TWI642679B - 萃取核酸分子之裝置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明主要提供一種用於由一細胞或組織中純化一核酸分子的裝置，包括：一管柱及一過濾棉。其中該過濾棉具有過濾純化該非染色體核酸分子過程中所產生之凝絮狀沉澱之功能。另外，本發明另外提供一種使用該裝置之核酸萃取方法，利用該裝置進行核酸萃取可減少許多離心所需要之時間及人力。

Description

萃取核酸分子之裝置及其使用方法

本發明係關於一種核酸物質萃取的裝置及其使用方法，特別是一種使用管柱中具有過濾棉用以萃取核酸物質之裝置及其使用方法。

自1953年DNA雙股螺旋結構解開以後，許多資源不斷的投入關於DNA及RNA等核酸分子之構造、功能及用途等各方面的研究，特別是關於核酸分子於診斷及治療疾病方面及遺傳工程學上的應用。

而在遺傳工程學的研究上，以細菌的質體作為載體以選殖特定目標DNA片段是一種十分常見的方法。質體通常形成環狀存在於細胞內且具有自我複製的能力。目前已發展出許多可用來抽取或純化質體DNA的方法，包括鹼性裂解法、煮沸法、氯化銫純化法及商業化套件等。其中鹼性裂解法為一種效率較高且較簡易的方法，主要原理為利用鹼性物質使得細胞內質體及染色體變性，使DNA由雙股解開成單股，而後再以酸性物質中和使得DNA由單股復性為雙股。然而在此復性反應中，小分子質體DNA可在復性反應中迅速恢復為原本的鹼基配對方式及構型，具有較高水溶性；然而分子量較大的染色體DNA無法順利配對恢復原來的構型並與溶液中的鉀鹽形成一種凝絮狀的白色沉澱，故可利用這樣的方式將目標質體DNA與染色體分離。

然而，將凝絮狀的沉澱與溶有目標質體DNA的澄清溶液分離尚需經過數個離心步驟才能完成，在自動化的過程中若能將這些離心的過程簡化，則對於降低時間及人力成本有極大的幫助。再者，其他種類的核酸分子之萃取過程，如萃取植物細胞或組織之核酸分子時，細胞或組織裂解液的內含物可分為水溶性及非水溶性，而核酸分子溶在水溶性部分，也必須將非水溶性的雜質先以離心方式排除後，在將水溶性的核酸分子分離出，此離心過程也需要簡化以節省時間及人力成本。

為了解決上述問題，本發明之一目的係提供一種用於純化一核酸分子之裝置，包括：一管柱及一過濾棉，該過濾棉係填塞於管柱內。

於一較佳實施例中，其中該核酸分子為質體、DNA或RNA。

於另一較佳實施例中，其中該過濾棉位於該管柱底部。

於另一較佳實施例中，其中該過濾棉之孔徑大小介於0.2至20微米之間。

於另一較佳實施例中，其中該過濾棉大體上完全嵌合於該管柱底部之管壁。

於另一較佳實施例中，其中該過濾棉之材質係選自由纖維素、玻璃纖維或聚合物所組成之群組。

本發明之另一目的為提供一種使用本發明之裝置所進行之核酸分子純化方法，包括：(a)將一細胞或一組織裂解，以形成一帶有目標核酸分子之懸浮液；(b)使該懸浮液內之非目標核酸分子雜質形成一纖維狀或一凝絮狀沉澱物；及(c)透過該裝置之該過濾棉過濾該凝絮狀沉澱物，僅 吸取含該目標核酸分子之澄清液態物質進行核酸純化步驟。

於一較佳實施例中，其中該步驟(c)係利用一附有過濾膜之微量吸管吸取經過濾之該澄清液態物質。

於另一較佳實施例中，其中該微量吸管置入該裝置的同時進行排氣，當該微量吸管抵住該過濾棉，開始吸取該澄清液態物質。

於另一較佳實施例中，其中該目標核酸分子為質體、DNA或RNA。

依據上述本發明之裝置、使用其之純化非染色體核酸分子純化方法，其相較於先前技術產生的優點如下：本發明之裝置利用微量吸管透過過濾棉過濾純化核酸分子過程中所產生之凝絮狀沉澱，並吸取含有目標核酸分子之澄清液，簡化傳統純化中所需之數次離心過程，以降低所需花費之時間及人力等成本。

100‧‧‧裝置

10‧‧‧蓋體

20‧‧‧管體

30‧‧‧過濾棉

40‧‧‧管柱

圖1顯示本發明裝置之示意圖。

本文中術語「一」或「一種」當與「包含」連用於申請專利範圍或說明書中，可能代表有一個。但也符合「一或多個」或「至少一個」。

本發明之純化一非染色體核酸分子之裝置及搭配其使用之微量吸管

請參照圖1，其顯示本發明裝置100之示意圖。

本發明的目的主要在於提供一種用於純化一核酸分子的裝置100，包括：一管柱40及一過濾棉30，該過濾棉30係填塞於管柱40內。其 中，本發明之裝置100較佳可用於萃取一細胞中的核酸分子，該「細胞」術語，表示一種原核生物細胞，例如細菌細胞，或一種真核生物細胞，例如酵母菌細胞、植物細胞、哺乳類動物細胞(如人類細胞或老鼠細胞)，其已為習知而無限制其種類。再者，本發明之裝置100亦可用於萃取一組織中的核酸分子，本發明中術語「組織」，係為介於細胞與器官之間的細胞架構，由許多形態相似的細胞及細胞間質所組成，例如上皮組織、肌肉組織、結締組織或神經組織等。

上述術語「核酸分子」或「核酸」，是以核苷酸為單元所組成的分子，包含DNA，RNA等。在一方面，本發明之裝置100較佳係用於萃取或純化組織中的核酸分子；本文中術語「萃取或純化組織中的核酸分子」，意指該萃取之核酸分子實質上不包含細胞碎片或細胞間質，因此，本文中之核酸分子可包含染色體分子及非染色體分子。本文中所稱「目標核酸分子」則可因萃取或純化之目的不同，而代表不同的核酸分子，如當目的為由細菌中萃取質體時，該目標核酸分子代表非染色體的核酸分子；而當目的為由動物或植物組織中萃取染色體核酸分子時，則目標核酸分子代表該動物或植物之染色體核酸分子。因此，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，可因不同的萃取或純化目的，而理解本文中之目標核酸分子之涵義。

在另一方面，本發明之裝置100較佳為用於萃取或純化細胞中染色體以外之核酸分子，如質體DNA、RNA等。本文中術語「萃取或純化細胞中一非染色體核酸分子」，意指該萃取之非染色體核酸分子係實質上不包含細胞碎片及染色體DNA。

上述術語「過濾棉30」，位於該管柱40底部，其作用為過濾凝絮狀之沉澱物，換言之，其可由一液態溶液中將特定大小的顆粒或雜質濾除。本文中術語「凝絮狀沉澱物」，若為由細胞中萃取或純化質體DNA時，意指由與酸性物質形成凝絮之染色體DNA、細胞膜、蛋白質及其他細胞碎片等等不溶於水之物質所構成；若為由組織中萃取或純化DNA或RNA時，組織裂解液會形成「纖維狀沉澱物」，意指由細胞膜、蛋白質、細胞間質及其他細胞碎片等等不溶於水之物質所構成。

上述之過濾棉30之孔徑大小介於0.2至20微米之間，以避免孔徑過大而使得固態凝絮狀物質經由過濾棉30孔洞與目標之澄清溶液混合。

上述之過濾棉30，其大體上完全嵌合於該管柱40底部之管壁。其中「大體上完全嵌合」係指90%以上面積與管柱40底部之管壁相嵌合，更好為95%以上，如95%、96%、97%、98%、99%或實質上100%嵌合。於本文中之「管柱40」可為習知實驗室中使用的管柱40，其包含一蓋體10(若蓋體並非必須也可省略)以及一管體20，該管體20較佳但並不限於圓柱形。為使過濾棉30大體上完全嵌合於該管柱40底部之管壁，過濾棉30較佳為與管柱40相同之形狀，如為一圓柱形過濾棉30；但考量到過濾棉30本身的彈性，可使用一方形過濾棉30，其中該方形的邊長略大於圓形管柱40之直徑，則將方形過濾棉30塞入該管柱底部時，由於過濾棉30的彈性使然，得以先壓縮塞入管柱底部後，過濾棉30於管柱40的底部空間膨脹後實質上100%嵌合於管柱40底部之管壁。該過濾棉30的厚度並無限制，只要能有效過濾其中之固態凝絮狀物質即可；較佳之厚度為管柱40長度之6分之1高，或5分之 1高度。

上述之過濾棉30，其中材質係選自由纖維素、玻璃纖維及聚合物所組成之群組，但不限制其種類。

本發明之裝置及搭配其所進行之核酸分子純化方法

本發明的主要目的在於提供一種使用如本發明之裝置100所進行之核酸分子純化方法，包含：(a)將一細胞或一組織裂解，以形成一帶有目標核酸分子之懸浮液；(b)使該懸浮液內之非目標核酸分子雜質形成一凝絮狀沉澱物；及(c)透過該裝置100之該過濾棉30過濾該凝絮狀沉澱物，僅吸取含該目標核酸分子之澄清液態物質進行核酸純化步驟。

依據上所述之核酸分子純化方法中，其中步驟(a)之將細胞或組織裂解的方法可包括物理方法如均質化、超音波、法式細胞破碎儀；化學方法如化學溶菌(如可使用0.2M NaOH以及1% SDS混合液培育)等；或酵素方法如使用溶菌酶等。上述細胞或組織裂解時可添加RNaseA。通常在細胞或組織裂解時，先將細胞或組織懸浮於一懸浮液中，該懸浮液之配方已為習知且可由市面上購得，如葡萄糖、Tris-HCl及EDTA混合液。

上述之細胞或組織裂解方法之主要目的在於使得細胞膜/壁受到破壞，使得細胞質內之物質釋出及/或破壞細胞間質，形成一包含細胞質蛋白及質體等物質之溶菌液/溶胞液。

接著，於步驟(b)中，使該懸浮液內之非目標核酸分子雜質形成一纖維狀或一凝絮狀沉澱物，該形成凝絮狀沉澱物之方法亦為習知，如使用酸性物質如醋酸鉀或醋酸鈉等，使染色體DNA形成凝絮狀沉澱物。懸浮液中的非目標核酸分子雜質形成纖維狀沉澱物或凝絮狀沉澱物為萃取 目標核酸分子不同時，而形成不同的沉澱物。於一實施例中，若欲萃取細菌細胞中的質體DNA，則會於懸浮液中加入酸性物質使染色體DNA與酸性物形成凝絮狀沉澱物；於另一實施例中，若欲於組織中萃取染色體DNA，則將組織均質後，染色體DNA溶於水，而該懸浮液中則會有非目標核酸分子雜質如細胞間質、結締組織碎片等形成之纖維狀沉澱物。

依據上所述之步驟(c)，可利用習知的方法將含該目標核酸分子之澄清液態物質進行核酸純化步驟，其純化步驟亦為習知，如使用習知的管柱純化法純化目標核酸；其中，較佳係利用一附有過濾膜之微量吸管或針筒，直接於該裝置100中吸取經過濾之該澄清液態物質。其中，該附有過濾膜之微量吸管或針筒中，該過濾膜具有吸附DNA或RNA之功能，可使得經過過濾棉過濾後之澄清液通過微量吸管之過濾膜後，澄清液內的目標DNA分子或RNA分子被吸附於該過濾膜，進而輕易的將澄清液中之目標DNA分子或RNA分子與其他不需要之液體或雜質分離。(該附有過濾膜之微量吸管已為習知，可參考台灣專利公告號M477925。)

依據上所述之步驟，於一較佳實施態樣，其中該微量吸管置入該裝置100的同時進行排氣，當該微量吸管抵住該過濾棉30，開始吸取該澄清液態物質。其中進行排氣步驟的目的在於避免微量吸管在抵住該過濾棉30之前的過程當中不小心吸取到纖維狀或凝絮狀之固態物質，由於纖維狀或凝絮狀物質中包含不溶於水之細胞膜、蛋白質及其他細胞碎片等，若吸取其並與目標澄清溶液混合時，會導致純化目標DNA或RNA的效率降低。再者，該微量吸管抵住該過濾棉30時，較佳為直接將具有彈性的過濾棉30壓到靠近管底(約距離管底0.01~0.1cm)，使該微量吸管等於前端具有過 濾棉30的濾嘴功能，而能夠確保微量吸管吸入的液體均是經由過濾棉30過濾後的澄清溶液，但該微量吸管不可完全將過濾棉30壓至管底且該微量吸管抵住管底，否則無法吸取溶液。

另外，本發明之步驟(a)、(b)及(c)均可於本發明之裝置100中進行，或者步驟(a)可先於一微量離心管(eppendorf)中進行，並接著將懸浮液吸取至本發明之裝置100中，並於裝置100中進行後敘之步驟(b)及(c)。或者，可於步驟(b)進行完後，再將所有液體吸取至本發明之裝置100中。

綜上所述，可知本發明之方法的特徵在於利用純化核酸裝置100，包含一管柱40及一過濾棉30，及使用該裝置100之純化核酸分子之方法，利用該裝置100過濾核酸分子純化過程中所產生之纖維狀或凝絮狀沉澱，減少離心之過程所需之時間及人力等成本。

以下實施例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實施例1至3

使用本發明之裝置100搭配QIAGEN Plasmid Min Kit(Catalog no.12123)之質體萃取套組。首先將微量離心管中的2ml的大腸桿菌液離心後，去除上清液，接著加入300μl之P1緩衝液，以移液器上下抽吸使細胞重新懸浮。將懸浮液轉移至本發明之裝置100中，加入300μl之P2緩衝液，以移液器上下抽吸使細胞裂解，接著，再加入300之P3緩衝液懸浮液中產生凝絮狀物。使用附有過濾膜之微量吸管(其為自動化裝置，可自動抽吸)邊排氣邊往裝置100的底部之過濾棉30靠近，待抵住該過濾棉30並離管柱40 底部0.01cm時，停止排氣，轉成吸取，具有質體DNA的溶液被吸取至該微量吸管內，至一乾淨離心管中，並進一步上下抽吸使質體DNA吸附於微量吸管上的過濾膜，並將廢液排除，接著分別抽吸750μl清洗液(Buffer QC)兩次，以清洗過濾膜，將微量吸管抽吸並推排至少15次，使殘於在微量吸管內的酒精揮發。最後，將200μl沖提液(Buffer QF)經由該微量吸管的吸取，並靜置3分鐘，接著，排出該溶質體DNA的沖提液至1.5ml的微量離心管中。每個實驗進行三重複，分別為實施例1至3。

比較例1至3

使用與實施例相同的廠牌之質體萃取套組，首先將微量離心管中的2ml的大腸桿菌液離心後，去除上清液，接著加入300μl之P1緩衝液，以移液器上下抽吸使細胞重新懸浮，再加入300μl之P2緩衝液，迅速反轉多次後，再加入300μl之P3緩衝液反轉多次後，懸浮液中產生凝絮狀物。接著，離心10分鐘後，吸取上清液，並使用QIAGEN Plasmid Min Kit(Catalog no.12123)萃取套組萃取上清液中的質體DNA。每個實驗進行三重複，分別為比較例1至3。

下表1中為實施例與比較例抽取質體DNA的結果測試，可見使用本發明之裝置及方法，其萃取出的質體DNA濃度及純度與先前技術差異不大，但可簡化先前技術中繁雜的前置離心步驟，且可進行自動化抽取，而具有節省時間及人力的較佳功效。

Claims (7)

1. 一種用於純化一核酸分子之裝置，包括：一底部密封之管柱及一過濾塊，該過濾塊係填塞於管柱內；其中，該過濾塊係過濾一凝絮狀沉澱物，該過濾塊位於該管柱底部，且該過濾塊不與該核酸分子結合；其中該過濾塊之孔徑大小介於0.2至20微米之間，且該過濾塊之材質係選自由纖維素、玻璃纖維及聚合物所組成之群組。
2. 如申請專利範圍第1項所述之裝置，其中該核酸分子為質體、DNA或RNA。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之裝置，其中該過濾塊大體上完全嵌合於該管柱底部之管壁。
4. 一種使用如申請專利範圍第1項所述之裝置所進行之核酸分子純化方法，包括：(a)將一細胞或一組織裂解，以形成一帶有目標核酸分子之懸浮液；(b)使該懸浮液內之非目標核酸分子雜質形成一纖維狀或一凝絮狀沉澱物；及(c)透過該裝置之該過濾塊過濾該凝絮狀沉澱物，僅吸取含該目標核酸分子之澄清液態物質進行核酸純化步驟。
5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該步驟(c)係利用一附有過濾膜之微量吸管或針筒吸取經過濾之該澄清液態物質。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該微量吸管或針筒置入該裝置的同時進行排氣，當該微量吸管或針筒之一針頭抵住該過濾塊，開始吸取該澄清液態物質。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該目標核酸分子為質體、DNA或RNA。