛋白、水分和无机盐等成份组成。NO半衰期很短，气道NO绝大部分转化为亚硝酸盐溶解并相对稳定地存在于气道粘液中，因此，气道粘液中的亚硝酸盐水平可指示气道NO水平。用户通过本发明提供的主动深咳方法采集气道粘液样本，收集到取样管中，与由适量的盐酸苯胺、乙酸、硫酸铜、氯化钠水溶液组成的样本稀释液混合，再接触固定有适量的1-萘胺盐酸盐、壳聚糖季铵盐和乙酸检测区的试纸条，观察试纸条检测区的颜色变化。亚硝酸盐和盐酸苯胺在酸性条件下反应生成重氮化合物，随液体上行与1-萘胺盐酸盐进行偶合反应，产生不溶性产物呈现紫红色，指示样本中亚硝酸盐水平达到或超过检测阈值，气道NO水平有异常升高。壳聚糖季铵盐促进反应生成的紫红色产物凝聚在检测区，使得结果更加清晰可读。体系中的乙酸和氯化钠分别提供反应所需的酸性pH值和离子强度，硫酸铜有利于排除样本稀释过程中一些还原性物质的干扰。

具体的，本发明提供的主动深咳气道粘液取样方法为：清水漱口后，喝一口水，以双手拍打前胸10次，深呼吸5次，再用力咳6次，然后，将口腔中聚集的液体吐入取样管中。以本方法采集到的样本体积通常为1-2ml。

具体的，本发明提供的样本稀释液的组成为：5-100mM盐酸苯胺、1％-5％(v/v)乙酸、1-5mM硫酸铜、100-180mM氯化钠混合溶液。

具体的，样本稀释液的使用体积为4ml，其与样本的体积比通常为4:1-2:1。

具体的，本发明提供的试纸条的制备工艺为：在适合大小的滤纸条下端适合位置，标记为检测区，滴加1-2μl/mm的1mM-1.5mM 1-萘胺盐酸盐、3％-10％(w/v)壳聚糖季铵盐、0.1％-0.2％(v/v)乙酸混合水溶液，在检测区上方7-15mm处，标记为质控区，滴加1-2μl/mm的3-8mM中性红、3-8mM碳酸钠混合水溶液，再以60℃30分钟干燥处理。

具体的，本发明一种实施方式中，所述气道NO检测方法，具体操作步骤为：将待测样本置于取样管中，加入样本稀释液，充分摇晃混合均匀，将试纸条下端浸入混合液中接近但不达到检测区，然后静置约30秒，观察检测区的颜色变化，呈现紫红色指示样本中亚硝酸盐达到或超过1.0mM，气道NO水平异常升高；否则，为阴性结果。

基于上述发明方法，本发明提供的气道NO检测试剂盒由整合有指示槽的取样管(含底座)、管盖、样本稀释液和固定有指示剂的试纸条组成。

具体的，本发明提供的试剂盒的取样管为可用管盖盖紧密闭、带有底座的透明磨砂硬塑料管，一侧附有中空且底部与管体内部联通的指示槽，槽内置试纸条。试纸条为核心组分，由固定有检测区和质控区的滤纸条及塑料背板组成。其滤纸条制备工艺为：在大小为50mm×5mm×0.7mm(长度×宽度×厚度)的滤纸条距下端21mm处，标记好检测区，滴加5μl的1.1mM 1-萘胺盐酸盐、5％壳聚糖季铵盐、0.1％乙酸溶液；在检测区上方12mm处(距底端33mm处)，标记好质控区，滴加5μl的5mM中性红、5mM碳酸钠溶液，再以60℃30分钟干燥处理。

具体的，本发明提供的试剂盒的管盖可与取样管适配旋紧，管盖内设容积为5ml的腔室，以可被刺破的密封膜密封装载有4ml的样本稀释液。

具体的，本发明提供的试剂盒的样本稀释液的组成为：15mM盐酸苯胺、2.5％(v/v)乙酸、1mM硫酸铜、140mM氯化钠。

具体的，本发明提供的试剂盒以亚硝酸盐计的检测限为1.0mM，比100例健康志愿者气道粘液样本中亚硝酸盐浓度的上限高至少20％，因此，能保证对健康志愿者检测的假阳性率＜1％。

具体的，本发明提供的试剂盒操作步骤为：1、清水漱口后，以双手拍打前胸10次，深呼吸5次，用力咳6次；2、把口腔内液体吐入取样管中；3、盖上管盖并拧紧，摇晃约10s，使得样本与试剂混合均匀；4、静置3分钟后，观察并比对结果。QC窗(质控区)显紫红色，指示操作正确，结果有效；AS窗(检测区)显紫红色，为阳性结果(+)，指示气道NO水平异常升高，提示哮喘相关气道炎症风险，建议前往医院接受深入诊疗。

本发明的原理基于相互关联的3个层次是：1)通过本发明提供的漱口-拍打深呼吸促进气道活跃-深咳的步骤，能咳出并收集到可供检测的气道粘液样本，体积通常在1-2ml。2)NO半衰期很短，气体状态下仅约3秒，在水溶液中也只有约500秒，气道NO绝大部分被快速氧化生成亚硝酸盐而相对稳定地存在于气道粘液中，因此，通过测定气道粘液样本中亚硝酸盐而间接指示气道NO比直接测定NO更为灵敏准确可靠。在本发明确定的乙酸、硫酸铜、盐酸苯胺和壳聚糖季铵盐组合条件下，亚硝酸盐可以和盐酸苯胺快速反应生成不稳定的重氮化合物，随液体上行与试纸条上1-萘胺盐酸盐进行偶联反应，产生不溶于水的紫红色偶氮化合物，并凝聚显示在试纸条检测区。3)本发明提供的试纸吸滤显色定性检测系统，通过优化使用合适浓度的乙酸、硫酸铜、盐酸苯胺和壳聚糖季铵盐，不仅能克服常规Greiss比色法的可溶性产物在试纸上迅速扩散而不能定性显色的局限，能屏蔽正常气道粘液样本中的亚硝酸盐本底，而且，还能排除样本中可能存在的还原性物质的干扰，使得显色结果能够灵敏特异指示气道NO的异常升高。

本发明的主要发明点和有益效果：

1)标准化的取样方法。本发明以首创的标准化取样方法采集气道粘液样本，既非采集唾液或口水，也非采集痰液。唾液或口水取样只能直接指示口腔内环境的变化或基于其部分成分源于血液渗透而能间接指示全身系统性变化，但并非特异指示源于气道NO的变化。痰液源于肺呼吸道，能指示源于气道NO的变化，但咳痰属于机会行为而难以标准化取样且样本黏稠难以处理，不利于POCT。本发明的气道粘液取样方法，无需等候咳痰，在以漱口步骤排除痰液和唾液，通过标准化的漱口-喝水-拍打-深呼吸-用力咳的步骤，促进气道活跃，能咳出并收集到可供检测的气道粘液样本，通过无创取样特异指示气道NO的变化。

2)加速反应生成利于定性观察、不溶于水的紫红色偶氮化合物。常规Greiss比色法检测所生成的可溶性红色产物在试纸上迅速扩散，不能定性显色，而亚硝酸盐和盐酸苯胺在常规的盐酸条件下反应速度较慢，易受还原性物质的干扰，不利于POCT。本发明确定了在乙酸、硫酸铜、盐酸苯胺和壳聚糖季铵盐的组合条件下，由不低于1mM浓度的亚硝酸盐启动产生不溶于水的紫红色偶氮化合物的偶联反应可以在常温下3分钟之内完成，结果凝聚显示在试纸条检测区，利于定性观察，成功建立POCT检测。

3)本发明提供的试纸吸滤显色定性检测系统，通过优化使用合适浓度的乙酸、硫酸铜、盐酸苯胺和壳聚糖季铵盐，能完全屏蔽正常气道粘液样本中的亚硝酸盐本底，能排除样本中可能存在的还原性物质的干扰，使得显色结果能够灵敏特异指示气道NO的异常升高。

4)本发明提供的试剂盒配方设计，具有较大缓冲容错空间，能容许取样体积常规浮动，使得不必精确计量取样体积，有利于POCT。

5)本发明提供的气道NO检测方法及试剂盒，只需进行简单的4步操作，可在3～5分钟内完成，结果直观易判读；所用试剂材料无毒无刺激性，取样和操作过程安全无创，检测全程可由用户自行完成，一次性使用，杜绝交叉传染风险，具备安全无创、便利易用、性能可靠、快速及时等优点，具备良好的用户依从性。

6)本发明试剂盒生产工艺规范可标准化，成本较低，成品体积小，可常温储藏，便于运输及携带使用，利于普及推广。

7)本发明克服了诱导痰吸光度法存在的取样具刺激性安全风险、标本采集和处理过程复杂而难以标准化等缺点，也克服了FeNO法受限于NO气体半衰期很短而对非急性发作期患者的检测敏感性较低和需专业质控指导和专门消毒等性能和便利性的不足。本发明与2种经典方法比对总结如表1所示。

表1本发明与诱导痰吸光度法及FeNO法比对

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1试纸条和检测结果示意图。

图2试纸条成品以及检测结果实拍图。。

图3管盖的俯视图。

图4试剂盒一体化设计示意图。

图5试剂盒成品以及检测结果实拍图。

1：取样管；2：管盖；3：指示槽；4：底座；6：尖锐突起；32：试纸条；33：检测窗(AS窗)；34：质控窗(QC窗)；41：样本稀释液与样本混合物；321：检测区，1-萘胺盐酸盐-壳聚糖季铵盐条带；322：质控区，中性红-碳酸钠条带。

具体实施方式

以下以具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。本文所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。

实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规手段。

实施例中所采用的试剂，如无特别说明，均为市场购买得到。

图1为试纸条和检测结果示意图。本实施例的试纸条32上设有321检测区，固定有1-萘胺盐酸盐和壳聚糖季铵盐，检测操作完成后，在该区内显现紫红色指示样本为阳性；322质控区，固定有中性红和碳酸钠，检测操作完成后，该区显示明显的紫红色，说明操作正确，结果可靠。

图2为试纸条成品和检测结果实拍图，图示说明同上。

图3－图5所示，根据本发明方法建立的一种气道NO快速检测试剂盒，主要包括取样管1(含底座4)、管盖2、内置试纸条的指示槽3。

本发明实施例中取样管1为磨砂ABS管，可旋紧密封，口径：25mm高度：90mm，可立，带有管盖2、底座4，底座内有一定斜度的样本导流槽联通管体与指示槽，以利于样本与样本稀释液混合并进入指示槽3。在样本检测完成后，试剂盒整体与样本溶液一起处于盖紧密封状态，避免污染环境及交叉传染。本实施例中，所述取样管1和管盖2通过螺旋固定，螺旋固定较扣盖制作成本小，生产技术成熟，密封性好。

取样管1与指示槽3长度相匹配，指示槽3内固定置有试纸条32，试纸条32的大小根据指示槽的大小来确定，取样管1如图5所示，底座4含有样本稀释液和样本混合物41。

管盖2内有圆柱封存管可密封容纳样本稀释液，旋入管盖过程中可通过取样管1上沿的尖锐突起6刺破封膜使液体落入管底。本实施例中，所述样本稀释液，体积为4ml，组成为15mM盐酸苯胺、2.5％(v/v)乙酸、1mM硫酸铜、140mM氯化钠。

实施例中，指示槽3内置的试纸条32由尺寸(长×宽)为50mm×5mm滤纸条及32mm×5mm背部支撑塑料条组成。滤纸条与塑料条为顶端对齐。在距滤纸条底端21mm处标记为检测区，以移液器枪头均匀滴加一条5mm×5mm 1-萘胺盐酸盐-壳聚糖季铵盐条带，配方为1.1mM1-萘胺盐酸盐、5％(w/v)壳聚糖季铵盐、0.1％(v/v)乙酸溶液，用量5μL；在其上方12mm处标记为质控区，以移液器枪头均匀滴加一条5mm×5mm一条中性红-碳酸钠条带，配方为5mM中性红、5mM碳酸钠溶液，用量5uL。指示槽3向外的一面贴有标签标识检测窗(AS窗)33和质控窗(QC窗)34，位置分别与试纸条检测区和质控区对应。检测操作完成后，QC窗可观察到明显的紫红色，指示操作正确；若样本亚硝酸盐含量大于1mM，AS窗可观察到明显紫红色，指示检测结果为阳性，气道NO水平有异常升高。

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1：气道粘液取样方式的优选确认

气道粘液的特征成分为气道特异表达的黏蛋白MUC5AC或其mRNA。我们募集了30名健康志愿者，进行每日1次连续12日的取样，并采用ELISA法和PCR法检测样本中能否检测到气道粘液特征的黏蛋白MUC5AC或其mRNA。取样方式A为本发明提供的取样方式，取样方式B、C、D分别减少拍打、深呼吸或用力咳次数各1，取样方式E，为不经漱口深咳直接收集口水/唾液样本。ELISA和PCR结果显示，应用本发明的取样方式取样得到的样本，MUC5AC及其mRNA的检出率均达到100％，证明气道粘液样本，取样成功率达到100％；减少拍打或深呼吸或用力咳的次数，都会导致MUC5AC及其mRNA检出率显著下降，不能保证取样成功；而不经漱口直接收集的口水/唾液样本，MUC5AC及其mRNA检出率低于5％，基本不包含气道粘液成分。因此，我们确认本发明提供的取样方法为优选方案，能够保证气道粘液取样成功。具体数据参见下表2。

表2志愿者气道黏蛋白MUC5AC及mRNA检测统计

实施例2：试纸条组分的优选确认

试纸条由尺寸(长×宽)为50mm×5mm滤纸条及32mm×5mm背部支撑塑料条组成。滤纸条与塑料条为顶端对齐。在距滤纸条底端21mm处标记为检测区(A)，以移液器枪头均匀滴加一条5mm×5mm 1-萘胺盐酸盐-壳聚糖季铵盐条带；在其上方12mm处标记为质控区(Q)，以移液器枪头均匀滴加一条5mm×5mm一条中性红-碳酸钠条带。检测区和质控区试剂配方如表3所示，体积均为5μL。样本稀释液的组成为：60mM盐酸苯胺、1.5％(v/v)乙酸、1mM硫酸铜、125mM氯化钠。阴性对照品为纯化水，阳性对照品为1.2mM NaNO₂。检测方法按说明书进行。操作完成后，Q区均可观察到明显的紫红色，指示操作正确；阴性对照品检测区均没有观察到明显紫红色，指示检测结果为阴性；阳性对照品检测区均能观察到明显紫红色，指示检测结果为阳性，因此，在所测试的试剂浓度范围制备的试纸条均能达到符合预期的检测结果(表3)。

表3试纸条组成的对照品测试及统计

实施例3：样本稀释液组成测试

试纸条规格和制备参见说明书正文和实施例2。检测区为滴加5μl的1.1mM 1-萘胺盐酸盐、5％(w/v)壳聚糖季铵盐、0.1％(v/v)乙酸溶液；质控区组成为滴加5μl的5mM中性红、5mM碳酸钠溶液。样本稀释液配方如表4所示。阴性对照品为纯化水，阳性对照品为1.2mMNaNO₂。检测方法按说明书进行。操作完成后，质控区均可观察到明显的紫红色，指示操作正确；阴性对照品检测区均没有观察到明显紫红色，指示检测结果为阴性；阳性对照品检测区均能观察到明显紫红色，指示检测结果为阳性，因此，在所测试的试剂浓度范围制备的样本稀释液均能达到符合预期的检测结果。

表4样本稀释液的组成

编号	样本稀释液组成	备注
			E1	5mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、100mM氯化钠
E2	25mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、100mM氯化钠
			E3	100mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、100mM氯化钠
F1	15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、100mM氯化钠
			F2	15mM盐酸苯胺、3mM硫酸铜、2.5％乙酸、100mM氯化钠
F3	15mM盐酸苯胺、5mM硫酸铜、2.5％乙酸、100mM氯化钠
			G1	15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、1％乙酸、100mM氯化钠
G2	15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、100mM氯化钠
			G3	15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、5％乙酸、100mM氯化钠
H1	15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、120mM氯化钠
			H2	15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、150mM氯化钠
H3	15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％乙酸、180mM氯化钠

实施例4：样本中残留有常见饮品及药物对结果判断的影响

试纸条规格和制备参见说明书正文和实施例2。检测区为滴加5μl的1.1mM 1-萘胺盐酸盐、5％(w/v)壳聚糖季铵盐、0.1％(v/v)乙酸溶液；质控区组成为滴加5μl的5mM中性红、5mM碳酸钠溶液。样本稀释液的组成为：15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％(v/v)乙酸、140mM氯化钠混合水溶液。阴性对照品为纯化水，阳性对照品为1.2mM NaNO₂。检测方法按说明书进行。所测试的干扰物质入表5所示。干扰物质在样本中的含量统一为该物质的常规用量占样本体积的2％，高于该物质常规使用并漱口后的残余量在取样中可能的体积比。每个样本进行3次重复测试，共进行3批试验。结果观察统计表明，操作完成后，质控区均可观察到明显的紫红色，指示操作正确；阴性对照品检测区均没有观察到明显紫红色，指示检测结果为阴性；阳性对照品检测区均能观察到明显紫红色，指示检测结果为阳性，因此，在所测试的浓度范围内，所测试的干扰物质不影响检测结果，即对检测结果没有干扰。

表5干扰物质

编号	干扰物质	备注
			GRWZ01	牛奶
GRWZ02	可乐
			GRWZ03	豆浆
GRWZ04	茶水
			GRWZ05	咖啡
GRWZ06	果汁
			GRWZ07	白酒
GRWZ08	咳嗽药水
			GRWZ09	布洛芬
GRWZ10	阿司匹林
			GRWZ11	先锋霉素
GRWZ12	对乙酰氨基酚
			GRWZ13	沙丁胺醇
GRWZ14	布地奈德
			GRWZ15	沙美特罗替卡松
GRWZ16	噻托溴铵

实施例5：本发明气道一氧化氮快速检测试剂盒的生产

本例进行1000套计划量的试剂盒生产。首先制定生产批号和生产计划(表6)，并进行物料准备(表7)。

表6.1000套计划量组分表

表7.物料清单

编号

品名

规格

性质

数量

稀释倍数

备注

KKGM12001

取样管管身

个

原料，洁净

1000

-

KKGM12002

取样管管底

个

原料，洁净

1000

-

KKGM12003

管盖

个

原料，洁净

1000

-

KKGM12004

封口膜

个

原料，洁净

1000

-

KKGM12005

270g定性滤纸

30×30cm

原料，洁净

20

-

KKGM12006

1-萘胺盐酸盐

分析纯

原料，洁净

1.5mg

100×

KKGM12007

乙酸

分析纯

原料，洁净

157.5ml

-

KKGM12008

壳聚糖季铵盐

92％取代度

原料，洁净

375mg

-

KKGM12009

中性红

100mM

中间品，暂存

380μL

20×

KKGM12010

碳酸钠

100mM

中间品，暂存

380μL

20×

KKGM12011

盐酸苯胺

分析纯

原料，洁净

12g

KKGM12012

NaCl

分析纯

原料，洁净

49g

KKGM12013

硫酸铜

分析纯

原料，洁净

958mg

KKGM12014

标签

个

原料，洁净

1000

-

KKGM12015

自封袋和干燥剂

套

原料，洁净

1000

-

KKGM12016

说明书

个

原料，洁净

1000

-

KKGM12017

外包装盒

个

原料，洁净

1000

-

关键工序-试纸条制备：在裁剪为300mm×60mm规格的270g普通定性滤纸距底部约21mm以铅笔划线标注沿线为检测区域，在其上方12mm以铅笔划线标注沿线为质控区域，按说明书正文方法以点样笔在检测区域以点样笔划线滴加1.1mM 1-萘胺盐酸盐、5％(w/v)壳聚糖季铵盐、0.1％(v/v)乙酸溶液混合水溶液，在质控区域划线滴加5mM中性红、5mM碳酸钠水溶液；以60℃30分钟干燥后，将滤纸条粘贴固定于PVC背板上，滤纸条下端比PVC背板下端长16mm，垂直切割成5mm的长条。试纸条制备完成后，应进行关键工序抽检，以确定试纸条质量合格。

样本稀释液配制分装：按本说明书正文所示的试剂盒样本稀释液的配方配制4000ml，按4ml/份分装至管盖内，以封口膜密封。

取样管装配：在试纸条背部粘贴双面泡沫胶，将试纸条置入并粘贴在取样管指示槽中，并使试纸条的下端可以恰好贴近管底，再把取样管底座密封固定在管身上；在指示槽外贴上预留QC窗与A窗的标签，使得QC窗与AS窗分别与试纸条上的质控区域及检测区域对应。车间检验员现场检查装配合格后，于指示槽顶部贴上合格标志。将管盖与取样管装入置有干燥剂的自封袋中，封紧，室温暂存得到半成品，待抽检合格后，进行外包装。

外包装：将抽检合格后的半成品及说明书装入外包装盒中，贴上合格证，入库备用。

实施例6：本发明气道一氧化氮快速检测试剂盒质检

一、关键工序抽检

试纸条制备完成后进行关键工序抽检，以确定试纸条质量合格。

(1)外观

试纸条外观尺寸应符合设定。

(2)阴性参考品符合率

取10份企业阴性参考品进行检测，检测结果应均为阴性。

(3)阳性参考品符合率

取10份企业阳性参考品进行检测，检测结果应均为阳性。

(4)检测限

取企业检测限参考品进行重复检测20次，应至少19次的检测结果为阳性。

二、半成品检验

(1)外观

组分齐全，自封袋和干燥剂包装完好，无泄漏，无破损、无回潮现象；标签字迹清晰，指示槽顶部贴有合格标志，窗口位置与试纸条上相应区域匹配。

(2)阴性参考品符合率

直接采用关键工序抽检结果。

(3)阳性参考品符合率

直接采用关键工序抽检结果。

(4)检测限

直接采用关键工序抽检结果。

(5)重复性

取企业重复性参考品，重复检测10次，检测结果应均为阳性，显色均一。

(6)样本处理效率

按本发明所示气道粘液取样方法取样，取从10例健康志愿者的气道粘液样本混合分装得到的阴性样本5份及从10例哮喘患者的气道粘液样本混合分装得到的阳性样本5份分别进行检测，阴性样本检测结果应均为阴性，阳性样本检测结果应均为阳性。

三、成品检验

(1)外观

组分齐全，自封袋和干燥剂包装完好，无泄漏，无破损、无回潮现象；标签字迹清晰，指示槽顶部贴有合格标志，窗口位置与试纸条上相应区域匹配。成品全重称重应≥23.50g，指示其中封存的试剂足量。

(2)性能

在外观核对无误后，直接采用关键工序抽检和半成品检验的性能指标。

实施例7：健康志愿者测试

试剂盒成品见实施例5。在园区现场宣传征集健康志愿者50例，年龄20-40岁，职业为高科技行业从业人员，男女比例约50％，一年内参加过全面体检，无异常状况，无重度吸烟或重污染行业从业史，无肺癌或哮喘等肺病史，无相关疾病家族史。部分女性处于妊辰或哺乳期，自我感觉良好。工作人员主持登记，发放试剂盒成品，并进行操作讲解演示。然后，由志愿者按本说明书正文描述的方法进行检测操作，并将结果报告给工作人员。工作人员比对确认后，进行结果统计分析。结果显示，50例检测QC窗均显示明显的紫红色，操作正确率100％；50例检测AS窗均没有明显显色，均为阴性，所测志愿者的哮喘发病风险很低。

实施例8：哮喘患者测试

试剂盒成品见实施例5。征集哮喘患者志愿者30例，年龄20-70岁，职业不限，男女比例约50％，经肺功能检查确诊为哮喘或自我描述一年内有发作过诱因不明的明显喘息、气急或胸闷症状并当天自行缓解，且3个月内没有使用过糖皮质激素类药物。女性没有处于妊辰或哺乳期。工作人员主持登记，发放试剂盒成品，并进行操作讲解演示。然后，由志愿者按本说明书正文描述的方法进行检测操作，并将结果报告给工作人员。工作人员比对确认后，进行结果统计分析。结果显示，30例检测QC窗均显示明显的紫红色，操作正确率100％；30例检测AS窗均显示明显的紫红色，均为阳性，指示气道NO水平异常升高，提示哮喘相关气道炎症风险，建议前往医院接受深入诊疗。

实施例9：上呼吸道炎症患者测试

试剂盒成品见实施例5。征集感冒咳嗽、鼻炎、咽喉炎患者各20例，年龄20-40岁，职业不限，男女比例约50％，一年内参加过全面体检，无其它异常状况，无重度吸烟或重污染行业从业史，无肺癌或哮喘等肺病史，无相关疾病家族史。女性没有处于妊辰或哺乳期。工作人员主持登记，发放试剂盒成品，并进行操作讲解演示。志愿者清洁鼻涕，并轻咳清爽咽喉和排除咳痰后，按本说明书正文描述的方法进行检测操作，并将结果报告给工作人员。工作人员比对确认后，进行结果统计分析。结果显示，60例检测QC窗均显示明显的紫红色，操作正确率100％；60例检测AS窗均没有明显显色，均为阴性，所测志愿者的哮喘发病风险很低。

实施例10：哮喘体检筛查应用

试剂盒成品见实施例5。在体检中心安排一名工作人员现场负责登记表格和试剂盒发放回收，并在受试者有疑问时进行必要解答指导，滚动播放宣传讲解视频。试剂盒使用方法同说明书正文描述。体检受试者可随到随测，平均用时约5分钟。有多人到场时可平行自测，30人次检测总共只需花费约10分钟时间。据此估算，1天(8小时)可完成检测约1440人次。而FeNO测试需专业人员1对1专业指导和质控，并需进行消毒处理，体检受试者通常需排队等候，30人次检测约需40分钟，8小时只能完成检测约120人次。本发明可提高体检筛查效率约12倍。

实施例11：儿童筛查应用

试剂盒成品见实施例5。征集了有既往及家族过敏史且家长描述曾发生过咳嗽、呼气急促、有喘鸣声等表现突然出现又自行停止(又称突发突止)的儿童志愿者20例，年龄4-6岁，男女比例约50％，没有进行过雾化吸入或其它方式治疗。工作人员主持登记，发放试剂盒成品，并进行操作讲解演示。然后，由家长指导并协助儿童志愿者按本说明书正文描述的方法进行检测操作，并将结果报告给工作人员。工作人员比对确认后，进行结果统计分析。结果显示，20例检测QC窗均显示明显的紫红色，操作正确率100％；20例检测AS窗均显示明显的紫红色，均为阳性，指示气道NO水平异常升高，提示哮喘相关气道炎症风险，建议前往医院接受深入诊疗。哮喘通常是由于遗传因素或环境因素与自身免疫力而引起的过敏性疾病。研究证明,儿童哮喘的早期干预和持续管理有利于哮喘疾病的控制和改善预后。但是，当前用于哮喘的诊断或辅助检查方法，如肺功能测定、气道激发试验、FeNO测定、诱导痰液分析等，在儿童中受到设备条件及患儿配合的限制而难以进行。本发明取样和测试过程都可有家长协助，儿童只需配合进行简单的漱口、咳嗽和吐液等动作，难度不大，完成度有保证，有利于儿童哮喘早筛早诊早治。

实施例12：社区应用

试剂盒成品见实施例5。在试点社区超市投放本发明试剂盒成品50套，并张贴附有二维码的宣传海报，用户自行用手机扫码观看视频讲解，在线登记后，现场领取试剂盒自行检测，按本发明说明书所述方法进行检测操作，再将检测结果在线更新。检测结果汇总统计，阳性按用户上报结果统计，阴性统计除按用户上报结果外，未上报结果者也按阴性统计；逻辑依据是阳性更能激发用户的沟通欲望而漏报率很低，而阴性则可能降低用户的沟通欲望而漏报率较高。统计显示，共有6例阳性，阳性率为12％，高于普通人群哮喘患病率(4.2％)。考虑到试用用户可能是因为曾经有过一些相似症状表现而对试用兴趣较高，可以归属入高危人群，阳性率较高是合理的。社区医院是全民健康的重要建设内容，但通常并没有肺功能检查等哮喘诊断专业设施，需前往中心医院进行检查，不利于居民参加哮喘筛查。本发明所述试剂盒方便居民在社区参与哮喘筛查，有望发展成为对全民健康建设的有力补充。

实施例13：居家自测使用

试剂盒成品见实施例5。征集了20例常规使用吸入糖皮质激素的哮喘患者志愿者居家自行使用本发明试剂盒取样测试，每周进行1次，一共进行4次测试。取样测试时段选择在吸入用药之前。志愿者年龄10-50岁，性别比例约50％，用药疗程不超过2年且不短于1个月。试剂盒使用方法按本说明书方法进行。用户将检测结果通过网络回传或由工作人员电话或微信随访收集使用情况并登记检测结果。结果统计显示，有4例患者出现4次检测均为阴性，另有7例患者出现至少1次检测为阴性。其余9例患者4次检测均为阳性。患者用药疗程中检测阳性频率下降或消失可能与气道炎症状况得到控制和改善相关。具体诊断还需前往中心医院进行进诊断确认。哮喘的吸入激素维持治疗是一个长期的过程。通常要求每日2次，每次1-2吸，坚持至少3-6个月后，病情稳定后方可开始减量停药。由于并不发病，而又缺乏便利直观的监测检测手段，很多患者往往不能长期坚持用药，擅自减量停药现象比较普遍，给哮喘控制造成隐患。本发明便于患者居家自测跟踪，有利于促进患者坚持用药。

实施例14：试剂盒保存及稳定性测试

试剂盒成品见实施例5。取样管(含试纸条)密封干燥组装在试剂盒成品包装内。试剂盒保存条件为室温25℃±5℃或冷藏，湿度≤60％。阴性参考品为健康志愿者气道粘液样本混合后按1ml/份分装制备，标准吸光度法测定显示亚硝酸盐含量＜1.0mM。阳性参考品为哮喘患者志愿者气道粘液样本混合后按1ml/份分装制备，标准吸光度法测定显示亚硝酸盐含量≥1.2mM。重复性参考品为1.2mM NaNO₂，检测限参考品为1.0mM NaNO₂。检测方法按说明书进行。每批检测，阴/阳/重复性各3次，检测限5次，每月检测2批。第2个月共4次检测后，初步统计表明，阴/阳/重复性检测限符合率均达到100％，符合质量要求。

实施例15：便携性和运输稳定性

试剂盒成品见实施例5。试剂盒保存条件、参考品同实施例14。取3批试剂盒，每批次40，放在高温40℃时存放3天，再从1.5m高度，让试剂盒自由落体跌落，反复3次，进行震荡跌落试验，观察试剂盒外包装、内包装等有无破损后，用阴性参考品、阳性参考品、检测限参考品进行测试。结果：仅有一个批次的一个试剂盒存在外包装部分破损，内包装无损坏，检测统计表明，阴/阳/重复性检测限符合率均达到100％，符合质量要求。

Claims

1.一种气道一氧化氮快速检测方法，其特征在于，所述方法过程为在清水漱口后，喝一口水，拍打前胸10次，深呼吸5次，用力咳6次，再将口内液体吐出收集与样本稀释液混合，以固定有指示剂的试纸条吸滤测定样本溶出的亚硝酸盐，检测区显现紫红色为阳性结果，指示样本中亚硝酸盐含量达到或超过检测阈值，气道一氧化氮水平较高。

2.根据权利要求1所述的气道一氧化氮快速检测方法，其特征在于，所述样本稀释液由5mM-100mM盐酸苯胺、1-5mM硫酸铜、1％-5％(v/v)乙酸、100mM-180mM氯化钠组成。

3.根据权利要求1所述的气道一氧化氮快速检测方法，其特征在于，所述的固定有指示剂的试纸条为适合大小的滤纸条，在其下端适合位置，干燥有1-2μl/mm的1.0-1.5mM 1-萘胺盐酸盐、3％-10％壳聚糖季铵盐、0.1％-0.2％(v/v)乙酸混合溶液，在该区域上方7mm-15mm处，干燥有1-2μl/mm的3-8mM中性红、3-8mM碳酸钠混合溶液。

4.一种气道一氧化氮快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒主要组成包含：整合有指示槽的取样管、管盖、样本稀释液和固定有指示剂的试纸条。

5.根据权利要求4所述的气道一氧化氮快速检测试剂盒，其特征在于，所述的取样管为可用管盖紧闭、带有底座的透明磨砂硬塑料管，一侧附有中空且底部与管体内联通的指示槽，槽内置试纸条。试纸条为核心组分，由固定有检测区和质控区的滤纸条及塑料背板组成。其滤纸条大小为50mm×5mm×0.7mm(长度×宽度×厚度)，在其下端21mm处，标记好检测区，干燥有5μl的1.1mM 1-萘胺盐酸盐、5％(w/v)壳聚糖季铵盐、0.1％(v/v)乙酸溶液；在其上方12mm处(距底端33mm处)，标记好质控区，干燥有5μl的5mM中性红、5mM碳酸钠溶液。

6.根据权利要求4所述的气道一氧化氮快速检测试剂盒，其特征在于，所述的样本稀释液以可被取样管内尖状物刺破的薄膜密封在管盖内，其组成为15mM盐酸苯胺、1mM硫酸铜、2.5％(v/v)乙酸、140mM氯化钠混合水溶液。

7.根据权利要求4所述的气道一氧化氮快速检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒以亚硝酸盐计的检测限为1.0mM。