CN113621681A - 一种检测口腔中幽门螺杆菌的组合物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测幽门螺杆菌的检测组合物，所述组合物含有尿素、磷酸氢二钾、氢氧化钠、对羟基苯甲酸甲酯、溴百里酚蓝和蒸馏水。本发明还提供了含有所述组合物的检测幽门螺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括口腔样本取样装置、检测装置、装有所述组合物的挤压式塑料瓶和装有95%v/v乙醇的挤压式塑料瓶。本发明具有如下技术效果：本发明的方法操作简便，适合没有专业知识和设备的一般消费者使用，能够精确且快速检测口腔样本中的幽门螺杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及致病菌的体外检测，具体涉及一种检测口腔中幽门螺杆菌的组合物和试剂盒。
背景技术
至2015年，全球幽门螺杆菌感染率为60.3%，中国总体感染率在50%以上。尤其是青年人群中有较高的感染率。一般认为，社会经济因素是影响幽门螺杆菌感染率的重要原因之一。低收入家庭携带幽门螺杆菌感染可能性更高，受教育程度低、生活在农村地区、拥挤的家庭和饮用水污染源等均会增加幽门螺杆菌感染率。而经济的发展，生活水平的提高会降低幽门螺杆菌感染率。我国国情是现有且仍将有大量人民生活水平不高，属于幽门螺杆菌易感人群。幽门螺杆菌感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，也与胃癌的产生密切相关。因此，幽门螺杆菌感染的早期准确检测有助于相关疾病的预防和治疗。
根据全国幽门螺杆菌感染处理共识报告，现有常用的非侵入性幽门螺杆菌感染检测方法有尿素呼气试验、粪便抗原试验和血清学试验。但这些方法都有其局限性：
尿素呼气试验包括碳13呼气法和碳14呼气法。一般认为，碳13呼气法虽有一定的假阳性率，仍是检测幽门螺杆菌感染的最好方法。但这两种方法需要配合专业仪器使用，不适合一般消费者的自行检查。
粪便抗原试验因不够方便，实际应用较少。同时其准确性较差，单价较高。
血清学试验检测的是血清中的幽门螺杆菌抗体，因此无法区分现症感染与过去的感染。临床应用受限。
快速尿素酶法（Rapid Urease Test，RUT）通过酶解尿素生成氨引起的环境pH值变化检测人体组织样本中是否存在幽门螺杆菌分泌的尿素酶，从而间接检测样本中是否存在幽门螺杆菌。传统上基于此方法研制的试剂盒用于胃部样本的检测，如Serim公司的Helicobacter Pylori Test Kit和GI Supply公司的HpFast™与HpOne™。近年来也有广州贝思奇，珠海克迪，深圳赛尔，珠海丽拓，福建三强等公司生产的面向一般消费者，用于牙垢样本检测的产品。但这些用于牙垢样本检测的产品外观简陋、档次低，且工艺设计复杂，生产自动化程度低。在技术上，用于胃部样本检测的产品需要专业医务人员通过胃镜采样后检测，一般消费者无法自主进行；用于牙垢样本检测的产品的问题在于牙垢的组成复杂，易受到食物残渣影响，且取样困难，在清洁的口腔中几乎无法取到牙垢。
中国专利CN102539424B，公开了一种pH值乙醇法舌苔快速尿素酶的检测方法及试剂盒，该检测方法包括如下步骤：
A、用pH试纸测量口腔唾液的酸碱度；
B、在快速尿素酶试剂杯中滴入95％乙醇液3～4滴，用牙签将杯底部附着的试剂颗粒与乙醇液搅匀；
C、取舌背后部舌苔置入试剂杯中，搅匀，静置5分钟后在试剂杯中再滴入3～4滴溶解液，搅匀，静置5～10分钟，观察颜色变化；
D、若变成红色，用pH试纸测量，将结果与口腔pH值比较，从而判断结果。试剂盒，包括有盒体，在所述的盒体内设有快速尿素酶试剂杯，盛装有1～10ml的溶解液和95％乙醇液的软塑瓶，检测范围5.5～9.0的pH精密试纸，棉签一包和牙签一包。
该专利存在以下问题：
1）未明确尿素酶相关试剂，仅说明使用宁波美康的快速诊断试剂杯。但目前已无法查询到该产品信息。
2）检测步骤繁琐。既要取样检测尿素酶，还要取样检测pH值。且未说明使用者应该如何检测口腔pH值。不方便普通人群的自行检查。
综上，现有技术或产品存在多种问题，不适于消费者对疑似幽门螺杆菌症状的自行检查。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种检测口腔中幽门螺杆菌的组合物、试剂盒和方法。
本发明的发明人提供了一种新的技术方案，并解决了现有技术存在的技术问题。
本发明的技术方案如下：
首先，本发明提供了一种检测幽门螺杆菌的检测组合物，所述组合物含有尿素、磷酸氢二钾、氢氧化钠、对羟基苯甲酸甲酯、溴百里酚蓝和蒸馏水；
各组分含量如下：尿素1%~3%w/v，磷酸氢二钾0.014%~0.041%w/v，氢氧化钠0.001%~0.004%w/v，对羟基苯甲酸甲酯0.1%~0.3%w/v，溴百里酚蓝0.01%~0.03%w/v，所述组合物的pH值为6~7。
上述组合物中，
尿素起着幽门螺杆菌产生的尿素酶底物的作用，对于测定幽门螺杆菌产生的尿素酶的活性，含量优选1%~3%w/v。
磷酸氢二钾和氢氧化钠起着设定体系pH值的作用，使得组合物在保存过程中pH值不发生大的改变；同时两者浓度较低，使其不影响样本中尿素酶引起的pH值变化；其中磷酸氢二钾含量优选0.014%~0.041%w/v，氢氧化钠含量优选0.001%~0.004%w/v。
对羟基苯甲酸甲酯起着防腐剂的作用，可防止组合物在保存过程中滋生细菌影响检测结果，含量优选0.1%~0.3% w/v。
pKa值在6.5~8.5的指示剂起着对pH变化敏感的作用，在本发明中溴百里酚蓝是最合适的；其具有在酸性溶液中表现出黄色和在中性、碱性溶液中为绿色、蓝色的特征，黄绿色与蓝色的差异比黄色与粉红色的差异更明显；且溴百里酚蓝颜色丰富，随pH值升高可显示青、浅蓝、深蓝等颜色，可半定量的提示幽门螺杆菌感染程度；含量优选0.01%~0.03%w/v。
最优选地，
所述组合物中，各组分含量如下：尿素2%w/v，磷酸氢二钾0.027%w/v，氢氧化钠0.002%w/v，对羟基苯甲酸甲酯0.2%w/v，溴百里酚蓝0.02%w/v，所述组合物的pH值为6.5。
其次，本发明得到了上述组合物并且提供了一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，该试剂盒包括口腔样本取样装置、检测装置、装有上述组合物的挤压式塑料瓶和装有95%v/v乙醇的挤压式塑料瓶。
95%v/v乙醇的作用是封闭口腔内唾液链球菌等产尿素酶的非幽门螺杆菌菌株，阻止其尿素酶的释出，减少对实验结果的影响。幽门螺杆菌的尿素酶基本位于细胞壁上，且幽门螺杆菌具有耐酸能力，其尿素酶的释放不受乙醇影响。
口腔样本取样装置为特定大小的牙刷。
检测装置为具有一定厚度的，包含一个特定尺寸孔洞的塑料片。检测装置通过切割塑料板后进行冲压获得。
第三，本发明提供一种从口腔样本中检测幽门螺杆菌的方法，其检测步骤包括用上述组合物与口腔样本反应和观察反应后上述组合物的颜色变化。使用者使用上述试剂盒附带的取样装置自舌上表面中后部刮取舌苔作为口腔样本，将口腔样本放置在反应孔中，在反应孔中加入95%乙醇浸泡样本数分钟后再加入上述组合物并观察颜色变化。
本发明中，
w/v的单位均为g/mL。
v/v的单位均为mL/mL。
本发明具有如下技术效果：
本发明通过使用95%乙醇浸泡样本，使得口腔样本中可表达尿素酶的非幽门螺杆菌菌株细胞膜被封闭，其中的尿素酶无法释放。而幽门螺杆菌不受95%乙醇影响，其尿素酶释放到胞外的检测组合物后催化组合物中的尿素分解生成氨，使得检测组合物pH值升高，检测组合物中的指示剂颜色则随pH值发生变化。本发明的方法操作简便，适合没有专业知识和设备的一般消费者使用，能够精确且快速检测口腔样本中的幽门螺杆菌。
附图说明
图1是本发明试剂盒中口腔样本取样装置的侧视图；
图2是本发明试剂盒中检测装置的透视图；
图3是说明本发明试剂盒的应用实施例的附图。
其中：1为检测装置；2是反应孔；3是本发明的检测组合物和95%乙醇的混合溶液；4是口腔样本。
具体实施方式
本发明实施例中涉及的材料说明如下：
尿素，溴百里酚蓝、磷酸氢二钾、氢氧化钠、对羟基苯甲酸甲酯均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
实施例1 制备检测组合物
使用100 mL蒸馏水溶解0.027 g无水磷酸氢二钾、0.002 g氢氧化钠并混匀，制备缓冲溶液。在上述缓冲溶液中加入2 g尿素、0.02 g溴百里酚蓝和0.2 g对羟基苯甲酸甲酯，使各组分完全溶解并混匀。将上述水溶液用0.22μm无菌滤膜过滤后，即得检测组合物。
检测组合物中各组分含量分别为：尿素2%w/v，溴百里酚蓝0.02% w/v，磷酸氢二钾0.027% w/v，氢氧化钠0.002% w/v，对羟基苯甲酸甲酯0.2% w/v。检测组合物pH值为6.5。
实施例2 制备幽门螺杆菌检测试剂盒
将实施例1中所制备的检测组合物灌装入挤压式塑料瓶中。
准备95%乙醇灌装入另一挤压式塑料瓶中。
准备检测装置和取样装置。
从而制备幽门螺杆菌检测试剂盒。
口腔样本取样装置牙刷长度为7.5cm。
检测装置尺寸为6cm*2cm*0.3cm，包含一个半径为0.5cm，深度为0.2cm的孔洞。检测装置通过切割塑料板后进行冲压获得。
实施例3 功效验证
自已经过碳13呼气法检测的6名慢性胃炎患者取样，分别使用上述检测试剂盒和广州贝思奇公司生产的胃幽门螺杆菌（HP）检测试纸检测。
贝思奇产品按其操作说明操作。
本发明检测试剂盒的检测操作如下：
1.等待检测试剂盒温度上升至室温。使用取样装置自舌上表面中后部刮取舌苔，并将舌苔样本放入反应孔中。
2.向反应孔中挤出一至数滴95%乙醇，至没过样本为止。用取样装置略微搅拌，等待5至10分钟。
3.向反应孔中挤出数滴上述检测组合物，至液面高度与反应孔顶部齐平为止，等待5至15分钟。
4.观察并记录反应孔中液体颜色。若液体颜色出现绿色或蓝色，则判定样本为阳性；若液体颜色为黄色或黄绿色，则判定样本为阴性。
结果如下：
可见上述检测试剂盒检测结果与碳13呼气法检测结果一致。而贝思奇产品存在假阴性的情况。贝思奇产品及其类似产品问题在于，其设计无法排除非幽门螺杆菌菌株所产尿素酶的干扰。因此一般限定反应时间3分钟以内，只能检出较严重的感染，若样本中幽门螺杆菌数量较少，则会出现假阴性。
Claims (3)
1.一种检测幽门螺杆菌的检测组合物，其特征在于，所述组合物含有尿素、磷酸氢二钾、氢氧化钠、对羟基苯甲酸甲酯、溴百里酚蓝和蒸馏水；
各组分含量如下：尿素1%~3%w/v，磷酸氢二钾0.014%~0.041%w/v，氢氧化钠0.001%~0.004%w/v，对羟基苯甲酸甲酯0.1%~0.3%w/v，溴百里酚蓝0.01%~0.03%w/v，所述组合物的pH值为6~7。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，各组分含量如下：尿素2%w/v，磷酸氢二钾0.027%w/v，氢氧化钠0.002%w/v，对羟基苯甲酸甲酯0.2%w/v，溴百里酚蓝0.02%w/v，所述组合物的pH值为6.5。
3.含有如权利要求1或2所述组合物的检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括口腔样本取样装置、检测装置、装有所述组合物的挤压式塑料瓶和装有95%v/v乙醇的挤压式塑料瓶。
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| CN (1) | CN113621681A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114807298A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-07-29 | 浙江省立同德医院(浙江省精神卫生研究院) | 一种幽门螺杆菌检测试剂盒 |
| CN115825055A (zh) * | 2023-02-16 | 2023-03-21 | 山东众之康生物科技有限公司 | 一种幽门螺杆菌检测试剂及检测方法 |
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2020
- 2020-05-08 CN CN202010380517.3A patent/CN113621681A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114807298A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-07-29 | 浙江省立同德医院(浙江省精神卫生研究院) | 一种幽门螺杆菌检测试剂盒 |
| CN114807298B (zh) * | 2022-05-31 | 2022-10-25 | 浙江省立同德医院(浙江省精神卫生研究院) | 一种幽门螺杆菌检测试剂盒 |
| CN115825055A (zh) * | 2023-02-16 | 2023-03-21 | 山东众之康生物科技有限公司 | 一种幽门螺杆菌检测试剂及检测方法 |
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