EA022842B1 - Способ выделения нуклеиновой кислоты и набор для этого - Google Patents

Abstract

Согласно изобретению предложен способ выделения природных и синтетических нуклеиновых кислот, таких как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), рибонуклеиновая кислота (РНК) и пептидо-нуклеиновая кислота (ПНК), из твердого или жидкого образца с использованием ваты. Вата упакована таким образом, что раствор, содержащий нуклеиновые кислоты, проходит через нее и нуклеиновые кислоты из указанного раствора связываются с указанной ватой в среде, оптимальной для связывания. Нуклеиновые кислоты связываются с ватой таким образом, что связанные нуклеиновые кислоты могут выдержать многочисленные промывки жидкостью, содержащей воду, и вымываться в водном буфере, с которым вымывающиеся нуклеиновые кислоты могут непосредственно использоваться для амплификации с помощью ПЦР или для любых других биохимических или молекулярно-биологических целей.

Description

Изобретение относится к выделению и очистке нуклеиновых кислот. Более конкретно, оно относится к способу и набору для выделения и очистки нуклеиновых кислот с использованием ваты или ее производных.

Предшествующий уровень техники

Протоколы экстракции нуклеиновых кислот в целом можно разделить на протоколы выделения на основе силикагеля и не на основе силикагеля. Существующие протоколы выделения на основе силикагеля и не на основе силикагеля могут включать промывку водой для удаления компонентов, не являющихся нуклеиновыми кислотами, и требуют промывки водой с некоторым содержанием спирта. Присутствие спирта в вымываемом растворе нуклеиновых кислот ингибирует полимеразную цепную реакцию (ПЦР), таким образом, как правило, оба протокола требуют высокоскоростного центрифугирования или других способов удаления остаточного спирта и элюирования нуклеиновых кислот водным буфером при комнатной температуре или повышенной температуре. В некоторых случаях оба протокола требуют высокой концентрации солей с промывкой полиэтиленгликолем или водным раствором спирта. Использование высокой концентрации солей и водного раствора спирта вносит ограничивающие требования для элюирования нуклеиновых кислот, такие как строгая необходимость в удалении указанных соединений до элюирования нуклеиновых кислот или использование центрифуги и т.д. Следовательно, ни один из существующих протоколов выделения на основе силикагеля и не на основе силикагеля не может использоваться в месте предоставления медицинских услуг (р1асе οί саге, РОС), так как использование центрифуги приводит к выделению летучих веществ. Некоторые из протоколов не на основе силикагеля, описанных в литературе, представлены ниже.

Патент США 7264927: в указанном документе описано применение целлюлозы или целлюлозной бумаги, включающее использование для связывания полиалкиленгликоля и высоких концентраций солей и, в конечном итоге, элюирование нуклеиновых кислот в буфере или деионизированной воде.

Патент США 6084091: описан способ применения целлюлозного порошка (такого как картофельный крахмал) для выделения нуклеиновых кислот.

Патент США 5804684: описан способ применения фильтровальной бумаги для экстракции нуклеиновых кислот, где указанная бумага помещается в материал, такой как пластиковый наконечник, с использованием мягкой бумаги или кусочка ваты в качестве фильтра или барьера для удержания фильтровальной бумаги.

Во всех описанных выше процессах используются коммерчески доступные колонки, заполненные силикагелем, для конечного выделения нуклеиновых кислот либо требуется более длительная обработка образца (более 30 мин), либо требуется использование высоких концентраций солей во время промывания матрицы, либо использование центрифуг и т.д. Ни в одном из способов экстракции нуклеиновых кислот на основе целлюлозы не промывают нуклеиновые кислоты 100%-ным водным буфером или водой, а обычно используют растворы с содержанием спиртов или с содержащих полиолы соединений.

Сущность изобретения

Таким образом, изобретение относится к способу выделения нуклеиновых кислот из образца, где указанный способ включает следующие этапы: (а) добавление лизирующего буфера к образцу, содержащему нуклеиновую кислоту, с получением раствора лизата или (Ь) добавление лизирующего буфера в комбинации со связывающим буфером к указанному образцу с получением раствора лизата, (с) добавление связывающего буфера к раствору этапа (а) для связывания нуклеиновой кислоты с матрицей или непосредственного связывания раствора этапа (Ь) с матрицей и (й) промывание и элюирование связанной с матрицей нуклеиновой кислоты для выделения и очищения указанной нуклеиновой кислоты; и набору для выделения нуклеиновой кислоты из образца, где указанный набор включает матрицу и буферы.

Краткое описание сопутствующих графических материалов

Признаки настоящего изобретения будут более очевидны из следующего описания и прилагаемой формулы изобретения наряду с сопутствующими графическими материалами. Следует понимать, что на указанных фигурах изображены только некоторые варианты реализации изобретения, следовательно, указанные фигуры не ограничивают объем изобретения, при этом настоящее изобретение будет более конкретно и детально описано с помощью сопутствующих графических материалов.

Фиг. 1 - вата, упакованная в [а] шприц, [Ь] иглу шприца, [с] пластиковые формы, присоединенные к шприцу, [й] пластиковую бутылку с завинчивающейся крышкой, [е] стеклянную пробирку, [ί] стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой;

фиг. 2 - вата, упакованная в [а] одноразовую пластиковую пипетку, [Ь] формованную пастеровскую пластиковую пипетку, [с] стеклянную пастеровскую пипетку, [й] пластиковую пипетку с резиновой грушей, [е] ватный тампон, [ί] формованную пластиковую пипетку;

фиг. 3 - вата, упакованная в [а] пробирку Эппендорфа, [Ь] стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой, [с] формованный пластиковый наконечник на 1мл, [й] одноразовую стеклянную градуированную пипетку с резиновой грушей, [е] вискозный тампон, [ί] стеклянную пипетку с грушей из пластика и резины;

фиг. 4 - образцы ДНК, очищенные в соответствии с различными протоколами, амплифицировали с

- 1 022842 помощью ПЦР. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы, дорожка 2 - вискоза, упакованная в наконечник для пипетки на 1 мл, дорожка 3 - коммерческий вискозный тампон, дорожка 4 - вата, упакованная в наконечник для пипетки на 1 мл, дорожка 5 - коммерческая колонка, заполненная силикагелем, дорожка 6 ДНК очищали с использованием коммерческого ватного тампона, дорожка 7 - неамплифицированная ДНК, дорожка 8 - контрольный раствор;

фиг. 5 - образцы ДНК, очищенные в соответствии с различными протоколами, амплифицировали с помощью ПЦР. Дорожка 1 - вата, упакованная в наконечник для пипетки на 1 мл, дорожка 2 - контрольный раствор, дорожка 3 - вата, упакованная в шприц на 2 мл, дорожка 4 - коммерческая колонка, заполненная силикагелем, дорожка 5 - маркер молекулярной массы;

фиг. 6 - образцы ДНК, очищенные в соответствии с различными протоколами, амплифицировали с помощью ПЦР. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы, дорожка 2 - коммерческий протокол на основе силикагеля, дорожка 3 - вата, упакованная в наконечник для пипетки на 1 мл, дорожка 4 - фильтровальная бумага \М1ш1тап Νο 1, упакованная в наконечник для пипетки, дорожка 5 - протокол с использованием РТА- карты;

фиг. 7 - образец цитоплазматической 308 РНК, очищенной в соответствии с различными протоколами, амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы, дорожка 2 - хирургическая вата, дорожка 3 - автоклавированная вата, дорожка 4 - промытая гидроксидом натрия вата, дорожка 5 - промытая соляной кислотой вата, дорожка 6 - абсорбирующая вата, дорожка 7 - колонка, заполненная силикагелем Цьадеи, дорожка 8 - РТА-карта;

фиг. 8 - компонент картриджа, набитого ватой, для автоматической экстракции нуклеиновых кислот.

Подробное описание изобретения

В следующем подробном описании изобретения приведены ссылки на сопутствующие графические материалы, которые формируют часть настоящей заявки. Не следует считать, что приведенные в пример варианты реализации изобретения, описанные в подробном описании изобретения, графические материалы и формула изобретения ограничивают настоящее изобретение. Возможны другие варианты реализации изобретения и другие вариации в пределах сущности и объема предмета, представленного в настоящей заявке. Очевидно, что аспекты настоящего изобретения, в целом описанные в настоящей заявке и показанные на фигурах, могут иметь большое разнообразие комбинаций, каждая из которых однозначно рассматривается согласно настоящему изобретению и составляет часть указанного изобретения.

Изобретение относится к способу выделения нуклеиновой кислоты из образца, где указанный способ включает следующие этапы:

(a) добавление лизирующего буфера к образцу, содержащему нуклеиновую кислоту, с получением раствора лизата; или (b) добавление лизирующего буфера в комбинации со связывающим буфером к указанному образцу с получением раствора лизата;

(c) добавление связывающего буфера к раствору этапа (а) для связывания нуклеиновой кислоты с матрицей или непосредственного связывания раствора этапа (Ь) с матрицей; и (4) промывание и элюирование связанной с матрицей нуклеиновой кислоты для выделения и очищения нуклеиновой кислоты.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей ДНК, РНК и ПНК.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения образец представляет собой биологический или не биологический образец.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения биологический образец выбран из группы, включающей кровь, мокроту, сыворотку, слюну или тканевые экстракты, и не биологический образец выбран из группы, включающей химически синтезированную ПНК.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения лизирующий буфер выбран из группы, включающей тиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), трис-буфер, детергент, полиол, моновалентную соль, содержащую катион группы 1А, или бивалентную соль, содержащую катион группы ΙΙΑ, и переваривающий белки фермент, необязательно вместе с мочевиной, или любую их комбинацию.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения концентрация ЭДТА находится в диапазоне от примерно 10 до примерно 300 мМ, предпочтительно составляет примерно 100 мМ.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения концентрация тиоцианата гуанидина или гидрохлорида гуанидина находится в диапазоне от примерно 0.1 до примерно 7 М.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения концентрация мочевины находится в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 7 М.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения концентрация трис-буфера находится в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 100 мМ, предпочтительно составляет примерно 20 мМ.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения концентрация полиола находится в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 30 об.%.

- 2 022842

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения детергент выбран из группы, включающей лаурилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, тритон Х-100, Твин 20 и N0-40 или любую их комбинацию, и переваривающий белки фермент представляет собой протеиназу К.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения связывающий буфер представляет собой воду, необязательно вместе с полиолами или не полиолами.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения полиол включает растворимые в воде полиольные соединения, выбранные из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, глицерина, полипропиленгликоля, этиленгликоля и пропиленгликоля.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения указанные не полиолы включают спирты, включающие метанол, этанол, пропанол, или любую растворимую в воде жидкость, содержащую функциональную группу кислоты, амина, спирта, фенола, амида или сложного эфира в качестве одной из функциональных групп; или любую их комбинацию.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения промывание и элюирование осуществляется с использованием промывочного буфера и элюирующего буфера соответственно.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения промывание включает первую промывку промывочным буфером, содержащим примерно от 1 до примерно 99 об.%, предпочтительно примерно от 30 до примерно 70 об.% и оптимально примерно 50 об.% водного раствора спирта, с последующими многократными промывками промывочным буфером, содержащим 100%-ную воду.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения водный раствор спирта выбран из группы, включающей этанол, метанол, н-пропанол, 2-пропанол, глицерин, полиэтиленгликоль (РЕС), полипропиленгликоль (РРС), этиленгликоль и пропиленгликоль.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения вода выбрана из группы, включающей деионизированную воду, свободную от ДНК-аз воду, свободную от РНК-аз воду, воду Μίΐΐίρ, фильтрованную воду, водопроводную воду и грунтовую воду или любую их комбинацию.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения указанный промывочный буфер может необязательно включать соли, выбранные из группы, включающей МдС1₂, СаС1₂, Ν;Κ.Ί и КС1, или буферы, выбранные из группы, включающей бицин, трицин, трис-буфер, НЕРЕ8, СНАР8, фосфат, ацетат, МЕ8, пиридин, пиперазин, бис-трис-буфер, Р1РЕ8, АСЕ8, ВЕ8, ТЕ8, борат, ТАР8, СНЕ8, сАр§, этаноламин и пиперидин, имеющие рН в диапазоне от примерно 5 до примерно 12.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения элюирующий буфер включает теплую воду, температура которой находится в диапазоне от примерно 45 до примерно 99°С, вместе с буфером или солью, имеющей рН в диапазоне от примерно 8 до примерно 11.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения вода выбрана из группы, включающей деионизированную воду, свободную от ДНК-аз воду, свободную от РНК-аз воду, воду Μίΐΐίρ, фильтрованную воду, водопроводную воду и грунтовую воду или любую их комбинацию.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения буфер выбран из группы, включающей бицин, трицин, трис-буфер, НЕРЕ8, СНАР8, фосфат, ацетат, МЕ8, пиридин, пиперазин, бис-трис-буфер, Р1РЕ8, АСЕ8, Ве§, ТЕ8, борат, ТАР8, СНЕ8, САР8, этаноламин и пиперидин, или любую их комбинацию, имеющие рН в диапазоне от примерно 5 до примерно 12, или имеющие рКа в диапазоне от примерно 7 до примерно 10.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения соль выбрана из группы, включающей МдС1₂, СаС1₂, Ν;Κ.Ί и КС1, или любую их комбинацию, в концентрации в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 100 мМ, предпочтительно в диапазоне от примерно 5 до примерно 50 мМ.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения матрица выбрана из группы, включающей вату, производные ваты и синтетические полимеры, содержащие смесь хлопка, или любую их комбинацию.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения вата выбрана из группы, включающей природную вату, хирургическую вату, клиническую вату, коммерчески доступную вату, крученую вату, промытую водой вату, промытую кислотой или основанием вату, автоклавированную вату, вату, обработанную буфером, имеющую рН в диапазоне от примерно 1 до примерно 14, вату, обработанную раствором соли, вату, обработанную органическим растворителем, прессованную вату и переработанную вату.

Настоящее изобретение также относится к набору для выделения нуклеиновой кислоты из образца, где указанный набор включает матрицу и буферы.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения матрица выбрана из группы, включающей вату, производные ваты и синтетические полимеры, содержащие смесь хлопка, или любую их комбинацию.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вата выбрана из группы, включающей природную вату, хирургическую вату, клиническую вату, коммерчески доступную вату, крученую вату, промытую водой вату, промытую кислотой или основанием вату, автоклавированную вату, вату, обработанную буфером, имеющую рН в диапазоне от примерно 1 до примерно 14, вату, обработанную раствором соли, вату, обработанную органическим растворителем, прессованную вату и переработанную вату.

- 3 022842

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения буфер выбран из группы, включающей лизирующий буфер, связывающий буфер, промывочный буфер и элюирующий буфер, как описано выше.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения образец включает биологические или не биологические образцы.

Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения биологический образец выбран из группы, включающей кровь, мокроту, сыворотку, слюну или тканевые экстракты, и не биологический образец выбран из группы, включающей химически синтезированную ПНК.

Настоящее изобретение относится к способу конструирования системы экстракции нуклеиновых кислот с использованием ваты. Вату размещают таким образом, что все растворы, упоминаемые в способе экстракции нуклеиновых кислот, взаимодействуют с указанной ватой.

Согласно другому варианту реализации изобретения определения различных материалов, используемых согласно настоящему изобретению, представлены ниже.

Вата, производные ваты, материалы, содержащие вату, и подобные вате материалы.

Пушистую вату получали в виде коробочек вокруг семян хлопчатника. Для экстракции нуклеиновых кислот вата является предпочтительным материалом для использования в качестве матрицы. Виды ваты, которые являются подходящими, могут представлять собой природную вату, хирургическую вату, клиническую вату, коммерчески доступную вату, крученую вату, промытую водой вату, промытую кислотой или основанием вату, автоклавированную вата, вату, обработанную буфером (рН 1-14), вату, обработанную раствором соли, вату, обработанную органическим растворителем, прессованную вату, переработанную вату и т.д. Любые хлопковые материалы или различные формы ваты или синтетические полимеры, содержащие смесь хлопка, или материалы, содержащие вату, могут применяться для экстракции нуклеиновых кислот. Материалы типа шерсти, шелка, кашемира и т.д., которые содержат волокна, подобные хлопку, также рассматриваются как часть настоящего изобретения. Хлопок, полученный с помощью сельскохозяйственного производства с использованием только органических удобрений или полученный с использованием инсектицидов и пестицидов, также рассматривается как часть настоящего изобретения. Хлопок, полученный в разных географических зонах, немного различается по составу, структуре, цвету и качеству. Указанный хлопок, выращенный в любых регионах мира, рассматривается как часть настоящего изобретения. Любой продукт, являющийся производным хлопка, или материал, для изготовления которого используется хлопок, рассматривается как часть настоящего изобретения и может использоваться для экстракции нуклеиновых кислот.

Лизирующий буфер.

Лизирующий буфер содержит высокую концентрацию ЭДТА для обеспечения связывания нуклеиновых кислот с ватой и также для возможности обработки различных видов образцов (крови, мокроты, сыворотки, слюны, тканевых экстрактов и т.д.). Возможны разные варианты составляющих указанный буфер солей, и использование ЭДТА приведено в качестве примера, который не следует рассматривать в качестве ограничения изобретения. Как правило, любые отрицательно заряженные молекулы в высокой концентрации могут выталкивать нуклеиновые кислоты из раствора и усиливать их связывание с ватой. Лизирующий буфер состоит из тиоцианата гуанидина или гидрохлорида гуанидина, ЭДТА, трис-буфера, детергента, необязательно с мочевиной, полиолом, моновалентной солью, содержащей катион группы ΙΑ, и/или бивалентной солью, содержащей катион группы ΙΙΑ, и протеиназой К, или любого переваривающего белки фермента. Концентрация тиоцианата гуанидина или гидрохлорида гуанидина во всех случаях может составлять между 0.1 и 7 М. В некоторых способах применения тиоцианат гуанидина может быть заменен на гидрохлорид гуанидина или мочевину, и его концентрация также может варьировать от 0.1 до 7 М. Мочевину используют для денатурации белков, при этом она дополняет функцию солей гуанидина, и ее концентрация может варьировать между 0 и 7 М. Как правило, большинство описанных в литературе протоколов лизиса для крови включают использование ЭДТА в диапазоне 1-20 мМ. Концентрация ЭДТА в лизирующем буфере согласно настоящему изобретению значительно отличается и предпочтительно находится в диапазоне 10-300 мМ, более предпочтительно составляет около 100 мМ. Концентрацию ЭДТА можно адаптировать для других нуклеиновых кислот, таких как РНК и ПНК, но в целом, было обнаружено, что более высокая концентрация ЭДТА способствует улучшению времени цикла (С'1) и интенсивности сигнала в ходе ПЦР и ОТ-ПЦР. Значительно отличающаяся концентрация ЭДТА способствует связыванию железа, присутствующего в гемоглобине (в случае крови), предотвращает какую-либо ДНК-азную и РНК-азную активность и создает сильный отрицательный заряд, в условиях которого нуклеиновые кислоты могут связываться с ватой. Важным аспектом описанного выше является то, что настоящий вариант реализации изобретения является первым примером, в котором связывание ДНК с матрицей проводят в основных условиях. Важно, что рН раствора для связывания оказывает значительный эффект на связывание ДНК/РНК с ватой, и следовательно, рН около 8-10 является предпочтительным для связывания, при этом рН 7.1-12 также может использоваться. Хлорид магния, как правило, используется в более высоких концентрациях для дезактивации РНК-азной активности, и следовательно, в протоколе лизиса ДНК он отсутствует или используется в минимальном количестве (в концентрации 20 мМ). Кроме того, ЭДТА также ингибирует РНК-зы, и использование МдС1₂ не является

- 4 022842 существенным и необязательно для любого случая выделения нуклеиновых кислот. Трис представляет собой вариант буфера для лизиса и, как было обнаружено, может использоваться в концентрации 0-100 мМ, и, как правило, концентрация около 20 мМ является оптимальной. Необходимо отметить, что в лизирующем буфере согласно настоящему изобретению трис-буфер используется для облегчения лизиса и может быть заменен на любой подходящий буфер. Полиол используют в связывающем буфере для улучшения растворимости расщепленных и денатурированных белков. Содержание полиолов в связывающем буфере может составлять 0-30 об.%. В некоторых случаях применения связывающий буфер отдельно не добавляли и после лизиса проводили непосредственное связывание нуклеиновых кислот с матрицей. Все указанные буферы, как правило, готовили на деионизированной воде, и в случае выделения РНК вода может быть необязательно обработанной диэтилпирокарбонатом (ЧЕРС) и автоклавированной. Лизис с использованием протеиназы К можно проводить до добавления описанного выше лизирующего буфера (в случае крови, мокроты, слюны, спермы и т.д.) и необязательно может проводиться с лизирующим буфером. Обработка протеиназой К, как было обнаружено, является эффективной в указанном лизирующем буфере, и, следовательно, указанная обработка может проводиться до добавления лизирующего буфера или вместе с лизирующим буфером для любого типа жидкого образца, содержащего нуклеиновые кислоты. Детергент, используемый в лизирующем буфере, может быть выбран из группы, состоящей из ЛСН (лаурилсульфат натрия), ДСН, тритона Х-100, Твина 20, или любого другого обычно используемого ионного, неионного детергента, известного в данной области техники.

Связывающий буфер.

Было обнаружено, что связывающий буфер, который добавляют после лизиса для инициации связывания нуклеиновых кислот с ватой, является очень пластичным по составу и рН. Связывающий буфер является настолько пластичным, что для разведения концентрации солей в лизирующем буфере достаточного простого добавления воды, при этом наблюдается хорошее связывание нуклеиновых кислот с ватой. Вату для взаимодействия можно помещать во время лизиса или после добавления связывающего буфера для экстракции нуклеиновых кислот из конретного образца. Для практического применения связывающий буфер может иметь любое значение рН между 4 и 12, предпочтительно в диапазоне от 7 до 10. Для многокомпонентных образцов, таких как кровь, мокрота или слюна, связывающий буфер может содержать определенный процент растворимых в воде полиольных соединений, таких как РЕО, глицерин, РРО, этиленгликоль, пропиленгликоль и т.д. Молекуляная масса РЕО и РРО может варьировать от 200 до 200000, и в случае любого практического применения она составляет от 1000 до 20000. Содержание полиольных соединений в связывающем растворе может составлять до 50 об.%, но для любого практического применения оно будет составлять 1-30 об.%. Полиольные соединения используют для гарантии полного растворения лизированных компонентов, и если лизис с помощью протеиназы К является полным, то содержание полиола может снижаться до 1%. Буферы, известные в данной области техники, включающие бицин, трицин, трис-буфер, НЕРЕ8, СНАР8, фосфат, ацетат, МЕ8, пиридин, пиперазин, бис-трис-буфер, Р1РЕ8, АСЕ8, ВЕ8, ТЕ8, борат, ТАР8, СНЕ8, сАр§, этаноламин, пиперидин и т.д., имеющие рН в диапазоне 5-12, предпочтительно в диапазоне 7-10, можно использовать для получения связывающего буфера, при этом присутствие буфера не является обязательным, но его можно использовать в зависимости от типа образца, объема образца, температуры, состава лизирующего буфера. Если используются буферные соли, их концентрация может варьировать от 1 до 200 мМ, предпочтительно от 1 до 100 мМ и более предпочтительно от 5 до 50 мМ. Концентрация, описанная выше, представляет собой концентрацию связывающего раствора, и после его добавления к лизирующему буферу концентрация меняется в зависимости от состава лизирующего буфера. Также рН, определенный выше, относится к значению рН связывающего буфера на момент его приготовления и при его добавлении к лизирующему буферу рН смешанного раствора (лизирующий буфер + связывающий буфер) может меняться. Хотя спирты, такие как метанол, этанол и пропанол, представляют собой не полиолы, они также могут использоваться в приготовлении связывающего буфера. В целом, можно использовать любую растворимую в воде жидкость, содержащую функциональную группу кислоты, амина, спирта, фенола, амида, сложного эфира и т.д. в качестве одной из функциональных групп.

Промывочные буферы.

Промывочный буфер представляет собой раствор, который селективно вымывает компоненты, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, из ваты. Если клинический образец представляет собой кровь, то после связывания вата становится коричневого цвета, удалению которого, как было обнаружено, способствует содержание этанола в промывочном буфере (называемом промывочным буфером 1). В частности, первую промывку проводят буфером или водой, содержащей 1-99 об.%, предпочтительно 30-70 об.%, более предпочтительно 50 об.% этанола. При необходимости могут проводиться многократные промывки водным раствором этанола для удаления компонентов, не являющихся нуклеиновыми кислотами, что может зависеть от образца. Метанол, н-пропанол, 2-пропанол, глицерин, РЕО, РРО, этиленгликоль, пропиленгликоль или любой другой растворимый в воде спирт может заменять этанол в промывочном растворе. Промывочный буфер 2, содержащий моно- или бивалентный катион, можно использовать вместе с промывочным буфером 1, имеющим описанный выше состав. Промывочные буферы 1 и 2 могут иметь одинаковый состав и состоять из воды, спирта и моно- или бивалентного катиона. Количество промывок

- 5 022842 ваты промывочными буферами 1 и 2 может составлять 0-10 и в идеале находится в диапазоне 1-3. Последующие промывки обычно проводят с использованием деионизированной воды, и количество промывок может составлять от одной до десяти, предпочтительно от 2 до 5 и более предпочтительно 3-5. Деионизированную воду, используемую на этапе промывания, можно заменять на свободную от ДНК-азы, свободную от РНК-азы воду, или воду Μίΐΐίρ. или фильтрованную воду, или водопроводную воду, или грунтовую воду. Было показано, что изначальная промывка водным раствором спирта способствует удалению большинства компонентов, не являющихся нуклеиновыми кислотами, с последующими многократными промывками водой (100%-ная вода) для удаления остаточного спирта. Промывки водой используют для гарантии, что полученные нуклеиновые кислоты являются готовыми для ПЦР, с минимальным содержанием или в отсутствии ингибиторов ПЦР. Промывочные буферы могут необязательно содержать соли, такие как МдС1₂, СаС1₂, ЫаС1, КС1, или буферы, такие как бицин, трицин, трис-буфер, НЕРЕЗ, СНЛРЗ, фосфат, ацетат, МЕЗ, пиридин, пиперазин, бис-трис-буфер, ΡΙΡΕ8, АСЕ8, ВЕЗ, ТЕЗ, борат, ТАРЗ, СНЕЗ, САРЗ, этаноламин, пиперидин и т.д., имеющие рН в диапазоне 5-12. Концентрация буфера или соли или их комбинации, может составлять 1-1000 мМ, предпочтительно находится в диапазоне 20-200 мМ и более предпочтительно составляет около 100 мМ.

Элюирующий буфер.

Любой теплый (45-99°С) водный буферный раствор может вымывать нуклеиновые кислоты из ваты. Было обнаружено, что рН элюирующего буфера, является критичным, но предпочтительно находится в диапазоне 8-11, и что элюирование следует проводить при температуре между 45-99°С для полного восстановления нуклеиновых кислот. Деионизированную воду, используемую для приготовления буфера на этапе элюирования, можно заменять на свободную от ДНК-аз, свободную от РНК-аз воду, или воду Μί11ίρ, или фильтрованную воду, или водопроводную воду, или грунтовую воду. Для элюирования можно использовать буферы, известные в данной области техники, включающие бицин, трицин, трис-буфер, НЕРЕЗ, СНАРЗ, фосфат, ацетат, МЕЗ, пиридин, пиперазин, бис-трис-буфер, Р1РЕЗ, АСЕЗ, ВЕЗ, ТЕЗ, борат, ТАРЗ, СНЕЗ, САРЗ, этаноламин, пиперидин и т.д., имеющие рН в диапазоне от 5 до 12, хотя рКа наиболее предпочтительных буферов находится в диапазоне 7-10. Во всех случаях использования ваты для элюирования связанных нуклеиновых кислот элюирующий буфер должен быть теплым, и в случаях практического применения температура указанного буфера находится в диапазоне 45-99°С. Описанные условия сильно контрастируют с большинством описанных в литературе способов, согласно которым элюирование проводят в теплых условиях с использованием деионизированной воды. Однако нуклеиновые кислоты, связанные с ватой, не могут полностью вымываться теплой водой, и буфер или присутствие соли имеют существенное значение. Соль может представлять собой МдС1₂, СаС1₂, ЫаС1, КС1 и т.д. в концентрации 0-100 мМ, предпочтительно в диапазоне 5-50 мМ. Буфер может быть выбран из группы буферов, а именно бицина, трицина, трис-буфера, НЕРЕЗ, СНАРЗ, фосфата, ацетата, МЕЗ, пиридина, пиперазина, бис-трис-буфера, Р1РЕЗ, АСЕЗ, ВеЗ, ТЕЗ, бората, ТАРЗ, СНЕЗ, САРЗ, этаноламина, пиперидина.

Восстановление нуклеиновых кислот.

В случае настоящей системы восстановление нуклеиновых кислот зависит от лизирующего буфера, связывающего буфера, промывочных буферов и элюирующего буфера и используемой комбинации. В зависимости от комбинации восстановление нуклеиновых кислот может быть сравнимым с любой системой экстракции нуклеиновых кислот на основе силикагеля. Также было обнаружено, что в случае образцов с низким титром подход для экстракции нуклеиновых кислот на основе ваты согласно настоящему изобретению является более эффективным по сравнению со способами на основе силикагеля.

Количество ваты.

Количество ваты зависит от объема клинического образца, и было обнаружено, что для объема образцов в диапазоне 1-300 мкл подходящим является использование 5-30 мг ваты. Для объемов образцов в диапазоне миллилитров может требоваться 50 мг, или более, ваты. В целом, от 1 мг до 10 г ваты является достаточным для экстракции нуклеиновых кислот из любого клинического, экологического или полевого образца.

Стоимость каждого анализа.

Так как вата, используемая согласно настоящему протоколу, представляет собой хирургическую вату, коммерчески доступную в любой аптеке или розничном магазине (может быть автокпавированной или подверженной очистке), цена каждой экстракции нуклеиновых кислот является минимальной и одной из самых низких из описанных на сегодняшний день в литературе. Кроме того, учитывая устранение случайных ингибиторов ПЦР в элюирующих растворах нуклеиновых кислот, простоту и адаптируемость к применению в РОС, легкость автоматизации и т.д., настоящий поход является лучшим, а стоимость экстракции, вероятно, является дополнительным преимуществом.

Безопасность компонентов и утилизация растворов.

В системе экстракции нуклеиновых кислот на основе ваты большинство используемых буферов имеют водную основу, благодаря чему отработанный материал может безопасно и эффективно утилизироваться специалистами в данной области техники. Вата может быть упакована в картридж для применения в РОС, в котором могут задерживаться все лизирующие, связывающие, промывочные растворы, и

- 6 022842 при использовании которого у медицинского работника или лаборанта нет необходимости удалять отработанный материал, так как указанный картридж является изолированной системой.

Применение экстрагированных нуклеиновых кислот.

Экстрагированные нуклеиновые кислоты с использованием протокола на основе ваты, описанного в настоящем варианте реализации изобретения, могут быть готовыми для использования в ПЦР или ОТПЦР. Другие способы применения описанного протокола на основе ваты включают восстановление нуклеиновых кислот из клинического образца для архивирования, хранения, дальнейшего применения в области биохимии или молекулярной биологии и т.д. Экстрагированные нуклеиновые кислоты можно использовать для любого способа применения в области биохимии или молекулярной биологии, которые через некоторое время могут быть открыты специалистами в данной области техники.

Применение ваты в форме, подходящей для экстракции нуклеиновых кислот.

Настоящий вариант реализации изобретения представляет собой экстракцию нуклеиновых кислот в готовом для ПЦР виде с использованием ваты с минимальным необходимым оборудованием, таким как центрифуга или другое оборудование для открутки. Вата может быть упакована в любую форму, подходящую для экстракции нуклеиновых кислот в зависимости от количества образца, качества образца и происхождения образца. Предпочтительно нуклеиновые кислоты получают в растворе или эмульсии, которые обрабатывают в соответствии с описанными системами для лизиса, связывания, промывания и элюирования. Следовательно, упаковка ваты является критичным этапом в экстракции нуклеиновых кислот, и любая форма, в которой вата может контактировать с раствором, содержащим нуклеиновые кислоты, рассматривается как часть настоящего изобретения. На фиг. 1-3 показаны некоторые способы упаковки ваты, которые никоим образом не следует рассматривать в качестве ограничения. Для краткости, вата упаковывается таким образом, что раствор, содержащий нуклеиновые кислоты, контактирует с ватой, или вата контактирует с жидкостью, и указанная форма рассматривается как часть настоящего изобретения.

Согласно другому варианту реализации изобретения вата может быть упакована в модифицированный пластиковый наконечник для пипетки на 1 мл, модифицированный пластиковый наконечник для пипетки на 2 мл, пробирку Ра1сои на 15 мл, пробирку Ра1сои на 50 мл, пробирку Эппендорфа на 1,5 мл, пробирку Эппендорфа на 2 мл, пробирку из боросиликатного стекла на 5 мл, пластиковый флакон с завинчивающейся крышкой на 4 мл, пластиковую пастеровскую пипетку на 3 мл, стеклянную пастеровскую пипетку, стеклянную пастеровскую пипетку с резиновой грушей, пластиковую пастеровскую пипетку с резиновой грушей, стеклянную пипетку с формой из пластика и резины в качестве груши, стеклянный флакон на 2 мл с пластиковой крышкой, одноразовый и автоклавированный пластиковый шприц на 10 мл, пластиковую форму, присоединенную к шприцу на 5 мл, одноразовую единицу, присоединенную к шприцу на 50 мл и т.д. Вата также может быть представлена в виде ватного тампона, изготовленного автоматически или вручную. Ватный тампон, показанный на фиг. 3 [е], изготовленный из вискозы и любого полимера, содержащего смесь хлопка (1-100%), или химически или физически модифицированная вата (1-100%) рассматривается как часть настоящего изобретения.

Использование ваты для хранения клинического образца.

Вата может подвергаться непосредственному взаимодействию с образцом и, являясь абсорбентом, может стабилизировать и поддерживать указанный образец в сохранной форме. Сохранная форма определяется устройством, в котором содержание нуклеиновых кислот в добавленном образце значительно не деградирует. Связывание может являться обратимым, при этом нуклеиновые кислоты можно экстрагировать с использованием протокола экстракции нуклеиновых кислот, описанного в настоящем варианте реализации изобретения. Вата может быть необязательно пропитана стабилизатором, который улучшает стабильность образца и составляющих образца. Необязательно вата может быть пропитана ферментом или химическим или лизирующим буфером, описанным в настоящем протоколе, или лизирующим буфером, содержащим протеиназу К, или протеиназу К, вместе со стабилизирующими буферными растворами солей. Вата может быть обработана ЭДТА, азидом натрия, основанием, кислотой, лизирующим буфером, медом и антибактериальным агентом, обработана любым противомикробным агентом, любым противовирусным соединением или обработана ЭДТА и азидом натрия, антибактериальным, противомикробным, противовирусным агентом, антикоагулянтами, стабилизаторами клинических образцов, известными в данной области техники, медом или любой их комбинацией. Объем образца с добавлением ваты для хранения может представлять собой любой объем, но для практического применения он может составлять от 1 мкл до 20 мл, и используемое количество ваты может представлять собой любое количество, но для любого практического применения указанное количество может составлять от 1 мг до 10 г. Сбор образца может осуществляться на пропитанной лизирующим буфером вате и также рассматривается как часть настоящего изобретения.

Способ использования системы с упакованной ватой для экстракции нуклеиновых кислот.

Вату упаковывали в устройство, как показано на фиг. 1-3, с использованием протокола экстракции нуклеиновых кислот, описанного в настоящем варианте реализации изобретения. Механизмом, с помощью которого вату подвергали взаимодействию с системами лизиса, связывания, промывания и элюирования, описанными в настоящем варианте реализации изобретения, может быть нагрев, встряхивание,

- 7 022842 перемешивание на вортексе, перемешивание, непрерывное движение, пипетирование или любой другой способ, с помощью которого подвергают взаимодействию твердые вещества и жидкости. По существу, жидкость, содержащая нуклеиновые кислоты, контактирует с волокнами ваты.

Согласно другому варианту реализации изобретения способ согласно настоящему изобретению является одним из наиболее легких и наиболее пластичных протоколов экстракции нуклеиновых кислот, описанных в литературе. Почти все описанные в литературе способы требуют использования центрифуги для осаждения содержимого или магнита для удержания намагниченных частиц в неизменном положении или и того и другого, а способ, описанный в настоящем варианте реализации изобретения, полностью устраняет необходимость использования центрифуги или магнита. Существующие протоколы выделения нуклеиновых кислот ограничены по объему образца или требуют проведения множества манипуляций для обработки больших объемов образцов. В соответствии с протоколом согласно настоящему изобретению можно обрабатывать фактически любое количество образца (в случае практического применения от 1 мкл до 20 мл) практически одновременно при использовании одноразовой системы экстракции. Способ согласно настоящему изобретению приводит к получению нуклеиновых кислот, готовых для непосредственного использования для дальнейшего определения и последующей обработки, такой как ПЦР, секвенирование или блоттинг. Простота системы делает ее одинаково подходящей для использования как в месте предоставления медицинских услуг (ροίηΐ οί саге, РОС), так и в организованных лабораториях, что впервые описано в литературе.

Протокол на основе ваты, описанный в настоящем варианте реализации изобретения, имеет характерные признаки, такие как устранение необходимости использования центрифуги, минимальные различия среди пользователей, эффективность, сравнимая с протоколами на основе силикагеля, простота использования по сравнению с любыми существующими протоколами выделения нуклеиновых кислот, возможность обработки любого количества образца, полноценное восстановление нуклеиновых кислот, возможность обработки образцов с низким титром, легкость автоматизации, подходящей для установленного в больницах оборудования, так и установок в местах предоставления медицинских услуг, и высокая стабильность восстановления и качества нуклеиновых кислот.

Согласно другому варианту реализации изобретения в способе, описанном в настоящей заявке, используются волокнистые материалы, такие как вата, для экстракции нуклеиновых кислот фактически из любого клинического или аналитического образца биологической природы в готовом для ПЦР или отбратно-транскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР) или секвенирования или блоттинга виде. Процедура включает лизирование, связывание нуклеиновых кислот с ватой, промывание нуклеиновых кислот, связанных с ватой, водными растворами, и элюирование нуклеиновых кислот в буфере с солями, такими как КС1. Типичный лизирующий буфер в протоколах на основе силикагеля или не на основе силикагеля содержит некоторые тетра- или двухосновные ионы, такие как ЭДТА (хелатирующие агенты), которые связываются с железом в крови. Согласно описанному в настоящей заявке протоколу добавляли ЭДТА в высокой концентрации (10-300 мМ) для создания условий, в которых все нуклеиновые кислоты селективно связываются с ватой. Обычно рН лизирующего буфера доводят до 6 для обеспечения связывания с матрицей (силикагелем или не силикагелем), в условиях, где большинство белков и других компонентов являются нейтральными или положительно заряженными, тогда как нуклеиновые кислоты все еще отрицательно заряжены и взаимодействует с матрицей. В настоящей системе связывания рН должен быть основным (рН 8-11), и избыток отрицательно заряженной ЭДТА (10-300 мМ) сам по себе действует в качестве буфера и доводит рН до примерно 8. Протокол согласно настоящему изобретению является первым протоколом, в котором нуклеиновые кислоты лизируются и могут связываться с матрицей при основном рН. Связывающий буфер может представлять собой воду, любой водный буфер, имеющий рН в диапазоне 311, или воду, содержащую полиэтиленгликоль (РЕС, 1-30%), или глицерин (1-30%), или полипропиленгликоль (РРС, 1-30%), или этиленгликоль (1-50%), или пропиленгликоль (1-50%), или любой растворимый в воде спирт или любую их комбинацию. Связывающий буфер используется для обеспечения разбавления солей лизирующего буфера, усиления связывания нуклеиновых кислот в условиях с высоким содержанием ЭДТА и солюбилизации частиц лизата. Описанный протокол может включать широкий диапазон буферов для связывания с различными значениями рН, что также является первым в литературе примером использования пластичного связывающего буфера с точки зрения рН или состава. Более длительная обработка образца ограничивает объем образца, и невозможность количественной оценки нуклеиновых кислот является связанным с РТЛ-картами ограничением. Указанные ограничения отсутствует в протоколе экстракции нуклеиновых кислот, описанном в настоящем варианте реализации изобретения с использованием ваты. Наконец, согласно всем описанным в литературе протоколам, элюирование проводят в водном буфере или воде при комнатной температуре или иногда при повышенной температуре, тогда как промывание нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению проводят водой при комнатной температуре и элюирование проводят при повышенной температуре (50-99°С). При использовании протокола и матрицы, определенных в настоящем варианте реализации изобретения, горячая деионизированная вода не будет вымывать все связанные нуклеиновые кислоты, и присутствие буфера или соли или их комбинации является обязательным. Указанные условия сильно контрастируют с описанными в литературе протоколами экстракции нуклеиновых кислот, согласно которым связанные нуклеино- 8 022842 вые кислоты вымывают из матрицы в горячей деионизированной воде (протоколы на основе силикагеля и не на основе силикагеля позволяют вымывание нуклеиновых кислот горячей водой). Элюирующий буфер в любых случаях может иметь рН между 8-10, что указывает на то, что элюирующий буфер является пластичным с точки зрения рН, и для эффективного элюирования связанных нуклеиновых кислот из ваты является предпочтительным некоторое содержание соли, такой как КС1.

Согласно другому варианту реализации изобретения в приведенных ниже способах используется вата и другие волокнистые материалы на основе ваты для количественной экстракции нуклеиновых кислот в специальных условиях лизиса, связывания, промывания и элюирования, которые являются уникальными для элюирования нуклеиновых кислот из ваты. Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена система быстрого выделения нуклеиновых кислот из любого экологического, клинического, бактериального, грибкового и животного источника с использованием ваты. Образцы могут представлять собой клеточные лизаты, жидкости организма, растения, ткани и бактериальные клетки и клеточные лизаты. Вата и вискоза представляют собой волокнистые материалы, получаемые естественным и искусственным путем соответственно, которые, как было обнаружено, связываются с нуклеиновыми кислоты при конкретных условиях. Процесс связывания нуклеиновых кислот и селективное удерживание нуклеиновых кислот на вате и высвобождение нуклеиновых кислот при определенных условиях элюирования показаны на примере ДНК и РНК.

Согласно другому варианту реализации изобретения при типичной экстракции ДНК из клинического образца, такого как кровь, указанную кровь лизировали с помощью лизирующего буфера, состоящего из тиоцианата гуанидина, ЭДТА, буфера, такого как трис-буфер, детергента, такого как тритон Х-100, необязательно с мочевиной, полиолом, моновалентной солью, содержащий катион группы ΙΑ, и/или бивалентной солью, содержащий катион группы ΙΙΑ, и расщепляющие белки ферменты, такие как протеиназа К. Концентрация тиоцианата гуанидина во всех случаях может составлять между 0.1 и 7 М. В некоторых способах применения тиоцианат гуанидина можно заменять на гидрохлорид гуанидина, и его концентрация также может варьировать от 1 до 6 М. Мочевину использовали для денатурации белков, при этом она дополняет функцию солей гуанидина и ее концентрация может варьировать между 0 и 7 М. Как правило, большинство описанных в литературе протоколов лизиса для крови включают использование ЭДТА в диапазоне 20 мМ. Лизирующий буфер согласно настоящему изобретению может выдерживать значительно более высокие концентрации ЭДТА в диапазоне 10-300 мМ, предпочтительно около 100 мМ, для эффективного связывания нуклеиновых кислот с ватой. Концентрацию ЭДТА можно адаптировать для других нуклеиновых кислот, таких как РНК и ПНК, но в целом, было обнаружено, что более высокие концентрации ЭДТА способствуют улучшению времени цикла (СТ) и интенсивности сигнала в ходе ПЦР и ОТ-ПЦР. Значительно более высокие концентрации ЭДТА способствуют связыванию железа, присутствующего в гемоглобине (в случае крови), предотвращают любую ДНК-азную активность и создают сильный отрицательный заряд, в условиях которого нуклеиновые кислоты могут связываться с ватой. Важным аспектом описанного выше является то, что добавление значительно более высокой концентрации ЭДТА в буфере делает рН указанного буфера основным и, насколько нам известно, настоящий вариант реализации является первым примером, в котором связывание нуклеиновой кислоты с матрицей проводится в основных условиях. Важно, что рН раствора для связывания должен быть основным для обеспечения связывания нуклеиновых кислот с ватой, так как при очень кислом рН ЭДТА может осаждаться из лизирующего буфера, и следовательно, рН выше 8 является предпочтительным для связывания. Хлорид магния, как правило, используется в более высоких концентрациях для подавления РНКазной активности, и следовательно, он может использоваться в протоколе лизиса нуклеиновых кислот. Трис представляет собой вариант буфера для лизиса и, как было обнаружено, может использоваться в концентрации 0-100 мМ, и, как правило, концентрация около 20 мМ является оптимальной. Полиолы используют в лизирующем или связывающем буфере для повышения активности протеиназы К и для улучшения растворимости расщепленных белков. Содержание полиола в лизирующем буфере может составлять 0-30 об.%. Все указанные буферы готовили на деионизированной воде и в случае выделения РНК вода может быть обработанной диэтилпирокарбонатом (ЭЕРС) и автоклавированной. Лизис с использованием протеиназы К может быть проведен до добавления выше описанного лизирующего буфера (в случае крови, мокроты, слюны и т.д.) и вместе с лизирующий буфером (в случае мочи, пота и т.д.). Было обнаружено, что обработка протеиназой К является эффективной в упомянутом лизирующем буфере, и следовательно, указанная обработка может осуществляться до добавления лизирующего буфера или вместе с лизирующим буфером для любого вида клинического образца, содержащего нуклеиновые кислоты.

Согласно другому варианту реализации изобретения было обнаружено, что связывающий буфер, который добавляли после лизиса для инициации связывания нуклеиновых кислот с ватой, является очень пластичным по составу. Связывающий буфер настолько пластичен по составу, что для разведения концентрации солей в лизирующем буфере достаточно простого добавления воды. Вату можно помещать для ее взаимодействия во время лизиса или после добавления связывающего буфера. Состав связывающего буфера может иметь любой рН между 5 и 12, предпочтительно в диапазоне 7-10. Для многокомпонентных образцов, таких как кровь, мокрота или слюна, связывающий буфер может содержать опреде- 9 022842 ленный процент полиольных соединений, таких как РЕО, глицерин, РРО, этиленгликоль, пропиленгликоль и т.д. Было обнаружено, что обычно используемые связывающие растворы (для систем выделения нуклеиновых кислот на основе силикагеля), такие как этанол или водный раствор этанола, снижают аффинность связывания нуклеиновых кислот с ватой. Т.е было обнаружено, что присутствие этанола во время этапа связывания снижает эффективность связывания нуклеиновых кислот с ватой.

Согласно другому варианту реализации изобретения промывочный буфер представляет собой раствор, который селективно вымывает компоненты, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, из ваты. Если клинический образец представляет собой кровь, то после связывания вата становится коричневого цвета, удалению которого, как было обнаружено, способствует содержание этанола в промывочном буфере (называемом промывочным буфером 1). В частности, первую промывку проводили с использованием буфера или воды, содержащей 10-90%, предпочтительно 30-70%, более предпочтительно 50% этанола. Метанол, н-пропанол, изопропанол, глицерин, РЕО, РРО, этиленгликоль, пропиленгликоль или любой другой растворимый в воде спирт может заменять этанол в промывочном растворе. Можно использовать промывочный буфер 2, в котором присутствует моно- или бивалентный катион, вместе с промывочным буфером 1, имеющим описанный состав. Промывочные буферы 1 и 2 также могут иметь одинаковый состав и содержать воду, спирт и моно- или бивалентный катион. Количество промывок ваты промывочными буферами может составлять 0-10 и в идеале находится в диапазоне 1-3. Последующие промывки обычно проводили с использованием деионизированной воды. Количество указанных промывок может составлять от одной до десяти, предпочтительно от 2 до 5 и более предпочтительно 3-5. Деионизированную воду, используемую на этапе промывания, можно заменять на свободную от ДНК-аз воду, свободную от РНК-аз воду или воду МИНЦ или фильтрованную воду или водопроводную воду или грунтовую воду.

Согласно другому варианту реализации изобретения вымывание нуклеиновых кислот из ваты может осуществляться с помощью любого водного буфера. Необходимая концентрация буфера составляет между 1 и 200 мМ, предпочтительно 5-50 мМ, более предпочтительно 30-70 мМ, в элюирующем буфере. Буферы, известные в данной области техники, включающие бицин, трицин, трис-буфер, НЕРЕ8, СНАР8, фосфат, ацетат, МЕ§, пиридин, пиперазин, бис-трис-буфер, Р1РЕ8, АСЕ8, ВЕ§, ТЕ§, борат, ТАР8, этаноламин, СНЕ8, САР8, этаноламин, пиперидин и т.д., имеющие рН в диапазоне 5-12, предпочтительно в диапазоне 7-10, более предпочтительно в диапазоне 8-10, способны вымывать нуклеиновые кислоты из ваты в горячих условиях. Вымывание нуклеиновых кислот из ваты необходимо проводить при повышенной температуре между 50 и 100°С, предпочтительно при 70-95°С, более предпочтительно при примерно 85°С.

Согласно другому варианту реализации изобретения очищенные нуклеиновые кислоты могут являться на 10-100% чистыми и обычно являются готовыми для ПЦР. Очистка нуклеиновых кислот зависит от оптимальной комбинации лизирующего, связывающего, промывочных и элюирующего буфера и матрицы для очищения (вата или производные ваты или материалы, содержащие смесь хлопка). Было показано, что РТА-карты или связанные с целлюлозой частицы или целлюлозная фильтрованная бумага не являются эффективными при указанных комбинациях буферов, что указывает на то, что вата отличается от других форм целлюлозы с точки зрения взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. В соответствии с родственными способами согласно настоящему изобретению предложены пути выделения нуклеиновых кислот из образца, содержащего нуклеиновые кислоты, с использованием ваты или производных ваты или материалов, содержащих смесь хлопка, в качестве твердой матрицы, с использованием следующего общего протокола.

a) Образец, содержащий нуклеиновые кислоты, добавляли к лизирующему буферу. Лизирующий буфер состоял из тиоцианата гуанидина, ЭДТА, трис-буфера, детергента, необязательно с мочевиной, полиолом, моновалентной солью, содержащей катион группы 1А и/или бивалентной солью, содержащий катион группы 11А, и протеиназой К. Образец нуклеиновых кислот и лизирующий буфер перемешивали и нагревали при 50-95°С в течение 1-20 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли связывающий буфер, который мог представлять собой воду, буфер, имеющий рН между 4-11, или раствор, содержащий полиол. Объем связывающего буфера мог соответствовать 0.1-10-кратному объему лизирующего буфера.

c) Указанный выше раствор готовили для его взаимодействия с ватой, предпочтительно при комнатной температуре, в течение времени от нескольких секунд до нескольких минут.

б) Затем вату промывали особым образом (1-я промывка) промывочным буфером, содержащим водный раствор спирта или только воду.

е) Указанную выше вату последовательно промывали водой или буфером до удаления остаточного спирта из указанной ваты.

Г) Нуклеиновые кислоты вымывали буфером, состоящим из соли, такой как КС1 (солей, содержащих катион группы 1А или группы 11А), и/или бицином, таким как буфер, и элюирующие нуклеиновые кислоты обычно являлись готовыми для использования в ПЦР или ОТ-ПЦР.

Настоящее изобретение также конкретизируется с помощью следующей таблицы, которая обеспечивает сравнительную оценку способом, используемым согласно настоящему изобретению, и способами, используемыми согласно предшествующему уровню техники. В таблице приведены сравнения между

- 10 022842 различными способами некоторых важных аспектов, используемых для характеристики способов, которые применяются для выделения нуклеиновых кислот.

Сравнительная оценка важных аспектов, связанных с выделением нуклеиновых кислот

Номер	Свойство	Экстракция нуклеиновых кислот с использовани ем ваты	Экстракция нуклеиновых кислот на основе целлюлозно й матрицы	Экстракция нуклеиновых кислот с использовани ем коммерческих колонок с силикагелем	Экстракция нуклеиновых кислот с использовани ем магнитных наночастиц, покрытых силикагелем
1	Лизирующий буфер рН выше 8	Да	Нет	Нет	Нет
2	Один протокол для ДНК/РНК	Да	Возможно	Возможно, но обычно предложены разные протоколы	Возможно
3	Элюирование нуклеиновых кислот водой/ буфером лри рН 7	Нет	Да	Да	Да
4	Промывка 100% водой связанных с матрицей нуклеиновых	Да	Возможно	Нет	Нет

	кислот
5	Автоматиэирова нная обработка нуклеиновых кислот	Да	Не описано в литературе	Не описано в литературе	В литературе существуют прототипы
6	Использование центрифуги	Нет	Да	Да	В некоторых протоколах
7	Выделение летучих веществ во время осуществления протокола	Нет	Да	Да	В некоторых протоколах
8	Пригодность для использования в месте предоставления медицинских услуг	Да	Нет, требует дополнитель ной лабораторно й обработки образца	Нет, требует использовани е центрифуги и приводит к выделению летучих веществ	Нет, требует наличия объемных приборов
9	Подходящая для ОТ-ПЦР экстракция нуклеиновых кислот	Да	Да	Да	Да
10	Возможность обработки различных образцов, таких как кровь, мокрота, сыворотка, слюна, ткани и т.д., с минимальной предварительно й обработкой образца	Да	Нет	Нет	Нет
и	Типичное время выделения нуклеиновых кислот	8-12 минут	20-30 минут	15-20 минут	15-20 минут
12	Стандартная стоимость	Ае. 10-30	Пе. 50-100	Пе. 150-500	Не. 100-500

выделения нуклеиновых кислот (стоимость реагентов, матрицы и Других компонентов набора)

Технология настоящего изобретения далее раскрыта с помощью следующих примеров. Однако не следует считать, что примеры ограничивают объем изобретения.

Общая методика.

Раствор, содержащий нуклеиновые кислоты, приводили во взаимодействие с ватой, предпочтительно при комнатной температуре, и компоненты, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, вымывали из

- 11 022842 ваты с использованием ряда промывок, включающих промывку водным раствором спирта и водой. Нуклеиновые кислоты вымывали из ваты с использованием водного буфера, состоящего из соли, при повышенной температуре. Вымывающиеся нуклеиновые кислоты являлись готовыми для дальнейшей обработки или для ПЦР. Следующие примеры приведены для вариантов с использованием ваты, упакованной в наконечник для пипетки на 1 мл, обычно используемой в научно-исследовательских лабораториях. Специалисту в данной области техники очевидно, что вата может быть упакована в любую форму, в которой есть возможность контактирования жидкости с указанной ватой. По существу, любое устройство с впускным и выпускным отверстием, между которыми может быть упакована вата, рассматривается как часть настоящего изобретения.

Пример 1. Экстракция ДНК из крови.

a) 50 мкл крови добавляли к 75 мкл лизирующего буфера (30 мкл протеинкиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) 150 мкл связывающего буфера (вода с 0.1 г/мл РЕО 6000) добавляли к указанному выше раствору.

c) Готовили пластиковую пипетку на 1 мл, в которую упаковывали 8 мг ваты (пипетка с ватой, как показано на фиг. 2[а]), для взаимодействия с выше указанным раствором.

й) Затем пипетку с ватой промывали 2 мл промывочного буфера 1 (50% этанол) и промывочного буфера 2 (50% этанол, содержащий 100 мМ МдС1₂).

е) Наконечник с ватой промывали водой (3 X 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали 100 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 2. Экстракция ДНК из крови.

a) 100 мкл крови добавляли к 150 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеинкиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 300 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0.1 г/мл РЕО6000).

c) Готовили формованный наконечник для пипетки на 1 мл, в который упаковывали 10 мг ваты (наконечник с ватой, как показано на фиг. 3[с]), для взаимодействия с указанным выше раствором.

й) Затем наконечник с ватой промывали 1 мл промывочного буфера 1 (50% этанол) и 2 мл промывочного буфера 2 (50% этанол, содержащий 100 мМ МдС1₂).

е) Наконечник с ватой промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали в 200 мкл элюирующем буфере (10 мМ бицин, 10 мМКС1, рН9.8) при 95°С.

Пример 3. Экстракция ДНК из крови.

a) 100 мкл содержащей малярийного паразита (р. РаЮрагит) крови добавляли к 150 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеинкиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100).

Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) 300 мкл связывающего буфера (вода с 0.1 г/мл РЕО6000) добавляли к указанному выше раствору.

c) Готовили формованный наконечник для пипетки на 1 мл, в который упаковывали 10 мг ваты (наконечник с ватой, как показано на фиг. 3[с]) взаимодействия с указанным выше раствором.

й) Затем наконечник с ватой промывали 1 мл промывочного буфера 1 (50% этанол). е) Наконечник с ватой промывали 2 мл промывочного буфера 2 (50% этанол, содержащий 100 мМ

М§С12).

ί) Наконечник с ватой промывали водой (3 х 1 мл).

д) Нуклеиновые кислоты вымывали в 200 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН9.8) при 95°С.

Пример 4. Экстракция РНК из крови.

a) 50 мкл крови с положительной реакцией на чикунгунью добавляли к 75 мкл лизирующего буфера (30 мкл протеинкиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 150 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО6000).

c) Готовили наконечник для пипетки на 1 мл, в который упаковывали 10 мг ваты, для взаимодействия с указанным выше раствором.

- 12 022842

й) Затем наконечник с ватой промывали особым образом 1 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 50 мМ МдС1₂).

е) Наконечник с ватой промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали в 200 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицина, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 5. Экстракция ДНК из слюны.

a) 50 мкл слюны добавляли к 100 мкл лизирующего буфера (10 мкл протеинкиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 200 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) 250 мкл связывающего буфера (10% глицерин в воде) добавляли к указанному выше раствору.

c) Готовили формованный наконечник для пипетки на 1 мл, в который упаковывали вату (наконечник с ватой, как показано на фиг. 3[с]), для взаимодействия с указанным выше раствором.

й) Затем наконечник с ватой промывали особым образом 3 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 200 мМ МдС1₂).

е) Наконечник с ватой промывали водой (3 х 1 мл) путем пипетирования жидкости три раза во время каждой промывки.

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали в 250 мкл элюирующем буфере (10 мМ бицин, 50 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 6. Экстракция РНК из крови.

a) 100 мкл крови с положительной реакцией на чикунгунью добавляли к 150 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеинкиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем указанный раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 300 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО 6000).

c) Готовили формованный наконечник для пипетки на 1 мл, в который упаковывали 10 мг ваты (наконечник с ватой, как показано на фиг. 3[с]), для взаимодействия с указанным выше раствором.

й) Затем наконечник с ватой промывали особым образом 1 мл промывочного буфера 1 (50% этанол) и 2 мл промывочного буфера 2 (50% этанол, содержащий 50 мМ МдС1₂).

е) Наконечник с ватой промывали водой (2 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали 100 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 7. Экстракция РНК из крови.

a) 50 мкл крови с положительной реакцией на чикунгунью добавляли к 75 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 80 мМ ЭДТА, 20 мМ трисбуфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 55°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 70°С в течение 2 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 150 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО 8000).

c) Готовили шприц на 2.5 мл, в который упаковывали 10 мг ваты (шприц с ватой, как показано на фиг. 1[а]), для взаимодействия с указанным выше раствором.

й) Затем наконечник с ватой промывали особым образом 1 мл промывочного буфера 1 (50% этанол) и 2 мл промывочного буфера 2 (50% этанол, содержащий 50 мМ МдС1₂).

е) Шприц с ватой промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали 100 мкл лизирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 8. Экстракция ДНК из мокроты.

a) 100 мкл мокроты добавляли к 150 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 5 мин, затем раствор нагревали при 75°С в течение 2 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 300 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО 6000).

c) Готовили пипетку с гофрированным резервуаром на 5 мл, в которую упаковывали 10 мг ваты (пипетка с гофрированным резервуаром с ватой, как показано на фиг. 2[Ь]), для взаимодействия с указанным выше раствором.

й) Затем наконечник с ватой промывали особым образом 1 мл промывочного буфера 1 (50% этанол) и промывочного буфера 2 (50% этанол, содержащий 50 мМ МдС1₂).

е) Пипетку с гофрированным резервуаром с ватой промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали 100 мкл элюирующего буфера (10 мМ трицин, 10 мМ КС1, рН

- 13 022842

9.8) при 95°С.

Пример 9. Экстракция ДНК из сыворотки.

a) 50 мкл сыворотки добавляли к 75 мкл лизирующего буфера (60 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 150 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО 6000).

c) Готовили формованный наконечник для пипетки на 1 мл, в который упаковывали 10 мг ваты (наконечник с ватой, как показано на фиг. 3[с]), для взаимодействия с ватой.

ά) Затем наконечник с ватой промывали особым образом 1 мл промывочного буфера 1 (50% этанол) и 2 мл промывочного буфера 2 (50% этанол, содержащий 50 мМ МдС1₂).

е) Наконечник с ватой промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали в 200 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН9.8) при 95°С.

Пример 10. Экстракция РНК из сыворотки.

a) 100 мкл сыворотки с положительной реакцией на чикунгунью добавляли к 150 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеинкиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 2 мин.

b) 300 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО6000) добавляли к указанному выше раствору.

c) Готовили формованный наконечник для пипетки на 1 мл, в который упаковывали 10 мг ваты (наконечник с ватой, как показано на фиг. 3[с]), для взаимодействия с ватой.

ά) Затем наконечник с ватой промывали особым образом 3 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 50 мМ МдС1₂).

е) Наконечник с ватой промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали в 200 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицина, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95 ^СС.

Пример 11. Экстракция ДНК из мокроты.

a) 50 мкл мокроты добавляли к 150 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100, рН 9.5). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 85°С в течение 6 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 150 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО 6000).

c) Готовили 10 мг ваты для взаимодействия с указанным выше раствором.

ά) Затем вату промывали особым образом 3 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 50 мМ М§С1₂).

е) Вату промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали 100 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицина, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 12. Экстракция ДНК из мокроты.

a) 50 мкл мокроту добавляли к 75 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 0.01% тритон Х-100, рН 9.5). Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре 5 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 150 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕО 6000).

c) Готовили 10 мг ваты для взаимодействия с указанным выше раствором.

ά) Затем вату промывали особым образом 3 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 100 мМ М§С1₂).

е) Вату промывали водой (3 х 1 мл).

ί) Нуклеиновые кислоты вымывали 100 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 13. Экстракция РНК из ткани.

a) 50 мкл ткани с положительной реакцией на бешенство добавляли к 175 мкл лизирующего буфера (40 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М тиоцианат гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трисбуфер, 0.01% тритон Х-100, рН 9.5), перемешивали на вортексе в течение 7 мин и супернатант переносили в пробирку. Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 75°С в течение 3 мин.

b) К указанному выше раствору добавляли 350 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1

- 14 022842 г/мл РЕС 6000).

с) Готовили 20 мг ваты для взаимодействия с указанным выше раствором.

ά) Затем вату промывали особым образом 3 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 100 мМ МдС1₂).

е) Вату промывали водой (3 х 1 мл).

1) Нуклеиновые кислоты вымывали 100 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицина, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С.

Пример 14. Экстракция РНК из крови.

a) Лизирующий буфер, связывающий буфер, промывочные буферы и элюирующий буфер готовили в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом (ЭЕРС).

b) 50 мкл крови с положительной реакцией на чикунгунью помещали в 50 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл и 250 мкл лизирующего буфера (5.6 М тиоцианат гуанидина, 20 мМ ЭДТА, 20 мМ трис-буфер, 100 мМ МдС1₂, 0.1% тритон Х-100). Пробирку нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем пробирку нагревали при 80°С в течение 2 мин.

c) К указанному выше раствору добавляли 1 мл связывающего буфера (10% РЕС 6000).

ά) Готовили шприц на 3 мл, в который упаковывали вату (шприц с ватой, как показано на фиг. 1[а]), для взаимодействия с раствором путем попеременного перемещения поршня шприца вверх-вниз пять раз.

е) Затем шприц с ватой промывали особым образом 3 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 100 мМ МдС1₂) путем попеременного перемещения поршня шприца вверх-вниз семь раз.

1) Шприц с ватой промывали водой (3 х 2 мл) путем попеременного перемещения поршня шприца вверх-вниз вместе с жидкостью три раза во время каждой промывки.

д) Нуклеиновые кислоты вымывали в 200 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН

9.8) при 95°С путем попеременного перемещения поршня шприца вверх-вниз вместе с жидкостью два раза.

И) Нуклеиновые кислоты, присутствующие в крови, получали в готовом для ПЦР виде и осуществление протокола в целом занимало примерно 9 мин.

Пример 15. Экстракция пептидо-нуклеиновых кислот (ПНК).

a) 50 мкл стандартного раствора, содержащего ПНК, добавляли к 75 мкл лизирующего буфера (10 мкл протеиназы К в концентрации 10 мг/мл, 5.6 М гидрохлорид гуанидина, 100 мМ ЭДТА, 20 мМ трисбуфер, 0.01% тритон Х-100, рН 9.5), перемешивали на вортексе в течение 7 мин и супернатант переносили в пробирку. Полученный раствор нагревали до 60°С и оставляли при указанной температуре на 3 мин, затем раствор нагревали при 75°С в течение 3 мин

b) К указанному раствору добавляли 150 мкл связывающего буфера (вода, содержащая 0,1 г/мл РЕС6000).

c) Готовили 10 мг ваты для взаимодействия с указанным выше раствором.

ά) Затем вату промывали особым образом 3 мл промывочного буфера 1 (50% этанол, содержащий 100 мМ МдС1₂).

е) Затем вату промывали водой (3 х 1 мл).

1) Протеино-нуклеиновые кистоты элюировали в 100 мкл элюирующего буфера (10 мМ бицин, 10 мМ КС1, рН 9.8) при 95°С.

Пример 16. ПЦР-амплификация.

Образцы ДНК/РНК, очищенные в соответствии с протоколом согласно настоящему изобретению, подвергали ПЦР-амплификации с последующим гель-электрофорезом. Результаты изображены на фиг. 4-7. На фиг. 4 представлены сравнительные полосы образцов ДНК, выделенных и очищенных с использованием вискозы, коммерческого вискозного тампона, ваты, упакованной в наконечник для пипетки на 1 мл, коммерческой колонки, заполненной силикагелем, и ватного тампона. Подобным образом, на фиг. 5 представлены сравнительные полосы образцов ДНК, очищенных в соответствии с различными протоколами, а именно, с помощью ваты, упакованной в наконечник для пипетки на 1 мл, ваты, упакованной в шприц на 2 мл, коммерческого колоночного силикагеля, и маркер молекулярной массы.

Также на фиг. 6 представлены сравнительные полосы образцов ДНК, очищенных в соответствии с различными протоколами, а именно, маркер молекулярной массы, образцы, полученные с помощью коммерческого протокола на основе силикагеля, ваты, упакованной в наконечник для пипетки на 1 мл, фильтровальной бумаги \УНа1тап Νο 1, упакованной в наконечник для пипетки, и протокола с использованием РТА-карты.

Дополнительно на фиг. 7 показаны сравнительные полосы образца цитоплазматической 308 РНК, амплифицированной с помощью ОТ-ПЦР, которую очищали в соответствии с различными протоколами. В указанных протоколах использовали различные источники ватной матрицы, а именно, хирургическую вату, автоклавированную вату, промытую гидроксидом натрия вату, промытую соляной кислотой вату и абсорбирующую вату.

Несмотря на то что в настоящей заявке были описаны различные аспекты и варианты реализации изобретения, другие аспекты и варианты реализации настоящего изобретения будут очевидны специали- 15 022842 стам в данной области техники. Различные аспекты и варианты реализации изобретения, описанные в настоящей заявке, приведены в качестве иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение. Действительный объем и сущность настоящего изобретения указаны в следующей далее формуле изобретения.

Claims (29)

1. Способ выделения нуклеиновой кислоты из образца, где указанный способ включает следующие этапы:

(a) добавление лизирующего буфера, имеющего основный рН, к образцу, содержащему нуклеиновую кислоту, с получением раствора лизата или (b) добавление лизирующего буфера, имеющего основный рН, в комбинации со связывающим буфером к образцу с получением раствора лизата;

(c) добавление связывающего буфера к раствору этапа (а) для связывания нуклеиновой кислоты с ватной матрицей или непосредственного связывания раствора этапа (Ь) с ватной матрицей и (й) промывание водой и элюирование связанной с матрицей нуклеиновой кислоты для выделения и очищения нуклеиновой кислоты.

2. Способ по п.1, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей ДНК, РНК и

ПНК.

3. Способ по п.1, где указанный образец представляет собой биологический или небиологический образец.

4. Способ по п.3, где биологический образец выбран из группы, включающей кровь, мокроту, сыворотку, слюну или тканевые экстракты, и небиологический образец выбран из группы, включающей химически синтезированную ПНК.

5. Способ по п.1, где указанный лизирующий буфер выбран из группы, включающей тиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина, ЭДТА, трис-буфер, детергент, полиол, моновалентную соль, содержащую катион группы ΙΑ, или бивалентную соль, содержащую катион группы ΙΙΑ, и переваривающий белки фермент, необязательно вместе с мочевиной, или любую их комбинацию, и где лизис осуществляется при значении рН, предпочтительно находящемся в диапазоне от примерно 8 до примерно 11.

6. Способ по п.5, где концентрация указанной ЭДТА находится в диапазоне от примерно 10 до примерно 300 мМ, предпочтительно составляет примерно 100 мМ.

7. Способ по п.5, где концентрация указанного тиоцианата гуанидина или указанного гидрохлорида гуанидина находится в диапазоне от примерно 0.1 до примерно 7 М.

8. Способ по п.5, где концентрация указанной мочевины находится в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 7 М.

9. Способ по п.5, где концентрация указанного трис-буфера находится в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 100 мМ, предпочтительно составляет примерно 20 мМ.

10. Способ по п.5, где концентрация указанного полиола находится в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 30 об.%.

11. Способ по п.5, где указанный детергент выбран из группы, включающей лаурилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, тритон Х-100, ΝΡ-40 и Твин 20 или любую их комбинацию, и где переваривающий белки фермент представляет собой протеиназу К.

12. Способ по п.1, где указанный связывающий буфер представляет собой воду, необязательно вместе с полиолами или не полиолами.

13. Способ по п.12, где указанный полиол включает растворимые в воде полиольные соединения, выбранные из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, глицерина, полипропиленгликоля, этиленгликоля и пропиленгликоля.

14. Способ по п.12, где указанный не полиол включает спирты, включающие метанол, этанол, пропанол, или любую растворимую в воде жидкость, содержащую функциональную группу кислоты, амина, спирта, фенола, амида или сложного эфира в качестве одной из функциональных групп, или любую их комбинацию.

15. Способ по п.1, где указанное промывание и элюирование осуществляется с использованием промывочного буфера и элюирующего буфера соответственно.

16. Способ по п. 15, где указанное промывание включает первую промывку промывочным буфером, содержащим от примерно 1 до примерно 99 об.%, предпочтительно от примерно 30 до примерно 70 об.% и оптимально примерно 50 об.% водного раствора спирта с последующими многократными промывками промывочным буфером, содержащим 100%-ную воду.

17. Способ по п.16, где указанный водный раствор спирта выбран из группы, включающей этанол, метанол, н-пропанол, 2-пропанол, глицерин, РЕС, РРС, этиленгликоль и пропиленгликоль.

18. Способ по пп.1 и 16, где указанная вода выбрана из группы, включающей деионизированную воду, свободную от ДНК-аз воду, свободную от РНК-аз воду, воду МИНЦ, фильтрованную воду, водопроводную воду и грунтовую воду или любую их комбинацию.

- 16 022842

19. Способ по пп.15 и 16, где указанный промывочный буфер может необязательно содержать соли, выбранные из группы, включающей МдС1₂, СаС1₂, \аС1 и КС1, или буферы, выбранные из группы, включающей бицин, трицин, трис-буфер, ΗΕΡΕδ, СНЛР8, фосфат, ацетат, ΜΕδ, пиридин, пиперазин, бистрис-буфер, ΡΙΡΕδ, ЛСЕ8, ΒΕδ, ΤΕδ, борат, ΤΑΡδ, С1 ΙΕδ, СΑΡδ, этаноламин и пиперидин, имеющие рН в диапазоне от примерно 5 до примерно 12.

20. Способ по п.15, где указанный элюирующий буфер включает теплую воду, имеющую температуру в диапазоне от примерно 45 до примерно 99°С, вместе с буфером или солью, имеющей рН в диапазоне от примерно 8 до примерно 11.

21. Способ по п.20, где указанная вода выбрана из группы, включающей деионизированную воду, свободную от ДНК-аз воду, свободную от РНК-аз воду, воду Μϊΐΐϊφ, фильтрованную воду, водопроводную воду и грунтовую воду или любую их комбинацию.

22. Способ по п.20, где указанный буфер выбран из группы, включающей бицин, трицин, трисбуфер, ΗΕΡΕδ, С1 ΗΑΡδ, фосфат, ацетат, ΜΕδ, пиридин, пиперазин, бис-трис-буфер, ΡΙΡΕδ, ΑСΕδ, ΒΕδ, ΤΕδ, борат, ΤΑΡδ, СΗΕδ, СΑΡδ, этаноламин и пиперидин или любую их комбинацию, имеющие рН в диапазоне от примерно 5 до примерно 12.

23. Способ по п.20, где указанная соль выбрана из группы, включающей МдС1₂, САС1₂, \аС1 и КС1 или любую их комбинацию, в концентрации в диапазоне от примерно 0.01 до примерно 100 мМ, предпочтительно в диапазоне от примерно 5 до примерно 50 мМ.

24. Способ по п.1, где вата выбрана их группы, включающей природную вату, хирургическую вату, клиническую вату, коммерчески доступную вату, крученую вату, промытую водой вату, промытую кислотой или основанием вату, автоклавированную вату, вату, обработанную буфером, имеющую рН в диапазоне от примерно 1 до примерно 14, вату, обработанную раствором соли, вату, обработанную органическим растворителем, прессованную вату и переработанную вату.

25. Набор для выделения нуклеиновой кислоты, включающий ватную матрицу и буферы, выбранные из группы, включающей лизирующий буфер, имеющий значение рН, предпочтительно находящееся в диапазоне от 8 до 11, связывающий буфер, промывочный буфер и элюирующий буфер и любую их комбинацию.

26. Набор по п.25, где указанная вата выбрана из группы, включающей природную вату, хирургическую вату, клиническую вату, коммерчески доступную вату, крученую вату, промытую водой вату, промытую кислотой или основанием вату, автоклавированную вату, обработанную буфером вату, имеющую рН в диапазоне от примерно 1 до примерно 14, вату, обработанную раствором соли, вату, обработанную органическим растворителем, прессованную вату и переработанную вату.

27. Набор по п.25, где указанный буфер выбран из группы, включающей лизирующий буфер по пп.5-11, связывающий буфер по пп.12-14, промывочный буфер по пп.15 и 19 и элюирующий буфер по пп.15 и 20-23.

28. Набор по п.25, где указанный образец включает биологические или небиологические образцы.

29. Набор по п.28, где биологический образец выбран из группы, включающей кровь, мокроту, сыворотку, слюну или тканевые экстракты, и небиологический образец выбран из группы, включающей химически синтезированную ПНК.