WO2024080275A1 - 環境ｄｎａ又は環境ｒｎａの回収方法 - Google Patents

環境ｄｎａ又は環境ｒｎａの回収方法 Download PDF

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WO2024080275A1
WO2024080275A1 PCT/JP2023/036721 JP2023036721W WO2024080275A1 WO 2024080275 A1 WO2024080275 A1 WO 2024080275A1 JP 2023036721 W JP2023036721 W JP 2023036721W WO 2024080275 A1 WO2024080275 A1 WO 2024080275A1
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WO
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environmental
dna
nucleic acid
rna
acid capture
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/036721
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English (en)
French (fr)
Inventor
良久 赤松
遼平 中尾
愛美 稲葉
史子 岩城
Original Assignee
国立大学法人山口大学
日本工営株式会社
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Filing date
Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering environmental DNA or environmental RNA.
  • a method using a fibrous structure is widely used to sample and concentrate microorganisms or biological fragments in a sample. Specifically, by filtering environmental samples such as water or gases such as carbon dioxide using a filter such as cellulose or PVDF, microorganisms and cell fragments contained in the environmental sample or gas can be collected and concentrated.
  • Patent Document 3 a method including a process using pressure cycles and ultrasonic treatment (see Patent Document 3) and a process of mixing a cell sample with a treatment reagent containing protease and a surfactant (see Patent Document 4) have been disclosed in the process of efficiently recovering collected microorganisms and biological fragments.
  • the objective of the present invention is to provide a method for capturing environmental DNA or environmental RNA using a carrier with high retention power, and then efficiently recovering the captured environmental DNA or environmental RNA from the carrier.
  • the inventors conducted intensive research to solve the above problems, and conducted experiments using artificial cells containing DNA as a model of environmental DNA.
  • natural sea sponge and absorbent cotton as carriers for capturing DNA
  • they captured the artificial cells on them using running water then tried to recover the artificial cells by applying pressure and negative pressure to the carriers, and then recover the DNA.
  • by using natural sea sponge or absorbent cotton it is possible to retain the artificial cells once captured on them for a long period of time.
  • applying pressure and negative pressure to natural sea sponge or absorbent cotton increases the recovery efficiency of the captured artificial cells, and as a result, increases the recovery efficiency of the DNA in the artificial cells, and thus completed the present invention.
  • the present invention is as follows. [1] (a) contacting an environmental sample containing environmental DNA or environmental RNA with a nucleic acid capture carrier made of a flexible porous material to capture the environmental DNA or environmental RNA or a biological sample containing them on the nucleic acid capture carrier; (b) applying pressure or negative pressure to the nucleic acid binding carrier; A method for recovering the environmental DNA or environmental RNA from the environmental sample, comprising the steps of (a) and (b) in that order. [2] The method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [1] above, characterized in that the environmental sample containing the environmental DNA or environmental RNA is river water, groundwater, surface water, lake water, seawater, sewage, rainwater, soil, sludge, or air.
  • step (a) The method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [1] above, characterized in that the nucleic acid capture carrier is a sponge or absorbent cotton.
  • step (a) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [1] above, characterized in that in step (a), it includes a step (a') of freezing and thawing the nucleic acid capture carrier after capturing the environmental DNA or environmental RNA or a biological sample containing them on the nucleic acid capture carrier.
  • step (a') A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [4] above, characterized in that in step (a'), the method includes a step of dehydrating the environmental DNA or environmental RNA or a biological sample containing them after capturing them on the nucleic acid capture carrier, and then freezing and thawing the nucleic acid capture carrier.
  • step (b) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [1] above, characterized in that in step (b), the nucleic acid capture carrier is placed in a catheter syringe and pressurized or negatively pressurized.
  • step (b) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [1] above, characterized in that in step (b), the nucleic acid capture carrier is contacted with a protease, incubated, and then pressurized or negatively pressurized.
  • step (b) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [1] above, characterized in that in step (b), the nucleic acid capture carrier is placed in a catheter syringe, the nucleic acid capture carrier is brought into contact with a protease within the catheter syringe, the catheter syringe holding the nucleic acid capture carrier is incubated, and then the nucleic acid capture carrier is pressurized or negatively pressurized.
  • step (a) A method for recovering environmental DNA or RNA as described in [1] above, characterized in that in step (a), the method comprises a step (a') of freezing and thawing the nucleic acid capture carrier after capturing the environmental DNA or environmental RNA or a biological sample containing them on the nucleic acid capture carrier, and in step (b), the nucleic acid capture carrier is contacted with a protease and incubated, and then pressurized or negatively pressurized the nucleic acid capture carrier.
  • step (b) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in [1] above, characterized in that an environmental sample containing environmental DNA or environmental RNA is contacted with a nucleic acid capture carrier made of a flexible porous material for more than 3 hours.
  • the present invention has the following aspects.
  • step (b) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in any one of [1] to [5] above, characterized in that in step (b), the nucleic acid capture carrier is placed in a catheter syringe and pressurized or negatively pressurized.
  • step (b) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in any of [1] to [6] above, characterized in that in step (b), the nucleic acid capture carrier is contacted with a protease, incubated, and then pressurized or negatively pressurized.
  • step (b) A method for recovering environmental DNA or environmental RNA described in any one of [1] to [7] above, characterized in that in step (b), the nucleic acid capture carrier is placed in a catheter syringe, the nucleic acid capture carrier is brought into contact with a protease within the catheter syringe, the catheter syringe holding the nucleic acid capture carrier is incubated, and then the nucleic acid capture carrier is pressurized or negatively pressurized.
  • step (a) A method for recovering environmental DNA or RNA described in any of [1] to [8] above, characterized in that in step (a), the nucleic acid capture carrier is allowed to capture the environmental DNA or environmental RNA, or a biological sample containing them, and then the nucleic acid capture carrier is frozen and thawed, and in step (b), the nucleic acid capture carrier is contacted with a protease and incubated, and then the nucleic acid capture carrier is pressurized or negatively pressurized.
  • the method of the present invention for recovering environmental DNA or environmental RNA makes it possible to capture environmental DNA or environmental RNA contained in an environmental sample cumulatively over a long period of time, and to efficiently recover the captured environmental DNA or environmental RNA from the nucleic acid capture carrier.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overview of the waterway experimental facility used in Example 1. This is a diagram showing the amount of DNA contained in artificial cells recovered in Example 1 by squeezing them using a juicer using a kitchen sponge or natural sea sponge as a carrier.
  • FIG. 13 is a conceptual diagram of an experimental device used in the process of placing a nucleic acid capture carrier in a catheter syringe in Example 2 and then pouring in artificial cells.
  • FIG. 1 shows the amount of DNA recovered from a natural sponge by four different processes in Example 2.
  • FIG. 13 is a diagram showing the flow of four groups including freezing treatment and surfactant treatment (Osban treatment) in Example 3.
  • FIG. 13 shows the amount of DNA recovered after protease treatment in four groups, including freezing treatment and surfactant treatment (Osban treatment) in Example 3.
  • FIG. 13 is a diagram showing the amount of DNA in the DNA fragment contained in artificial cell 2 and the amount of DNA in the DNA fragment contained in artificial cell 3 when natural sponge or absorbent cotton is treated with protease in Example 4.
  • FIG. 13 is a graph showing the DNA recovery rate when three types of proteases were used in Example 5.
  • 13 is a graph showing the DNA recovery rate in Example 6 when the sample was not frozen, was frozen and stored at -20° C. for 30 days, and was frozen and stored at -80° C. for 30 days.
  • FIG. 13 is a graph showing the DNA recovery rate in Example 7 when the sample was in a dehydrated or hydrated state without freezing, or when the sample was in a dehydrated or hydrated state with freezing.
  • FIG. 13 is a graph showing the amount of RNA recovered when Pseudomonas phage ⁇ 6 or mouse norovirus was captured in Example 8.
  • environmental DNA or environmental RNA means DNA or RNA derived from organisms present in the environment, such as water, soil, or air.
  • the nucleic acid capture carrier is not particularly limited as long as it is made of a flexible porous material and can capture nucleic acid.
  • the flexibility can be, for example, a property in which the overall shape or the shape of the pores therein and the surface state can be changed by pressure or negative pressure, such as when the carrier is placed in a catheter syringe and pressure or negative pressure is applied by a plunger.
  • examples of the flexible porous material include porous bodies formed from sponges, dietary fibers such as cellulose fibers, and chemical fibers such as nylon.
  • the sponge containing the porous structure may be either a natural sponge or an artificial sponge, but is preferably a natural sponge, more preferably a sponge belonging to the phylum Porifera, and even more preferably a common sponge containing sponge skeletal fibers whose main component is amino acids.
  • the natural sponge may be left in its natural state, but may also be a sponge made by drying the sponge skeletal fibers of a natural sponge, that is, a sponge sponge, or a sponge made by bleaching the same. Examples of the dried sponge skeletal fibers of a natural sponge include soft silk and honeycomb natural sponges. When contacting the environmental sample, the sponge may be cut to a predetermined size or shredded using a blender or the like.
  • porous bodies made from the above-mentioned cellulosic fibers include absorbent cotton, natural cotton, and also porous bodies made from fibers whose main raw material is cellulose, such as hemp, rayon, pulp, and cupra.
  • the environmental sample may be river water, groundwater, surface water, lake water, or other land water, seawater, sewage flowing down a sewer pipe, rainwater or tap water flowing down a pipe, soil, sludge, or air.
  • the method of contacting the environmental sample containing environmental DNA or environmental RNA with the nucleic acid capture carrier made of a flexible porous material is not particularly limited, but examples include a method of submerging the nucleic acid capture carrier made of a flexible porous material in the environmental sample containing environmental DNA or environmental RNA, a method of floating it in the environmental sample containing environmental DNA or environmental RNA, a method of placing the nucleic acid capture carrier at an intake or exhaust site of an instrument or the like and contacting or passing the sample containing environmental DNA or environmental RNA, a method of fixing the nucleic acid capture carrier at a position where it will infiltrate into the environmental sample containing environmental DNA or environmental RNA, a method of fixing or suspending the nucleic acid capture carrier in the atmosphere, a method of moving and exposing the nucleic acid capture carrier in the environmental sample, and a method of flowing the environmental sample containing environmental DNA or environmental RNA into the nucleic acid capture carrier made of a flexible porous material.
  • the contact time can be adjusted appropriately depending on the purpose of analysis of the environmental DNA or environmental RNA to be collected, and can be, for example, 15 minutes or more, 30 minutes or more, 1 hour or more, 3 hours or more, 12 hours or more, 24 hours or more, 3 days or more, 1 week or more, 1 month or more, or 3 months or more.
  • the above-mentioned environmental sample is preferably in its natural state outdoors, but an environmental sample collected from outdoors may also be used.
  • the environmental sample is mainly water such as land water such as river water, groundwater, surface water, or lake water, seawater, sewage flowing down a sewer pipe, rainwater flowing down a pipe, or tap water
  • the environmental sample containing the environmental DNA or environmental RNA is contacted with a nucleic acid capture carrier made of a flexible porous material, and then, if necessary, the water is squeezed out at the site of collection, and only the nucleic acid capture carrier that has captured the environmental DNA or environmental RNA or a biological sample containing them can be brought home, which makes it possible to reduce the effort of carrying heavy water and the transportation and disposal of unsanitary substances contained in sewage, etc.
  • capturing environmental DNA or environmental RNA on the nucleic acid capture carrier means retaining environmental DNA or environmental RNA on the surface of the nucleic acid capture carrier, particularly on the surface or within the porous space of the carrier.
  • the environmental DNA or environmental RNA may be retained directly, but also includes those adsorbed to suspended matter including all or part of mammalian cells or bacterial tissues, organic matter present in the environmental sample, or those retained together with the water or air contained in the environmental sample.
  • the biological sample containing environmental DNA or environmental RNA may be a DNA virus that contains DNA or an RNA virus that contains RNA. Such viruses may be enveloped or non-enveloped viruses.
  • examples of DNA and RNA viruses that infect animals, aquatic organisms, plants, bacteria, and other organisms and exist in the water environment or air include enteric viruses such as norovirus, rotavirus, enterovirus, and adenovirus, and respiratory infection viruses such as coronavirus and influenza virus.
  • enteric viruses such as norovirus, rotavirus, enterovirus, and adenovirus
  • respiratory infection viruses such as coronavirus and influenza virus.
  • Step (a) may include a step (a') of freezing and thawing the nucleic acid capture carrier after capturing the environmental DNA or environmental RNA on the nucleic acid capture carrier.
  • Step (a') (1) prevents the captured environmental DNA or environmental RNA from being decomposed by the biological activity of nucleases, etc., or by physical or chemical influences such as heat, and (2) enables the long-term storage of the nucleic acid capture carrier that has captured the environmental DNA or environmental RNA.
  • the freezing method is not particularly limited, but examples include a method of cooling and freezing the nucleic acid capture carrier on which environmental DNA or environmental RNA has been captured with liquid nitrogen or dry ice, or a method of freezing by placing it in a freezer at -80°C or -20°C.
  • the freezing may be performed directly on the nucleic acid capture carrier, or the nucleic acid capture carrier may be placed in a bag, tube, catheter syringe, etc., and the bag, tube, catheter syringe, etc. itself may be cooled to freeze the nucleic acid capture carrier inside.
  • the nucleic acid capture carrier may be placed in a bag, tube, catheter syringe, etc., and the bag, tube, catheter syringe, etc. itself may be cooled to bring the nucleic acid capture carrier inside to an environment of 4°C or lower, preferably 0°C or lower, using dry ice or ice, thereby making it possible to suppress biological activity such as nuclease.
  • the melting method is not particularly limited, but examples include a method in which the nucleic acid capture carrier that has captured environmental DNA or environmental RNA is melted at room temperature or under refrigerated conditions at 4 to 10°C, and a method in which a bag or tube containing the nucleic acid capture carrier is melted by running water or by leaving it still under refrigerated conditions at 4 to 10°C.
  • the nucleic acid capture carrier can be dehydrated after capturing the environmental DNA or environmental RNA or a biological sample containing them, and then frozen and thawed.
  • the dehydration can suppress the fragmentation of nucleic acids caused by crystallization of water molecules due to freezing, or suppress biological activity.
  • dehydration here does not only mean complete removal of water, but also includes the case where water remains after squeezing with pressure or the like to remove water.
  • the sponge can be washed with a solution that does not contain the environmental DNA or environmental RNA. This washing can reduce impurities that act as inhibitors in molecular biological analysis (such as quantitative PCR) after attachment to the sponge.
  • Step (b) the application of pressure or negative pressure to the nucleic acid capture carrier may be any pressure applied or pressure reduced in a state where the nucleic acid capture carrier is placed in a container to change the shape of the nucleic acid capture carrier or the porous shape of the nucleic acid capture carrier, but it is preferable to apply pressure or negative pressure when the nucleic acid capture carrier is not dry.
  • This pressure or negative pressure makes it easier for the environmental DNA or environmental RNA captured by the nucleic acid capture carrier or the biological sample containing them to separate from the nucleic acid capture carrier, improving the recovery efficiency of the environmental DNA or environmental RNA or the biological sample containing them.
  • step (b) it is preferable to apply pressure and negative pressure in step (b), and it is preferable to perform 2 or more cycles, 5 or more cycles, 10 or more cycles, or 20 or more cycles of pressure and negative pressure as one cycle.
  • water such as distilled water may be added when applying pressure and negative pressure.
  • the method of applying pressure is not particularly limited, but examples thereof include squeezing the nucleic acid capture carrier, placing the nucleic acid capture carrier in a container such as a catheter syringe and pressing it with a plunger, and using a juicer to apply pressure.
  • applying pressure to the nucleic acid capture carrier is also referred to as "squeezing.”
  • the method of applying negative pressure is not particularly limited, but examples thereof include placing the nucleic acid capture carrier in a container such as a catheter syringe and pulling it with a plunger to apply negative pressure.
  • the environmental sample contained in the nucleic acid capture carrier can be controlled to leak only from the tip of the tube, which makes it easier to manage the hygiene of the operator when handling wastewater such as sewage, and makes it possible to suppress contamination by bacteria, etc.
  • the nucleic acid capture carrier can be contacted with a protease, incubated, and then pressurized or negatively pressurized.
  • protease can change the capture state between the nucleic acid capture carrier and environmental DNA or environmental RNA, or a biological sample containing them, thereby improving the recovery efficiency of environmental DNA or environmental RNA, or a biological sample containing them.
  • the protease can act on the sponge fibers, which are the skeletal components of the sponge, biological cells attached to the sponge fibers, or biofilms, thereby changing the capture state between the nucleic acid capture carrier and environmental DNA or environmental RNA, or a biological sample containing them.
  • the protease is not particularly limited, and may be an endopeptidase or an exopeptidase.
  • the protease include proteinase K (ProK), serine proteases such as trypsin, cysteine proteases such as papain, metaproteases such as thermolysin, aspartyl proteases such as pepsin, matrix metalloproteases (MMPs), and pronase. These may be used in combination.
  • proteases having an activity to inactivate nucleases are preferred from the viewpoint of suppressing the degradation of environmental DNA or environmental RNA, and from this viewpoint, proteinase K is preferred.
  • nucleic acid capture carrier In order to bring the nucleic acid capture carrier into contact with a protease, a method in which the nucleic acid capture carrier is infiltrated in a solution containing a protease may be mentioned.
  • the proteases may be used in combination with a protease having an activity to inactivate nucleases.
  • step (b) it is preferable to place the nucleic acid capture carrier in a catheter syringe, bring the nucleic acid capture carrier into contact with the protease in the catheter syringe, incubate the catheter syringe holding the nucleic acid capture carrier, and then pressurize or negatively pressurize the catheter syringe.
  • a plunger after placing the nucleic acid capture carrier in the catheter syringe, bring the nucleic acid capture carrier into contact with the protease in the catheter syringe, incubate the catheter syringe holding the nucleic acid capture carrier with the plunger still inserted, and then pressurize or negatively pressurize the nucleic acid capture carrier by pushing or pulling the plunger. If a catheter syringe is used, it is possible to bring the nucleic acid capture carrier into contact with the protease by sucking a solution containing the protease from the tip of the catheter syringe.
  • the nucleic acid capture carrier may include a step (a') of freezing and thawing the nucleic acid capture carrier after capturing environmental DNA or environmental RNA on the nucleic acid capture carrier, and in step (b), the nucleic acid capture carrier may be brought into contact with a protease and incubated, and then the nucleic acid capture carrier may be pressurized or negatively pressurized.
  • the nucleic acid capture carrier may include a step (a') of placing the nucleic acid capture carrier into a catheter syringe after capturing environmental DNA or environmental RNA on the nucleic acid capture carrier, placing a plunger in the catheter syringe, and then freezing and thawing the catheter syringe, and in step (b), the nucleic acid capture carrier may be brought into contact with the protease by sucking protease from the tip of the catheter syringe, and then the catheter syringe may be incubated, and then the plunger may be pushed or pulled to pressurize or negatively pressurize the nucleic acid capture carrier.
  • the recovery efficiency of environmental DNA or environmental RNA can be further improved.
  • the environmental DNA or environmental RNA obtained above or a biological sample containing them may be extracted and purified.
  • Methods for purification that can be used include filtration using filter paper, column purification, and methods using commercially available nucleic acid purification kits.
  • the obtained environmental DNA or environmental RNA can be analyzed using PCR, for example, where a region commonly conserved in the order, family, genera, species, or strain of biological classification is used as the amplified region, or where a region of a gene specifically possessed by a microorganism, including a target organism or virus, is used as the amplified region.
  • This analysis makes it possible to determine whether or not a particular organism, such as bacteria, or virus is present at the site where the environmental sample was collected.
  • Example 1 Retention of environmental DNA (1)
  • Environmental DNA is often encapsulated in or attached to cell fragments released into the environment, but because quantitative evaluation of cell fragments is difficult, we used artificial cells in which DNA fragments with specific sequences were encapsulated in liposomes as a model of biological fragments that encapsulate environmental DNA.
  • the artificial cells were made by preparing liposomes encapsulating the DNA fragments using DNA fragments and phospholipids (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and 1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)propane (DOTAP) as raw materials (commissioned to Hashimoto Electronics Co., Ltd.).
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOTAP 1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)propane
  • the DNA fragments consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1) region of the nuclear DNA of carp (Cyprinus carpio). Nucleic acid (synthesized by Eurofins Genomics) was inserted into the pMD-21 vector, transformed into E.
  • the liposomes containing the DNA fragments thus produced were giant unilamellar liposomes (GUVs), and the particle sizes of which were distributed in the range of 1 ⁇ m to 35 ⁇ m after filtration after production.
  • the liposomes containing the carp DNA fragments described above were designated artificial cell 1.
  • ITS1 SEQ ID NO: 1 5'-TTCAAAGACC CCCCGTAACA GGGGGCGCCC GTCCGGGGTC ACGACCCCCC TTATTTTTTC CAAAACCCCT GTGTGCGGCA TGGC-3'
  • the experiment was carried out in the water channel experimental facility shown in Figure 1.
  • the pipe in Figure 1 had a diameter of 10 cm, a slope of 1/50, and tap water was run through it to a depth of 1.0 to 3.0 cm.
  • a polyurethane foam kitchen sponge (Ohe Co., Ltd.) or a soft silk natural sponge (Asahi Sho Co., Ltd.) was placed near the center of the pipe as a carrier for capturing artificial cells in the flowing water of the water channel with a constant flow rate.
  • Each of the above carriers had the same volume and weight, and was cut to a size that could fit without applying pressure into a stainless steel cage measuring 6 cm wide, 8 cm long, and 2 cm high.
  • the artificial cells 1 containing the DNA fragments prepared above were added to the artificial cell addition port in an amount of 2.0 ⁇ 10 8 copies over a period of 30 minutes, thereby capturing the artificial cells 1 on each carrier. After that, the carriers were left in running water for about 3.5 hours without adding the artificial cells 1. Immediately after the addition of the artificial cells 1 for 30 minutes, and after the artificial cells 1 were left in running water for about 3.5 hours after the addition of the artificial cells 1 for 30 minutes (4 hours later), each carrier was removed from the waterway experimental facility and collected, and the artificial cells 1 captured on the carriers were collected in the following three groups.
  • 1st time (1 squeeze): The carrier was squeezed with a squeeze juicer (Idea Sekikawa Co., Ltd.) and the squeezed liquid containing the artificial cell 1 captured on the carrier was collected in a bottle.
  • 2nd time (2 squeezes): 100 mL of distilled water was added to each carrier squeezed in the 1st time, and the squeezed liquid containing the artificial cell 1 captured on the carrier was collected in a bottle by squeezing it again with the squeeze juicer.
  • 3rd to 10th times 3 to 10 squeezes: 100 mL of distilled water was added to each carrier squeezed in the 2nd time, and the artificial cell 1 captured on the carrier was collected by squeezing it again with the squeeze juicer. After that, the addition of distilled water and squeezing were repeated in the same way up to the 10th time, and the squeezed liquid obtained was collected in the same bottle (only natural sponge was used for the 3rd to 10th times).
  • Each collected liquid was filtered with glass fiber filter paper GF/F (manufactured by Global Life Science Technologies Japan), and the artificial cells 1 captured on the carrier contained in the collected liquid were captured on the glass fiber filter paper.
  • DNA was extracted from the artificial cells 1 captured on the filter paper using a DNA extraction kit, DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), and then quantitative PCR was performed using the following primer and probe set.
  • the probe used was a probe in which FAM was linked as a reporter to the 5' end of a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and BHQ1, a quencher, was linked to the 3' end.
  • the amount of DNA was calculated by calculating the number of copies in 1 cm 3 of the carrier from the average value of the obtained DNA copy numbers (copies) (copies/cm 3 ).
  • ITS1 5'-TTCAAAGACC CCCCGTAAC-3' (SEQ ID NO: 2)
  • Reverse primer 5'-GCCATGCCGC ACACA-3' (SEQ ID NO: 3)
  • Probe 5'-TCACGACCCC CCTTATTTTT TCCAAAACC-3' (SEQ ID NO: 4)
  • the PCR reaction solution had the following composition: EMM *1) 5 ⁇ L Uracil-N-glycosylase (UNG) 0.1 ⁇ L 20x primer/probe *2) 0.5 ⁇ L Template DNA 2 ⁇ L Sterile water 2.4 ⁇ L Reaction volume: 10 ⁇ L *1: 2x TaqMan Environmental MasterMix (Thermofisher Scientific) *2: Mix the above forward primer, reverse primer, probe, and TE buffer.
  • the PCR reaction was carried out as follows. (1) Initial denaturation: 55°C, 120 seconds; (2) Thermal denaturation: 95°C, 300 seconds; (3) Annealing and extension reaction: 60°C, 60 seconds; (4) 55 cycles of (2) and (3).
  • the results of the amount of DNA extracted from the artificial cells 1 recovered in each carrier by the method described above for the first time (squeezed once) and the second time (squeezed twice) are shown in Figure 2.
  • the horizontal axis indicates the amount of DNA (copies/cm 3 ) recovered from each carrier, which was left in running water for about 3.5 hours immediately after the addition of the artificial cells 1 for 30 minutes, and the horizontal axis indicates the amount of DNA immediately after the addition of the artificial cells 1 for 30 minutes, and was recovered after 4 hours.
  • the amount of DNA was reduced in both the cases of 30 minutes and 4 hours in the kitchen sponge, but increased in the case of 30 minutes in the natural sponge, and even in the case of 4 hours, the rate of reduction was lower than that of the kitchen sponge.
  • the natural sponge recovered more than 7 times as much DNA in the first squeeze (1 squeeze) and more than 37 times as much in the second squeeze (2 squeezes) compared to the kitchen sponge.
  • the natural sponge (4h) was squeezed 3, 5, 7, or 10 times, about 60% of the DNA was recovered in the 10th squeeze (10 squeezes) compared to the second squeeze (2 squeezes) (not shown).
  • Example 2 Recovery of DNA from a natural sponge From Example 1 above, it became clear that natural sponges have a particularly high ability to retain DNA and artificial cells. Therefore, next, a method for efficiently recovering DNA from a natural sponge was examined. First, liposomes encapsulating DNA fragments were prepared as artificial cells in the same manner as in Example 1. As the DNA fragment, linear DNA containing a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the ITS1 region of carp nuclear DNA, as described in Example 1, was used.
  • the tip of a catheter syringe (50 mL SS-50CZ: Terumo Corporation) was connected to the top of an aspirator via a glass fiber filter paper GF/F (Global Life Science Technologies Japan, Inc.).
  • soft silk natural sponges of approximately the same volume, adjusted to an average of about 0.5 g, were placed in the catheter syringe as nucleic acid capture carriers, and TE buffer containing 2.0 ⁇ 10 8 copies of artificial cell 1 was poured in and aspirated at -40 to -50 kPa using an aspirator to capture the artificial cell 1 in the natural sponge.
  • 100 ml of a washing treatment solution (distilled water was used) was added for washing, and the artificial cell 1 that was not captured was removed by aspirating again with the aspirator, and the sponge was dehydrated by aspirating.
  • the natural sponge with artificial cells 1 captured was removed from the catheter syringe containing the natural sponge, placed in a squeeze juicer (Idea Sekikawa Co., Ltd.), squeezed a first time, and collected in a bottle. Furthermore, 40 mL of distilled water was added, and a second squeeze was performed to collect the squeezed liquid containing artificial cells 1 in the same bottle as the first time.
  • a squeeze juicer Idea Sekikawa Co., Ltd.
  • a plunger was inserted into a catheter syringe containing a natural sponge with the artificial cell 1 captured therein, and pressure was applied once by pushing the plunger, and the first squeezed liquid was collected in a bottle from the tip of the catheter syringe.
  • 40 mL of distilled water was added so that the natural sponge was immersed in the distilled water.
  • a plunger was inserted into the catheter syringe, and the pressure/negative pressure cycle was repeated 10 times by pushing the plunger to apply pressure and pulling the plunger to apply negative pressure, and finally pressure was applied to collect the squeezed liquid in the same bottle as the first time.
  • a plunger was inserted into a catheter syringe containing a natural sponge with the artificial cell 1 captured therein, and the plunger was pressed once to apply pressure, and the first squeezed liquid was collected from the tip of the catheter syringe into a bottle.
  • 40 mL of NaOH solution pH 10.8 was added to the catheter syringe so that the natural sponge was soaked in the NaOH solution.
  • a plunger was inserted into the catheter syringe, and the pressure/negative pressure cycle was repeated 10 times by pressing the plunger and pulling the plunger to apply pressure, and the squeezed liquid was collected in the same bottle as the first squeezed liquid by applying pressure.
  • the squeezed liquid was neutralized by adding 40 ⁇ L of ⁇ 100 Tris-EDTA buffer and 200 ⁇ L of 0.2N H 2 SO 4 .
  • Example 2-A the plunger was slowly inserted into the catheter syringe containing the natural sponge with the artificial cell 1 captured therein, and then a 1000 ⁇ L tip was attached to the tip of the catheter syringe containing the natural sponge with the artificial cell 1 captured therein, and the plunger was pulled to aspirate 20 mL (10 U/mL) of a protease (Proteinase K (ProK): 29442-85: Nacalai Tesque)) solution prepared in Tris-EDTA buffer into the catheter syringe as a treatment solution.
  • a protease Proteinase K (ProK): 29442-85: Nacalai Tesque
  • the plunger was pressed to apply pressure, and the plunger was pulled to apply negative pressure, and the pressure/negative pressure cycle was repeated five times to allow ProK to infiltrate evenly into the natural sponge.
  • the solution that came out of the tip of the catheter syringe by pressing the plunger was collected in a 50 mL tube, and the solution was collected in the catheter syringe by pulling the plunger.
  • the catheter syringe was vigorously shaken once or twice with a catheter tip syringe cap (ED-CP: Terumo Corporation) on the catheter syringe with the cap side facing up to remove the natural sponge, and then the cap was removed to remove the air from the top.
  • ED-CP catheter tip syringe cap
  • the catheter syringe with the cap attached and the plunger inserted was placed on a tumbling mixer (RH-24, 3D Gyratory Rocker: MUILAB Corporation) and reacted at 56°C for 1 hour.
  • the squeezed liquid was collected in a bottle by applying pressure, and to prevent the recapture of DNA by the natural sponge, the buffer included with the DNeasy Blood & Tissue Kit (QUIAGEN) was aspirated and mixed with the squeezed liquid collected earlier under pressure, and the pressure/negative pressure cycle of applying pressure by pushing the plunger and applying negative pressure by pulling the plunger was repeated five times, after which the DNA-containing solution was collected in a bottle into which the included buffer had been dispensed in an amount to be used for one carrier.
  • a tumbling mixer RH-24, 3D Gyratory Rocker: MUILAB Corporation
  • the washing solutions obtained in the above Comparative Examples A to C were filtered through a glass fiber filter GF/F (Global Life Science Technologies Japan), and the artificial cells 1 contained in the collected solution were captured on the glass fiber filter.
  • DNA was extracted from the artificial cells 1 captured on the filter in the same manner as in Example 1 above using a DNeasy Blood & Tissue Kit (QUIAGEN).
  • the DNA-containing solution was applied to the column of the DNeasy kit, and DNA was extracted according to the recommended protocol.
  • quantitative PCR was performed using the primer and probe sets of SEQ ID NOs: 2 to 4 described in Example 1 as templates, using each of the extracted DNAs as templates.
  • the amount of DNA was obtained by calculating the number of copies per carrier from the average value of the obtained DNA copies (copies) (copies/carrier).
  • Example 3 Recovery of DNA from natural sponges - 2 In order to suppress the decomposition of nucleic acids captured in natural sponges and improve their detection and quantification, freezing treatment or surfactant treatment was examined as a pretreatment before the protease treatment described in Example 2.
  • liposomes encapsulating DNA fragments were prepared as artificial cells in the same manner as in Example 1.
  • the DNA fragments used were linear DNA containing nucleic acids consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the ITS1 region of nuclear DNA of the same carp (Cyprinus carpio) as in Example 1 above.
  • the tip of a catheter syringe (50 mL SS-50CZ: Terumo Corporation) was connected to the top of an aspirator via a glass fiber filter paper GF/F (Global Life Science Technologies Japan, Inc.) in the same manner as in Example 2.
  • soft silk natural sponges of approximately the same volume, adjusted to an average of about 0.5 g, were placed in the catheter syringe, and a solution containing 2.0 x 10 8 copies of artificial cell 1 was poured in and aspirated at -40 to -50 kPa using an aspirator to capture the artificial cell 1 in the sponge. Further, 100 ml of a washing treatment solution (distilled water was used) was added for washing, and the uncaptured artificial cell 1 was removed by aspirating again with the aspirator.
  • a washing treatment solution distilled water was used
  • Osban Benzalkonium chloride
  • the buffer included with the DNeasy Blood & Tissue Kit (QUIAGEN) was aspirated from each of the four groups, pressurized and mixed with the previously collected squeezed liquid, and after five pressurized/negative pressure cycles, the DNA-containing solution was collected, and DNA was extracted using the DNeasy Blood & Tissue Kit (QUIAGEN). Then, quantitative PCR was performed using the primer and probe set of SEQ ID NOs: 2 to 4 described in Example 1, with each extracted DNA as a template, to calculate the number of DNA copies per carrier (copies/carrier) and determine the amount of DNA. The results are shown in Figure 6.
  • Example 4 Retention of environmental DNA (2)
  • the carrier is left in running water for a predetermined time to capture the environmental DNA and environmental RNA on the carrier, if the captured environmental DNA is not retained in the carrier for the predetermined time, only the environmental DNA captured on the carrier immediately before the carrier was recovered can be detected in the subsequent analysis. Therefore, the retention of artificial DNA over time was examined using natural sea sponge and absorbent cotton as carriers.
  • liposomes encapsulating DNA fragments were prepared as artificial cells (fabrication requested from Katayama Chemical Industry Co., Ltd.). However, the liposomes were the same as in Example 1, but as the DNA fragments, instead of the nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the ITS1 region of the nuclear DNA of carp (Cyprinus carpio) in Example 1, a chimeric artificial gene of whale shark and lion consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (synthesized by Eurofins Genomics) or a chimeric artificial gene of blue whale and Dendrobates tinctorius consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (synthesized by Eurofins Genomics) was inserted into a pEX-A2J2 vector, transformed into E.
  • the liposome encapsulating the DNA fragment containing the chimeric artificial gene of the blue whale and Dendrobates tinctorius is referred to as artificial cell 2
  • the liposome encapsulating the DNA fragment containing the chimeric artificial gene of the whale shark and lion is referred to as artificial cell 3.
  • a solution containing 2.0 ⁇ 10 8 copies of the artificial cells 2 prepared above was added to the artificial cell addition port over 30 minutes, thereby capturing the artificial cells 2 on each carrier. After that, the carrier was left in running water for 3 hours without adding artificial cells. Next, a solution containing 2.0 ⁇ 10 8 copies of the artificial cells 3 prepared above was added to the artificial cell addition port over 30 minutes. Immediately after adding the artificial cells 3 for 30 minutes, each carrier was removed from the waterway experimental facility and collected, and the following protease (ProK) treatment was performed to extract the respective DNA contained in the artificial cells 2 and 3.
  • ProK protease
  • Protease (ProK) treatment The natural sponge or absorbent cotton in which the artificial cell 2 and the artificial cell 3 were captured was taken out and placed in a catheter syringe. Then, the plunger was slowly inserted into the catheter syringe, and then, as in Example 2-A, a 1000 ⁇ L tip was attached to the tip of the catheter syringe, and the plunger was pulled to aspirate 20 mL (10 U/mL) of a protease proteinase K (ProK: 29442-85: Nacalai Tesque) solution prepared in Tris-EDTA Buffer into the catheter syringe as a treatment solution.
  • a protease proteinase K ProK: 29442-85: Nacalai Tesque
  • the pressure/negative pressure cycle of pressing the plunger and pulling the plunger to apply pressure and negative pressure was repeated five times to uniformly infiltrate ProK into the natural sponge or absorbent cotton.
  • the catheter syringe was vigorously shaken once or twice with the cap side up while the catheter tip syringe cap (ED-CP: Terumo Corporation) was attached to the catheter syringe, and the natural sponge or absorbent cotton was dropped in, and then the cap was removed to remove the air from the top.
  • ED-CP Terumo Corporation
  • the above-mentioned cap was attached, and the catheter syringe with the plunger inserted was placed on a tumbling mixer (RH-24, 3D Gyratory Rocker: MUILAB) and reacted at 56°C for 1 hour.
  • the squeezed liquid was collected in a bottle by applying pressure, and in order to further suppress recapture of DNA in the natural sponge or absorbent cotton, the buffer attached to the DNeasy was aspirated, pressurized and mixed with the previously collected squeezed liquid, and the pressurized/negative pressure cycle of applying pressure by pushing the plunger and applying negative pressure by pulling the plunger was repeated five times, and then the DNA-containing solution was collected in another bottle.
  • DNA was extracted from the DNA-containing solution by the direct capture method using Wastewater Viral RNA/DNA Extraction Kits (Promega).
  • the probe used was a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 10, with FAM as a reporter linked to the 5' end and BHQ1 as a quencher linked to the 3' end.
  • the amount of DNA was calculated from the average value of the obtained DNA copy numbers (copies) to obtain the number of copies in 1 cm 3 of the carrier (copies/cm 3 ).
  • the DNA amount of the DNA fragment contained in the artificial cell 2 added 4 hours before the carrier was collected was compared with the DNA amount of the DNA fragment contained in the artificial cell 3 added 30 minutes before the carrier was collected, to clarify the retention characteristics of the carrier.
  • the PCR reaction solution composition and PCR reaction were performed under the same conditions as described in Example 1.
  • the results are shown in FIG. 7.
  • the amount of DNA on the vertical axis is the number of DNA copies (copies/cm 3 ) in 1 cm 3 of the recovered carrier, and is the average value of the same experiment performed three times for each carrier. It was confirmed that DNA can be efficiently recovered by ProK treatment not only when natural sponge but also when absorbent cotton is used as the carrier. Furthermore, it was revealed that both natural sponge and absorbent cotton can recover not only DNA fragments contained in artificial cell 3 added 30 minutes before recovering the carrier, but also DNA fragments contained in artificial cell 2 added 4 hours before recovering the carrier. Therefore, it was revealed that the DNA recovery efficiency is improved by ProK treatment even in absorbent cotton, and that both natural sponge and absorbent cotton have a high ability to retain accumulated captured DNA for a long period of time.
  • Example 5 Examination of other proteases Although ProK was used as the protease in the above Examples 2 to 4 , other proteases were also examined. Furthermore, in the above Examples 2 and 3, DNA recovery was evaluated by the amount of recovered DNA (copies/carrier), and in the above Example 4, DNA recovery was evaluated by the ratio ⁇ (K/S) of the amount of recovered DNA K (copies) to the amount of DNA added S (copies). As the artificial cell, artificial cell 3, which is a liposome encapsulating a DNA fragment containing a chimeric artificial gene of a whale shark and a lion, prepared in Example 4, was used.
  • the tip of a catheter syringe (50 mL SS-50CZ: Terumo Corporation) was connected to the top of the aspirator via glass fiber filter paper GF/F (Global Life Science Technologies Japan, Inc.).
  • soft silk natural sponges of approximately the same volume, adjusted to an average of about 0.5 g, were placed in the catheter syringe as nucleic acid capture carriers, and 100 mL of PBS (-) (calcium and magnesium-free phosphate buffered saline: Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 2.0 x 10 8 copies of artificial cells 3 was poured in and aspirated with an aspirator to capture the artificial cells 3 in the natural sponge. Further, 100 ml of a washing treatment solution (distilled water was used) was added for washing, and the artificial cells 3 that were not captured were removed by aspirating again with an aspirator.
  • PBS -
  • a washing treatment solution distilled water was used
  • the plunger was slowly inserted into the catheter syringe containing the natural sponge with the artificial cell 3 captured. With the plunger still inserted, the catheter syringe was frozen and stored at -20°C overnight, and then thawed under running water.
  • the catheter syringe was vigorously shaken once or twice with a catheter tip syringe cap (ED-CP: Terumo Corporation) on it, with the cap side facing up, to remove the natural sponge, and then the cap was removed and the air was removed from the top.
  • ED-CP catheter tip syringe cap
  • the cap was attached, and the catheter syringe with the plunger inserted was placed on an upturning mixer (RH-24, 3D Gyratory Rocker: MUILAB Corporation) and reacted for 1 hour at 56°C for ProK, 70°C for Thermolysin, and 37°C for Pronase.
  • the squeezed liquid was collected in a bottle by applying pressure, and to prevent the recapture of DNA by the natural sponge, the buffer included with the Maxwell (registered trademark) RSC Enviro TNA kit was aspirated and mixed with the squeezed liquid collected earlier under pressure, and the pressure/negative pressure cycle of applying pressure by pushing the plunger and applying negative pressure by pulling the plunger was repeated five times, after which the DNA-containing solution was collected in a bottle into which the included buffer had been dispensed in an amount used for one carrier.
  • Maxwell registered trademark
  • the DNA-containing solution was applied to the column of the Maxwell® RSC Enviro TNA kit, and DNA was extracted according to the recommended protocol. Then, quantitative PCR was performed using each extracted DNA as a template and the primer and probe set of SEQ ID NOs: 7 to 9 to determine the amount of DNA recovered, K (copies). Furthermore, the amount of DNA recovered, K (copies), was divided by the amount of DNA added, S (copies), to calculate the ratio of the amount of DNA recovered to the amount of DNA added, ⁇ (K/S). The results are shown in Figure 8.
  • Figure 8 confirms that DNA can be recovered using thermolysin and pronase in addition to ProK.
  • Example 6 Study of the effect of long-term frozen storage and freezing temperature on the recovery rate In Example 3, the effect of freezing treatment on improving DNA recovery efficiency was confirmed, and the effects of long-term frozen storage and freezing temperature on the recovery rate were studied.
  • artificial cells 3 which are liposomes encapsulating DNA fragments containing chimeric artificial genes of whale sharks and lions, were prepared, and the artificial cells 3 were captured by a natural sponge in a catheter syringe and washed with distilled water.
  • a plunger was slowly inserted into a catheter syringe containing a natural sponge with the artificial cells 3 captured therein, and the catheter syringes with the plunger inserted were divided into three groups: (1) without freezing, (2) frozen and stored at -20°C for 30 days and then thawed under running water, and (3) frozen and stored at -80°C for 30 days and then thawed under running water.
  • ProK was aspirated into the catheter syringe and protease treatment was performed in the same manner as in Example 5.
  • protease treatment was performed without storage.
  • DNA was extracted from each of (1) to (3) and quantitative PCR was performed using the primer and probe sets of SEQ ID NOs: 7 to 9 to determine the amount of DNA recovered, K (copies). Furthermore, the amount of DNA recovered, K (copies), was divided by the amount of DNA added, S (copies), to calculate the ratio ⁇ (K/S), of the amount of DNA recovered to the amount of DNA added. The results are shown in Figure 9.
  • Example 7 Study on the effect of moisture content during freezing on the recovery rate In Examples 3 and 6, the effect of the freezing treatment was confirmed, and the effect of moisture content during freezing on the recovery rate was also studied.
  • the natural sponge with the artificial cells 3 trapped therein was placed in the sponge, and 100 mL of PBS(-) containing 2.0 x 108 copies of the artificial cells 3 was poured in and aspirated with an aspirator to trap the artificial cells 3 in the natural sponge. Further, 100 mL of a washing treatment solution (distilled water) was added for washing, and the untrapped artificial cells 3 were removed by aspirating again with an aspirator.
  • a washing treatment solution distilled water
  • Example 8 Recovery of RNA In Examples 1 to 7, DNA was recovered, but RNA recovery was also attempted. As shown in FIG. 3, the tip of a catheter syringe (50 mL SS-50CZ: Terumo Corporation) was connected to the top of an aspirator via a glass fiber filter paper GF/F (Global Life Science Technologies Japan, Inc.).
  • GF/F Glass Fiber filter paper
  • soft silk natural sponges of approximately the same volume, adjusted to an average of about 0.5 g, were placed in the catheter syringe as nucleic acid capture carriers, and 100 mL of PBS(-) (phosphate buffered saline without calcium and magnesium) containing Pseudomonas phage ⁇ 6 (1.67 ⁇ 10 8 copies) having double-stranded RNA or mouse norovirus (1.64 ⁇ 10 7 copies) having single-stranded (+) RNA was poured in and aspirated with an aspirator to capture each virus on the natural sponge. Further, 100 mL of a washing treatment solution (distilled water was used) was added for washing, and the uncaptured viruses were removed by aspirating again with an aspirator.
  • PBS(-) phosphate buffered saline without calcium and magnesium
  • Pseudomonas phage ⁇ 6 (1.67 ⁇ 10 8 copies
  • mouse norovirus (1.64 ⁇ 10 7 copies
  • the plunger was slowly inserted into the catheter syringe containing the natural sponge that had captured each of the above viruses, then a 1000 ⁇ L tip was attached to the end of the syringe, and the plunger was pulled back to aspirate 20 mL (10 U/mL) of protease (Proteinase K (ProK): 29442-85: Nacalai Tesque)) solution prepared in Tris-EDTA buffer into the catheter syringe as an enzyme treatment solution. After that, the plunger was pushed to apply pressure, and the plunger was pulled back to apply negative pressure, repeating this pressure/negative pressure cycle five times (5 repetitions) to evenly infiltrate the natural sponge with ProK.
  • protease Proteinase K (ProK): 29442-85: Nacalai Tesque
  • the catheter syringe was vigorously shaken once or twice with a catheter tip syringe cap (ED-CP: Terumo Corporation) on it, with the cap side facing up, to remove the natural sponge, and then the cap was removed to remove the air from the top.
  • ED-CP catheter tip syringe cap
  • the cap was attached, and the catheter syringe with the plunger inserted was placed on a tumbling mixer (RH-24, 3D Gyratory Rocker: MUILAB Corporation) and reacted at 56°C for 1 hour.
  • the squeezed liquid was collected in a bottle by applying pressure, and to prevent the recapture of RNA in the natural sponge, the buffer provided with the Maxwell (registered trademark) RSC Enviro TNA kit was aspirated and mixed with the squeezed liquid previously collected under pressure, and the pressure/negative pressure cycle of applying pressure by pushing the plunger and applying negative pressure by pulling the plunger was repeated five times, after which the RNA-containing solution was collected in a bottle into which the provided buffer had been dispensed in an amount to be used for one carrier.
  • Maxwell registered trademark
  • RNA-containing solution was applied to a column of Maxwell (registered trademark) RSC Enviro TNA kit, and RNA was extracted according to the recommended protocol. Then, reverse transcription quantitative PCR (Master MIX: TaqMan TM Fast Virus 1-Step Master Mix for qPCR (Applied Biosystems)) was performed using the primer and probe set of SEQ ID NOs: 7 to 9 to determine the amount of recovered RNA K (copies). The results are shown in FIG.
  • the method for recovering environmental DNA or RNA makes it easy and quick to collect environmental samples on-site, and makes it possible to efficiently recover environmental DNA or RNA from environmental samples, making it possible to use the method for biological surveys in rivers and coastal areas, and surveys of viruses and microorganisms in sewage, etc.

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Abstract

本発明の課題は、保持力の高い担体を用いて環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉し、その後にその捕捉した環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを効率よく上記担体から回収可能な方法を提供することにある。　（ａ）環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を接触させて、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させる工程；（ｂ）前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧する工程；の（ａ）及び（ｂ）を順次備えた、前記環境試料から前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法を行う。

Description

環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡの回収方法
　本発明は環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡの回収方法に関する。
　河川における生物の分布や多様性情報は、河川生態系の保全や多自然川づくりのような生物との調和に配慮した河川管理において重要な情報となる。また、下水等における病原微生物の検出はコロナウイルスなどの疫学調査として有用である。こうしたなか、近年、環境中に存在する生物由来のＤＮＡやＲＮＡを検出する環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡの分析が、生物調査における新たなツールとして利用され始めている。環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡによる調査では、環境試料を採取してＤＮＡやＲＮＡを解析するだけであることから、環境試料を採取する現地での作業は簡便かつ迅速に行うことができる。また、生物そのものを捕獲するなど、生物へ直接的な影響を与えることはなく、かつ専門家による種の同定も基本的に不要である。
　ここで、医療分野や生物医学の研究分野おいて核酸を捕集、濃縮、抽出する種々の方法が知られている。たとえば、試料中の微生物若しくは生物片のサンプリングや濃縮を行うためには、繊維状の構造体を用いる方法が普及している。具体的には、セルロースやＰＶＤＦ等のフィルターを用いて、水等の環境試料や炭酸ガス等の気体等を濾過することにより、環境試料や気体に含まれている微生物や細胞片を捕集・濃縮することができる。また、種々の材質を「粒子」、例えば球状(ビーズ)、カプセル、多面体などに加工し、強磁性体、核酸解析キットや核酸捕捉担体等固相粒子担体として活用し、効率的に核酸を精製・増幅するための技術が開発されており、核酸捕捉担体の材質としてポリスチレン、プラスチック、シリカゲル等の例示群の一例として天然海綿が例示されている（特許文献１、２参照）。さらに、捕集された微生物や生物片を効率的に回収する過程において、圧力サイクルや超音波処理による工程を含む方法（特許文献３参照）、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬と細胞試料とを混合する工程（特許文献４参照）が開示されている。
　しかし、これまで環境試料中の環境ＤＮＡや環境ＲＮＡを扱う手法はほとんど研究が進んでいない。また、河川水、下水などの環境試料中の環境ＤＮＡや環境ＲＮＡは、野生生物の行動やヒトの生活パターン、環境試料を採取する場所や時間等によって時間的に大きく変動するという特殊な事情がある。そのため、環境試料中の環境ＤＮＡや環境ＲＮＡを対象とし、それらを長期間累積的に担体に捕捉し、さらにその担体から効率的に核酸物質などを回収する方法が求められている。また、近年の新型コロナウイルスの流行において、変異株など流行しているウイルス型の把握を目的として下水中のわずかなＲＮＡウイルスを回収する技術が求められている。
国際公開第２０２１／００６３５３号パンフレット 特表２０１７－５１０２７８号公報 特開２０１３－４２６７０号公報 国際公開第２０１０／０８２６３１号パンフレット
　環境ＤＮＡや環境ＲＮＡの分析にあたって、これまでは環境試料のサンプリングとして、所定の時間に河川若しくは下水等で採取するのみが一般的であった。このような方法であれば、短時間でサンプリングを行うことができるが、採取した瞬間における生物情報だけしか解析できないこととなる。その結果、環境ＤＮＡや環境ＲＮＡは環境試料を採取する場所や時間帯によって大きくばらついてしまうという問題があった。一方で、一日に何度も繰り返し環境試料を採取するのは手間も時間もかかる。また、河川若しくは下水等の水を主体とする環境試料を分析するには、それらを分析する場所に運ぶ必要があり、さらに下水等の場合に一定の処理や技術が必要であった。そのため、環境ＤＮＡや環境ＲＮＡを捕捉する担体を、それらを含む環境試料に所定の時間、連続的にさらして捕捉することが考えられる。この場合には、変動が大きい環境下で、経時的に担体に捕捉した環境ＤＮＡや環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料等を担体中に留める必要がある。さらに、採取した現場ですぐに核酸を分析するのは難しいことから、上記担体中に捕捉した環境ＤＮＡや環境ＲＮＡが分解されないように安定的に保持し、かつ分析の段階で担体から環境ＤＮＡや環境ＲＮＡを回収する必要が生じる。そこで本発明の課題は、保持力の高い担体を用いて環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉し、その後にその捕捉した環境ＤＮＡや環境ＲＮＡを効率よく上記担体から回収可能な方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、環境ＤＮＡのモデルとしてＤＮＡを含有する人工細胞を用いて実験を行った。ＤＮＡを捕捉する担体として天然海綿及び脱脂綿を用い、それらに上記人工細胞を流水により捕捉させ、その後その担体を加圧及び負圧することで人工細胞を回収し、その後ＤＮＡの回収を試みた。その結果、天然海綿又は脱脂綿を用いることで、一旦それらに捕捉した人工細胞を長時間保持できることを見出した。さらに、天然海綿又は脱脂綿を加圧及び負圧することにより捕捉された人工細胞の回収効率が高まり、その結果人工細胞中のＤＮＡの回収効率か高まることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］（ａ）環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を接触させて、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させる工程；
（ｂ）前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧する工程；
の（ａ）及び（ｂ）を順次備えた、前記環境試料から前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［２］前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料が、河川水、地下水、地表水、湖沼水、海水、下水、雨水、土壌、汚泥、又は大気であることを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［３］前記核酸捕捉担体が、海綿又は脱脂綿であることを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［４］工程（ａ）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有することを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［５］工程（ａ’）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に脱水し、次いで、前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程を含有することを特徴とする、上記［４］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［６］工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［７］工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［８］工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて、前記カテーテルシリンジ内で前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえで、前記核酸捕捉担体を保持したカテーテルシリンジをインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［９］工程（ａ）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有し、かつ、工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［１０］環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を３時間以上接触させることを特徴とする、上記［１］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
　さらに本発明は、以下の態様を有する。
［３’］前記核酸捕捉担体が、海綿又は脱脂綿であることを特徴とする、上記［１］又は［２］に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［４’］工程（ａ）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有することを特徴とする、上記［１］～［３］のいずれかに記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［６’］工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］～［５］のいずれかに記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［７’］工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］～［６］のいずれかに記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［８’］工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて、前記カテーテルシリンジ内で前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえで、前記核酸捕捉担体を保持したカテーテルシリンジをインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］～［７］のいずれかに記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［９’］工程（ａ）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有し、かつ、工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、上記［１］～［８］のいずれかに記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
［１０’］環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を１時間以上接触させることを特徴とする、上記［１］～［９］のいずれかに記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
　本発明の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法により、環境試料中に含まれる環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを長時間かつ累積的に捕捉すること、及びその捕捉した環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを核酸捕捉担体から効率よく回収することが可能となる。
実施例１で用いた水路実験施設の概要を示す図である。 実施例１において、台所スポンジ又は天然海綿を担体として用い、圧搾ジューサーで圧搾して回収した人工細胞に含まれるＤＮＡ量を示す図である。 実施例２のカテーテルシリンジに核酸捕捉担体を入れて、さらに人工細胞を流し入れる工程に用いた実験装置の概念図である。 実施例２において、天然海綿から４つの異なる工程によって回収したＤＮＡ量を示す図である。 実施例３において、凍結処理や界面活性処理（オスバン処理）を含む４群のフローを示す図である。 実施例３において、凍結処理や界面活性処理（オスバン処理）を含む４群におけるプロテアーゼ処理を経て回収したＤＮＡ量を示す図である。 実施例４において、天然海綿又は脱脂綿において、プロテアーゼ処理した場合の人工細胞２に含まれるＤＮＡ断片のＤＮＡ量及び人工細胞３に含まれるＤＮＡ断片のＤＮＡ量を示す図である。 実施例５において、３種類のプロテアーゼを用いた場合のＤＮＡの回収割合を調べた図である。 実施例６において、凍結なし、３０日－２０℃で凍結保存、３０日－８０℃で凍結保存した場合のＤＮＡの回収割合を調べた図である。 実施例７において、脱水状態若しくは含水状態で凍結なし、あるいは脱水状態若しくは含水状態で凍結ありの場合のＤＮＡの回収割合を調べた図である。 実施例８において、シュードモナスファージφ６又はマウスノロウイルスを捕捉した場合のＲＮＡの回収量を調べた図である。
　本明細書において、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡとは、水、土壌、大気などの環境中に存在する生物由来のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
◆工程（ａ）
　工程（ａ）において、核酸捕捉担体としては、柔軟性を有する多孔質材料からなり、核酸を捕捉可能な担体であれば特に制限されない。上記柔軟性とは、例えばカテーテルシリンジ内に入れて押し子で加圧若しくは負圧した場合等、加圧や負圧によって全体の形状又は中の多孔質の形状及びその表面の状態が変化しうる性質を挙げることができる。また、上記柔軟性を有する多孔質材料としては、海綿や、セルロース系繊維などの食物性繊維、ナイロンなどの化学繊維から形成された多孔質体を挙げることができる。
　上記多孔質を包含する海綿としては、天然海綿でも人工海綿でもよいが、天然海綿であることが好ましく、海綿動物門（Porifera）に属する海綿動物であることがより好ましく、アミノ酸を主成分とする海綿骨格繊維を含む普通海綿網であることがさらに好ましい。また、上記天然海綿は天然のままでもよいが、天然海綿の海綿骨格繊維を乾燥させたもの、いわゆる海綿スポンジや、それらを脱色加工されたものを用いてもよい。さらに、天然海綿の海綿骨格繊維を乾燥させたものとしてソフトシルク種やハニカム種の天然海綿を挙げることができる。なお、環境試料と接触させる際には、海綿を所定の大きさにカット若しくはブレンダー等で細断して用いてもよい。
　上記セルロース系繊維から形成された多孔質体としては、脱脂綿や天然の綿のほか、麻、レーヨン、パルプ、キュプラ等のセルロースを主原料とする繊維から形成された多孔質体を挙げることができる。
　工程（ａ）において、環境試料としては河川水、地下水、地表水、若しくは湖沼水などの陸水、海水、下水管路を流下する下水、管路を流下する雨水若しくは水道水、土壌、汚泥、又は大気などを挙げることができる。
　工程（ａ）において、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を接触させる方法は特に制限されないが、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料中に柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を沈める方法や、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料に浮かべる方法や、機器などによる吸入や排出部位に核酸捕捉担体を設置し環境ＤＮＡや環境ＲＮＡを含有する試料を接触若しくは通過させる方法や、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料中に浸潤する位置に核酸捕捉担体を固定する方法や、大気中に核酸捕捉担体を固定又はぶら下げる方法や、環境試料中で核酸捕捉担体を移動して暴露させる方法や、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体に環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料を流す方法を挙げることができる。具体的には河川若しくは下水管の底に上記核酸捕捉担体を沈める方法を挙げることができる。接触させる時間は、回収する環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡの解析目的に応じて適宜調整できるが、例えば１５分以上、３０分以上、１時間以上、３時間以上、１２時間以上、２４時間以上、３日以上、１週間以上、１ヶ月以上、３ヶ月以上を挙げることができる。また、上記環境試料は、野外の自然のままの状態が好ましいが、野外から採取した環境試料を用いてもよい。なお、環境試料が河川水、地下水、地表水、若しくは湖沼水などの陸水、海水、下水管路を流下する下水、管路を流下する雨水若しくは水道水等の水を主体とするものである場合には、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を接触させた後、必要に応じて採取した現場において水分を絞って、前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた核酸捕捉担体のみを持ち帰ればよく、これにより、重たい水を運ぶことや、下水等に含まれる非衛生的な物質の運搬や処分の手間を抑制することが可能となる。
　工程（ａ）において、核酸捕捉担体に環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉させるとは、核酸捕捉担体の表面、特に多孔質の表面や多孔質内に環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを保持させることを意味し、直接環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡが保持されてもよいが、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含む生物試料、たとえば哺乳動物の細胞又はバクテリアの全部又は一部の組織、環境試料中に存在する有機物などを含む浮遊物に吸着したもの、又はそれらが環境試料に含まれる水又は大気と共に保持される態様も包含する。環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含む生物試料としては、ＤＮＡを包含するＤＮＡウイルスやＲＮＡを包含するＲＮＡウイルスであってもよい。かかるウイルスとしては、エンベロープウイルスでもノンエンベロープウイルスでもよい。具体的には、後述の実施例に使用したマウスノロウイルス（ＭＮＶ）、シュードモナスファージφ６以外にも、ノロウイルス、ロタウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルスなどに代表される腸管系ウイルス、コロナウイルス，インフルエンザウイルスに代表される呼吸器感染ウイルスなど、動物、水生生物、植物、細菌などの生物に感染し、水環境若しくは大気中に存在するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを挙げることができる。
　工程（ａ）において、核酸捕捉担体に環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉させた後に核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有することができる。工程（ａ’）により、（１）捕捉後の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡがヌクレアーゼなどの生物活性や熱などの物理・化学的な影響によって分解されるのを抑制すること、（２）環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉させた核酸捕捉担体を長期保管することが可能となる。
　上記凍結の方法としては特に制限されないが、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉させた核酸捕捉担体を液体窒素やドライアイスで冷却して凍結する方法や、－８０℃や－２０℃等の冷凍ストッカーに置いて凍結する方法を挙げることができる。上記凍結は、上記核酸捕捉担体をそのまま直接凍結してもよいが、核酸捕捉担体をバッグ、チューブ、カテーテルシリンジなどに入れ、バッグ、チューブ、カテーテルシリンジなど自体を冷却することによって中の核酸捕捉担体を凍結してもよい。なお、工程（ａ）において、核酸捕捉担体を完全に凍結させずに、核酸捕捉担体をバッグバッグ、チューブ、カテーテルシリンジなどに入れ、バッグ、チューブ、カテーテルシリンジなど自体を冷却することによって中の核酸捕捉担体をドライアイスや氷などを用いて４℃以下、好ましくは０℃以下の環境下とし、ヌクレアーゼなどの生物活性を抑制可能な状態にしてもよい。
　また上記融解の方法としては特に制限されないが、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉させた核酸捕捉担体を室温又は４～１０℃の冷蔵条件下で融解する方法や、上記核酸捕捉担体を入れたバッグやチューブを流水処理又は４～１０℃の冷蔵条件下に静置して融解する方法を挙げることができる。
　工程（ａ’）において、核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に脱水し、次いで、前記核酸捕捉担体を凍結及び融解することもできる。上記脱水により、凍結で引き起こされる水分子の結晶化による核酸の断片化を抑制すること、若しくは生物活性を抑制することが可能となる。なお、ここでの脱水は完全に水を除去するだけでなく、加圧などにより絞って水分を除く程度で、水分が残存していることも含まれる。また、上記脱水の前に、前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有しない溶液で洗浄してもよい。この洗浄により海綿に付着した後の分子生物学分析（定量ＰＣＲなど）において阻害として働く夾雑物質を減らすことが可能となる。
◆工程（ｂ）
　工程（ｂ）において、核酸捕捉担体を加圧又は負圧するとは、核酸捕捉担体を容器に入れた状態で圧力を加える、若しくは圧力を減少させて核酸捕捉担体若しくは核酸捕捉担体の多孔質の形状が変化させるようにするものであればよいが、核酸捕捉担体が乾燥していない状態で加圧又は負圧することが好ましい。この加圧又は負圧によって、核酸捕捉担体に捕捉された環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料が核酸捕捉担体から離れやすくなり、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料の回収効率が向上することとなる。また、工程（ｂ）において、加圧及び負圧を行うことが好ましく、加圧及び負圧を１サイクルとして２サイクル以上、５サイクル以上、１０サイクル以上、若しくは２０サイクル以上行うことが好ましい。なお、加圧及び負圧を行う際に、蒸留水などの水を加えてもよい。
　工程（ｂ）において、加圧する方法は特に制限されないが、核酸捕捉担体を絞る方法のほか、核酸捕捉担体をカテーテルシリンジ等の容器に入れて押し子等で押すことで加圧する方法や、圧搾ジューサーなどで加圧する方法を挙げることができる。なお、本明細書において、核酸捕捉担体を加圧することを「圧搾する」ともいう。また、工程（ｂ）において、負圧する方法は特に制限されないが、核酸捕捉担体をカテーテルシリンジ等の容器に入れて押し子等で引くことで負圧する方法を挙げることができる。なお、カテーテルシリンジと押し子を用いる場合には、核酸捕捉担体に含まれる環境試料を筒先のみから漏出させるようにコントロールできることから、下水等の汚水を扱う場合において、作業者の衛生面での管理が容易となるほか、バクテリアなどによるコンタミネーションを抑制することが可能となる。
　工程（ｂ）において、核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで加圧又は負圧することもできる。プロテアーゼを用いることで、核酸捕捉担体と環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料との捕捉状態に変化を与え、環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料の回収効率を向上させることが可能となる。たとえば、核酸捕捉担体として海綿を用いた場合には、プロテアーゼが海綿の骨格成分の海綿質繊維、海綿質繊維に付着した生物細胞、若しくはバイオフィルムなどに作用することにより、核酸捕捉担体と環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料との捕捉状態に変化を与えることができる。
　上記プロテアーゼとしては特に制限されず、エンドペプチダーゼであってもエキソペプチダーゼであってもよい。また、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）、トリプシンなどのセリンプロテアーゼ、パパイン等のシステインプロテアーゼ、サーモリシンなどのメタプロテアーゼ、ペプシンなどのアスパルチルプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、またはプロナーゼなどのプロテアーゼ混合物を挙げることができ、これらを組み合わせて用いてもよい。また、特に、ヌクレアーゼを不活化する活性を有するプロテアーゼであることが環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡの分解を抑制する観点から好ましく、この点からプロテイナーゼＫが好ましい。核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させるには、プロテアーゼを含む溶液に核酸捕捉担体が浸潤するようにする方法を挙げることができる。また、上記プロテアーゼと共に別途ヌクレアーゼを不活化する活性を有するプロテアーゼを組み合わせて用いてもよい。
　また、工程（ｂ）において、核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて、カテーテルシリンジ内で核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえで、核酸捕捉担体を保持したカテーテルシリンジをインキュベートし、次いでカテーテルシリンジを加圧又は負圧することが好ましい。さらに、核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れた後に押し子を差し込み、次いでカテーテルシリンジ内で核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえで、核酸捕捉担体を保持したカテーテルシリンジに押し子を差し込んだままの状態でインキュベートし、次いで押し子を押す又は引くことによって核酸捕捉担体を加圧又は負圧することが好ましい。カテーテルシリンジを用いれば、カテーテルシリンジの筒先からプロテアーゼを含む溶液を吸引することによって、核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させることが可能となる。現在、下水や何らかの汚染物を含む環境試料を扱う場合には、防護服を着用した上で、環境試料が漏れないように細心の注意を払う必要があるが、上記カテーテルシリンジを用いれば環境試料をほぼ密封した状態で扱うことができ、作業者の安全性の観点で好ましい。さらに、上記工程によれば、野外で環境試料を採取し、その後の輸送過程やプロテアーゼ処理工程等において核酸捕捉担体にバクテリア等のコンタミネーションを防止しつつ、プロテアーゼの吸引から核酸捕捉担体の加圧又は負圧、さらには加圧による環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料の回収までの流れをカテーテルシリンジ内において一連で行うことができる。
　さらに、工程（ａ）において、核酸捕捉担体に環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉させた後に核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有し、かつ、工程（ｂ）において、核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで核酸捕捉担体を加圧又は負圧してもよい。凍結処理を行った後にプロテアーゼ処理を行うことで、より環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡの回収効率を高めることができる。さらに、工程（ａ）において、核酸捕捉担体に環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを捕捉させた後に核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて押し子をカテーテルシリンジに入れた上でカテーテルシリンジを凍結及び融解する工程（ａ’）を含有し、かつ、工程（ｂ）において、カテーテルシリンジの筒先からプロテアーゼを吸引することによって核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでカテーテルシリンジをインキュベートし、次いで押し子を押す又は引くことで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧してもよい。凍結処理を行った後にプロテアーゼ処理及び加圧又は負圧を行うことで、より環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡの回収効率を高めることができる。
　上記で得られた環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料は、必要に応じて環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを抽出して精製してもよい。精製する方法としては、濾紙等による濾過、カラム精製、市販の核酸精製キットを用いる方法等を用いることができる。
　また、得られた環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡは、例えば生物分類における目、科、属、種、株などにおいて共通に保存されている領域を増幅領域としたＰＣＲや、ターゲットとする生物又はウイルスを含んだ微生物が特異的に有する遺伝子の領域を増幅領域としたＰＣＲ等の解析を行うことができる。その解析によって、環境試料の採取場所における所定のバクテリア等の生物又はウイルスの存在の有無を調べることが可能である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
［実施例１］環境ＤＮＡの保持力（１）
　天然海綿の環境ＤＮＡ保持力を台所用スポンジと比較する実験を行った。環境ＤＮＡは多くの場合に環境中に放出された細胞片に内包若しくは付着しているが、細胞片は定量的な評価が難しいことから、環境ＤＮＡを内包する生物片のモデルとしてリポソーム内に特定の配列を持つＤＮＡ断片を内包させた人工細胞を用いた。
　上記人工細胞は、ＤＮＡ断片と、リン脂質（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）と１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）を原料として、上記ＤＮＡ断片を内包するリポソームを作製した（橋本電子社に作製依頼）。上記ＤＮＡ断片は、コイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ　ｃａｒｐｉｏ）の核ＤＮＡのＩＴＳ１（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　Ｓｐａｃｅｒ１）領域における配列番号１で示される塩基配列からなる核酸（ユーロフィンジェノミクス社にて合成）をｐＭＤ－２１ベクターに組み込み、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して培養した後に大腸菌から上記ベクターを回収し、かかる回収したベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで処理して直鎖状ＤＮＡとしたものを用いた。なお、作製したＤＮＡ断片を内包するリポソームは巨大単層リポソーム（ＧＵＶ）であり、作製後の濾過により粒子径は、１μｍから３５μｍの範囲に分布したものを用いた。なお、上記コイのＤＮＡ断片を内包するリポソームを人工細胞１とする。
　Ｃａｒｐ．　ＩＴＳ１　（配列番号１）
5’-TTCAAAGACC CCCCGTAACA GGGGGCGCCC GTCCGGGGTC ACGACCCCCC TTATTTTTTC CAAAACCCCT GTGTGCGGCA TGGC-3’
　実験は、図１に示す水路実験施設で行った。図１における配管は管径１０ｃｍ、配管の勾配は１／５０であり、水深１．０～３．０ｃｍとなるように水道水を流した。流速を一定にした水路の流水中に人工細胞を捕捉する担体としてポリウレタンフォーム製の台所用スポンジ（オーエ社）、又はソフトシルク種の天然海綿（朝日商会社）を配管の中央付近に設置した。上記各担体は、いずれも同じ容積、同じ重さであり、幅６ｃｍ、長さ８ｃｍ、高さ２ｃｍのステンレスカゴに、圧力を加えないまま収まるサイズに切り出して使用した。
　３０分間かけて人工細胞添加口に上記で作製したＤＮＡ断片を内包する人工細胞１を２．０×１０８ｃｏｐｉｅｓ添加することで、各担体に人工細胞１を捕捉させた。その後、人工細胞１を添加せずにそのまま３時間半ほど流水中に放置した。人工細胞１を３０ｍｉｎ添加直後、及び人工細胞１を３０ｍｉｎ添加後３時間半ほど流水中に放置した後（４時間後）、それぞれの担体を水路実験施設から取り出して回収し、以下の３つの群に分けて担体に捕捉した人工細胞１を回収した。
１回目（圧搾１回）：担体を圧搾ジューサー（アイデアセキカワ社）で圧搾して担体に捕捉した人工細胞１を含む圧搾液をボトルに回収
２回目（圧搾２回）：１回目で圧搾した各担体に蒸留水１００ｍＬを加えて、再度上記圧搾ジューサーで圧搾して担体に捕捉した人工細胞１を含む圧搾液をボトルに回収
３～１０回目（圧搾３～１０回）：２回目で圧搾した各担体に蒸留水１００ｍＬを加えて、再度上記圧搾ジューサーで圧搾して担体に捕捉した人工細胞１を回収し、その後１０回目まで同様に蒸留水の添加及び圧搾を繰り返して得た圧搾液を同じボトルに回収（３～１０回目は天然海綿のみ）
　それぞれの回収した液は、ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｆ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン製）で濾過し、回収した液に含有されている担体に捕捉した人工細胞１をガラス繊維濾紙上に捕捉した。濾紙上に捕捉された人工細胞１は、ＤＮＡ抽出キットであるＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを抽出し、その後以下のプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲを行った。なお、プローブは配列番号４に示される塩基配列からなる核酸の５’末端にレポーターとしてＦＡＭ、３’末端にクエンチャーであるＢＨＱ１が連結したプローブを用いた。ＤＮＡ量は、得られたＤＮＡコピー数（ｃｏｐｉｅｓ）の平均値から、担体１ｃｍ3中のコピー数を算出して得た（ｃｏｐｉｅｓ／ｃｍ３）。
Ｃａｒｐ．　ＩＴＳ１の増幅
フォワードプライマー：5’-TTCAAAGACC CCCCGTAAC-3’（配列番号２）
リバースプライマー　：5’-GCCATGCCGC ACACA-3’（配列番号３）
プローブ　　　　　　：5’-TCACGACCCC CCTTATTTTT TCCAAAACC-3’（配列番号４）
　ＰＣＲの反応液組成は以下で行った。
ＥＭＭ＊１）　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　　μＬ
ウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）　　　　０．１μＬ
２０×プライマー・プローブ＊２）　　　　　　　　０．５μＬ
テンプレートＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　２　　μＬ
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．４μＬ
反応液量　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　μＬ
＊１：2x TaqMan Environmental MasterMix (Thermofisher Scientific社)
＊２：上記フォアードプライマー、リバースプライマー、プローブ、ＴＥバッファーを混合
　また、ＰＣＲの反応は以下で行った。
（１）　初期変性５５℃　　１２０秒
（２）　熱変性　９５℃　　３００秒
（３）　アニーリング及び伸張反応　６０℃　６０秒
（４）　（２）及び（３）を５５サイクル
　それぞれの担体において上記１回目（圧搾１回）及び上記２回目（圧搾２回）の記載の方法で回収した人工細胞１から抽出したＤＮＡ量の結果を図２に示す。横軸の「３０ｍｉｎ」は人工細胞１を３０ｍｉｎ添加直後、「４ｈ」は人工細胞１を３０ｍｉｎ添加直後に３時間半ほど流水中に放置し、その後（４時間後）に回収したそれぞれの担体１ｃｍ３あたりから回収されたＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／ｃｍ３）である。上記１回目（圧搾１回）で回収した人工細胞１と２回目（圧搾２回）で回収した人工細胞１から抽出したＤＮＡ量の結果を比較すると、台所用スポンジでは３０ｍｉｎ、４ｈの場合のいずれも減少していたが、天然海綿では３０ｍｉｎの場合は増加し、４ｈの場合でも台所スポンジと比較して減少率が低かった。また、４ｈの場合に着目すると、天然海綿では台所用スポンジと比較して１回目（圧搾１回）で７倍以上、２回目（圧搾２回）で３７倍以上も多くのＤＮＡを回収していた。なお、天然海綿（４ｈ）を３、５、７、又は１０回繰り返し圧搾回収したところ、１０回目（圧搾１０回）であっても２回目（圧搾２回）と比較して６０％程度のＤＮＡを回収できた（図示無し）。
　上記結果から、台所スポンジから回収したＤＮＡは間隙水に含まれているＤＮＡが主であり、台所スポンジの表面に保持されているＤＮＡ（又は人工細胞１）はほとんどないものと考えられた。一方、天然海綿は間隙水に含まれているＤＮＡ以外にも、天然海綿の表面に保持された状態で捕捉されているＤＮＡ（又は人工細胞１）が相当量あることが示唆された。また、天然海綿を用いれば、少なくとも３時間半もＤＮＡが天然海綿内に保持されており、圧力を加えて圧搾することで回収しやすいこと、及び繰り返し圧搾することでより多くのＤＮＡを回収することが確認された。
［実施例２］天然海綿からのＤＮＡの回収
　上記実施例１により、特に天然海綿はＤＮＡや人工細胞の保持力が高いことが明らかとなった。そこで、次に、天然海綿からのＤＮＡを効率よく回収するための方法を検討した。まず、実施例１と同様に、人工細胞としてＤＮＡ断片を内包するリポソームを作製した。ＤＮＡ断片としては、実施例１の記載と同じコイの核ＤＮＡのＩＴＳ１領域における配列番号１で示される塩基配列からなる核酸を含む直鎖状ＤＮＡを用いた。
　図３に示すようにアスピレーターの上にガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｆ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社）を介してカテーテルシリンジ（５０ｍＬ　ＳＳ－５０ＣＺ：テルモ社）の筒先を連結した。次に、カテーテルシリンジ内に平均０．５ｇ程度に揃えたほぼ同じ容積のソフトシルク種の天然海綿を核酸捕捉担体として入れて、２．０×１０８ｃｏｐｉｅｓの人工細胞１を含有するＴＥ　ｂｕｆｆｅｒを流し入れてアスピレーターを用いて－４０～－５０ｋＰａで吸引して人工細胞１を天然海綿に捕捉させた。さらに１００ｍｌの洗浄処理液（蒸留水を使用）を加えて洗浄し、再度アスピレーターで吸引することで捕捉しなかった人工細胞１を除去すると共に、吸引による脱水状態とした。
次に、以下の表１に示す比較例（Ａ）～（Ｃ）又は実施例（２－Ａ）の工程によって上記ＤＮＡ断片又は上記人工細胞１を含有する液を５０ｍＬチューブに回収した。
　比較例Ａでは、人工細胞１を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジから上記天然海綿を取り出し、圧搾ジューサー（アイデアセキカワ社）に入れ１回目の圧搾を行いボトルに回収した。さらに、蒸留水４０ｍＬを加え、２回目の圧搾を行うことで人工細胞１を含んだ圧搾液を１回目と同じボトルに回収した。
　比較例Ｂでは、上記人工細胞１を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジに押し子を差し込み、押し子を押すことで１回加圧してカテーテルシリンジの筒先から１回目の圧搾液をボトルに回収した。次に、蒸留水４０ｍＬを加えて天然海綿が蒸留水に浸るようにした。その後、カテーテルシリンジに押し子を差し込み、押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを１０回繰り返し、最後に加圧することで圧搾液を１回目と同じボトルに回収した。
　比較例Ｃでは、上記人工細胞１を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジに押し子を差し込み、押し子を押すことで１回加圧してカテーテルシリンジの筒先から１回目の圧搾液をボトルに回収した。次に、ＮａＯＨ溶液（ｐＨ１０．８）４０ｍＬをカテーテルシリンジに加えて天然海綿にＮａＯＨ溶液が浸るようにした。その後、カテーテルシリンジに押し子を差し込み、押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを１０回繰り返し、最後に加圧することで圧搾液を１回目と同じボトルに回収した。圧搾液は、×１００　Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ　ｂｕｆｆｅｒ　４０μＬ、および０．２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４　２００μＬを添加し、中和を行った。
　実施例２－Ａでは、上記人工細胞１を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジに押し子をゆっくり差し込み、次に上記人工細胞１を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジの筒先に１０００μＬのチップを付けて、押し子を引いてＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで調製したプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）：２９４４２－８５：ナカライテスク））溶液２０ｍＬ（１０Ｕ／ｍＬ）を処理液としてカテーテルシリンジに吸引した。その後押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返してＰｒｏＫを天然海綿に均等に浸潤させた。なお、押し子を押してカテーテルシリンジの筒先から出た溶液は５０ｍＬチューブに回収し、押し子を引くことでその溶液をカテーテルシリンジ内に回収した。空気を抜くために、１～２回、カテーテルシリンジにカテーテルチップシリンジ用キャップ（ＥＤ－ＣＰ：テルモ社）をした状態でキャップ側を上にして、強くカテーテルシリンジを振り天然海綿を落としたあと上記キャップを外して上部から空気を抜いた。次いで、上記キャップを装着し、押し子が挿入されたカテーテルシリンジのまま転倒混和機（ＲＨ－２４、３Ｄ　Ｇｙｒａｔｏｒｙ　Ｒｏｃｋｅｒ　：ＭＵＩＬＡＢ社）に載せて５６℃で１時間反応させた。最後に上記キャップを外した後、加圧することで圧搾液をボトルに回収し、さらにＤＮＡの天然海綿への再捕捉を抑制するために、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社）に付属のバッファーを吸引し、加圧して先に回収した圧搾液と混合し、押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返した後、ＤＮＡ含有溶液を、付属のバッファーを１担体に使用する量を分注していたボトルに回収した。
　上記比較例Ａ～Ｃで得られた洗浄液はガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｆ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社）で濾過し、回収した液に含有されている人工細胞１をガラス繊維濾紙上に捕捉した。濾紙上に捕捉された人工細胞１は、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社）を用いて上記実施例１と同様にＤＮＡを抽出した。また、上記実施例２－Ａは、上記ＤＮＡ含有溶液を上記ＤＮｅａｓｙのキットのカラムにアプライし、推奨のプロトコルに沿ってＤＮＡを抽出した。その後、それぞれの抽出したＤＮＡをテンプレートとし、実施例１に記載の配列番号２～４のプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲを行った。ＤＮＡ量は、得られたＤＮＡコピー数（ｃｏｐｉｅｓ）の平均値から、担体あたりのコピー数を算出して得た（ｃｏｐｉｅｓ／担体）。
　結果を図４に示す。実施例２－ＡのＰｒｏＫ処理後の加圧／負圧サイクル工程を行った場合には、比較例Ａ～Ｃに対して飛躍的にＤＮＡの回収量が多いことが明らかとなった。また、加圧／負圧サイクルを繰り返すこと、特に負圧により天然海綿が捕捉したＤＮＡ又は人工細胞１が剥がれやすくなったことがＤＮＡの回収量の向上につながったものと考えられる。
［実施例３］天然海綿からのＤＮＡの回収－２
　天然海綿に捕捉した核酸の分解を抑え、検出・定量の向上を目的とし、実施例２に記載したプロテアーゼ処理の前処理として、凍結処理又は界面活性剤処理について検討した。
　まず、実施例１と同様に、人工細胞としてＤＮＡ断片を内包するリポソームを作製した。ＤＮＡ断片としては、上記実施例１と同じコイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ　ｃａｒｐｉｏ）の核ＤＮＡのＩＴＳ１領域における配列番号１で示される塩基配列からなる核酸を含む直鎖状ＤＮＡを用いた。
　次に、実施例２と同様にアスピレーターの上にガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｆ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社）を介してカテーテルシリンジ（５０ｍＬ　ＳＳ－５０ＣＺ：テルモ社）の筒先を連結した。次に、カテーテルシリンジ内に平均０．５ｇ程度に揃えたほぼ同じ容積のソフトシルク種の天然海綿を入れて、２．０×１０８ｃｏｐｉｅｓの人工細胞１を含有する溶液を流し入れてアスピレーターを用いて－４０～－５０ｋＰａで吸引することで人工細胞１を海綿に捕捉させた。さらに１００ｍｌの洗浄処理液（蒸留水を使用）を加えて洗浄し、再度アスピレーターで吸引することで捕捉しなかった人工細胞１を除去した。
　上記で蒸留水をできるだけ除去した後、図５に示すように、プロテアーゼ処理前に凍結処理、ベンザルコニウム塩化物（オスバン）処理＋洗浄なし、ベンザルコニウム塩化物（オスバン）処理＋１回洗浄又は処理無しの４つの群に分けた。
（１）凍結処理
　上記人工細胞１を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジに押し子をゆっくり差し込み、次に押し子を差した状態でカテーテルシリンジをそのまま－２０℃で３時間凍結保存し、その後流水融解して上記実施例２－Ａの記載と同じ方法によりカテーテルシリンジにＰｒｏＫを吸引してプロテアーゼ処理を行った。
（２）ベンザルコニウム塩化物（オスバン）処理＋洗浄なし
　核酸の分解抑制を目的としてオスバン（オスバンＳ　ベンザルコニウム塩化物（塩化ベンザルコニウム）１０ｗ／ｖ％水溶液：日本製薬社）２０ｍＬをカテーテルシリンジに添加した。３０分静置後、押し子を押して加圧することによりオスバンを除去した。次に上記凍結処理と同様にカテーテルシリンジにＰｒｏＫを吸引してプロテアーゼ処理を行った。
（３）ベンザルコニウム塩化物（オスバン）処理＋洗浄
　オスバン（１．０ｍＬ／Ｌ）２０ｍＬをカテーテルシリンジに添加した。３０分静置後、押し子を押して加圧することによりオスバンを除去した。次に５０ｍＬの蒸留水を加えた後に押し子を押して加圧することにより洗浄後に上記凍結処理と同様にカテーテルシリンジにＰｒｏＫを吸引してプロテアーゼ処理を行った。
（４）処理なし
　上記凍結処理、オスバンの処理をすることなくカテーテルシリンジにＰｒｏＫを吸引してプロテアーゼ処理を行った。
　上記４群それぞれ、その後実施例２における２－Ａと同様にＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社）に付属のバッファーを吸引し、加圧して先に回収した圧搾液と混合し、５回の加圧／負圧サイクル後にＤＮＡ含有溶液を回収し、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを抽出した。その後、それぞれの抽出したＤＮＡをテンプレートとし、実施例１に記載の配列番号２～４のプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲを行って担体あたりのＤＮＡコピー数（ｃｏｐｉｅｓ／担体）を算出してＤＮＡ量とした。結果を図６に示す。
　図６に示すように、凍結処理をすることによって、ＤＮＡの回収が処理なしと比較して２倍以上となった。また、「オスバン処理＋洗浄なし」は「処理なし」の場合と比較してややＤＮＡ回収が低下し、さらに「オスバン処理＋１回洗浄」では、「洗浄なし」の場合と比較して８割程度ＤＮＡ回収率が低下していた。一般的に凍結融解処理を行うと核酸の収率が低下する可能性があったが、凍結処理によるＤＮＡ回収率の２倍以上の向上は驚くべき結果であった。
［実施例４］環境ＤＮＡの保持力（２）
　環境ＤＮＡおよび環境ＲＮＡの解析においては、担体を流水中に所定の時間静置して環境ＤＮＡおよび環境ＲＮＡを担体に捕捉させる場合には、担体に捕捉した環境ＤＮＡが担体中に所定の時間保持されなければ、その後の解析で担体を回収した直前に担体に捕捉された環境ＤＮＡしか検出できない。そこで、担体として天然海綿及び脱脂綿を用いて、人工ＤＮＡの経時的な保持力を調べた。
　実施例１と同様に、人工細胞としてＤＮＡ断片を内包するリポソームを作製した（片山化学工業社に作製依頼）。ただし、リポソームは実施例１と同じであるが、ＤＮＡ断片としては、上記実施例１におけるコイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ　ｃａｒｐｉｏ）の核ＤＮＡのＩＴＳ１領域における配列番号１で示される塩基配列からなる核酸の代わりに、配列番号５で示される塩基配列からなるジンベイザメとライオンのキメラ人工遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社にて合成）又は配列番号６で示される塩基配列からなるシロナガスクジラとアイゾメヤドクガエルのキメラ人工遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社にて合成）をｐＥＸ－Ａ２Ｊ２ベクターに組み込み、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して培養した後に大腸菌からベクターを回収し、その回収したベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで処理して直鎖状ＤＮＡとしたものを用いた。なお、シロナガスクジラとアイゾメヤドクガエルのキメラ人工遺伝子を含むＤＮＡ断片を内包するリポソームを人工細胞２、ジンベイザメとライオンのキメラ人工遺伝子を含むＤＮＡ断片を内包するリポソームを人工細胞３とする。
ジンベイザメとライオンのキメラ人工遺伝子：（配列番号５）
5’-ATGACCAACATTCGAAAATCCTGAGGAGCTACAGTTATCACTAACCTCCTATCCGCCTTCCCCTACATTGGCTCATCAGTCACCCACATTTGCCGCGATGTAAACTATGGCTGAATTATCCGGTACCTACACATGGCCACAAACATCCGAAA-3’
シロナガスクジラとアイゾメヤドクガエルのキメラ人工遺伝子：（配列番号６）
5’-ATCATACGCAAAACCCACCCCAACCTCCTATCAGCAATCCCATACATTGGTACTACCCTAGTCGAATGAATCTGAGGCGGTTTCACGCCAACGGCGCCTCTTTCTTCTTCATCTGTATCTACCTTCACATCGGCCGATGACCAACATCCGAAAAAC-3’
　実験は、上記図１に示す水路実験施設で行った。流速を一定にした水路の流水中に人工細胞を捕捉する担体としてソフトシルク種の天然海綿（朝日商会社）、又は脱脂綿（品番001-010070：イワツキ社）を設置した。なお、脱脂綿は１ｃｍ３で平均７．３ｇであった。
　３０分間かけて人工細胞添加口に上記で作製した人工細胞２を２．０×１０８ｃｏｐｉｅｓを含む溶液を添加することで、各担体に人工細胞２を捕捉させた。その後、人工細胞を添加せずにそのまま３時間流水中に放置した。次に、３０分間かけて人工細胞添加口に上記で作製した人工細胞３を２．０×１０８ｃｏｐｉｅｓを含む溶液を添加した。人工細胞３を３０ｍｉｎ添加直後、それぞれの担体を水路実験施設から取り出して回収し、以下プロテアーゼ（ＰｒｏＫ）処理を行い、人工細胞２及び人工細胞３に含まれるそれぞれのＤＮＡを抽出した。
　プロテアーゼ（ＰｒｏＫ）処理： 
　人工細胞２及び人工細胞３を捕捉させた天然海綿又は脱脂綿を取り出し、カテーテルシリンジ内に入れた。そして、カテーテルシリンジに押し子をゆっくり差し込み、次に実施例２－Ａと同様にカテーテルシリンジの筒先に１０００μＬのチップを付けて、押し子を引いてＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで調製したプロテアーゼのプロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ：２９４４２－８５：ナカライテスク）溶液２０ｍＬ（１０Ｕ／ｍＬ）を処理液としてカテーテルシリンジに吸引した。その後押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返してＰｒｏＫを天然海綿又は脱脂綿に均等に浸潤させた。空気を抜くために、１～２回、カテーテルシリンジにカテーテルチップシリンジ用キャップ（ＥＤ－ＣＰ：テルモ社）をした状態でキャップ側を上にして、強くカテーテルシリンジを振り天然海綿又は脱脂綿を落としたあとキャップを外して上部から空気を抜いた。次いで、上記キャップを装着し、押し子が挿入されたカテーテルシリンジのまま転倒混和機（ＲＨ－２４、３Ｄ　Ｇｙｒａｔｏｒｙ　Ｒｏｃｋｅｒ　：ＭＵＩＬＡＢ）に載せて５６℃で１時間反応させた。最後にキャップを外した後、加圧することで圧搾液をボトルに回収し、さらにＤＮＡの天然海綿又は脱脂綿への再捕捉を抑制するために、ＤＮｅａｓｙに付属のバッファーを吸引し、加圧して先に回収した圧搾液と混合し、押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返した後、ＤＮＡ含有溶液を別のボトルに回収した。さらに上記ＤＮＡ含有溶液をＷａｓｔｅｗａｔｅｒ　Ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ／ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（プロメガ社）を用いてダイレクトキャプチャー法によりＤＮＡを抽出した。
　その後、プロテアーゼ（ＰｒｏＫ）処理によって抽出したＤＮＡをテンプレートとし、以下のプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲを行った。なお、プローブは配列番号７又は１０に示される塩基配列からなる核酸の５’末端にレポーターとしてＦＡＭ、３’末端にクエンチャーであるＢＨＱ１が連結したプローブを用いた。ＤＮＡ量は、得られたＤＮＡコピー数（ｃｏｐｉｅｓ）の平均値から、担体１ｃｍ3中のコピー数を算出して得た（ｃｏｐｉｅｓ／ｃｍ３）。そして、担体を回収する４時間前に添加した人工細胞２に含まれるＤＮＡ断片のＤＮＡ量と、担体を回収する３０分前に添加した人工細胞３に含まれるＤＮＡ断片のＤＮＡ量を比較することで、担体の保持特性を明らかにすることとした。
ジンベイザメとライオンのキメラ人工遺伝子の増幅
フォワードプライマー：5’-CTGAGGAGCTACAGTTATCACTAACC-3’（配列番号７）
リバースプライマー　：5’-GTGTAGGTACCGGATAATTCAGCC-3’　（配列番号８）
プローブ　　　　　　：5’-CCTACATTGGCTCATCAGTCACCCAC-3’（配列番号９）
シロナガスクジラとアイゾメヤドクガエルのキメラ人工遺伝子の増幅
フォワードプライマー：5’-CAACCTCCTATCAGCAATCCCATAC-3’　（配列番号１０）
リバースプライマー　：5’-CGGCCGATGTGAAGGTAGATAC-3’　　 （配列番号１１）
プローブ　　　　　　：5’-CGAATGAATCTGAGGCGGTTTCACGCC-3’（配列番号１２）
　ＰＣＲの反応液組成及びＰＣＲの反応は実施例１の記載と同じ条件で行った。
　結果を図７に示す。縦軸のＤＮＡ量は回収された担体１ｃｍ3中のＤＮＡコピー数を算出したもの（ｃｏｐｉｅｓ／ｃｍ３）であり、同じ実験をそれぞれの担体で３回行った平均値である。天然海綿だけでなく脱脂綿を担体として用いた場合も、ＰｒｏＫ処理によって効率的にＤＮＡを回収できることが確認された。さらに、天然海綿、脱脂綿のいずれも、担体を回収する３０分前に添加した人工細胞３に含まれるＤＮＡ断片だけでなく、担体を回収する４時間前に添加した人工細胞２に含まれるＤＮＡ断片も回収できることが明らかとなった。したがって、脱脂綿においてもＰｒｏＫ処理によってＤＮＡ回収効率が向上することや、天然海綿、脱脂綿のいずれも累積的に捕捉したＤＮＡを長期間保持する能力が高いことが明らかとなった。
［実施例５］他のプロテアーゼの検討
　上記実施例２～４ではプロテアーゼとしてＰｒｏＫを用いたが、他のプロテアーゼについても検討を行った。また、上記実施例２、３では回収されたＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／担体）、上記実施例４では回収されたＤＮＡ量（ｃｏｐｉｅｓ／ｃｍ３）でＤＮＡの回収の評価を行ったが、本実施例では、ＤＮＡの添加量Ｓ（ｃｏｐｉｅｓ）に対する回収したＤＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）の割合δ（Ｋ／Ｓ）でＤＮＡの回収の評価を行った。人工細胞としては実施例４で作製した、ジンベイザメとライオンのキメラ人工遺伝子を含むＤＮＡ断片を内包するリポソームである人工細胞３を用いた。
　上記図３に示すようにアスピレーターの上にガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｆ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社）を介してカテーテルシリンジ（５０ｍＬ　ＳＳ－５０ＣＺ：テルモ社）の筒先を連結した。次に、カテーテルシリンジ内に平均０．５ｇ程度に揃えたほぼ同じ容積のソフトシルク種の天然海綿を核酸捕捉担体として入れて、２．０×１０８ｃｏｐｉｅｓの人工細胞３を含有するＰＢＳ（－）（カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水：日水製薬社）１００ｍＬを流し入れてアスピレーターで吸引して人工細胞３を天然海綿に捕捉させた。さらに１００ｍｌの洗浄処理液（蒸留水を使用）を加えて洗浄し、再度アスピレーターで吸引することで捕捉しなかった人工細胞３を除去した。
　上記人工細胞３を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジに押し子をゆっくり差し込み、押し子を差した状態でカテーテルシリンジをそのまま－２０℃で一晩凍結保存し、その後流水融解した。次に、筒先に１０００μＬのチップを付けて、押し子を引いてＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで調製したプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）：２９４４２－８５：ナカライテスク）溶液２０ｍＬ（１０Ｕ／ｍＬ）、サーモリシン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ：１０Ｕ／ｍＬ：Ｍｅｒｃｋ社）、又はプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ：１０Ｕ／ｍＬ：ロシュ・ダイアグスティック社）を酵素処理液としてカテーテルシリンジに吸引した。その後押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返して（５反復）ＰｒｏＫを天然海綿に均等に浸潤させた。
　空気を抜くために、１～２回、カテーテルシリンジにカテーテルチップシリンジ用キャップ（ＥＤ－ＣＰ：テルモ社）をした状態でキャップ側を上にして、強くカテーテルシリンジを振り天然海綿を落としたあと上記キャップを外して上部から空気を抜いた。次いで、上記キャップを装着し、押し子が挿入されたカテーテルシリンジのまま転倒混和機（ＲＨ－２４、３Ｄ　Ｇｙｒａｔｏｒｙ　Ｒｏｃｋｅｒ　：ＭＵＩＬＡＢ社）に載せてＰｒｏＫは５６℃、サーモリシンは７０℃、プロナーゼは３７℃で１時間反応させた。最後に上記キャップを外した後、加圧することで圧搾液をボトルに回収し、さらにＤＮＡの天然海綿への再捕捉を抑制するために、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）　ＲＳＣ　Ｅｎｖｉｒｏ　ＴＮＡ　ｋｉｔに付属のバッファーを吸引し、加圧して先に回収した圧搾液と混合し、押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返した後、ＤＮＡ含有溶液を、上記付属のバッファーを１担体に使用する量を分注していたボトルに回収した。
　上記ＤＮＡ含有溶液を上記Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）　ＲＳＣ　Ｅｎｖｉｒｏ　ＴＮＡ　ｋｉｔキットのカラムにアプライし、推奨のプロトコルに沿ってＤＮＡを抽出した。その後、それぞれの抽出したＤＮＡをテンプレートとし、配列番号７～９のプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲを行って回収したＤＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）を求めた。さらに、回収したＤＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）を添加したＤＮＡの添加量Ｓ（ｃｏｐｉｅｓ）で割って、添加したＤＮＡ量に対する回収したＤＮＡの割合δ（Ｋ／Ｓ）を算出した。結果を図８に示す。
　図８により、ＰｒｏＫ以外にサーモリシンやプロナーゼを用いてもＤＮＡを回収できることが確認された。
［実施例６］長期凍結保存及び凍結温度による回収率への影響の検討
　実施例３において凍結処理によるＤＮＡ回収効率の向上効果について確認したが、長期凍結保存及び凍結温度による回収率への影響を検討した。
　実施例４と同じ方法でジンベイザメとライオンのキメラ人工遺伝子を含むＤＮＡ断片を内包するリポソームである人工細胞３を調製し、カテーテルシリンジ内の天然海綿に人工細胞３を捕捉させ、蒸留水で洗浄した。
　上記人工細胞３を捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジに押し子をゆっくり差し込み、押し子を差した状態でカテーテルシリンジを（１）凍結無し、（２）そのまま－２０℃で３０日凍結保存、その後流水融解、（３）そのまま－８０℃で３０日凍結保存し、その後流水融解の３群に分け、それぞれその後実施例５と同様にカテーテルシリンジにＰｒｏＫを吸引してプロテアーゼ処理を行った。なお、上記（１）凍結なしは、カテーテルシリンジに押し子をゆっくり差し込んだあと、保存せずにそのままプロテアーゼ処理を行った。
　その後（１）～（３）それぞれＤＮＡを抽出し、配列番号７～９のプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲを行って回収したＤＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）を求めた。さらに、回収したＤＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）を添加したＤＮＡの添加量Ｓ（ｃｏｐｉｅｓ）で割って、添加したＤＮＡ量に対する回収したＤＮＡ量の割合δ（Ｋ／Ｓ）を算出した。結果を図９に示す。
　図９より、凍結なしと比較して－２０℃の凍結保存でおよそ１．８倍、－８０℃の凍結保存でおよそ２倍のＤＮＡが回収された。したがって、３０日の長期凍結保存を行っても、高いＤＮＡの回収率が維持されていること、及び－８０℃で保存した場合は、より回収率が向上することが確認された。
［実施例７］凍結時の含水状態による回収率への影響の検討
　実施例３及び６において凍結処理の効果について確認したが、凍結時の水分含有状態による回収率への影響を検討した。
　上記人工細胞３を捕捉させた天然海綿を入れ、２．０×１０８ｃｏｐｉｅｓの人工細胞３を含有するＰＢＳ（－）１００ｍＬを流し入れてアスピレーターで吸引して人工細胞３を天然海綿に捕捉させた。さらに１００ｍｌの洗浄処理液（蒸留水を使用）を加えて洗浄し、再度アスピレーターで吸引することで捕捉しなかった人工細胞３を除去した。
　次にカテーテルシリンジに押し子を差し込み、（１）押し子をシリンジの先まで押すことで天然海綿を加圧して脱水、（２）押し子で天然海綿を加圧して脱水後に、１００ｍｌの蒸留水を添加、の（１）と（２）の２つの群に分け、それぞれその後に凍結無し若しくは－８０℃で一晩凍結保存及び流水融解した。次に、実施例５と同様にそれぞれのカテーテルシリンジにＰｒｏＫを吸引してプロテアーゼ処理を行った。そして、ＤＮＡを抽出し、配列番号７～９のプライマー、プローブセットを用いた定量ＰＣＲを行って回収したＤＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）を求めた。さらに、回収したＤＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）を添加したＤＮＡの添加量Ｓ（ｃｏｐｉｅｓ）で割って、添加したＤＮＡ量に対する回収したＤＮＡの割合δ（Ｋ／Ｓ）を算出した。結果を図１０に示す。
　図１０より、凍結なし、凍結ありのいずれも含水状態と比較して脱水状態の方がおよそ１．５倍のＤＮＡが回収された。したがって、凍結前に核酸捕捉担体から水分をできるだけ吸引して除去した方がＤＮＡの回収率が高まることが確認された。
［実施例８］ＲＮＡの回収
　実施例１～７ではＤＮＡの回収を行ったが、ＲＮＡの回収についても試みた。上記図３に示すようにアスピレーターの上にガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｆ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社）を介してカテーテルシリンジ（５０ｍＬ　ＳＳ－５０ＣＺ：テルモ社）の筒先を連結した。次に、カテーテルシリンジ内に平均０．５ｇ程度に揃えたほぼ同じ容積のソフトシルク種の天然海綿を核酸捕捉担体として入れて、２本鎖ＲＮＡを有するシュードモナスファージφ６（１．６７×１０８コピー）、又は一本鎖（＋）ＲＮＡを有するマウスノロウイルス（１．６４×１０７コピー）を含有するＰＢＳ（－）（カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）１００ｍＬを流し入れてアスピレーターで吸引してそれぞれのウイルスを天然海綿に捕捉させた。さらに１００ｍｌの洗浄処理液（蒸留水を使用）を加えて洗浄し、再度アスピレーターで吸引することで捕捉しなかったウイルスを除去した。
　上記それぞれのウイルスを捕捉させた天然海綿を入れたカテーテルシリンジに押し子をゆっくり差し込み、次に筒先に１０００μＬのチップを付けて、押し子を引いてＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで調製したプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ（ＰｒｏＫ）：２９４４２－８５：ナカライテスク））溶液２０ｍＬ（１０Ｕ／ｍＬ）を酵素処理液としてカテーテルシリンジに吸引した。その後押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返して（５反復）ＰｒｏＫを天然海綿に均等に浸潤させた。
　空気を抜くために、１～２回、カテーテルシリンジにカテーテルチップシリンジ用キャップ（ＥＤ－ＣＰ：テルモ社）をした状態でキャップ側を上にして、強くカテーテルシリンジを振り天然海綿を落としたあと上記キャップを外して上部から空気を抜いた。次いで、上記キャップを装着し、押し子が挿入されたカテーテルシリンジのまま転倒混和機（ＲＨ－２４、３Ｄ　Ｇｙｒａｔｏｒｙ　Ｒｏｃｋｅｒ　：ＭＵＩＬＡＢ社）に載せて５６℃で１時間反応させた。最後に上記キャップを外した後、加圧することで圧搾液をボトルに回収し、さらにＲＮＡの天然海綿への再捕捉を抑制するために、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）　ＲＳＣ　Ｅｎｖｉｒｏ　ＴＮＡ　ｋｉｔに付属のバッファーを吸引し、加圧して先に回収した圧搾液と混合し、押し子を押すことで加圧、及び押し子を引くことで負圧の加圧／負圧サイクルを５回繰り返した後、ＲＮＡ含有溶液を、付属のバッファーを１担体に使用する量を分注していたボトルに回収した。
　上記ＲＮＡ含有溶液をＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）　ＲＳＣ　Ｅｎｖｉｒｏ　ＴＮＡ　ｋｉｔのカラムにアプライし、推奨のプロトコルに沿ってＲＮＡを抽出した。その後、配列番号７～９のプライマー、プローブセットを用いた逆転写定量ＰＣＲ（Ｍａｓｔｅｒ　ＭＩＸ：ＴａｑＭａｎTMＦａｓｔ　Ｖｉｒｕｓ　１－Ｓｔｅｐ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｆｏｒ　ｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））を行って回収したＲＮＡ量Ｋ（ｃｏｐｉｅｓ）を求めた。結果を図１１に示す。
　図１１より、シュードモナスファージφ６、マウスノロウイルスのいずれも１×１０４以上回収可能であることが確認された。
　環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法を用いれば、環境試料を採取する現地での作業は簡便かつ迅速であり、かつ環境試料から効率的に環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収することが可能となることから、河川、沿岸における生物調査、下水中のウイルスや微生物調査等に利用可能である。

Claims (10)

  1. （ａ）環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を接触させて、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させる工程；
    （ｂ）前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧する工程；
    の（ａ）及び（ｂ）を順次備えた、前記環境試料から前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  2. 前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料が、河川水、地下水、地表水、湖沼水、海水、下水、雨水、土壌、汚泥、又は大気であることを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  3. 前記核酸捕捉担体が、海綿又は脱脂綿であることを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  4. 工程（ａ）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有することを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  5. 工程（ａ’）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に脱水し、次いで、前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程を含有することを特徴とする、請求項４に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  6. 工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて加圧又は負圧することを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  7. 工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  8. 工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をカテーテルシリンジに入れて、前記カテーテルシリンジ内で前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえで、前記核酸捕捉担体を保持したカテーテルシリンジをインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  9. 工程（ａ）において、前記核酸捕捉担体に前記環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡ若しくはそれらを含む生物試料を捕捉させた後に前記核酸捕捉担体を凍結及び融解する工程（ａ’）を含有し、かつ、工程（ｂ）において、前記核酸捕捉担体をプロテアーゼと接触させたうえでインキュベートし、次いで前記核酸捕捉担体を加圧又は負圧することを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。
  10. 環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを含有する環境試料と、柔軟性を有する多孔質材料からなる核酸捕捉担体を３時間以上接触させることを特徴とする、請求項１に記載の環境ＤＮＡ又は環境ＲＮＡを回収する方法。

     
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