CN104911176A - 一种细菌dna提取液、提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌DNA提取液、提取方法及其应用，所述提取液由3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、NP-40、氢氧化钠和水组成，所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸在提取液中浓度为0.00001-0.0002mg/mL，NP-40在提取液中浓度为0.01-0.02%（体积百分含量），氢氧化钠在提取液中的浓度为0.01-0.05mg/mL，pH值为8.0-8.8。本发明还公开了用细菌DNA提取液提取细菌混合液中核酸的方法及应用，本发明细菌DNA提取液能够高效的从细菌混合液中提取核酸，其操作简单、成本低，提取效果好，在分子诊断领域能够得到很好的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌DNA提取液、提取方法及其应用，特别涉及一种能从多种细菌及其混合物中提取核酸的细菌DNA提取液、提取方法及其应用。
背景技术
近年来在感染性疾病中不同种类细菌的多重感染趋于增加,多重感染严格地说，指多种细菌均是作为原发性的且是同时发生的感染。多重感染性疾病在临床上相当常见，但由于病因复杂所以确诊甚为困难。
随着分子诊断技术的发展，使聚合酶链式反应（PCR）和探针杂交等分子生物学方法以非培养方式直接检测细菌样品成为可能。分子诊断技术的第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸的提取，这直接影响着检测的结果。
长期以来，样品中核酸的提取和纯化一直是耗时，繁琐的过程，虽然目前细菌的核酸提取方法和商品化的试剂盒有很多，并且这些方法的原理和操作过程各不相同，但是没有一个公认的可以同时对多种细菌混合物进行核酸进行高效提取的方法。因此，如何从多种细菌混合物中高效、快捷的提取核酸进行检测已成为了目前分子诊断技术推广和应用的瓶颈。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种能从多种细菌混合物中提取核酸的细菌DNA提取液，同时提供用该提取液提取细菌核酸的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种细菌DNA提取液，由3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、氢氧化钠和水组成，所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸在提取液中浓度为0.00001-0.0002mg/mL，所述NP-40在提取液中体积百分含量为001-0.02%，所述氢氧化钠在提取液中的浓度为0.01 -0.05mg/mL， 提取液pH值为8.0-8.8。
本发明进一步优选方案是，所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸在提取液中的浓度为0.0001mg/mL，所述NP-40在提取液中体积百分含量为0.01%，所述氢氧化钠在提取液中的浓度为0.03mg/mL，提取液 pH值为8.3。
用上述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法，包括如下步骤：将1000-3000μl细菌混合液置于离心管中，在15-37℃条件下，10000-15000rpm离心5-10min，弃上清，在沉淀物质中加入细菌DNA提取液10-100μl，反应1-10min后，剧烈振荡2min，然后瞬时离心，去除管壁液体，得到细菌混合物的核酸。
本发明进一步优选方案是，将3000μl细菌液置于离心管中，在25℃条件下，12000rpm离心10min，弃上清，在沉淀物质中加入细菌DNA提取液50μl，反应3min后，剧烈振荡2min，然后瞬时离心，去除管壁液体，得到细菌混合物的核酸。
所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。进一步，所述细菌为沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌。
上述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法应用于PCR检测。
本发明细菌DNA提取液及其提取方法能够同时从革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌混合样品中提取核酸，操作简单，成本低，提取效果好，提取的核酸能够应用于分子诊断领域。
附图说明
图1为沙门氏菌核酸的实时荧光定量 PCR 检测（曲线1是本发明所述方法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线2水煮法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果是）。
图2为志贺氏菌核酸的实时荧光定量 PCR 检测（曲线3是本发明所述方法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线4是水煮法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果）。
图3 为金黄色葡萄球菌核酸的实时荧光定量 PCR 检测（曲线5是本发明所述方法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线6是水煮法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果）。
图4 为溶血性链球菌核酸的实时荧光定量 PCR 检测（曲线7是本发明所述方法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果，曲线8是水煮法所提取的核酸产物的实时荧光定量PCR结果）。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一
一种细菌DNA提取液，由3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、氢氧化钠和水组成，所述 3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸在所述提取液中的浓度为0.00001-0.0002mg/mL，所述NP-40在所述提取液中的浓度为0.001-0.02%（体积百分含量），所述氢氧化钠在提取液中的浓度为0.01 -0.05mg/mL，提取液pH值为8.0-8.8。
在本实施例中，所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸在所述提取液中的浓度为 0.0001mg/ml，所述 NP-40在所述提取液中的浓度为0. 01%（体积百分含量），所述氢氧化钠在提取液中的浓度为0.03mg/mL，提取液pH值为8.3。
实施例二
用实施例一所述的细菌DNA提取液提取沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌核酸，同时用现有技术即水煮法裂解上述细菌，并用实时荧光PCR检测进行对比。
1、实验材料
细菌样本：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌混合物。
试剂：细菌DNA提取液、DEPC水、灭菌水。
引物：
2、细菌核酸的提取
（1）制备细菌混合样本：
分别将沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌（均购买自武汉菌种保存中心）接种于1mL的LB培养基，培养条件为37℃过夜培养，然后将其混合，得到4mL的细菌混合样本。
（2）本发明细菌混合样本DNA的提取：
取1mL的细菌混合样本，12000rpm进行离心10min，弃上清，向沉淀物中加入细菌DNA提取液50μL，反应3 min，再在涡旋器上剧烈振荡 2 min（在振荡过程中按紧离心管的盖子，防止菌液混合物漏出），得到细菌混合物裂解液。将细菌混合物裂解液瞬时离心（2000rpm进行离心3s），去除管壁液体，得到细菌混合物的核酸。
（3）水煮法裂解细菌：
取上述得到的细菌混合样本1mL，12000rpm进行离心10min，弃上清，向沉淀加入灭菌水50μL，在涡旋器上剧烈振荡 2 min（在振荡过程中按紧离心管的盖子，防止菌液混合物漏出）。瞬时离心（2000rpm进行离心3s），去除管壁液体，在100℃加热5min，然后12000rpm离心10min，取离心液，得到细菌混合物裂解液。
3、沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量PCR反应体系如下：
| 本发明或水煮法所得细菌裂解液 | 5μL |
| 沙门氏菌引物 | 上下游分别为0.5μL |
| dNTP | 0.4μL |
| 10×buffer | 2.5μL |
| Taq | 0.3μL |
| 灭菌水 | 15.8μL |
沙门氏菌引物：上游引物：5’-TCGTCATTCCATTACCTACC-3’
下游引物：5’-AAACGTTGAAAAACTGAGCA-3’
特异性引物PCR反应程序如下：
1 94℃ 3min
2 94℃ 5s
3 55℃ 40s
4 Go to 2 40个循环
结果如表1和图1所示，
表1为沙门氏菌裂解液进行实时荧光定量PCR检测所得到的Ct
| 细菌裂解方法 | Ct值 |
| 水煮法得到的裂解液 | 25.36 |
| 本发明得到的裂解液 | 28.07 |
4、志贺氏菌的实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量PCR反应体系如下：
| 上述实验所得的细菌裂解液 | 5μL |
| 志贺氏菌引物 | 上下游分别为0.5μL |
| dNTP | 0.4μL |
| 10×buffer | 2.5μL |
| Taq | 0.3μL |
| 灭菌水 | 15.8μL |
志贺氏菌引物：
上游引物：5’-AAATGCGTTTCTATGGCGTGT-3’
下游引物：5’-CCCCAGAGGGAGAACCAGTC-3’
特异性引物PCR反应程序如下：
1 94℃ 3min
2 94℃ 5s
3 55℃ 40s
4 Go to 2 40个循环
结果如表2和图2所示，
表2 为志贺氏菌裂解液进行实时荧光定量PCR检测所得到的Ct
| 细菌裂解方法 | Ct值 |
| 水煮法得到的裂解液 | 33.72 |
| 细菌DNA提取液提取的裂解液 | 38.25 |
5、金黄色葡萄球菌的实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量PCR反应体系如下：
| 上述实验所得的细菌裂解液 | 5μL |
| 金黄色葡萄球菌引物 | 上下游分别为0.5μL |
| dNTP | 0.4μL |
| 10×buffer | 2.5μL |
| Taq | 0.3μL |
| 灭菌水 | 15.8μL |
金黄色葡萄球菌引物：
上游引物：5’-AATTAACGAAATGGGCAGAAACA-3’
下游引物：5’-TGGCAACACCCTGAACTT-3’
特异性引物PCR反应程序如下：
1 94℃ 3min
2 94℃ 5s
3 55℃ 40s
4 Go to 2 40个循环
结果如表3和图3所示。
表2 为金黄色葡萄球菌裂解液进行实时荧光定量PCR检测所得到的Ct
| 细菌裂解方法 | Ct值 |
| 水煮法得到的裂解液 | 28.43 |
| 细菌DNA提取液提取的裂解液 | 31.47 |
6、溶血性链球菌的实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量PCR反应体系如下：
| 上述实验所得的细菌裂解液 | 5μL |
| 溶血性链球菌引物 | 上下游分别为0.5μL |
| dNTP | 0.4μL |
| 10×buffer | 2.5μL |
| Taq | 0.3μL |
| 灭菌水 | 15.8μL |
溶血性链球菌引物：
上游引物：5’-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3’
下游引物：5’-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA-3’
特异性引物PCR反应程序如下：
1 94℃ 3min
2 94℃ 5s
3 55℃ 40s
4 Go to 2 40个循环
结果如表4和图4所示，
表4为溶血性链球菌裂解液进行实时荧光定量PCR检测所得到的Ct
| 细菌裂解方法 | Ct值 |
| 水煮法得到的裂解液 | 30.64 |
| 细菌DNA提取液提取的裂解液 | 33.78 |
从上述实时荧光定量 PCR，可以看出，本发明所述方法能够成功提取混合样品中的细菌核酸，提取效果比目前被广泛使用的水煮法好。
Claims (7)
1.一种细菌DNA提取液，其特征在于：由3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、NP-40、氢氧化钠和水组成，所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸在提取液中浓度为0.00001-0.0002mg/mL，所述NP-40在提取液中体积百分含量为0.01-0.02%，所述氢氧化钠在提取液中的浓度为0.01 -0.05mg/mL，提取液pH值为8.0-8.8。
2.如权利要求1所述的细菌DNA提取液，其特征在于：所述3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸在提取液中的浓度为0.0001mg/mL，所述NP-40在提取液中体积百分含量为0.01%，所述氢氧化钠在提取液中的浓度为0.03mg/mL，提取液 pH值为8.3。
3.用权利要求1-2任一项所述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：将1000-3000μl细菌混合液置于离心管中，在15-37℃条件下，10000-15000rpm离心5-10min，弃上清，在沉淀物中加入细菌DNA提取液10-100μl，反应1-10min后，剧烈振荡2min，然后瞬时离心，去除管壁液体，得到细菌混合物的核酸。
4.如权利要求3所述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：将3000μl细菌液置于离心管中，在25℃条件下，12000rpm离心10min，弃上清，在沉淀物质中加入细菌DNA提取液50μl，反应3min后，剧烈振荡2min，然后瞬时离心，去除管壁液体，得到细菌混合物的核酸。
5.如权利要求3或4所述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法，其特征在于：所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
6.如权利要求5所述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法，其特征在于：所述细菌为沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌。
7.权利要求3-4任一项所述的细菌DNA提取液提取细菌核酸的方法应用于PCR检测。
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