JP2011231200A - 有機蛍光色素内包シリカナノ粒子、その製造方法、及びそれを用いた生体物質標識剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【選択図】なし
Description
一般式(1): O−SiR1R2−X−S−S−Y−SiR3R4−O
式中、R1、R2、R3及びR4は、各々独立に、酸素原子又は炭素数1〜6のアルキル基、又は炭素数6〜10のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。X及びYは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数1〜12の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
工程(a):ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程(b):還元反応を行う工程
4.前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、下記一般式(2)で表されるシラン化合物であることを特徴とする前記第3項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
一般式(2): R5n(R6O)mSi−X−S−S−Y−SiR7l(OR8)k
式中、n及びmはn+m=3を満たし、mは0〜2の整数、nは1〜3の整数を表す。l及びkはl+k=3を満たし、lは0〜2の整数、kは1〜3の整数を表す。R5及びR7は非加水分解性の置換基を表す。R6O及びR8Oは、加水分解性の炭素数1〜6のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。X及びYは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数1〜12の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子に用いられる有機蛍光色素としては、特に制限はないが、200〜700nmの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜900nmの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示す態様の有機蛍光色素を用いることができる。なかでもin vivo光イメージング用途を想定し、「生体の窓」及び「分光領域の窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域である赤〜近赤外線の650〜1000nmの範囲内にあることが好ましい。
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分を含むことを特徴とする。
一般式(1): O−SiR1R2−X−S−S−Y−SiR3R4−O
式中、R1、R2、R3及びR4は、各々独立に、酸素原子又は炭素数1〜6のアルキル基、又は炭素数6〜10のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。
工程(b):還元反応を行う工程
当該製造方法を、より詳しく説明するならば、下記工程(1)〜(6)を有する態様の製造方法であることが好ましい。
一般式(2): R5n(R6O)mSi−X−S−S−Y−SiR7l(OR8)k
式中、n及びmはn+m=3を満たし、mは0〜2の整数、nは1〜3の整数を表す。
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子1の作製〕
ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基同一分子内にもつ化合物を用いて、下記工程(1)〜(4)の方法により、シリカナノ粒子1を作製した。
工程(5):工程(4)で得られたシリカナノ粒子1 1nM水分散液を調製したところに、8M尿素を添加、室温下2時間撹拌した。反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
特許文献1にならい下記工程(1)〜(5)の方法により、ジスルフィド結合もメルカプト基のどちらも有しないCy5内包シリカナノ粒子3を作製した。
特許文献2にならい下記工程(1)〜(5)の方法により、ジスルフィド結合をもたず、メルカプト基を有するCy5内包シリカ粒子4を作製した。
Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、Alexa Fluor 647のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(インビトロジェン社製)を用いた他はシリカナノ粒子1と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、HiLyte Fluor 647のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(AnaSpec社製)を用いた他はシリカナノ粒子1と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
Cy5のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、DyLight649のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(ThermoScientific社製)を、ビス[3−(トリエトキシシリル)プロピル]ジスルフィドの代わりに、ビス[3−(トリエトキシシリル)プロピル]テトラスルフィド(GELEST社製)を用いた他はシリカナノ粒子1と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
シリカナノ粒子2及び4を用い、分子修飾シリカナノ粒子A及びBを各々調製し、更にこれを用いて生体物質標識剤1及び2を調製して、生体物質標識剤の長期保存性を評価した。
(分子修飾シリカナノ粒子A:シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子2のアミノ基修飾)
シリカナノ粒子2 1mgを純水5mLに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。
(分子修飾シリカナノ粒子B:ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子4のアミノ基修飾)
シリカナノ粒子4について、分子修飾シリカナノ粒子Aの調製と同様の手順で、アミノ基修飾を行った。
(生体物質標識剤1:アミノ基修飾シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子への抗体結合体)
分子修飾シリカナノ粒子Aの調製で得られたアミノ基修飾シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子へ0.5mgを純水0.5mLに分散させたもの0.1mLをDMSO2mLに添加した。そこへ、sulfo−SMCC(Pierce社製)をいれ1時間反応させた。過剰のsulfo−SMCCなどを遠心分離により除去する、一方で、抗hCG抗体を1Mジチオスレイトール(DTT)で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去した。
(生体物質標識剤2:アミノ基修飾ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子への抗体結合体)
分子修飾シリカナノ粒子Bの調製で得られたアミノ基修飾ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子について、生体物質標識剤1の調製と同様の手順で、抗hCG抗体が結合したジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子(生体物質標識剤2)を得た。
1)マイクロプレート上ウェル内にアンチ−hαサブニットを固定化した。
2)抗原であるhCGを各ウェルに濃度を変えて入れた。
3)過剰のhCGを洗浄により除去後、各ウェルに生体物質標識剤分散液を入れた。
4)過剰の生体物質標識剤を洗浄により除去した。
5)マイクロプレートリーダーにより各ウェルの蛍光強度を測定した。励起光を3分間連続的に照射し、連続的に検出した蛍光強度を積算した。
Claims (5)
- シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
- 前記ジスルフィド結合を有する化学構造部分が、下記一般式(1)で表されることを特徴とする請求項1に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
一般式(1): O−SiR1R2−X−S−S−Y−SiR3R4−O
式中、R1、R2、R3及びR4は、各々独立に、酸素原子又は炭素数1〜6のアルキル基、又は炭素数6〜10のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。X及びYは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数1〜12の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。 - 請求項1又は請求項2に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法であって、少なくとも下記工程(a)及び工程(b)を有することを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程(a):ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程(b):還元反応を行う工程 - 前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、下記一般式(2)で表されるシラン化合物であることを特徴とする請求項3に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
一般式(2): R5n(R6O)mSi−X−S−S−Y−SiR7l(OR8)k
式中、n及びmはn+m=3を満たし、mは0〜2の整数、nは1〜3の整数を表す。l及びkはl+k=3を満たし、lは0〜2の整数、kは1〜3の整数を表す。R5及びR7は非加水分解性の置換基を表す。R6O及びR8Oは、加水分解性の炭素数1〜6のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。X及びYは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数1〜12の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。 - 請求項1又は請求項2に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤であって、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
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