ES2652335T3 - Un método para aislar ácidos nucleicos y un kit del mismo - Google Patents

Un método para aislar ácidos nucleicos y un kit del mismo Download PDF

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ES2652335T3 ES11730170.5T ES11730170T ES2652335T3 ES 2652335 T3 ES2652335 T3 ES 2652335T3 ES 11730170 T ES11730170 T ES 11730170T ES 2652335 T3 ES2652335 T3 ES 2652335T3
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Abstract

Un método para el aislamiento de ácido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) añadir tampón de lisis que tiene pH básico a la muestra que contiene ácido nucleico para obtener una solución lisada; o (b) añadir a la muestra tampón de lisis que tiene pH básico en combinación con tampón de unión para obtener una solución lisada; (c) añadir un tampón de unión a la solución obtenida de la etapa (a) para unir el ácido nucleico a una matriz de algodón o para la unión directa de la solución de la etapa (b) a una matriz de algodón, en donde el pH de unión es de 8 a 10; y (d) lavar con tampón de lavado y eluir el ácido nucleico unido a la matriz de algodón con tampón de elución para aislar y purificar el ácido nucleico; en donde el tampón de lisis comprende tiocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina, EDTA, Tris, un detergente y, opcionalmente, urea, un poliol, una sal monovalente que contiene un catión del grupo IA y/o una sal divalente que contiene un catión del grupo IIA y enzima digestiva de proteínas.

Description

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Descripcion
Un metodo para aislar acidos nucleicos y un kit del mismo Campo tecnico
La presente divulgacion se refiere al aislamiento y purification de acidos nucleicos. Mas esencialmente, proporciona un metodo y un kit para aislar y purificar acidos nucleicos usando algodon o sus derivados.
Antecedentes y tecnica anterior de la divulgacion
Los protocolos de extraction de acidos nucleicos se pueden clasificar ampliamente en protocolos basados en sllice y no basados en sllice. Los protocolos existentes de sllice y no sllice no pueden tolerar un lavado con agua para eliminar los componentes que no son acidos nucleicos y requieren un lavado acuoso con algun porcentaje de alcohol en el. La presencia de alcohol en la solution de acido nucleico eluida inhibe la reaction en cadena de la polimerasa y, por lo tanto, tlpicamente ambos protocolos requieren un centrifugado de alta velocidad u otros metodos para eliminar el alcohol residual y la elucion de acidos nucleicos con un tampon acuoso a temperatura ambiente o a temperatura elevada. En algunos casos, ambos protocolos requieren una alta concentration de sal con polietilenglicol o un lavado con alcohol acuoso. El uso de altas concentraciones de sales y alcohol acuoso restringe la elucion de acidos nucleicos como la elimination estricta de estos componentes antes de que se eluyan los acidos nucleicos o el uso de centrlfugas, etc. Por lo tanto, ninguno de los protocolos existentes basados en sllice o no basados en sllice puede usarse en el punto de atencion (POC), ya que una centrlfuga generara aerosoles. Algunos de los protocolos no basados en sllice indicados en la literatura son los siguientes: documento US 7,264,927, Este documento describe el uso de celulosa o papel de celulosa que implica el uso de polialquilenglicol y altas concentraciones de sal para unirse y, finalmente, eluir los acidos nucleicos en un tampon o agua desionizada.
Documento US 6,084,091: Describe el metodo de usar harina de celulosa (como almidon de patata) para el aislamiento de acidos nucleicos.
Documento US 5,804,684: Describe un metodo para usar papel de filtro para la extraccion de acido nucleico, en el que se aloja en un material como una punta de plastico con la ayuda de un papel de seda suave o una pieza de algodon como filtro o barrera para soportar el papel de filtro.
Todos los procesos anteriores utilizan columnas de sllice comercialmente disponibles para el aislamiento final de acidos nucleicos o requieren tiempos de procesamiento de muestras mas largos (mas de 30 minutos) o implican el uso de altas concentraciones de sales durante el lavado de la matriz o el uso de centrlfugas, etc. Ninguno de los metodos de extraccion de acido nucleico basados en celulosa lavan los acidos nucleicos con un tampon acuoso al 100 % o agua y habitualmente contienen un porcentaje de alcoholes o compuestos que contienen poliol.
El documento WO2008/150187 A1 da a conocer un metodo de multiples fines para extraer y purificar ARN, que incluye el diagnostico para analisis de rutina mediante sonda de ADN (ARN), RT-PCR y otros metodos.
Exposicion de la divulgacion
Por consiguiente, la presente divulgacion se refiere a un metodo para el aislamiento de acido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho metodo las etapas de: (a) anadir tampon de lisis a la muestra que contiene acido nucleico para obtener una solucion lisada o (b) anadir tampon de lisis en combination con tampon de union a la muestra para obtener una solucion lisada, (c) anadir un tampon de union a la solucion de la etapa (a) para unir el acido nucleico a una matriz o la union directa de la solucion de la etapa (b) a la matriz y (d) lavar y eluir el acido nucleico unido a la matriz para aislar y purificar el acido nucleico; y un kit para el aislamiento de acido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho kit una matriz y tampones.
La presente invention es como se describe en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de las figuras adjuntas
Las caracterlsticas de la presente divulgacion seran mas evidentes a partir de la siguiente descripcion y las reivindicaciones adjuntas, tomadas en conjunto con las figuras adjuntas. Entendiendo que estas figuras representan solo varias realizaciones de acuerdo con la divulgacion, por lo tanto, no deben considerarse limitantes de su alcance, ya que la divulgacion se describira con especificidad y detalles adicionales mediante el uso de las figuras adjuntas:
Figura 1: Algodon empaquetado en [a] jeringa [b] aguja de jeringa [c] moldes de plastico unidos a la jeringa [d] botella de plastico con tapon de rosca [e] tubo de ensayo de vidrio [f] vial de vidrio con tapon de rosca.
Figura 2: Algodon empaquetado en [a] cuentagotas de plastico desechable [b] pipeta de plastico Pasteur moldeada [c] pipeta de vidrio Pasteur [d] cuentagotas de plastico con cabezal de caucho [e] hisopo de algodon [f] pipeta de plastico moldeada.
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Figura 3: Algodon empaquetado en [a] tubo Eppendorf [b] tubo de vidrio con tapon de rosca [c] punta de plastico moldeado de 1 ml [d] pipeta graduada de vidrio desechable con cabezal de goma [e] hisopo de viscosa [f] pipeta de vidrio con cabezal de plastico y goma.
Figura 4: Muestras de ADN purificadas mediante diferentes protocolos se amplificaron mediante PCR. Calle 1: Marcador de peso molecular, Calle 2: viscosa empaquetada en una punta de pipeta de 1 ml, Calle 3: hisopo de viscosa comercial, Calle 4: algodon empaquetado en una punta de pipeta de 1 ml, Calle 5: columna de sllice comercial, Calle 6: ADN purificado usando un hisopo de algodon comercial, Calle 7: ADN sin amplificar,
Calle 8: blanco de agua.
Figura 5: Muestras de ADN purificadas mediante diferentes protocolos se amplificaron mediante PCR. Calle 1: algodon empaquetado en una punta de pipeta de 1 ml, Calle 2: blanco de agua, Calle 3: algodon empaquetado en una jeringa de 2 ml, Calle 4: columna de sllice comercial, Calle 5: Marcador de peso molecular:
Figura 6: Muestras de ADN purificadas mediante diferentes protocolos se amplificaron mediante PCR. Calle 1: Marcador de peso molecular, Calle 2: protocolo de sllice comercial, Calle 3: algodon empaquetado en una punta de pipeta de 1 ml, Calle 4: papel de filtro Whatman No 1 empaquetado en una punta de pipeta, Calle 5: Protocolo de la tarjeta de FTA.
Figura 7: Una muestra de ARN de 30 ct purificadas mediante diferentes protocolos se amplifico mediante RT- PCR. Calle 1: Marcador de peso molecular, Calle 2: Algodon quirurgico, Calle 3: Algodon esterilizado en autoclave, Calle 4: algodon lavado con hidroxido de sodio Calle 5: Algodon lavado con acido clorhldrico, Calle 6: Algodon absorbente, Calle 7: columna de sllice Qiagen, Calle 8: Tarjeta FTA Figura 8: Un componente del cartucho cargado con algodon para extraccion automatica de acido nucleico.
Descripcion detallada de la divulgacion
En la descripcion detallada siguiente se hace referencia a las figuras adjuntas, que forman parte de la misma. Las realizaciones ilustrativas descritas en la descripcion detallada, figuras y reivindicaciones no pretenden ser limitantes. Se pueden usar otras realizaciones y se pueden implementar otros cambios sin desviarse del esplritu o alcance de la materia objeto: presentada en el presente documento. Se entendera facilmente que los aspectos de la presente divulgacion, como generalmente se describen en el presente documento y se ilustran en las figuras, se pueden combinar en una amplia variedad, todo lo cual se contempla expllcitamente y forma parte de la presente divulgacion.
La presente divulgacion se refiere a un metodo para el aislamiento de acido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
(a) anadir tampon de lisis a la muestra que contiene acido nucleico para obtener una solucion lisada; o
(b) anadir tampon de lisis en combinacion con tampon de union a la muestra para obtener una solucion lisada;
(c) anadir un tampon de union a la solucion de la etapa (a) para unir el acido nucleico a una matriz o la union directa de la solucion de la etapa (b) a la matriz y
(d) lavar y eluir el acido nucleico unido a la matriz para aislar y purificar el acido nucleico.
En una realizacion de la presente divulgacion, el acido nucleico se selecciona de un grupo que comprende ADN, ARN y PNA.
En otra realizacion de la presente divulgacion, la muestra es una muestra biologica o no biologica.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, la muestra biologica se selecciona de un grupo que comprende extractos de sangre, esputo, suero, saliva o tejido, y la muestra no biologica se selecciona de un grupo que comprende PNA qulmicamente sintetizado.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el tampon de lisis se selecciona de un grupo que comprende tiocianato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, EDTA, Tris, detergente, poliol, sal monovalente que contiene cation del grupo IA o sal divalente que contiene cation del grupo IIA y enzima digestiva de protelnas opcionalmente junto con urea o cualquier combinacion de los mismos.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el EDTA tiene una concentracion que varla de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM, preferentemente aproximadamente 100 mM.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el tiocianato de guanidina o el hidrocloruro de guanidina tiene una concentracion que varla de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 7 M.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, la urea tiene una concentracion que varla de aproximadamente 0, 01 M a aproximadamente 7 M.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el Tris tiene una concentracion que varla de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 100 mM, preferentemente aproximadamente 20 mM.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el poliol tiene una concentracion que varla de aproximadamente
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En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el detergente se selecciona de un grupo que comprende laurilsulfato de sodio, dodecilsulfato de sodio, Triton X-100, Tween 20 y NP-40 o cualquier combinacion de los mismos y en el que la enzima de digestion de protelnas es proteinasa K.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el tampon de union es agua opcionalmente junto con polioles o no polioles.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el poliol comprende compuestos de poliol solubles en agua seleccionados de un grupo que consiste en polietilenglicol, glicerol, polipropilenglicol, etilenglicol y propilenglicol;
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el no poliol comprende alcoholes que consisten en metanol, etanol, propanol o cualquier llquido soluble en agua con un grupo funcional de acido, amina, alcohol, fenol, amida o ester como uno de los grupos funcionales; o cualquier combinacion de los mismos.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el lavado y elucion se llevan a cabo utilizando tampon de lavado y tampon de elucion, respectivamente.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el lavado comprende un primer lavado con un tampon de lavado que comprende de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % (v/v), preferentemente de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 % (v/v) y, optimamente, aproximadamente 50 % (v/v) de alcohol acuoso seguido de lavados multiples con un tampon de lavado que comprende 100 % de agua.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el alcohol acuoso se selecciona de un grupo que comprende etanol, metanol, n-propanol, 2-propanol, glicerol, PEG, PPG, etilenglicol y propilenglicol.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el agua se selecciona de un grupo que comprende agua
desionizada, agua libre de DNasa, agua libre de RNasa, agua MilliQ, agua filtrada, agua corriente y agua
subterranea o cualquier combinacion de las mismas.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, dicho tampon de lavado puede comprender, opcionalmente, sales seleccionadas de un grupo que comprende MgCh, CaCl2, NaCl y KCl, o tampones seleccionados de un grupo que comprende bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina y piperidina, que tienen un pH que varla de aproximadamente 5 a aproximadamente 12.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el tampon de elucion comprende agua caliente que tiene una temperatura que varla de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 99 °C junto con tampon o sal, que tiene un pH que varla de aproximadamente 8 a aproximadamente 11.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el agua se selecciona de un grupo que comprende agua
desionizada, agua libre de DNasa, agua libre de RNasa, agua MilliQ, agua filtrada, agua corriente y agua
subterranea o cualquier combinacion de las mismas.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el tampon se selecciona de un grupo que comprende bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BeS, TES borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina y piperidina o cualquier combinacion de las mismas que tenga un pH que varla de aproximadamente 5 a aproximadamente 12 o que tenga un pKa que varla de aproximadamente 7 a aproximadamente 10.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, la sal se selecciona de un grupo que comprende MgCh, CaCh, NaCl y KCl o cualquier combinacion de los mismos en la concentracion que varla de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 100 mM, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, la matriz se selecciona de un grupo que comprende algodon, derivados de algodon y pollmeros sinteticos que tienen mezclas de algodon o cualquier combinacion de los mismos.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el algodon se selecciona de un grupo que comprende algodon natural, algodon quirurgico, algodon de grado cllnico, algodon comercial, algodon hilado, algodon lavado con agua, algodon lavado con acido o base, algodon esterilizado en autoclave, algodon tratado con tampon que tiene pH que varla de aproximadamente 1 a aproximadamente 14, algodon tratado con solucion salina, algodon tratado con disolvente organico, algodon prensado y algodon procesado.
La presente divulgacion se refiere adicionalmente a un kit para el aislamiento de acido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho kit una matriz y tampones.
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En una realizacion de la presente divulgacion, la matriz se selecciona de un grupo que comprende algodon, derivados de algodon y pollmeros sinteticos que tienen mezclas de algodon o cualquier combinacion de los mismos.
En otra realizacion de la presente divulgacion, el algodon se selecciona de un grupo que comprende algodon natural, algodon quirurgico, algodon de grado cllnico, algodon comercial, algodon hilado, algodon lavado con agua, algodon lavado con acido o base, algodon esterilizado en autoclave, algodon tratado con tampon que tiene pH que varla de aproximadamente 1 a aproximadamente 14, algodon tratado con solucion salina, algodon tratado con disolvente organico, algodon prensado y algodon procesado.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, el tampon se selecciona de un grupo que comprende el tampon de lisis, tampon de union, tampon de lavado y tampon de elucion como se ha descrito anteriormente.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, la muestra comprende muestras biologicas o no biologicas.
En otra realizacion mas de la presente divulgacion, la muestra biologica se selecciona de un grupo que comprende extractos de sangre, esputo, suero, saliva o tejido, y la muestra no biologica se selecciona de un grupo que comprende PNA qulmicamente sintetizado.
La presente divulgacion se refiere a un metodo para construir un sistema de extraccion de acido nucleico usando algodon. El algodon se aloja de manera que todas las soluciones mencionadas en la extraccion de acido nucleico interaccionen con el algodon.
En otra realizacion, las especificaciones para varios materiales usados en la presente divulgacion se proporcionan a continuacion:
Algodon, derivados del algodon, materiales que comprenden algodon y materiales similares al algodon: El algodon esponjoso se obtiene como una capsula alrededor de la semilla de algodon de la planta de algodon. Para la extraccion de acidos nucleicos, el algodon es el material preferido como matriz. Las formas de algodon pueden ser algodon natural, algodon quirurgico, algodon de grado cllnico, algodon comercial, algodon hilado, algodon lavado con agua, algodon lavado con acido o base, algodon esterilizado en autoclave, algodon tratado con tampon (pH 1-14), algodon tratado con solucion salina, algodon tratado con disolvente organico, algodon prensado, algodon procesado, etc. son adecuadas. Cualquier tela de algodon o diferentes formas de algodon o pollmeros sinteticos con una mezcla de algodon o materiales que contienen algodon podrlan usarse para la extraccion de acidos nucleicos. Los materiales como lana, seda, cachemira, etc., que tienen fibras similares al algodon tambien se consideran parte de esta divulgacion. El algodon producido mediante agricultura organica o el uso de insecticidas y pesticidas tambien se considera parte de esta divulgacion. El algodon producido en diferentes geograflas sera ligeramente diferente en cuanto a la composicion, estructura, color y calidad, y se considera que el algodon cultivado en todas las regiones del mundo es parte de esta divulgacion. Cualquier producto con un origen de algodon o un material, que utiliza algodon en su fabricacion se considera parte de esta divulgacion y podrla utilizarse para la extraccion de acido nucleico.
Tampon de lisis: El tampon de lisis contiene una concentracion alta de EDTA para permitir la union de acidos nucleicos al algodon y tambien para la manipulacion de diferentes tipos de muestras (extractos de sangre, esputo, suero, saliva, tejido, etc.). La variacion de las sales constituyentes es posible y el uso de EDTA se da como ejemplo y no debe considerarse como llmite de la divulgacion. Tlpicamente, cualquier molecula cargada negativamente a una concentracion elevada podrla repeler los acidos nucleicos en solucion y mejorar la union al algodon. El tampon de lisis comprende tiocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina, EDTA, Tris, un detergente y, opcionalmente, con urea, un poliol, una sal monovalente que contiene un cation del grupo IA y/o una sal divalente que contiene un cation del grupo I IA y proteinasa K o cualquier enzima digestiva de protelnas. El tiocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina puede estar en cualquier lugar entre 0,1 a 7 M en concentracion. El tiocianato de guanidina puede reemplazarse con hidrocloruro de guanidina o urea en algunas aplicaciones y su concentracion tambien puede variar de 0,1 a 7 M. La urea se utiliza para desnaturalizar las protelnas y complementara la funcion de las sales de guanidina y podrla variar entre 0 y 7 M. Tlpicamente, la mayorla de la literatura informo que los protocolos de lisis para sangre contenlan EDTA en el intervalo de 1-20 mM. Nuestro tampon de lisis podrla contener cantidades significativamente diferentes de EDTA, preferentemente en el intervalo de 10-300 mM, mas preferentemente en un intervalo de aproximadamente 100 mM. La concentracion de EDTA puede manipularse para otros acidos nucleicos, como ARN y PNA, pero, en general, se encontro que una mayor concentracion de EDTA ayuda a mejorar los tiempos de ciclo (Ct) y las intensidades de senal en la PCR y la RT-PCR. La concentracion significativamente diferente de EDTA ayuda a detener el hierro presente en la hemoglobina (para la sangre), previene cualquier actividad de DNasa y RNasa, y crea una atmosfera altamente negativa en la que el acido nucleico se puede unir al algodon. El aspecto importante de esto es que, esta realizacion es el primer ejemplo en el que la union del ADN a una matriz se realiza en condiciones basicas. De forma importante, el pH de union de la solucion tiene un efecto significativo sobre la union del ADN/ARN al algodon y, por lo tanto, se usa un pH de aproximadamente 8-10 para la union,
El cloruro de magnesio se usa tlpicamente en concentraciones mas altas para desactivar la actividad de la RNasa y,
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por lo tanto, en el protocolo de lisis del ADN, esta ausente o se usa mlnimamente (a 20 mM). De nuevo, el uso de EDTA tambien desactiva la RNasa y el uso de MgCl2 no necesita ser esencial y es opcional para cualquier aplicacion de acido nucleico. Tris es la eleccion del tampon para la lisis y se encontro que se puede usar de 0-100 mM y, tlpicamente, aproximadamente 20 mM es el optimo. Debe senalarse que, en el tampon de lisis de la invencion, el papel de Tris es ayudar en la lisis y puede ser reemplazado por cualquier tampon adecuado. El uso de poliol en el tampon de union es mejorar la solubilidad de las protelnas escindidas y desnaturalizadas. El porcentaje de poliol en el tampon de union podrla ser 0-30 % (v/v). En algunas aplicaciones, no se agrega un tampon de union distinto y, despues de la lisis, los acidos nucleicos se unieron directamente a la matriz. Todos estos tampones se prepararon tlpicamente en agua desionizada y, para aplicaciones de ARN, el agua se puede tratar opcionalmente con DEPC y esterilizar en autoclave. La lisis con proteinasa K puede realizarse antes de la adicion del tampon de lisis descrito anteriormente para sangre, esputo, saliva, semen, etc. y, opcionalmente, puede realizarse con tampon de lisis. Se encontro que el tratamiento con proteinasa K era eficaz en el tampon de lisis mencionado y, por lo tanto, este tratamiento puede estar por delante de la adicion de tampon de lisis o podrla serlo junto con tampon de lisis para cualquier tipo de muestra llquida que contenga acidos nucleicos. El detergente usado en el tampon de lisis podrla seleccionarse del grupo que comprende SLS (laurilsulfato sodico), SDS, Triton X-100. Tween 20 o cualquier otro detergente ionico no ionico de uso comun conocido en el estado de la tecnica.
Tampon de union: Se descubrio que el tampon de union, que se anadio despues de la lisis para iniciar la union de acidos nucleicos con algodon, era muy flexible en terminos de composicion y pH. El tampon de union es tan flexible que, la simple adicion de agua es suficiente para diluir la concentracion de sales en el tampon de lisis y se observo una buena union de los acidos nucleicos al algodon. Se puede colocar algodon para que interaccione durante la lisis o despues de la adicion de tampon de union para extraer acidos nucleicos de la muestra dada. A efectos practicos, la composicion de tampon de union puede tener cualquier pH entre 4 y 12, preferentemente en el intervalo de 7-10. Para muestras complejas como sangre, esputo o saliva, el tampon de union puede tener un cierto porcentaje de compuestos de poliol solubles en agua, tales como PEG, glicerol, PPG, etilenglicol, propilenglicol, etc. El peso molecular de PEG y PPG podrla oscilar entre 200-200.000 y para todos los propositos practicos sera de 1000 a 20.000. El porcentaje de compuestos de poliol en la solucion de union puede ser de hasta 50 % (v/v), pero para todas las aplicaciones practicas, sera de 1-30 % (v/v). Los compuestos de poliol son para asegurar la miscibilidad completa de los componentes lisados y si la lisis de la proteinasa K esta completa, el porcentaje de poliol puede disminuir al 1 %. Los tampones conocidos en el estado de la tecnica incluyen bicina, tricina, Tris, HEPEs, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina etc., en el intervalo de pH de 5-12, preferentemente en el intervalo de 7-10 pueden usarse para preparar tampon de union y la presencia de tampon no es obligatoria, pero dependiendo del tipo de muestra, el volumen de la muestra, la temperatura, la composicion del tampon de lisis, puede usarse. Si se usan sales tampon, su concentracion puede variar de 1-200 mM, preferentemente 1-100 mM y, lo mas preferentemente, 5- 50 mM. La concentracion descrita anteriormente es la concentracion de la solucion de union y, despues de la adicion al tampon de lisis, la concentracion cambiara dependiendo de la composicion del tampon de lisis. Asimismo, el pH definido anteriormente es para el pH del tampon de union cuando se hizo y despues de la adicion al tampon de lisis, el pH de la solucion mixta (tampon de lisis + tampon de union) podrla cambiar. Aunque los alcoholes como el metanol, el etanol y el propanol no son polioles, tambien pueden usarse en la preparacion del tampon de union. En general, se puede usar cualquier llquido soluble en agua con un grupo funcional de acido, amina, alcohol, fenol, amida, ester, etc. como uno de los grupos funcionales.
Tampon de lavado: Un tampon de lavado es una solucion, que lava selectivamente los componentes que no son acidos nucleicos del algodon. Si la muestra cllnica es sangre, despues de la union, el algodon sera de color marron y para eliminar el color se encontro que un porcentaje de etanol en el tampon de lavado (llamado tampon de lavado 1). ayudaba. Particularmente, el primer lavado se realizo con un tampon o agua que contenla 1-99 % (v/v), preferentemente 30-70 % (v/v), mas preferentemente 50 % (v/v) de etanol. Si es necesario, se pueden administrar multiples lavados acuosos de etanol para eliminar componentes de acidos no nucleicos y esto podrla depender de la muestra. El metanol, n-propanol, 2-propanol, glicerol, PEG, PPG, etilenglicol, propilenglicol o cualquier otro alcohol soluble en agua pueden reemplazar el etanol en la solucion de lavado. Se puede usar un tampon de lavado 2 en el que esta presente un cation mono o divalente junto con el tampon de lavado 1 como su composicion. Tambien es posible que el tampon de lavado 1 y 2 pueda tener la misma composicion y que comprenda agua, un alcohol y un cation mono o divalente. El numero de veces que se lava el algodon con los tampones de lavado 1 y 2 puede ser 010 e, idealmente, estar en el intervalo de 1-3. Los lavados posteriores usualmente seran con agua desionizada y el numero de lavados puede ser de uno a diez, preferentemente de 2 a 5 y, mas preferentemente, de 3-5. El agua desionizada utilizada en la etapa de lavado puede reemplazarse por DNasa, agua libre de RNasa o agua MilliQ o agua filtrada o agua corriente o agua subterranea. Los inventores observaron que un lavado inicial con alcohol acuoso tiende a eliminar la mayorla de los componentes de acido no nucleico y, luego, seguido de multiples lavados con agua (100 % de agua) para eliminar el alcohol residual. Los lavados con agua garantizan que los acidos nucleicos obtenidos esten preparados para PCR sin inhibidores de la PCR o con minima cantidad de los mismos. Los tampones de lavado pueden contener, opcionalmente, tales como, MgCh, CaCl2, NaCl, KC1, o tampones como bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina etc., en el intervalo de pH de 5-12. El tampon o la sal o una combinacion de ellos podria estar en la concentracion de 1-1000 mM, preferentemente en el intervalo de 20-200 mM y, mas preferentemente, aproximadamente 100 mM.
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Tampon de elucion: Cualquier solucion tampon acuosa caliente (45-99 °C) podrla eluir los acidos nucleicos del algodon. Se encontro que el pH de elucion era crucial, pero, preferentemente, en el intervalo de 8-11 y la elucion se debe realizar a una temperatura entre 45-99 °C para la recuperacion completa de acidos nucleicos. El agua desionizada utilizada en la formation del tampon en la etapa de elucion puede reemplazarse por DNasa, agua libre de RNasa o agua MilliQ o agua filtrada o agua corriente o agua subterranea. Los tampones conocidos en el estado de la tecnica incluyen bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina etc., en el intervalo de pH de 5-12 se pueden usar para la elucion, aunque los mas preferentes seran aquellos con un pKa en el intervalo de 7-10. Siempre que se use algodon para la elucion de acidos nucleicos unidos, el tampon de elucion debe estar tibio y, por consideraciones practicas, en el intervalo de 45-99 °C. Esto esta en marcado contraste con la mayorla de los metodos descritos en la bibliografla, en los que la elucion se realiza en condiciones calidas usando agua desionizada, pero los acidos nucleicos unidos al algodon no se pueden eluir completamente con agua caliente y la presencia de tampon o sal es crltica. La sal puede ser MgCh, CaCl2, NaCl, KCl, etc. a la concentration de 0-100 mM, preferentemente en el intervalo de 5-50 mM. El tampon puede seleccionarse del grupo de tampones, a saber, bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, mEs, piridina, piperazina, Bis-tris, PlPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina.
Recuperacion de acidos nucleicos: Con el sistema actual, la recuperacion de acidos nucleicos depende del tampon de lisis, el tampon de union, los tampones de lavado y el tampon de elucion y las combinaciones utilizadas. Dependiendo de la combination, la recuperacion de acido nucleico podrla ser comparable a cualquier sistema de extraction de acido nucleico basado en sllice. Tambien se observo que con muestras de tltulos bajos, la eficacia del enfoque dela invention de extraccion de acidos nucleicos a base de algodon a veces es mejor que la sllice.
Cantidad de algodon: La cantidad de algodon depende del volumen de la muestra cllnica y para las muestras en el intervalo de 1-300 pl, se encontro que 5-30 mg de algodon eran adecuados. Para volumenes de muestras en el intervalo de mililitros, un 50 mg o mas de algodon puede ser esencial. En general, 1 miligramo a 10 gramos de algodon es suficiente para extraer acidos nucleicos de cualquier muestra cllnica, ambiental o de campo.
Precio de cada ensayo: Como el algodon utilizado en este protocolo es algodon quirurgico disponible comercialmente en cualquier farmacia o tienda minorista (puede ser esterilizado en autoclave o estar sometido a purification), el precio de cada extraccion de acido nucleico es mlnimo y uno de los mas baratos notificados hasta la fecha en la literatura. De nuevo, considerando la elimination de la presencia accidental de inhibidores de la PCR en fracciones eluidas de acidos nucleicos, la simplicidad y la capacidad de adaptation al uso de POC, la facilidad de automatization, etc. hace que este enfoque sea superior y el coste por extraccion es, probablemente, una ventaja adicional.
Seguridad de los componentes y eliminacion de las soluciones: El sistema de extraccion de acidos nucleicos basado en algodon utiliza la mayorla de los tampones de origen acuoso con los cuales un experto en la tecnica puede eliminar los desechos de manera segura y efectiva. El algodon puede empaquetarse en un cartucho y todas las soluciones de lisis, union, y de lavado pueden quedar atrapadas en el cartucho para el uso de POC con lo que el trabajador de la salud o el analista no tiene que eliminar los desechos y el cartucho sera autocontenido.
Usos de acidos nucleicos extraldos: Los acidos nucleicos extraldos usando el protocolo de algodon descrito en esta realization pueden prepararse facilmente para su uso en una PCR o RT-PCR. Otras aplicaciones del protocolo de algodon descrito son para la recuperacion de acidos nucleicos de una muestra cllnica para su archivo, almacenamiento, uso posterior en bioqulmica y biologla molecular, etc. Los acidos nucleicos extraldos se pueden usar para cualquier aplicacion bioqulmica o de biologla molecular, que un experto en la materia descubrira de vez en cuando.
Uso de algodon en una forma adecuada para la extraccion de acido nucleico: Esta realizacion es para extraer acidos nucleicos en "forma lista para PCR" usando algodon con un requisito de equipo mlnimo, como centrlfuga u otro equipo de hilado. El algodon puede empaquetarse en cualquier forma adecuada para la extraccion de acido nucleico dependiendo de la cantidad de la muestra, la naturaleza de la muestra y el origen de la muestra. Preferentemente, los acidos nucleicos se obtuvieron en una solucion o emulsion, que se procesara de acuerdo con los sistemas de lisis, union, lavado y elucion descritos. Por tanto, el empaquetamiento de algodon es una parte crucial de la extraccion de acido nucleico y cualquier naturaleza en la que el algodon pueda entrar en contacto con la solucion que contiene acidos nucleicos se considera parte de esta divulgation. Las figuras 1-3 ilustran algunas formas en que se puede empaquetar el algodon, pero no debe interpretar como limitante de ninguna manera. En terminos simples, el algodon se empaqueta de tal manera que la solucion que contiene acido nucleico entre en contacto con el algodon o el algodon entra en contacto con el llquido y se considera parte de esta divulgacion.
En otra realizacion, el algodon puede empaquetarse en una punta de pipeta de plastico modificada de 1 ml, una punta de pipeta de plastico modificada de 2 ml, un tubo falcon de 15 ml, un tubo falcon de 50 ml, 1. un tubo eppendorf de 5 ml, un tubo eppendorf de 2 ml, un tubo de ensayo de vidrio de borosilicato de 5 ml, un vial de plastico con tapon de rosca de 4 ml, una pipeta Pasteur de plastico de 3 ml, una pipeta Pasteur de vidrio, una pipeta Pasteur de vidrio con un bulbo de caucho, una pipeta Pasteur de plastico con un bulbo de caucho, una pipeta de vidrio con
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un molde de caucho y de plastico como bulbo, vial de vidrio de 2 ml con un tapon de plastico, una jeringa de plastico de 10 ml desechable y esterilizada en autoclave, un molde de plastico unido a una jeringa de 5 ml, una unidad desechable conectada a una jeringa de 50 ml, etc. El algodon tambien se puede hacer como un bastoncillo de algodon y el bastoncillo puede estar hecho manualmente o a maquina. El bastoncillo de algodon que se muestra en la Figura 3[e] hecho de viscosa y cualquier pollmero mezclado con algodon (1 a 100 %) o algodon modificado qulmica o flsicamente (1 a 100 %) se considera parte de esta divulgacion.
Uso de algodon para almacenar una muestra clinica: El algodon puede exponerse directamente a la muestra y, al ser absorbente, el algodon se estabilizara y almacenara la muestra en una forma segura. La forma segura se define como un medio en el cual el contenido de acido nucleico de la muestra anadida no se degrada significativamente. La union puede ser reversible, en la que los acidos nucleicos pueden extraerse usando el protocolo de extraccion de acido nucleico descrito en esta realizacion. El algodon puede estar opcionalmente incluido con un estabilizante, lo que mejorara la estabilidad de la muestra y los constituyentes de la muestra. Opcionalmente, el algodon puede estar incluido con una enzima o un producto qulmico o el tampon de lisis notificado en este protocolo o tampon de lisis que contiene proteinasa K o proteinasa K junto con sales tampon estabilizantes. El algodon podrla estar tratado con EDTA, tratado con azida sodica, tratado con base, tratado con acido, tratado con tampon de lisis, tratado con miel, tratado con cualquier agente antibacteriano, tratado con cualquier agente antimicrobiano, tratado con cualquier compuesto antiviral o tratado con EDTA y azida sodica, antibacterianos, antimicrobianos, antivirales, anticoagulantes, estabilizantes de muestras cllnicas conocidas en el estado de la tecnica, miel o cualquier combinacion de los mismos. El volumen de muestra anadido al algodon para almacenar puede ser cualquier volumen, pero para todos los propositos practicos puede ser de 1 pl a 20 ml y la cantidad de algodon utilizada puede ser cualquier cantidad y para todos los propositos practicos puede ser de 1 mg a 10 gramos. Cuando se recoge la muestra, puede realizarse en un algodon impregnado con tampon de lisis y tambien se considera parte de esta divulgacion.
Metodo de uso del sistema empaquetado con algodon para la extraccion de acidos nucleicos: El algodon empaquetado en un dispositivo como se ilustra en la Figura 1-3 usando el protocolo de extraccion de acidos nucleicos notificado descrito en esta realizacion. El mecanismo por el cual se hizo que el algodon interaccionara con los sistemas de lisis, union, lavado y elucion descritos en esta realizacion puede ser calentamiento, sacudidas, agitacion en vortex, agitacion, movimiento constante, pipeteo o cualquier otro medio por el cual se hace que un solido y un llquido interaccionen. Esencialmente, el acido nucleico que contiene llquido entrara en contacto con las fibras de algodon.
En otra realizacion, el presente metodo es uno de los protocolos de extraccion de acidos nucleicos mas simples y mas flexibles presentados en la literatura. Casi todos los metodos de la literatura requieren una centrlfuga para centrifugar el contenido o un iman para mantener las partlculas magneticas en posicion intacta o ambas, y el metodo informado en esta realizacion elimina por completo la necesidad de una centrlfuga o un iman. Los protocolos de acido nucleico existentes tienen un llmite en el volumen de la muestra o requieren un procesamiento multiple para mayores volumenes de muestras. Este protocolo puede procesar practicamente cualquier cantidad de muestra (para fines practicos, de 1 pl a 20 ml) casi al mismo tiempo utilizando un sistema de extraccion desechable unico. El presente metodo produce acidos nucleicos inmediatamente listos para su posterior caracterizacion y procesamiento posterior, tal como PCR, secuenciacion o transferencia. La simplicidad de este sistema lo hace igualmente adecuado para el punto de atencion (POC) o laboratorios establecidos, el primero de un tipo notificado en la literatura.
El protocolo de algodon descrito en esta realizacion tiene caracterlsticas destacadas, tal como la eliminacion del uso de centrlfugas, la minima variacion de un usuario a otro, eficacia comparable a los protocolos de sllice, facilidad de uso en comparacion con cualquier protocolo de acido nucleico existente, capacidad de procesar cualquier cantidad de muestra, recuperacion adecuada de acidos nucleicos, capacidad para seleccionar muestras de tltulo bajo, la facilidad de automatizacion, adecuado tanto para entornos hospitalarios establecidos como para configuraciones de punto de atencion y alta consistencia en la recuperacion y calidad de acidos nucleicos.
En otra realizacion, el metodo descrito en esta divulgacion emplea materiales fibrosos, como algodon, para extraer acidos nucleicos de practicamente cualquier muestra clinica o analltica de origen biologico en una PCR o PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) o secuenciacion o formato listo para transferencia. El procedimiento comprende la lisis, union de acidos nucleicos a algodon, lavado del algodon unido a acido nucleico con soluciones acuosas y elucion de acidos nucleicos en un tampon con sal como KCl. Un tampon de lisis tlpico en protocolos de sllice o sin sllice contiene algunos iones tetrabasicos o dibasicos como EDTA (agentes quelantes), que se unen al hierro de la sangre. En este protocolo descrito, se anade una concentracion alta de EDTA (10-300 mM) para crear un entorno en el que toda la selectividad de los acidos nucleicos se une al algodon. Por lo general, el pH del tampon de lisis se ajusta a 6 para permitir la union a una matriz (sllice o no sllicea), en la que la mayorla de las protelnas y otros componentes son neutros o positivos en lo que respecta a la carga, en los que el acido nucleico todavla esta cargado negativamente e interacciona con la matriz. En el sistema actual, la union de pH debe ser basica (pH 8-11) y el exceso de EDTA con carga negativa (10-300 mM) actua como un tampon y eleva el pH a aproximadamente 8. El de los inventores es el primer protocolo en el que los acidos nucleicos se lisan y se pueden unir a una matriz a pH basico. El tampon de union puede ser agua, cualquier tampon acuoso que tenga un pH en el intervalo de 3-11 o agua que contenga polietilenglicol (PEG, 1-30 %) o glicerol (1-30 %) o polipropilenglicol (PPG, 1-30 %) o etilenglicol
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(1-50 %) o propilenglicol (1-50 %) o cualquier alcohol soluble en agua o cualquier combinacion de los anteriores. El tampon de union es para asegurar la dilucion de las sales de tampon de lisis, potenciar la union de los acidos nucleicos en una atmosfera rica en EDTA y solubilizar las partlculas lisadas. El protocolo notificado puede tolerar una amplia gama de tampones con diferente pH para la union y esta tambien es la primera vez en la literatura que el pH o composicion del tampon de union es tan flexible. Los tiempos de procesamiento de la muestra mas largos, el llmite del volumen de la muestra y la imposibilidad de la cuantificacion de los acidos nucleicos son desventajas asociadas con las tarjetas FTA, que no estan presentes con el protocolo de extraccion de acido nucleico descrito en esta realizacion usando algodon. Finalmente, todos los protocolos descritos en la literatura eluyen en un tampon acuoso o agua a temperatura ambiente u, ocasionalmente, a temperatura elevada, y nuestro lavado de acido nucleico es con agua a temperatura ambiente y elucion a temperatura elevada (50-99 °C). Usando el protocolo y la matriz definidos en esta realizacion, un agua desionizada caliente no eluira todos los acidos nucleicos unidos y la presencia de un tampon o sal o una combinacion de ellos es una necesidad. Esto tambien contrasta fuertemente con el protocolo de extraccion de acido nucleico de la literatura, que puede eluir acidos nucleicos unidos de la matriz en agua desionizada caliente (los protocolos tanto de sllice como no sillceos permiten la elucion con agua caliente de acidos nucleicos). El tampon de elucion podrla estar en cualquier punto entre pH 8-10, lo que indica que el pH de elucion es flexible y se prefiere alguna concentracion de sal como KCl para la elucion eficiente de acidos nucleicos unidos a partir de algodon.
En otra realizacion, len los metodos siguientes, se usaron algodon y otros materiales fibrosos a base de algodon en la extraccion cuantitativa de acidos nucleicos en condiciones especiales de lisis, union, lavado y elucion, que son unicas para la elucion de los acidos nucleicos del algodon. La presente divulgacion, en un aspecto, proporciona un sistema rapido de aislamiento de acidos nucleicos de cualquier origen ambiental, cllnico, bacteriano, fungico y animal usando algodon. Las muestras pueden ser lisados celulares, fluidos corporales, plantas, tejidos y celulas bacterianas y lisados celulares. El algodon y la viscosa son materiales fibrosos obtenidos de forma natural y artificial respectivamente, que se encontraron unidos a los acidos nucleicos en condiciones dadas. El proceso de union de acido nucleico y retention selectiva de acidos nucleicos sobre el algodon y la liberation de acidos nucleicos en condiciones de elucion especlficas se ilustra mediante el ADN y el ARN.
En otra realizacion, en una extraccion de ADN tlpica de una muestra cllnica como sangre, la sangre se liso con un tampon de lisis que comprende tiocianato de guanidina, EDTA, un tampon como Tris, un detergente como triton X- 100 y, opcionalmente, con urea, un poliol, una sal monovalente que contiene un cation del grupo IA y/o una sal divalente que contiene un cation del grupo I IA y enzimas que escinden la protelna como la proteinasa K. El tiocianato de guanidina puede estar en cualquier lugar entre 0,1 a 7M en concentracion. El tiocianato de guanidina puede reemplazarse con hidrocloruro de guanidina o urea en alguna aplicacion y su concentracion tambien puede variar de 1 a 6 M. La urea se utiliza para desnaturalizar las protelnas y complementara la funcion de las sales de guanidina y podrla variar entre 0 y 7 M. Tlpicamente, la mayorla de la literatura informo que los protocolos de lisis para sangre contenlan EDTA en el intervalo de 20 mM. Nuestro tampon de lisis podrla tolerar cantidades significativamente mas altas de EDTA, en el intervalo de 10-300 mM, preferentemente aproximadamente en un intervalo de 100 mM para la union eficiente del acido nucleico al algodon. La concentracion de EDTA puede manipularse para otros acidos nucleicos, como ARN y PNA, pero, en general, se encontro que una mayor concentracion de EDTA ayuda a mejorar los tiempos de ciclo (Ct) y las intensidades de senal en la PCR y la RT-PCR. La concentracion significativamente mas alta de EDTA ayuda a detener el hierro presente en la hemoglobina (para la sangre), previene cualquier actividad de DNasa y crea una atmosfera altamente negativa en la que el acido nucleico se puede unir al algodon. El aspecto importante de esto es que, la adicion de una concentracion significativamente mayor de EDTA en el tampon hace que el pH del tampon sea basico y, en lo que a nuestro conocimiento se refiere, esta realizacion es el primer ejemplo en el que el acido nucleico se une a una matriz en condiciones basicas. De forma importante, el pH de la union de la solution debe ser basico para permitir la union del acido nucleico al algodon, ya que a pH muy acido, existe la posibilidad de que el EDTA precipite fuera del tampon de lisis y, por lo tanto, se prefiere un pH superior a 8 para la union. El cloruro de magnesio se usa tlpicamente en concentraciones mas altas para desactivar la actividad de la RNasa y, por lo tanto, podrla usarse en el protocolo de lisis de acido nucleico. Tris es la election del tampon para la lisis y se encontro que se puede usar de 0-100 mM y, tlpicamente, aproximadamente 20 mM es el optimo. El uso de poliol en el tampon de lisis o de union es para aumentar la actividad de la Proteinasa K y para mejorar la solubilidad de las protelnas escindidas. El porcentaje de poliol en el tampon de lisis podrla ser 0-30 % (v/v). Todos estos tampones se prepararon en agua desionizada y, para aplicaciones de ARN, el agua se pudo tratar con DEPC y esterilizar en autoclave. La lisis con proteinasa K puede realizarse antes de la adicion del tampon de lisis descrito anteriormente para sangre, esputo, saliva etc. y junto con tampon de lisis para orina, sudoracion, etc. Se encontro que el tratamiento con proteinasa K era eficaz en el tampon de lisis mencionado y, por lo tanto, este tratamiento puede estar por delante de la adicion de tampon de lisis o podrla serlo junto con tampon de lisis para cualquier tipo de muestra cllnica que contenga acidos nucleicos.
En otra realizacion, se descubrio que el tampon de union, que se anadio despues de la lisis para iniciar la union de acidos nucleicos con algodon era muy flexible en terminos de composicion. El tampon de union es tan flexible que, la simple adicion de agua es suficiente para diluir la concentracion de sales en el tampon de lisis y se observo una buena union de los acidos nucleicos al algodon. Se puede colocar algodon para que interaccione durante la lisis o despues de la adicion de tampon de union. La composicion del tampon de union puede tener cualquier pH entre 5 y 12, preferentemente en el intervalo de 7-10. Para muestras complejas como sangre, esputo o saliva, el tampon de
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union puede tener un cierto porcentaje de compuestos de poliol, tales como PEG, glicerol, PPG, etilenglicol, propilenglicol, etc. Se descubrio que las soluciones de union utilizadas tradicionalmente (para sistemas de acido nucleico basados en sllice) como etanol o etanol acuoso disminulan la afinidad de union de los acidos nucleicos al algodon, es decir, se descubrio que la presencia de etanol durante la etapa de union disminuye la eficacia de la union de acido nucleico al algodon.
En otra realizacion, un tampon de lavado es una solucion, que lava selectivamente los componentes que no son acidos nucleicos del algodon. Si la muestra cllnica es sangre, despues de la union, el algodon sera de color marron y para eliminar el color se encontro que un porcentaje de etanol en el tampon de lavado (llamado tampon de lavado 1). ayudaba. Particularmente, el primer lavado se realizo con un tampon o agua que contenla 10-90 %, preferentemente 30-70 %, mas preferentemente 50 % de etanol. El metanol, n-propanol, isopropanol, glicerol, PEG, PPG, etilenglicol, propilenglicol o cualquier otro alcohol soluble en agua pueden reemplazar el etanol en la solucion de lavado. Se puede usar un tampon de lavado 2 en el que esta presente un cation mono o divalente junto con el tampon de lavado 1 como su composition. Tambien es posible que el tampon de lavado 1 y 2 pueda tener la misma composition y que comprenda agua, un alcohol y un cation mono o divalente. El numero de veces que se lava el algodon con los tampones de lavado puede ser 0-10 e, idealmente, estar en el intervalo de 1-3. Los lavados posteriores usualmente seran con agua desionizada y el numero de lavados puede ser de uno a diez, preferentemente de 2 a 5 y, mas preferentemente, de 3-5. El agua desionizada utilizada en la etapa de lavado puede reemplazarse por DNasa, agua libre de RNasa o agua MilliQ o agua filtrada o agua corriente o agua subterranea.
En otra realizacion, la elucion de acidos nucleicos del algodon puede realizarse con cualquier tampon acuoso. La concentration de tampon debe estar entre 1 y 200 mM, preferentemente de 5-50 mM, mas preferentemente, 30-70 mM en el tampon de elucion. Los tampones conocidos en el estado de la tecnica incluyen bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MeS, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, Etanolamina, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina etc., en el intervalo de pH de 5-12, preferentemente en el intervalo de 7-10, mas preferentemente en el intervalo de 8 -10, funcionaran para la elucion de acidos nucleicos del algodon en condiciones de calor. La elucion de acido nucleico del algodon debe realizarse a una temperatura elevada entre 50 y 100 °C, preferentemente a 70-95 °C, mas preferentemente a aproximadamente 85 °C.
En otra realizacion, los acidos nucleicos purificados pueden tener una pureza del 10-100 % y habitualmente estaran listos para PCR. La pureza de los acidos nucleicos depende de la combination optima de tampones de lisis, union, lavado y elucion y la matriz para la purification (derivados de algodon o algodon o materiales mezclados con algodon). Los inventores observaron que las tarjetas FTA o partlculas unidas a celulosa o papeles de filtro celulosicos no son eficaces en estas combinaciones de tampones, lo que indica que el algodon es diferente de otras formas de celulosa con respecto a la interaction con acidos nucleicos. En metodos relacionados, la presente divulgation proporciona un medio para aislar acidos nucleicos de una muestra que contiene acidos nucleicos usando derivados de algodon o algodon o materiales mezclados con algodon como la matriz solida usando el siguiente protocolo general.
a) La muestra que contiene acidos nucleicos se anadio al tampon de lisis. El tampon de lisis comprende tiocianato de guanidina, EDTA, Tris, un detergente y, opcionalmente, con urea, un poliol, una sal monovalente que contiene un cation del grupo IA y/o una sal divalente que contiene un cation del grupo IIA y proteinasa K. La muestra de acido nucleico y el tampon de lisis se mezclaron y calentaron a 50-95 °C durante 1-20 minutos.
b) Se agrega un tampon de union a la solucion anterior y podrla ser agua, un tampon con pH entre 4-11 o una solucion que contiene un poliol. El volumen del tampon de union podrla ser 0. 1-10 veces el volumen del tampon de lisis.
c) Se hizo que la solucion anterior interaccionara con el algodon, preferentemente a temperatura ambiente, durante de unos pocos segundos a algunos minutos.
d) A continuation, el algodon se lavo especlficamente (primer lavado) con un tampon de lavado que comprende alcohol acuoso o agua sola.
e) El algodon anterior se lavo posteriormente con agua o un tampon hasta que el alcohol residual se elimino del algodon.
f) Los acidos nucleicos se eluyeron con un tampon que comprendla sal como KCl (sales que contienen cation del grupo IA o del grupo IIA) y/o tampon de tipo bicina, y los acidos nucleicos eluidos estan normalmente listos para su uso en PCR o RT-PCR.
La presente divulgacion se elabora adicionalmente con la ayuda de la siguiente tabla, que proporciona una explication comparativa entre el metodo utilizado en la presente divulgacion y los utilizados en la tecnica anterior. La tabla compara algunos de los aspectos importantes con respecto a los diversos metodos utilizados para la caracterizacion de los metodos utilizados para el aislamiento de acidos nucleicos.
Tabla 1: Descripcion comparativa de aspectos importantes implicados en el aislamiento de acidos nucleicos.
N.° de M
Propiedad Extraccion de acidos nucleicos usando algodon Extraccion de acidos nucleicos basados en matriz de celulosa Extraccion de acidos nucleicos usando columnas de sflice comercial Extraccion de acidos nucleicos usando nanopartfculas magneticas recubiertas con sflice
1
pH del tampon de lisis por encima de 8 SI No No No
2
Protocolo unico para ADN/ARN SI Posible Posible, pero normalmente se dan protocolos diferentes Posible
3
Elucion de acidos nucleicos con agua/tampon a pH 7 No SI SI SI
4
100 % de lavado acuoso de acidos nucleicos unidos a la matriz SI Posible No No
5
Procesamiento automatico de acidos nucleicos SI No descrito en la literatura No descrito en la literatura Existen prototipos en la literatura
6
Uso de centrlfuga No SI SI En algunos protocolos
7
Generacion de aerosol durante el protocolo No SI SI En algunos protocolos
8
Idoneidad para el punto de atencion SI No, Necesita un procesamiento adicional de la muestra en un laboratorio No, requiere una centrlfuga y genera aerosoles No, Requiere instrumentos voluminosos
9
Extraccion de acido nucleico adecuada con RT- PCR SI SI SI SI
10
Capacidad para procesar diferentes muestras, como sangre, esputo, suero, saliva, tejidos etc. con mlnimo preprocesamiento de muestras SI No No No
11
Tiempo tlpico necesario para el aislamiento e acidos nucleicos 8-12 min 20-30 min 15-20 min 15-20 min
12
Costes estandar implicados para el aislamiento de acidos nucleicos (costes de los reactivos, matriz y otros componentes del kit) Rs. 10-30 Rs. 50-100 Rs. 150-500 Rs. 100-500
La tecnologla de la presente divulgacion se elabora mas detalladamente con la ayuda de los siguientes ejemplos. Sin embargo, no debe interpretarse que los ejemplos limitan el ambito de la divulgacion.
5
Metodologia general: La solucion que contiene acido nucleico se puso en contacto con el algodon, preferentemente a temperatura ambiente, y los componentes no nucleicos se lavaron del algodon usando una serie de lavados que comprenden agua y alcohol acuoso. Los acidos nucleicos de algodon se eluyeron usando un tampon acuoso que comprende una sal a temperatura elevada. Los acidos nucleicos eluidos estaran listos para un procesamiento 10 posterior o para la PCR. Los siguientes ejemplos se presentan con algodon empaquetado en una punta de pipeta de 1 ml que se utiliza habitualmente en los laboratorios de investigacion. Pero como un experto en la materia puede darse cuenta de que el algodon se puede empaquetar en cualquier forma donde exista la posibilidad de que un llquido entre en contacto con el. Esencialmente, cualquier cosa con una entrada y una salida y entre el algodon puede empaquetarse se considera parte de esta divulgacion.
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Ejemplo -1: Extraccion de ADN de la sangre
a) Se anadieron 50 |jl de sangre a 75 |jl de tampon de lisis (30 |jl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y
20 se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 150 jil de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo un cuentagotas de plastico de 1 ml empaquetado con 8 mg de algodon (cuentagotas de algodon,
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como se muestra en la Figura 2 [a]) interaccionara con la solucion anterior.
d) A continuacion, el cuentagotas de algodon se lavo con 2 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 %) y tampon de lavado 2 (etanol al 50 % que contenla MgCl2 100 mM).
e) La punta de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9,8) a 95 °C. Ejemplo -2: Extraccion de ADN de la sangre
a) Se anadieron 100 pl de sangre a 150 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 300 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo que una punta de pipeta moldeada de 1 ml empaquetada con 10 mg de algodon (punta de algodon, como se muestra en la Figura 3 [c]) interaccionara con la solucion anterior.
d) A continuacion,la punta de algodon se lavo con 1 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 %) y 2 ml de tampon de lavado 2 (etanol al 50 % que contenla MgCh 100 mM).
e) La punta de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 200 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -3: Extraccion de ADN de la sangre
a) Se anadieron 100 pl de sangre que contenla el parasito del paludismo (p. falciparum) a 150 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EdTa 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 300 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo que una punta de pipeta moldeada de 1 ml empaquetada con 10 mg de algodon (punta de algodon, como se muestra en la Figura 3 [c]) interaccionara con la solucion anterior.
d) A continuacion, la punta de algodon se lavo con 1 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 %)
e) La punta de algodon se lavo con 2 ml de tampon de lavado 2 (etanol al 50 % que contiene MgCh 100 mM).
f) La punta de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
g) Los acidos nucleicos se eluyeron en 200 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -4: Extraccion de ARN de la sangre
a) Se anadieron 50 pl de sangre positiva a Chikungunya a 75 pl de tampon de lisis (30 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 150 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo que una punta de pipeta de 1 ml con 10 mg de algodon interaccionara con la solucion anterior.
d) La punta de algodon se lavo especlficamente con 1 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 % que contiene MgCl2 50 mM).
e) La punta de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 200 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -5: Extraccion de ADN de la saliva
a) Se anadieron 50 pl de saliva a 100 pl de tampon de lisis (10 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EdTa 200 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 250 pl de tampon de union (10 % de glicerol en agua) a la solucion anterior.
c) Se hizo que una punta de pipeta moldeada de 1 ml empaquetada con algodon (punta de algodon, como se muestra en la Figura 3 [c]) interaccionara con la solucion anterior.
d) La punta de algodon se lavo especlficamente con 3 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 % que contiene MgCl2 200 mM).
e) La punta de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml) pipeteando el llquido tres veces durante cada lavado.
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 250 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 50 mM, pH 9. 8) a 95 °C.
Ejemplo -6: Extraccion de ARN de la sangre
a) Se anadieron 100 pl de sangre positiva a Chikungunya a 150 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 300 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG600) a la solucion anterior. c) Se hizo que
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una punta de pipeta moldeada de 1 ml empaquetada con 10 mg de algodon (punta de algodon, como se muestra en la Figura 3 [c]) interaccionara con la solucion anterior.
d) A continuacion,la punta de algodon se lavo especlficamente con 1 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 %) y 2 ml de tampon de lavado 2 (etanol al 50 % que contenla MgCh 50 mM).
e) La punta de algodon se lavo con agua (2 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -7: Extraccion de ARN de la sangre
a) Se anadieron 50 pl de sangre positiva a Chikungunya a 75 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 80 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 55 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 70 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 150 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 8000) a la solucion anterior.
c) Se hizo un jeringa de 2,5 ml empaquetado con 10 mg de algodon (jeringa de algodon, como se muestra en la Figura 1 [a]) interaccionara con la solucion anterior.
d) A continuacion,la punta de algodon se lavo especlficamente con 1 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 %) y 2 ml de tampon de lavado 2 (etanol al 50 % que contenla MgCh 50 mM).
e) La jeringa de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -8: Extraccion de ADN de esputo
a) Se anadieron 100 pl de esputo a 150 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 5 minutos. Luego, la solucion se calento a 75 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 300 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo que pipeta de fuelle de 5 ml empaquetada con 10 mg de algodon (fuelle de algodon, como se muestra en la Figura 2 [c]) interaccionara con la solucion anterior.
d) A continuacion,la punta de algodon se lavo especlficamente con 1 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 %) y tampon de lavado 2 (etanol al 50 % que contenla MgCh 50 mM).
e) El fuelle de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (tricina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -9: Extraccion de ADN de suero
a) Se anadieron 50 pl de suero a 75 pl de tampon de lisis (60 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EdTa 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 150 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo que una punta de pipeta moldeada de 1 ml empaquetada con 10 mg de algodon (punta de algodon, como se muestra en la Figura 3 [c]) interaccionara con el algodon.
d) A continuacion,la punta de algodon se lavo especlficamente con 1 ml de tampon de lavado 1 (etanol al 50 %) y 2 ml de tampon de lavado 2 (etanol al 50 % que contenla MgCl2 50 mM).
e) La punta de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 200 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -10: Extraccion de ARN de suero
a) Se anadieron 100 pl de suero positiva a Chikungunya a 150 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 2 minutos.
b) Se anadieron 300 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo que una punta de pipeta moldeada de 1 ml empaquetada con 10 mg de algodon (punta de algodon, como se muestra en la Figura 3 [c]) interaccionara con el algodon.
d) A continuacion, la punta de algodon se lavo especlficamente con 3 ml de tampon de lavado 3 (etanol al 50 % que contiene MgCh 50 mM).
e) La punta de algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 200 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -11: Extraccion de ADN de esputo
a) Se anadieron 50 pl de esputo a 150 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EdTa 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %, pH 9. 5). La solucion resultante se calento a
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60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 85 °C durante 6 minutos.
b) Se anadieron 150 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo 10 mg de algodon interaccionaran con la solucion anterior
d) A continuacion, el algodon se lavo especlficamente con 3 ml de tampon de lavado 3 (etanol al 50 % que contiene MgCl2 50 mM).
e) El algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -12: Extraccion de ADN de esputo
a) Se anadieron 50 pl de esputo a 75 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %, pH 9. 5). La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a dicha temperatura durante 5 minutos.
b) Se anadieron 150 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo 10 mg de algodon interaccionaran con la solucion anterior.
d) A continuacion, el algodon se lavo especlficamente con 3 ml de tampon de lavado 3 (etanol al 50 % que contiene MgCh 100 mM).
e) El algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -13: Extraccion de ARN de tejido
a) Se anadieron 50 pl de tejido positivo para la rabia a 175 pl de tampon de lisis (40 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %, pH 9. 5), se agito en vortex durante 7 minutos y se transfirio el sobrenadante a un tubo. La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 75 °C durante 3 minutos.
b) Se anadieron 350 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo 20 mg de algodon interaccionaran con la solucion anterior.
d) A continuacion, el algodon se lavo especlficamente con 3 ml de tampon de lavado 3 (etanol al 50 % que contiene MgCh 100 mM).
e) El algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C. Ejemplo -14: Extraccion de ARN de sangre
a) El tampon de lisis, el tampon de union, los tampones de lavado y el tampon de elucion se prepararon en agua DEPC.
b) Se colocaron 50 pl de sangre Chikungunya en 50 pl de 10 mg/ml de proteinasa K y 250 pl de tampon de lisis tiocianato de guanidina 5,6 M, EDTA 20 mM, Tris 20 mM, MgCl2 100 mM, Triton X-100 al 0,01 %,). El tubo se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 80 °C durante 2 minutos.
b) Se anadio 1 ml de tampon de union (10 % de PEG 6000) a la solucion anterior.
d) Se hizo que una jeringa de 3 ml con algodon (jeringa de algodon, como se muestra en la Figura 1 [a]) interaccionara con la solucion tirando del embolo de la jeringa hacia adelante y hacia atras cinco veces.
e) A continuacion, la jeringa de algodon se lavo especlficamente con un tampon de lavado 1 de 3 ml (etanol al 50 % que contenla MgCl 100 mM) tirando del embolo de la jeringa hacia adelante y hacia atras siete veces.
f) La jeringa de algodon se lavo con agua (3 x 2 ml) tirando del embolo de la jeringa hacia adelante y hacia atras tres veces durante cada lavado.
g) Los acidos nucleicos se eluyeron en 200 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C tirando del embolo de la jeringa hacia adelante y hacia atras dos veces.
h) Los acidos nucleicos presentes en la sangre se obtuvieron en forma de PCR preparada y el protocolo total tardo aproximadamente 9 minutos.
Ejemplo -15: Extraccion de acidos peptidonucleicos (APN)
a) Se anadieron 50 pl de solucion estandar con PNA a 75 pl de tampon de lisis (10 pl de 10 mg/ml de proteinasa K, hidrocloruro de guanidina 5,6 M, EDTA 100 mM, Tris 20 mM, Triton X-100 al 0,01 %, pH 9. 5), se agito en vortex durante 7 minutos y se transfirio el sobrenadante a un tubo. La solucion resultante se calento a 60 °C y se dejo a esa temperatura durante 3 minutos. Luego, la solucion se calento a 75 °C durante 3 minutos.
b) Se anadieron 150 pl de tampon de union (agua con 0,1 g/ml de PEG 6000) a la solucion anterior.
c) Se hizo 10 mg de algodon interaccionaran con la solucion anterior.
d) A continuacion, el algodon se lavo especlficamente con 3 ml de tampon de lavado 3 (etanol al 50 % que contiene MgCh 100 mM).
e) A continuacion, el algodon se lavo con agua (3 x 1 ml).
f) Los acidos nucleicos proteicos se eluyeron en 100 ul de tampon de elucion (bicina 10 mM, KCl 10 mM, pH 9. 8) a 95 °C.
Ejemplo -16: Amplificacion por PCR
Las muestras de ADN/ARN purificadas mediante el protocolo de la divulgacion instantanea se someten a amplificacion por PCR seguida de electroforesis en gel. Los resultados se muestran en las figuras 4, 5, 6 y 7. La 5 Figura 4 proporciona bandas comparativas de muestras de ADN aisladas y purificadas usando viscosa, hisopo de viscosa comercial, algodon empaquetado en una punta de pipeta de 1 ml, columna de sllice comercial y torunda de algodon. De manera similar, la figura 5 proporciona bandas comparativas de muestras de ADN purificadas por diferentes protocolos, a saber, algodon envasado en punta de pipeta de 1 ml, algodon empaquetado en una jeringa de 2 ml, columna de sllice comercial marcador de peso molecular.
10
Asimismo, la figura 6 proporciona bandas comparativas de muestras de ADN purificadas por diferentes protocolos, a saber, marcador de peso molecular, protocolo de sllice comercial, algodon empaquetado en una punta de pipeta de 1 ml, papel de filtro Whatman No 1 empaquetado en una punta de pipeta y protocolo de la tarjeta de FTA.
15 Ademas, la figura 7 proporciona bandas comparativas de una muestra de ARN de 30 ct amplificada por RT-PCR, que se purificaron mediante diferentes protocolos. Los protocolos utilizaron diferentes fuentes de la matriz de algodon, a saber, algodon quirurgico, Algodon esterilizado en autoclave, algodon lavado con hidroxido sodico, algodon lavado con acido clorhldrico y algodon absorbente.
20 Aunque se han descrito varios aspectos y realizaciones en el presente documento, otros aspectos y realizaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los diversos aspectos y realizaciones divulgados en el presente documento son a tltulo de ilustracion y no pretenden ser limitantes, con el verdadero alcance indicado por las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

  1. 5
    10
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    20
    25
    30
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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para el aislamiento de acido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
    (a) anadir tampon de lisis que tiene pH basico a la muestra que contiene acido nucleico para obtener una solucion lisada; o
    (b) anadir a la muestra tampon de lisis que tiene pH basico en combinacion con tampon de union para obtener una solucion lisada;
    (c) anadir un tampon de union a la solucion obtenida de la etapa (a) para unir el acido nucleico a una matriz de algodon o para la union directa de la solucion de la etapa (b) a una matriz de algodon, en donde el pH de union es de 8 a 10; y
    (d) lavar con tampon de lavado y eluir el acido nucleico unido a la matriz de algodon con tampon de elucion para aislar y purificar el acido nucleico;
    en donde el tampon de lisis comprende tiocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina, EDTA, Tris, un detergente y, opcionalmente, urea, un poliol, una sal monovalente que contiene un cation del grupo IA y/o una sal divalente que contiene un cation del grupo IIA y enzima digestiva de protelnas.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN, ARN y PNA y/o
    en donde dicha muestra es una muestra biologica o no biologica, y, opcionalmente, en donde la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste en extractos de sangre, esputo, suero, saliva o tejido, y la muestra no biologica se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en PNA sintetizado qulmicamente.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho EDTA tiene una concentration que varla de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM, preferentemente de aproximadamente 100 mM; y/o
    en donde dicho tiocianato de guanidina o dicho hidrocloruro de guanidina tiene una concentracion que varla de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 7 M; y/o
    en donde dicha urea tiene una concentracion que varla de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 7 M; y/o en donde dicho Tris tiene una concentracion que varla de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 100 mM, preferentemente aproximadamente 20 mM; y/o
    en donde dicho poliol tiene una concentracion que varla de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 30 % (v/v); y/o
    en donde dicho detergente se selecciona del grupo que consiste en laurilsulfato sodico, dodecilsulfato sodico, Triton X-100, NP-40 y Tween 20 o cualquier combinacion de los mismos y en donde la enzima de digestion de protelnas es proteinasa K.
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho tampon de union es agua opcionalmente junto con polioles o no polioles, en donde dicho poliol comprende, opcionalmente, compuestos de poliol solubles en agua seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, glicerol, polipropilenglicol, etilenglicol y propilenglicol; y en donde dicho no poliol comprende alcoholes seleccionados del grupo que consiste en metanol, etanol, propanol o cualquier llquido soluble en agua con un grupo funcional que consiste en acido, amina, alcohol, fenol, amida o ester como uno de los grupos funcionales; o cualquier combinacion de los mismos.
  5. 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho lavado comprende un primer lavado con un tampon de lavado que comprende de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % (v/v), preferentemente de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 70 % (v/v) y, optimamente, aproximadamente el 50 % (v/v) de alcohol acuoso seguido de lavados multiples con un tampon de lavado que comprende el 100 % de agua.
  6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que dicho alcohol acuoso se selecciona del grupo que consiste en etanol, metanol, n-propanol, 2-propanol, glicerol, PEG, PPG, etilenglicol y propilenglicol.
  7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que dicha agua se selecciona del grupo que consiste en agua desionizada, agua libre de DNasa, agua libre de RNasa, agua MilliQ, agua filtrada, agua corriente y agua subterranea o cualquier combinacion de las mismas.
  8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que dicho tampon de lavado comprende sales seleccionadas de un grupo que consiste en MgCl2, CaCl2, NaCl y KCl, o tampones seleccionados del grupo que consiste en bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina y piperidina, que tienen un pH que varla de aproximadamente 5 a aproximadamente 12.
  9. 9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho tampon de elucion comprende agua caliente que tiene una temperatura que varla de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 99 °C junto con tampon o sal, que tiene un pH que varla de aproximadamente 8 a aproximadamente 11, en donde dicha agua se selecciona del grupo
    5
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    15
    20
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    35
    que consiste en agua desionizada, agua libre de DNasa, agua libre de RNasa, agua MilliQ, agua filtrada, agua corriente y agua subterranea o cualquier combinacion de las mismas; en donde dicho tampon se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PlpES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina y piperidina o cualquier combinacion de las mismas que tiene un pH que varla de aproximadamente 5 a aproximadamente 12; y en donde dicho sal se selecciona, opcionalmente, del grupo que consiste en MgCh, CaCl2, NaCl y KCl o cualquier combinacion de las mismas en una concentracion que varla de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 100 mM, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM.
  10. 10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el algodon se selecciona de entre el grupo que consiste en algodon natural, algodon quirurgico, algodon de grado cllnico, algodon comercial, algodon hilado, algodon lavado con agua, algodon lavado con acido o base, algodon esterilizado en autoclave, algodon tratado con tampon que tiene pH que varla de aproximadamente 1 a aproximadamente 14, algodon tratado con solucion salina, algodon tratado con disolvente organico, algodon prensado y algodon procesado.
  11. 11. Un kit para el aislamiento de acido nucleico de una muestra, comprendiendo dicho kit una matriz de algodon, un tampon de lisis que tiene un pH basico, un tampon de union en el que el pH de union es de 8 a 10, un tampon de lavado y un tampon de elucion, en donde el tampon de lisis comprende tiocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina, EDTA, Tris, un detergente y, opcionalmente, urea, un poliol, una sal monovalente que contiene un cation del grupo IA y/o una sal divalente que contiene un cation del grupo IIA y enzima digestiva de protelnas.
  12. 12. El kit de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el algodon se selecciona de entre el grupo que consiste en algodon natural, algodon quirurgico, algodon de grado cllnico, algodon comercial, algodon hilado, algodon lavado con agua, algodon lavado con acido o base, algodon esterilizado en autoclave, algodon tratado con tampon que tiene pH que varla de aproximadamente 1 a aproximadamente 14, algodon tratado con solucion salina, algodon tratado con disolvente organico, algodon prensado y algodon procesado.
  13. 13. El kit de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el tampon de lisis es como se define en la reivindicacion 3, el tampon de union es como se define en la reivindicacion 4, el tampon de lavado es como se define en las reivindicaciones 5 a 8 y/o el tampon de elucion es como se define en la reivindicacion 9.
  14. 14. El kit de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicha muestra comprende muestras biologicas o no biologicas; en donde la muestra biologica se selecciona, opcionalmente, del grupo que consiste en extractos de sangre, esputo, suero, saliva o tejido, y la muestra no biologica se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en PNA sintetizado qulmicamente.
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