BR112012016774B1 - método para o isolamento de ácidos nucléicos e seu kit - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA O ISOLAMENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS E SEU KIT. A presente revelação provê um método para isolar ácidos nucleicos artificias e naturais como ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) e ácido nucleico peptídico (PNA) de uma amostra sólida ou liquida usando algodão. O algodão embalado é de maneira que, uma solução contendo ácidos nucleicos passa pelo algodão e os ácidos nucleicos na solução são ligados ao algodão em um meio ideal de ligação. Os ácidos nucleicos se ligam ao algodão de maneira que, os ácidos nucleicos ligados possam suportar múltiplas lavagens com um liquido compreendendo água e elui em um tampão aquoso, com o qual os ácidos nucleicos eluídos podem ser diretamente usados para amplificação usando PCR ou para quaisquer outras necessidades biológicas bioquímicas ou moleculares.

Description

A presente revelação se refere à isolação e purificação de ácidos nucleicos. Mais essencialmente, fornece um método e um kit para isolação e purificação de ácidos nucleicos usando algodão ou seus derivados.

FUNDAMENTOS E TÉCNICA ANTERIOR DA REVELAÇÃO

Os protocolos para a extração de acido nucleico podem ser amplamente classificados em protocolos baseados em sílica e não baseados em sílica. Os protocolos existentes baseados em sílica e não baseados em sílica não podem tolerar uma lavagem com água para a remoção dos componentes ácidos não nucleicos e exigem uma lavagem aquosa com alguma porcentagem de álcool presente. A presença de álcool na solução de ácido nucleico eluída inibe a reação de cadeia polimerase (PCR) e assim, normalmente ambos os protocolos exigem a rotação de alta velocidade ou outros métodos para a remoção do álcool residual e a eluição de ácidos nucleicos com um tampão aquoso em temperatura ambiente ou temperatura elevada. Em certos casos, ambos os protocolos exigem uma alta concentração salina com polietilenoglicol ou uma lavagem com álcool aquoso. O uso de alta concentração de sais e de álcool aquoso coloca uma restrição na eluição de ácidos nucleicos como a remoção completa desses componentes antes que os ácidos nucleicos sejam eluídos ou do uso de centrífugas, etc. Assim, nenhum dos protocolos existentes baseados em sílica ou não baseados em sílica podem ser usados não POINT OF CARE (POC) como uma centrífuga gera aerossóis. Alguns dos protocolos baseados não baseados em sílica comunicados na literatura são fornecidos abaixo:

Patente norte-americana 7264927: Este documento descreve o uso de celulose ou de papel celulose envolvendo o uso de polialquílenoglicol e altas concentrações salinas para a ligação e finalmente, a eluição de ácidos nucleicos em um tampão ou em água deionizada.

Patente norte-americana 6084091: Descreve o método de uso de farinha celulósica (como amido de batata) para a isolação de ácidos nucleicos.

Patente norte-americana 5804684: Descreve o método de uso de papel filtro para a extração de ácido nucleico, onde esteja alojado em um material como uma ponta plástica com a ajuda de um papel de tecido macio ou de uma peça de algodão como filtro ou barreira para suportar o papel filtro.

Todos os processos acima usam colunas de sílica disponíveis não comércio para o isolamento do ácido nucleico final, ou exigem maiores tempos para o processamento de amostras (maiores que 30 mins) ou envolvem o uso de altas concentrações de sais durante a lavagem da matriz ou o uso de centrífugas, etc. Nenhum dos métodos de extração de ácido nucleico baseados em celulose lava os ácidos nucleicos com um tampão aquoso 100% ou água e normalmente contendo uma porcentagem de compostos contendo poliol ou alcoóis.

DECLARAÇÃO DA REVELAÇÃO

Assim, a presente revelação relata um método para a isolação de ácido nucleico a partir de uma amostra, o referido método compreendendo as etapas de: (a) adição de um tampão lisado à amostra contendo ácido nucleico para obter uma solução lisada, ou (b) adição de um tampão lisado em combinação com um tampão de ligação à amostra para obter uma solução lisada, (c) adição de um tampão de ligação à solução da etapa (a) para ligar o ácido nucleico a uma matriz ou ligação direta da solução da etapa (b) a uma matriz, e (d) lavagem e eluição do ácido nucleico ligado à matriz para isolar e purificar o ácido nucleico; e um kit para a isolação do ácido nucleico de uma amostra, o referido kit compreendendo uma matriz e tampões.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS DE ACOMPANHAMENTO

As características da presente revelação se tornarão mais totalmente aparentes a partir da seguinte descrição e das reivindicações anexas, tomadas em conjunto com as figuras de acompanhamento. A compreensão de que essas figuras somente mostram várias realizações de acordo com a revelação, revala que, portanto não devem ser consideradas como limitadoras do escopo, como a revelação será descrita com detalhes e especificidades adicionais com o uso das figuras de acompanhamento:

Figura 1: Algodão embalado em [a] seringa [b] agulha de seringa [c] moldes plásticos fixados à seringa [d] garrafa plástica com tampa de rosca [e] tubo de vidro para testes [f] frasco de vidro com tampa de rosca.

Figura 2: Algodão embalado em [a] contagotas plástico descartável [b] Pipeta plástica moldada Pasteur [c] pipeta Pasteur de vidro [d] contagotas plástico com acionador de borracha [e] cotonete de algodão [f] pipeta plástica moldada.

Figura 3: Algodão embalado em [a] Tubo Eppendorf [b] tubo de vidro com tampa de rosca [c] ponta plástica moldada de 1mL [d] pipeta graduada de vidro descartável com acionador de borracha [e] cotonete de viscose [f] pipeta de vidro com acionador de plástico e borracha.

Figura 4: Amostras de DNA purificadas por diferentes protocolos foram amplificadas por PCR. Campo 1: Marcador de peso molecular, campo 2: viscose embalada em uma ponta de pipeta de 1 mL, campo 3: cotonete de viscose comercial, campo 4: algodão embalado em ponta de pipeta de 1 mL, campo 5: coluna de sílica comercial, campo 6: DNA purificado usando cotonete comercial de algodão, campo 7: DNA não amplificado, campo 8: branco de água.

Figura 5: As amostras de DNA purificadas por diferentes protocolos foram amplificadas por PCR. Campo 1: algodão embalado em ponta de pipeta de 1 mL, campo 2: branco de água, campo 3: algodão embalado em seringa de 2 mL, Campo 4: coluna comercial de sílica, campo 5: marcador de peso molecular.

Figura 6: As amostras de DNA purificadas por diferentes protocolos foram amplificadas por PCR. Campo 1: marcador de peso molecular, Campo 2: protocolo de sílica comercial, Campo 3: Algodão embalado em ponta de pipeta de 1 mL, Campo 4: Filtro de papel Whatman Não 1 embalado em uma ponta de pipeta, Campo 5: protocolo de cartão FTA.

Figura 7: Uma amostra RNA 30 ct purificada por diferentes protocolos foi amplificada por RT-PCR. Campo 1: Marcador de peso molecular, Campo 2: Algodão cirúrgico, campo 3: Algodão autoclavado, campo 4: algodão lavado com hidróxido de sódio Campo 5: algodão lavado com ácido clorídrico, campo 6: Algodão absorvente, Campo 7: Coluna sílica Qiagen, Campo 8: Cartão FTA

Figura 8: Uma componente do cartucho embalado em algodão para extração automatizada de ácido nucleico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

Na seguinte descrição detalhada, é feita referência aos desenhos de acompanhamento, da qual fazem parte. As realizações ilustrativas descritas na descrição detalhada, desenhos e reivindicações não são limitadoras. Podem ser utilizadas outras realizações, e podem ser feitas outras alterações, sem abandonar o espírito ou o escopo do assunto aqui apresentado. Será prontamente entendido que os aspectos da presente revelação, como geralmente descritos na presente, e ilustrados nas figuras, podem ser combinados em uma ampla variedade, todas sendo explicitamente contempladas e fazendo parte desta revelação.

A presente revelação se refere a um método para a isolação de ácido nucleico de uma amostra, o referido método compreendendo as etapas de: (a) Adição de um tampão lisado à amostra contendo ácido nucleico para obter uma solução lisada; ou (b) Adição de um tampão lisado em combinação com um tampão de ligação á amostra para obter uma solução lisada; (c) Adição de um tampão de ligação à solução da etapa (a) para ligar o ácido nucleico a uma matriz ou ligação direta da solução da etapa (b) à matriz; e (d) Lavar e eluir o ácido nucleico ligado à matriz para isolar e purificar o ácido nucleico.

Em uma realização da presente revelação, o ácido nucleico é selecionado de um grupo que compreende DNA, RNA e PNA.

Em outra realização da presente revelação, a amostra é uma amostra biológica ou não biológica.

Em ainda outra realização da presente revelação, a amostra biológica que é selecionada de um grupo que compreende sangue, catarro, soro, saliva ou extratos de tecidos e a amostra não biológica é selecionada de um grupo compreendendo PNA quimicamente sintetizado.

Em ainda outra realização da presente revelação, o tampão lisado é selecionado de um grupo que compreende tiocianato de guanidina, cloridrato de guanidina, EDTA, Tris, detergente, poliol, sal monovalente contendo cátion do grupo IA ou sal divalente contendo cátion do grupo IIA e enzima digestora de proteínas opcionalmente junto com uréia ou qualquer de suas combinações.

Em ainda outra realização da presente revelação, o EDTA tem concentração que varia entre cerca de 10 mM a cerca de 300 mM, preferivelmente cerca de 100 mM.

Em ainda outra realização da presente revelação, o tiocianato de guanidina ou o cloridrato de guanidina tem concentração que varia entre cerca de 0,1 M a cerca de 7 M.

Em ainda outra realização da presente revelação, a uréia tem concentração que varia entre cerca de 0,01 M a cerca de 7 M.

Em ainda outra realização da presente revelação, o Tris tem concentração que varia entre cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM, preferivelmente cerca de 20 mM.

Em ainda outra realização da presente revelação, o poliol tem concentração que varia entre cerca de 0,01% a cerca de 30% (v/v).

Em ainda outra realização da presente revelação, o detergente é selecionado de um grupo que compreende sódio lauril sulfato, sulfato dodecil sódio, Triton X-100, Tween 20 e NP-40 ou qualquer de suas combinações e em que a enzima digestora de proteína é proteinase K.

Em ainda outra realização da presente revelação, um tampão de ligação é água opcionalmente junto com polióis ou não polióis.

Em ainda outra realização da presente revelação, o poliol compreende compostos de poliol solúveis em água selecionados de um grupo que consiste de polietilenoglicol, glicerol, polipropilenogiicol, etilenoglicol e propilenoglicol.

Em ainda outra realização da presente revelação, o não poliol compreende alcoóis que consistem de metanol, etanol, propanol ou qualquer líquido solúvel em água com um grupo funcional de ácido, amina, álcool, fenol, amida ou éster como um dos grupos funcionais; ou qualquer de suas combinações.

Em ainda outra realização da presente revelação, a lavagem e a eluição são realizadas usando tampão de lavagem e tampão de eluição, respectivamente.

Em ainda outra realização da presente revelação, a lavagem compreende uma primeira lavagem com um tampão de lavagem compreendendo cerca de 1% a cerca de 99% (v/v), preferivelmente cerca de 30% a cerca de 70% (v/v) e idealmente cerca de 50% (v/v) de álcool aquoso seguido por múltiplas lavagens com um tampão de lavagem compreendendo 100% de água.

Em ainda outra realização da presente revelação, o álcool aquoso é selecionado de um grupo que compreende etanol, metanol, n-propanol, 2-propanol, glicerol, PEG, PPG, etilenoglicol e propilenoglicol.

Em ainda outra realização da presente revelação, a água é selecionada de um grupo que compreende água deionizada, água isenta de DNase, água isenta de RNase, água MilliQ, água filtrada, água de torneira e água do solo ou qualquer de suas combinações.

Em ainda outra realização da presente revelação, o referido tampão de lavagem pode opcionalmente compreender sais selecionados de um grupo que compreende MgCI2, CaCI2l NaCI e KCl, ou tampões selecionados de um grupo que compreende bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis- tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina e piperidina, com pH variando entre cerca de 5 a cerca de 12.

Em ainda outra realização da presente revelação, o tampão de eluição compreende água quente com temperatura variando entre cerca de 45°C a cerca de 99°C juntamente com tampão ou sal, com pH variando entre cerca de 8 a cerca de 11.

Em ainda outra realização da presente revelação, a água é selecionada de um grupo que compreende água deionizada, água isenta de DNase, água isenta de RNase, água MilliQ, água filtrada, água de torneira e água do solo ou qualquer de suas combinações.

Em ainda outra realização da presente revelação, o tampão é selecionado de um grupo que compreende bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina e piperidina ou qualquer de suas combinações com pH variando entre cerca de 5 a cerca de 12 ou tendo pKa variando entre cerca de 7 a cerca de 10, Em ainda outra realização da presente revelação, o sal é selecionado de um grupo que compreende MgCI2, CaCI2, NaCI e KCI ou qualquer de suas combinações em concentração variando entre cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM, preferivelmente na faixa de cerca de 5mM a cerca de 50 mM.

Em ainda outra realização da presente revelação, a matriz é selecionada de um grupo que compreende algodão, derivados de algodão e polímeros sintéticos com misturas de algodão ou qualquer de suas combinações.

Em ainda outra realização da presente revelação, o algodão é selecionado de um grupo que compreende algodão natural, algodão cirúrgico, algodão clínico, algodão comercial, algodão tecido, algodão lavado com água, algodão lavado com ácido ou base, algodão autoclavado, algodão tratado com tampão com pH variando entre cerca de 1 a cerca de 14, algodão tratado com solução salina, algodão tratado com solvente orgânico, algodão prensado e algodão processado.

A presente revelação ainda se refere a um kit para a isolação do ácido nucleico de uma amostra, o referido kit compreendendo uma matriz e tampões.

Em uma realização da presente revelação, a matriz é selecionada de um grupo que compreende algodão, derivados de algodão e polímeros sintéticos com misturas de algodão ou qualquer de suas combinações.

Em outra realização da presente revelação, o algodão é selecionado de um grupo que compreende algodão natural, algodão cirúrgico, algodão clínico, algodão comercial, algodão tecido, algodão lavado com água, algodão lavado com ácido ou base, algodão autoclavado, algodão tratado com tampão com pH variando entre cerca de 1 a cerca de 14, algodão tratado com solução salina, algodão tratado com solvente orgânico, algodão prensado e algodão processado.

Em ainda outra realização da presente revelação, o tampão é selecionado de um grupo que compreende o tampão lisado, tampão de ligação, tampão de lavagem e tampão de eluição como acima descrito.

Em ainda outra realização da presente revelação, a amostra compreende amostras biológicas ou não biológicas.

Em ainda outra realização da presente revelação, a amostra biológica é selecionada de um grupo que compreende sangue, catarro, soro, saliva ou extratos de tecidos e a amostra não biológica é selecionada de um grupo compreendendo PNA quimicamente sintetizado.

A presente revelação se refere a um método para a construção de um sistema para extração de ácido nucleico usando algodão. O algodão é alojado de forma a que todas as soluções mencionadas na extração do ácido nucleico interajam com o algodão.

Em outra realização, as especificações dos vários materiais usados na presente revelação são fornecidas abaixo:

Algodão, derivados de algodão, materiais compreendendo algodão e materiais tipo algodão: O algodão fofo é obtido como um casulo à volta da semente do algodão de um algodoeiro. Para a extração do ácido nucleico, o algodão é o material preferido como matriz. As formas de algodão podem ser algodão natural, algodão cirúrgico, algodão clínico, algodão comercial, algodão tecido, algodão lavado com água, algodão lavado com ácido ou base, algodão autoclavado, algodão tratado com tampão (pH 1-14), algodão tratado com solução salina, algodão tratado com solvente orgânico, algodão prensado e algodão processado, etc. são adequadas. Qualquer tecido de algodão ou diferentes formas de algodão ou polímeros sintéticos com mistura de algodão ou materiais contendo algodão podem ser usados para a extração do ácido nucleico. Materiais como lã, seda, caxemira etc, cujas fibras se comportam de forma similar ao algodão também são consideradas como parte desta revelação. O algodão produzido por fazendas orgânicas ou que usam inseticidas e pesticidas é também considerado como parte desta revelação. O algodão produzido em diferentes geografias terá a composição, estrutura, cor e qualidade um pouco diferente, e o algodão cultivado em todas as regiões do mundo será considerado como parte desta revelação. Qualquer produto com origem de algodão ou de um material que usa algodão em sua fabricação é considerado como parte desta revelação e pode ser usado para a extração de ácido nucleico.

Tampão Usado: O tampão lisado contém alta concentração de EDTA para permitir a ligação dos ácidos nucleicos ao algodão e também para o manuseio de diferentes tipos de amostras (sangue, catarro, soro, saliva, extratos de tecidos, etc). É possível a variação dos sais constituintes e o uso de EDTA é dado como exemplo e não deve ser considerado como limite da revelação. Tipicamente, qualquer molécula carregada negativamente em alta concentração pode repelir os ácidos nucleicos em solução e ampliar a ligação ao algodão. O tampão lisado compreende tiocianato de guanidina ou cloridrato de guanidina, EDTA, Tris, um detergente, e opcionalmente com uréia, um poliol, um sal monovalente contendo cátion do grupo IA ou sal divalente contendo cátion do grupo IIA, e proteinase K ou qualquer enzima digestora de proteína. O tiocianato de guanidina ou o cloridrato de guanidina pode ter concentração entre 0,1 e 7 M. O tiocianato de guanidina pode ser substituído por cloridrato de guanidina ou uréia em algumas aplicações e sua concentração também pode variar entre 0,1 e 7 M. A uréia é usada para desnaturar as proteínas e complementam a função dos sais de guanidina e pode variar entre 0 a 7 M. Tipicamente, a maior parte da literatura que relata protocolos de lise para sangue contém EDTA na faixa de 1-20 mM. Nosso tampão lisado pode conter quantidades significativamente diferentes de EDTA, preferivelmente na faixa de 10-300 mM, mais preferivelmente por volta da faixa de 100 mM. A concentração de EDTA pode ser manipulada para outros ácidos nucleicos como RNA e PNA, mas em geral, foi determinado que uma maior concentração de EDTA ajuda no aperfeiçoamento dos ciclos de tempo (Ct) e nas intensidades de sinal em PCR e RT-PCR. A concentração significativamente diferente de EDTA ajuda na retenção do ferro presente na hemoglobina (para sangue), evita qualquer atividade DNase e RNase, e cria uma atmosfera altamente negativa em que o ácido nucleico pode ligar-se ao algodão. O aspecto importante disso é que, esta realização é o primeiro exemplo em que a ligação do DNA a uma matriz é feita em condições básicas. De forma importante, o pH de ligação da solução tem efeito significativo na ligação DNA/RNA ao algodão, e assim é preferível um pH por volta de 8-10 para a ligação, mas também pode ser usado um pH de 7,1-12. O cloreto de magnésio é tipicamente usado em maiores concentrações para desativar a atividade RNase e assim, não protocolo de lise DNA está ausente ou é usado de forma mínima (cerca de 20 mM). Novamente, o uso de EDTA também desativa a RNase e o uso de MgCI2 não é essencial, sendo opcional para qualquer aplicação de ácido nucleico. Tris é a escolha do tampão de lise, e achamos que 0-100 mM pode ser usado, e tipicamente por volta de 20 mM é o ideal. Deve ser notado que, em nosso tampão lisado, o papel do Tris é o de ajudar na lise e pode ser substituído por qualquer tampão adequado. O uso de poliol não tampão de ligação é melhorar a solubilidade das proteínas clivadas e desnaturadas. A porcentagem de poliol em um tampão de ligação pode ser 0-30% (v/v). Em algumas aplicações, um tampão de ligação em separado não é adicionado e após a lise, os ácidos nucleicos foram diretamente ligados à matriz. Todos esses tampões foram tipicamente feitos em água deionizada e para aplicações RNA, a água pode ser opcionalmente tratada DEPC e autoclavada. A lise da proteinase K pode ser feita antes da adição do tampão lisado supramencionado para sangue, catarro, saliva, sêmen, etc e opcionalmente pode ser feito com tampão lisado. O tratamento da proteinase K foi determinado como efetivo não tampão lisado mencionado e assim, esse tratamento pode ser feito antes da adição do tampão lisado ou pode ser feito juntamente com o tampão lisado para qualquer tipo de amostra líquida que contenha ácidos nucleicos. O detergente usado não tampão lisado pode ser selecionado do grupo compreendendo SLS (sódio lauril sulfato), SDS, Triton X-100, Tween 20, ou qualquer outro detergente iônico, não iônico comumente usado conhecido na técnica.

Tampão de ligação: O tampão de ligação, que foi adicionado após a lise para iniciar a ligação dos ácidos nucleicos com o algodão foi determinado como sendo muito flexível em termos de composição e pH. O tampão de ligação é tão flexível que, somente a adição de água é suficiente para diluir a concentração dos sais não tampão lisado, sendo observada uma boa ligação dos ácidos nucleicos ao algodão. O algodão pode ser colocado para interagir durante a lise ou após a adição de um tampão de ligação para extrair os ácidos nucleicos da amostra dada. Para objetivos práticos, uma composição de tampão de ligação pode ter qualquer pH entre 4 e 12, preferivelmente na faixa de 7-10, Para amostras complexas como sangue, catarro ou saliva, um tampão de ligação pode ter uma determinada porcentagem de compostos de poliol solúveis em água como PEG, glicerol, PPG, etilenoglicol, propilenoglicol, etc. O peso molecular do PEG e do PPG pode variar entre 200- 200,000 e para todos os propósitos práticos será de 1000 a 20.000, A porcentagem dos compostos de poliol na solução de ligação pode ser de até 50% (v/v), mas para todas as aplicações práticas, será 1-30% (v/v). Os compostos de poliol devem garantir a completa miscibilidade dos componentes lisados e se a lise da proteinase K estiver completa, a porcentagem de poliol pode reduzir para 1%. Os tampões conhecidos na técnica incluem bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina, etc na faixa de pH 5-12, preferivelmente na faixa de 7-10 pode ser usado para a preparação de um tampão de ligação e a presença do tampão não é obrigatória, mas pode ser usado dependendo do tipo da amostra, do volume da amostra, da temperatura, da composição do tampão lisado. Se forem usados sais de tamponamento, suas composições podem variar de 1-200 mM, preferivelmente 1-100 mM, e mais preferivelmente 5-50 mM. A concentração acima descrita é a concentração da solução de ligação e após a adição ao tampão lisado a concentração muda dependendo da composição do tampão lisado. Também, o pH definido acima é para o pH de um tampão de ligação quando foi feito e após a adição ao tampão lisado o pH da solução misturada (tampão lisado + tampão de ligação) pode mudar. Apesar de alcoóis como metanol, etanol, e propanol não serem polióis, também podem ser usados na preparação do tampão de ligação. Em geral, pode ser usado qualquer líquido solúvel em água com um grupo funcional de ácido, amina, álcool, fenol, amida, éster, etc como um dos grupos funcionais.

Tampões de Lavagem: Um tampão de lavagem é uma solução, que seletivamente lava os componentes ácidos não nucleicos do algodão. Se a amostra clínica for sangue, após a ligação, o algodão terá cor marrom e para remover a cor foi determinado que uma porcentagem de etanol não tampão de lavagem (chamado tampão de lavagem 1) ajuda. Particularmente, a primeira lavagem foi feita com um tampão ou água contendo 1-99% (v/v), preferivelmente 30-70% (v/v), mais preferivelmente 50% (v/v) de etanol. Se necessário, podem ser feitas múltiplas lavagens com etanol aquoso para se livrar dos componentes ácidos não nucleicos, podendo depender da amostra. Metanol, n-propanol, 2-propanol, glicerol, PEG, PPG, etilenoglicol, propilenoglicol ou qualquer outro álcool solúvel em água pode substituir o etanol na solução de lavagem. Pode ser usado um tampão de lavagem 2 onde estiver presente um cátion monovalente ou divalente juntamente com o tampão de lavagem 1 como sua composição. É também possível que, o tampão de lavagem 1 e 2 possa ter a mesma composição e compreender água, um álcool e um cátion monovalente ou divalente. O número de vezes que o algodão pode ser lavado com os tampões de lavagem 1&2 pode ser 0-10 e idealmente na faixa de 1- 3. Outras lavagens serão normalmente com água deionizada e o número de lavagens pode ser um ou dez, preferivelmente 2 a 5 e mais preferivelmente 3-5. A água deionizada usada na etapa de lavagem pode ser substituída por água isenta de DNase, RNase, ou água MilliQ ou água filtrada ou de torneira ou água de solo. Observamos uma lavagem inicial com álcool aquoso tende a remover a maior parte dos componentes ácidos não nucleicos, sendo seguido por múltiplas lavagens com água (100% água) para remover o álcool residual. As lavagens com água garantem que os ácidos nucleicos obtidos sejam inibidores PCR prontos sem ou com PCR mínimo. Os tampões de lavagem podem conter opcionalmente sais como MgCI2, CaCl2, NaCI, KCI, ou tampões como bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina, etc na faixa de pH 5-12. O tampão ou o sal ou uma combinação desses pode estar em concentração de 1-1000 mM, preferivelmente na faixa de 20-200 mM e mais preferivelmente por volta de 100 mM. Tampão de eluição: Qualquer solução tampão aquosa quente (45-99 °C) pode eluir ácidos nucleicos do algodão. O pH de eluição foi determinado como crucial, mas preferivelmente na faixa de 8-11 e a eluição deve ser feita em uma temperatura entre 45-99° C para a recuperação completa dos ácidos nucleicos. A água deionizada usada não tampão que realiza a etapa de eluição pode ser substituída por água isenta de DNase, RNase ou água MilliQ ou água filtrada ou de torneira ou água de solo. Os tampões conhecidos na técnica incluem bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina, etc na faixa de pH 5-12 podem ser usados para a eluição, apesar de os mais preferidos serem com pKa na faixa de 7-10, Sempre que o algodão é usado para a eluição de ácidos nucleicos ligados, o tampão de eluição deve estar quente e para considerações práticas, na faixa de 45-99 °C. Isto se situa em pleno contraste com a maior parte dos métodos mencionados na literatura, em que a eluição é feita em condições quentes usando água deionizada, mas os ácidos nucleicos ligados ao algodão não podem ser compeltamente eluídos com água quente, sendo crítica a presença de um tampão ou sal. O sal pode ser MgCI2, CaCI2, NaCI, KCl, etc em concentração de 0-100 mM, preferivelmente na faixa de 5-50 mM. O tampão pode ser selecionado de um grupo de tampões, a saber, bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina.

Recuperação de ácidos nucleicos: Com o sistema atual, a recuperação dos ácidos nucleicos depende do tampão lisado, do tampão de ligação, dos tampões de lavagem e do tampão de eluição, como das combinações usadas. Dependendo da combinação, a recuperação do ácido nucleico pode ser comparável a qualquer sistema de extração de ácido nucleico baseado em sílica Também foi observado que com amostras de baixa titulação, a eficiência de nossa abordagem de ácido nucleico baseada em algodão é por vezes melhor que a sílica.

Quantidade de Algodão: A quantidade de algodão é dependente do volume da amostra clínica e para amostras na faixa de 1-300 μl, foi determinada como sendo adequada 5-30 mg de algodão. Para volumes de amostras na faixa de mililitros, pode ser essencial 50 mg ou mais de algodão. Não geral, 1 miligrama a 10 gramas de algodão são suficientes para extrair os ácidos nucleicos de quaisquer amostras clínicas, ambientais ou de campo.

Preço de cada ensaio: Como o algodão usado neste protocolo é o algodão cirúrgico disponível não comércio em qualquer farmácia ou varejo (pode ser autoclavado ou submetido a purificação), o preço de cada extração de ácido nucleico é mínimo e um dos mais baixos comunicados até o presente na literatura. Novamente, considerando a eliminação da presença dos inibidores acidentais de PCR nos eluados de ácido nucleico, a simplicidade e adaptabilidade de uso do POC, facilidade de automação, etc tornam essa abordagem superior, sendo o custo por extração provavelmente um bônus extra.

Segurança dos componentes e descarte das soluções: O sistema de extração de ácido nucleico baseado em algodão utiliza a maioria dos tampões de origem aquosa, com os quais as sobras podem ser descartadas segura e efetivamente por um técnico não assunto. O algodão pode ser embalado em um cartucho e toda as soluções de lise, ligação, e lavagem podem ser conservadas não cartucho para uso POC, com o qual o trabalhador ou analista de saúde não tem necessidade de descartar as sobras e o cartucho será autocontido.

Usos dos ácidos nucleicos extraídos: Os ácidos nucleicos extraídos que usam o protocolo de algodão descrito nesta realização podem estar prontos para uso em um PCR ou RT-PCR. Outras aplicações do protocolo descrito de algodão são para a recuperação de ácidos nucleicos de uma amostra clínica para arquivo, armazenagem, outros usos bioquímicos e de biologia molecular, etc. Os ácidos nucleicos extraídos podem ser usados para qualquer aplicação bioquímica ou biológica molecular, que um técnico não assunto poderá encontrar ocasionalmente.

Uso do algodão em uma forma adequada para a extração do ácido nucleico: Esta realização serve para extrair ácidos nucleicos em ‘forma pronta para PCR’ usando algodão com exigência de equipamento mínimo como centrífuga ou outro equipamento de rotação. O algodão pode ser embalado em qualquer forma adequada para a extração do ácido nucleico dependendo da quantidade da amostra, da natureza da amostra e da origem da amostra. Preferivelmente, os ácidos nucleicos foram obtidos em uma solução ou emulsão, que será processada de acordo com os sistemas descritos de lise, ligação,lavagem e eluição. Assim, a embalagem de algodão é uma parte importante da extração do ácido nucleico e qualquer natureza em que o algodão possa entrar em contato com a solução contendo ácidos nucleicos é considerada como parte desta revelação. As figuras 1- 3 ilustram algumas formas pelas quais o algodão pode ser embalado, mas não deve ser entendido como limitação de nenhuma forma. Em termos simples, o algodão é embalado de maneira que a solução contendo ácido nucleico entre em contato com o algodão ou o algodão entre em contato com o líquido, sendo considerado como parte desta revelação.

Em outra realização, o algodão pode ser embalado em uma ponta de pipeta modificada de plástico de 1 mL, ponta de pipeta modificada de plástico de 2mL, tubo falcon de 15 mL, tubo falcon de 50 mL, tubo eppendorf de 1,5 mL, tubo eppendorf de 2 mL, tubo de vidro borosílicato para testes de 5 mL, frasco de plástico de tampa roscada de 4 mL, pipeta Pasteur de plástico de 3 mL, pipeta Pasteur de vidro, pipeta Pasteur de vidro com bulbo de borracha, pipeta Pasteur de plástico com bulbo de borracha, pipeta de vidro com molde plástico e borracha como bulbo, frasco de vidro de 2 mL com tampa de plástico, seringa descartável de plástico autoclavada de 10 mL, molde de plástico fixado à seringa de 5 mL, unidade descartável fixada à seringa de 50 mL, etc. O algodão também pode ser feito sob a forma de um cotonete de algodão e o cotonete pode ser feito a máquina ou manualmente. O cotonete de algodão mostrado é a Fig: 3 [e] feito de viscose e qualquer polímero misturado com algodão (1 a 100%), ou algodão química ou fisicamente modificado (1 a 100%) é considerado como parte desta revelação.

Uso de algodão para guardar uma amostra clínica: O algodão pode ser exposto à amostragem diretamente e, sendo absorvente o algodão estabilizará e guardará a amostra de forma segura. A forma segura é definida como um meio em que o conteúdo de ácido nucleico da amostra adicionada não é significativamente degradado. A ligação pode ser de maneira reversível, onde os ácidos nucleicos podem ser extraídos usando o protocolo de extração do ácido nucleico descrito nesta realização. O algodão pode ser opcionalmente integrado com um estabilizador, que melhora a estabilidade da amostra e dos constituintes da amostra. Opcionalmente, o algodão pode ser integrado com uma enzima ou um produto químico ou ao tampão lisado comunicado neste protocolo ou ao tampão lisado contendo proteinase K, ou proteinase K junto com sais tampões estabilizadores. O algodão pode ser tratado com EDTA, tratado com azida sódica, tratado com base, tratado com ácido, tratado com tampão lisado, tratado com mel, tratado com qualquer agente antibacteriano, tratado com qualquer agente antimicrobiano, tratado com qualquer composto antiviral ou tratado com EDTA e azida sódica, antibacterianos, antimicrobianos, antivirais, anticoagulantes, estabilizadores de amostras clínicas conhecidos na técnica, mel, ou qualquer de suas combinações. O volume da amostra adicionada ao algodão para guardar pode ser de qualquer volume, mas para todas as razões práticas, pode ser 1 μl a 20 mL e a quantidade de algodão usado pode ser qualquer quantidade e por razões práticas pode ser 1 mg a 10 gramas. Quando a amostra é coletada, pode ser feita em um algodão impregnado com tampão lisado, sendo também considerado como parte desta revelação.

Método para uso de sistema de algodão embalado para extração de ácido nucleico: Algodão embalado em um dispositivo como exemplificado na Figura 1-3 usando o protocolo comunicado para extração de ácido nucleico descrito nesta realização. O mecanismo pelo qual o algodão interagiu com o sistema de lise, ligação, lavagem e eluição descrito nesta realização pode ser aquecimento, agitação, vórtex, rotação, movimento constante, pipetagem, ou qualquer outro meio pelo qual um sólido e um líquido podem interagir. Essencialmente, o ácido nucleico contendo líquido entrarão em contato com as fibras de algodão.

Em outra realização, o presente método e um dos mais simples e mais flexíveis protocolos para extração de ácido nucleico comunicados na literatura. Quase todos os métodos da literatura exigem uma centrífuga para girar o conteúdo, ou imã para reter as partículas magnéticas em posição de contato ou ambos e o método comunicado nesta realização elimina completamente a necessidade de uma centrífuga ou de um imã. Os protocolos existentes têm limites sobre o volume da amostra ou exigem múltiplos processamentos para maiores volumes de amostras. Este protocolo pode processar virtualmente qualquer quantidade de amostras (para objetivos práticos, 1 μl a 20 mL) quase ao mesmo tempo usando um simples sistema descartável de extração. O presente método produz ácidos nucleicos imediatamente prontos para novas caracterizações e processamentos a jusante como PCR, sequenciamento ou blotting. A simplicidade deste sistema torna-o igualmente adequado para point of care (POC) ou laboratórios estabelecidos, primeiro de um tipo comunicado na literatura.

O protocolo de algodão descrito nesta realização tem características salientes como a eliminação do uso da centrífuga, usuário mínimo para variação de usuário, eficiência comparável com os protocolos de sílica, facilidade de uso comparada com qualquer protocolo existente de ácido nucleico, capacidade para processar qualquer quantidade de amostra, adequada recuperação dos ácidos nucleicos, capacidade para colher amostras de baixa titulação, facilidade de automação, adequado tanto para ambientes hospitalares como para estabelecimentos de point of care e alta consistência na recuperação e na qualidade dos ácidos nucleicos.

Em outra realização, o método descrito nesta revelação emprega materiais fibrosos como o algodão para extrair ácidos nucleicos de virtualmente qualquer amostra clínica ou analítica de origem biológica em um PCR ou PCR (RT-PCR) de transcriptase reversa ou formato pronto de sequenciamento ou blotting. O procedimento compreende a lise, a ligação dos ácidos nucleicos ao algodão, a lavagem do algodão ligado ao ácido nucleico com soluções aquosas, e a eluição dos ácidos nucleicos em um tampão com sal como KCl. Um típico tampão lisado em protocolos de sílica ou não sílica contém alguns íons tetra ou dibásicos como EDTA (agentes queladores), que se ligam ao ferro do sangue. Nesse protocolo comunicado, é adicionada uma alta concentração de EDTA (10-300 mM) para criar um ambiente em que todos os ácidos nucleicos ligam-se seletivamente ao algodão. Normalmente o pH do tampão lisado é ajustado em 6 para permitir a ligação a uma matriz (sílica ou não sílica), onde a maioria das proteínas e dos demais componentes têm carga neutra ou positiva, onde o ácido nucleico é ainda carregado negativamente e interage com uma matriz. No sistema atual, o pH de ligação deve ser básico (pH 8-11) e o próprio excesso de EDTA negativamente carregado (10- 300 mM) atua como um tampão e leva o pH por volta de 8. O nosso é o primeiro protocolo em que os ácidos nucleicos são lisados e podem ser ligados a uma matriz com pH básico. O tampão de ligação pode ser a água, qualquer tampão aquoso com pH na faixa de 3-11, ou polietilenoglicol contendo água (PEG, 1-30%) ou glicerol (1-30%) ou polipropilenoglicol (PPG, 1-30%) ou etilenoglicol (1-50%) ou propilenoglicol (1-50%) ou qualquer álcool solúvel em água ou qualquer combinação acima. O tampão de ligação serve para garantir a diluição dos sais do tampão lisado, ampliar a ligação dos ácidos nucleicos em atmosfera rica em EDTA e solubilizar as partículas lisadas. O protocolo comunicado pode tolerar uma ampla faixa de tampões com diferentes pHs para ligação, sendo esta também a primeira vez na literatura que o pH de um tampão de ligação ou a composição é tão flexível. Os maiores tempos de processamento da amostra, o limite no volume da amostra e a não possibilidade de quantificação dos ácidos nucleicos são desvantagens associadas aos cartões FTA, que não existem no protocolo de extração de ácido nucleico comunicado nesta realização usando algodão. Finalmente, todos os protocolos comunicados na literatura de eluição em um tampão aquoso ou água em temperatura ambiente ou ocasionalmente em temperatura elevada e nossa lavagem de ácido nucleico são com água em temperatura ambiente e eluição em temperatura elevada (50-99 °C). Usando o protocolo e a matriz definidos nesta realização, a água quente deionizada não fará a eluição de todos os ácidos nucleicos ligados e a presença de um tampão ou sal ou uma combinação desses é uma necessidade. Isto é também um grande contraste no protocolo de extração de ácido nucleico na literatura, que pode eluir ácidos nucleicos ligados da matriz em água deionizada quente (tanto os protocolos de sílica e não sílica permitem a eluição em água quente de ácidos nucleicos). O tampão de eluição pode ser qualquer coisa entre pH 8-10, indicando que o pH de eluição é flexível, sendo preferida alguma concentração salina como KCI para a eluição eficiente dos ácidos nucleicos ligados do algodão.

Em outra realização, nos métodos abaixo, foram usados o algodão e outros materiais fibrosos baseados em algodão na extração quantitativa dos ácidos nucleicos em condições de lise, ligação, lavagem e eluição especiais, que são exclusivas para a eluição dos ácidos nucleicos do algodão. A presente revelação em um aspecto provê um rápido sistema para isolação do ácido nucleico de qualquer origem ambiental, clínica, bacteriana, fúngica e animal usando algodão. As amostras podem ser lisados celulares, fluidos corporais, plantas, tecidos e células bacterianas e lisados celulares. O algodão e a viscose são materiais fibrosos obtidos natural e artificialmente respectivamente, que foram determinados como ligados aos ácidos nucleicos sob dadas condições. O processo da ligação de ácido nucleico e a retenção seletiva dos ácidos nucleicos no algodão e a liberação dos ácidos nucleicos sob condições específicas de eluição são exemplificados pelo DNA e RNA.

Em outra realização, em uma típica extração de DNA de uma amostra clínica como sangue, o sangue foi lisado com um tampão lisado compreendendo tiocianato de guanidina, EDTA, um tampão como Tris, um detergente como triton X-100, e opcionalmente com uréia, um poliol, um cátion do grupo IA contendo sal monovalente e/ou um cátion do grupo IIA contendo sal divalente, e enzimas para divagem de proteínas como proteinase K. O tiocianato de guanidina pode estar entre 0,1 a 7M de concentração. O tiocianato de guanidina pode ser substituído pelo cloridrato de guanidina em algumas aplicações e sua concentração também pode variar entre 1 a 6 M. A uréia é usada para desnaturar as proteínas e complementa a função dos sais de guanidina e pode variar entre 0 e 7 M. Tipicamente a maioria dos protocolos de lise comunicados na literatura para sangue contêm EDTA na faixa de 20 mM. Nosso tampão lisado poderia tolerar quantidades significativamente maiores de EDTA na faixa de 10-300 mM, preferivelmente por volta da faixa de 100 mM para a eficiente ligação do ácido nucleico ao algodão. A concentração de EDTA pode ser manipulada para outros ácidos nucleicos como RNA e PNA, mas em geral, uma maior concentração de EDTA ajudou na melhoria dos tempos de ciclo (Ct) e nas intensidades de sinal em PCR e RT-PCR. A significativa maior concentração de EDTA ajuda na retenção do ferro presente na hemoglobina (para sangue), evita qualquer atividade DNase e cria uma atmosfera altamente negativa em que o ácido nucleico possa ligar-se ao algodão. O aspecto importante é que, a adição de uma concentração significativamente maior de EDTA ao tampão faz com que o pH do tampão se torne básico e até onde vai nosso conhecimento, esta realização é o primeiro exemplo em que o ácido nucleico que se liga a uma matriz é feito em condições básicas. De forma importante, o pH de ligação da solução tem que ser básico para permitir a ligação do ácido nucleico ao algodão, já que com o pH muito acídico, existe uma chance de o EDTA precipitar-se fora do tampão lisado e assim ser preferido um pH acima de 8 para a ligação. O cloreto de magnésio é tipicamente usado em maiores concentrações para desativar a atividade RNase e assim, poderia ser usado no protocolo de lise do ácido nucleico. O Tris é a escolha do tampão de lise, e encontramos que 0-100 mM pode ser usado e que tipicamente por volta de 20 mM é o ideal. O uso de poliol na lise ou um tampão de ligação serve para aumentar a atividade da Proteinase K e para melhorar a solubilidade das proteínas clivadas. A porcentagem de poliol no tampão lisado pode ser 0-30% (v/v). Todos esses tampões foram feitos em água deionizada e para a aplicação de RNA, a água pode ser tratada com DEPC e autoclavada. A lise da proteinase K pode ser feita antes da adição do supramencionado tampão lisado para sangue, catarro, saliva, etc e junto com o tampão lisado para urina, suor, etc. O tratamento com proteinase K foi determinado como efetivo no tampão lisado mencionado e assim, esse tratamento pode ser antes da adição do tampão lisado ou poderia ser junto com o tampão lisado para qualquer tipo de amostra clínica contendo ácidos nucleicos.

Em outra realização, o tampão de ligação, que foi adicionado após a lise para iniciar a ligação dos ácidos nucleicos ao algodão foi determinado como muito flexível em termos de composição. Um tampão de ligação é tão flexível que, somente a adição de água é suficiente para diluir a concentração de sais no tampão lisado, sendo também observada a boa ligação dos ácidos nucleicos ao algodão. O algodão pode ser posto para interagir durante a lise ou após a adição do tampão de ligação. A composição de um tampão de ligação pode ser com qualquer pH entre 5 a 12, preferivelmente na faixa de 7-10, Para amostras complexas como sangue, catarro ou saliva, um tampão de ligação pode ter uma certa porcentagem de compostos de polióis como PEG, glicerol, PPG, etilenoglicol, propilenoglicol etc. As soluções de ligação tradicionalmente usadas (para sistemas de ácido nucleico baseados em sílica) como etanol ou etanol aquoso foram determinadas como reduzindo a afinidade de ligação dos ácidos nucleicos ao algodão, isto é, a presença de etanol durante a etapa de ligação reduziu a eficiência de ligação do ácido nucleico ao algodão.

Em outra realização, um tampão de lavagem é uma solução, que seletivamente lava os componentes ácidos não nucleicos do algodão. Se a amostra clínica for sangue, após a ligação, o algodão terá coloração marrom e para remover a cor foi determinado que uma porcentagem de etanol no tampão de lavagem (denominado tampão de lavagem 1) ajuda. Particularmente, a primeira lavagem foi feita com um tampão ou água contendo 10-90%, preferivelmente 30-70%, mais preferivelmente 50% de etanol. Metanol, n-propanol, isopropanol, glicerol, PEG, PPG, etilenoglicol, propilenoglicol ou qualquer outro álcool solúvel em água podem substituir o etanol na solução de lavagem. Um tampão de lavagem 2 pode ser usado onde existir um cátion monovalente ou divalente juntamente com o tampão de lavagem 1 como sua composição. É também possível que, o tampão de lavagem 1 e 2 possam ter a mesma composição e compreender água, um álcool e um cátion monovalente ou divalente. O número de vezes em que o algodão pode ser lavado com tampões de lavagem pode ser 0-10 e idealmente na faixa de 1-3. Outras lavagens serão normalmente com água deionizada e o número de lavagens pode ser entre uma e dez, preferivelmente 2 a 5 e mais preferivelmente 3-5. A água deionizada usada na etapa de lavagem pode ser substituída por DNase, água isenta de RNase ou água MilliQ, água filtrada ou água de torneira ou água de solo.

Em outra realização, a eluição dos ácidos nucleicos do algodão pode ser feita com qualquer tampão aquoso. A concentração do tampão precisa estar entre 1 e 200 mM, preferivelmente 5-50 mM, mais preferivelmente, 30-70 mM no tampão de eluição. Os tampões conhecidos na técnica incluem bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, Etanolamine, CHES, CAPS, etanolamina, piperidina, etc, na faixa de pH 5-12, preferivelmente na faixa de 7-10, mais preferivelmente na faixa de 8-10, operam para a eluição dos ácidos nucleicos do algodão em condições quentes. A eluição do ácido nucleico do algodão precisa ser feita em temperatura elevada entre 50 e 100°C, preferivelmente em 70-95°C, mais preferivelmente por volta de 85°C.

Em outra realização, ácidos nucleicos purificados podem ser 10-100% puros, e normalmente estarão prontos para PCR. A pureza dos ácidos nucleicos depende da combinação ideal de lise, ligação, lavagem e dos tampões de eluição e da matriz para purificação (algodão ou derivados de algodão ou materiais misturados com algodão). Observamos que, os cartões FTA ou partículas com ligação de celulose, ou papéis filtro celulósicos não são eficientes nessas condições de combinações de tampão, indicando que o algodão é diferente das demais formas de celulose com relação à interação com os ácidos nucleicos. Nos métodos relacionados, a presente revelação fornece um meio para isolar ácidos nucleicos de uma amostra contendo ácidos nucleicos que usam algodão ou derivados de algodão ou materiais misturados com algodão como a matriz sólida que usa o seguinte protocolo geral. a) A amostra contendo ácidos nucleicos foi adicionada ao tampão lisado. O tampão lisado compreende tiocianato de guanidina, EDTA, Tris, um detergente, e opcionalmente uréia, um poliol, um cátion do grupo IA contendo sal monovalente e/ou um cátion do grupo IIA contendo sal divalente, e proteinase K. A amostra de ácido nucleico e o tampão lisado foram misturados e aquecidos a 50-95 °C por 1-20 min. b) Um tampão de ligação foi adicionado à solução acima que poderia ser água, um tampão com pH entre 4-11, ou uma solução contendo um poliol. O volume do tampão de ligação poderia ser 0,1-10 vezes o volume do tampão lisado. c) A solução acima foi feita para interagir com algodão preferivelmente em temperatura ambiente por alguns segundos a alguns minutos. d) Depois, o algodão foi especificamente lavado (primeira lavagem) comm um tampão de lavagem compreendendo álcool aquoso ou somente água. e) O algodão acima foi depois lavado com água ou um tampão até que o álcool residual fosse removido do algodão. f) Os ácidos nucleicos foram eluídos com um tampão compreendendo um sal como KCl (Sais contendo cátions do Grupo IA ou do Grupo IIA) e/ou bicina como tampão e os ácidos nucleicos eluídos estão normalmente prontos para uso em PCR ou RT-PCR.

A presente revelação é ainda elaborada com a ajuda da seguinte tabela, que provê uma comparação entre o método usado na presente revelação e aqueles usados na técnica anterior. A tabela compara alguns dos aspectos importantes com relação aos vários métodos usados para a caracterização de métodos usados para a isolação de ácidos nucleicos.

Tabela 1: Tabela comparativa dos importantes aspectos envolvidos na isolação de ácidos nucleicos.

A tecnologia da presente revelação é ainda elaborada em detalhes com a ajuda dos seguintes exemplos. Entretanto, os exemplos não devem ser entendidos como 5 limitadores do escopo da revelação.

Metodologia Geral: A solução contendo ácido nucleico foi colocada em contato com algodão preferivelmente em temperatura ambiente e sendo os componentes não nucleicos lavados do algodão usando uma série de lavagens compreendendo álcool aquoso e água. Os ácidos nucleicos do algodão foram eluídos usando um tampão 10 aquoso compreendendo um sal em temperatura elevada. Os ácidos nucleicos eluídos estarão prontos para novo processamento ou para PCR. Os seguintes exemplos são fornecidos com algodão embalado em uma ponta de pipeta de 1 mL usada normalmente em laboratórios de pesquisas. Mas como o técnico no assunto pode ver, o algodão pode ser embalado em qualquer forma em que exista uma oportunidade para que um líquido entre em contato com ele. Essencialmente, qualquer coisa com uma entrada e uma saída e entre o algodão que possa ser embalada é considerada como parte dessa revelação.

Exemplo-1: Extração de DNA do sangue a) 50 μl de sangue foram adicionados a 75 μl de tampão lisado (30 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60°C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85°C por 2 min. b) 150 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 6000) foram adicionados à solução acima. c) Um contagotas plástico de 1 mL embalado com 8 mg de algodão (contagotas de algodão, como mostrado na Figura 2[a]) foi colocado para interagir com a solução acima. d) Depois, o contagotas de algodão foi lavado com 2 mL de cada tampão de lavagem 1 (50% etanol) e tampão de lavagem 2 (50% etanol contendo 100 mM MgCI2). e) A ponta de algodão foi lavada com água (3 X 1mL). f) O ácidos nucleicos foram eluídos em 100 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KOI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-2: Extração de DNA do sangue a) 100 μl de sangue foram adicionados a 150 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85°C por 2 min. b) 300 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG6000) foram adicionados à solução acima. c) Uma ponta de pipeta moldada de 1 mL embalada com 10 mg algodão (ponta de algodão, como mostrado na Figura 3[c]) foi colocada para interagir com a solução acima. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada com 1 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol) e 2 mL de tampão de lavagem 2 (50% etanol contendo 100 mM MgCI2). e) A ponta de algodão foi lavada com água (3 X 1mL). f) O ácidos nucleicos foram eluídos em 200 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-3: Extração de DNA do sangue a) 100 μl de parasita da malária (p. falciparum) contendo sangue foram adicionados a 150 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85 °C por 2 min. b) 300 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG6000) foram adicionados à solução acima. c) Uma ponta de pipeta moldada de 1 mL embalada com 10 mg algodão (ponta de algodão, como mostrada na Figura 3[c]) foi colocada para interagir com a solução acima. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada com 1 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol). e) A ponta de algodão foi lavada com 2 mL de tampão de lavagem 2 (50% etanol contendo 100 mM MgCI2). f) A ponta de algodão foi lavada com água (3 X 1 mL). g) O ácidos nucleicos foram eluídos em 200 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-4: Extração de RNA do sangue a) 50 μl de sangue positivo Chikungunya foram adicionados a75 μl de tampão lisado (30 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85 °C por 2 min. b) 150 μl e um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG6000) foram adicionados à solução acima. c) Uma ponta de pipeta de 1 mL embalada com 10 mg algodão foi colocada para interagir com a solução acima. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada especificamente com 1 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 50 mM MgCI2). e) A ponta de algodão foi lavada com água (3X1 mL). f) O ácidos nucleicos foram eluídos em 200 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-5: Extração de DNA da saliva a) 50 μl de saliva foram adicionados a 100 μl de tampão lisado (10 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 200 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85 °C por 2 min. b) 250 μl de um tampão de ligação (10% glicerol em água) foram adicionados à solução acima. c) Uma ponta de pipeta moldada de 1 mL embalada com algodão (ponta de algodão, como mostrada na Figura 3[c]) foi colocada para interagir com a solução acima. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada especificamente com 3 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 200 mM MgCI2). e) A ponta de algodão foi lavada com água (3 X 1mL) pela pipetagem do líquido três vezes durante cada lavagem. f) O ácidos nucleicos foram eluídos em 250 μl de tampão de eluição (10 mM bicina, 50 mM KCl, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-6: Extração de RNA do sangue a) 100 μl de sangue positivo Chikungunya foram adicionados a 150 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85 °C por 2 min. b) 300 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 6000) foram adicionados à solução acima. c) Uma ponta de pipeta moldada de 1 mL embalada com 10 mg algodão (ponta de algodão, como mostrada na Figura 3[c]) foi colocada para interagir com a solução acima. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada especificamente com 1 mL tampão de lavagem 1 (50% etanol) e 2 mL de tampão de lavagem 2 (50% etanol contendo 50 mM MgCI2). e) A ponta de algodão foi lavada com água (2 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 100 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9.8) a 95 °C.

Exemplo-7: Extração de RN A do sangue a) 50 μl de sangue positivo Chikungunya foram adicionados a 75 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 80 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 55 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 70 °C por 2 min. b) 150 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 8000) foram adicionados à solução acima. c) Uma seringa de 2.5 mL embalada com 10 mg de algodão (seringa de algodão, como mostrado na Figura 1 [a]) foi colocada para interagir com a solução acima. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada especificamente com 1 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol) e 2 mL de tampão de lavagem 2 (50% etanol contendo 50 mM MgC12). e) O seringa de algodão foi lavado com água (3 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 100 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-8: Extração de DNA do catarro a) 100 μl de catarro foram adicionados a 150 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 5 min. Depois, a solução foi aquecida a 75 °C por 2 min. b) 300 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 6000) foram adicionados à solução acima. c) Uma pipeta de fole de 5 mL embalada com 10 mg de algodão (fole de algodão, como mostrado na Figura 2[b]) foi colocada para interagir com a solução acima. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada especificamente com 1 mL tampão de lavagem 1 (50% etanol) e tampão de lavagem 2 (50% etanol contendo 50 mM MgCb). e) O fole de algodão foi lavado com água (3 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 100 uL tampão de eluição (10 mM tricina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-9: Extração de DNA do soro a) 50 μl de soro foram adicionados a 75 μl de tampão lisado (60 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85 °C por 2 min. b) 150 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 6000) foram adicionados à solução acima. c) Uma ponta de pipeta moldada de 1 mL embalada com 10 mg algodão (ponta de algodão, como mostrada na Figura 3[c]) foi colocada para interagir com o algodão. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada especificamente com 1 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol) e 2 mL de tampão de lavagem 2 (50% etanol contendo 50 mM MgCy. e) A ponta de algodão foi lavada com água (3 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 200 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCl, pH 9,8) a 95°C.

Exemplo-10: Extração de RNA do soro a) 100 μl de soro positivo Chikungunya foram adicionados a 150 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85 °C por 2 min. b) 300 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG6000) foram adicionados à solução acima. c) Uma ponta de pipeta moldada de 1 mL embalada com 10 mg de algodão (ponta de algodão, como mostrada na Figura 3[c]) foi colocada para interagir com o algodão. d) Depois, a ponta de algodão foi lavada especificamente com 3 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 50 mM MgCI2). e) A ponta de algodão foi lavada com água (3X1 mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 200 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCl, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-11: Extração de DNA do catarro a) 50 μl de catarro foram adicionados a 150 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100, pH 9,5). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 85 °C por 6 min. b) 150 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 6000) foram adicionados à solução acima. c) 10 mg de algodão foram colocados para interagir com a solução acima. d) Depois, o algodão foi lavado especificamente com 3 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 50 mM MgCI2). e) O algodão foi lavado com água (3 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 100 uL tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-12: Extração de DNA do catarro a) 50 μl de catarro foram adicionados a 75 μl de tampão lisado (40 OL de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100, pH 9,5). A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 5 min. b) 150 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 6000) foram adicionados à solução acima. c) 10 mg algodão foram colocados para interagir com a solução acima. d) Depois, o algodão foi lavado especificamente com 3 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 100 mM MgCI2). e) O algodão foi lavado com água (3 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 100 uL tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-13: Extração de RNA do tecido a) 50 μl de tecido positivo à raiva foram adicionados a 175 μl de tampão lisado (40 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M tiocianato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100, pH 9,5), colocado em vórtex por 7 min e o sobrenadante foi transferido para um tubo. A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 75 °C por 3 min. b) 350 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG 6000) foram adicionados à solução acima. c) 20 mg de algodão foram colocados para interagir com a solução acima. d) Depois, o algodão foi lavado especificamente com 3 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 100 mM MgCI2). e) O algodão foi lavado com água (3 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 100 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCI, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-14: Extração de RNA do sangue a) O tampão lisado, tampão de ligação, tampões de lavagem e o tampão de eluição foram preparados em água DEPC. b) 50 μl de sangue Chikungunya foram colocados em 50 μl de 10 mg/mL proteinase K e 250 μl tampão lisado (5,6 M tiocianato de guanidina, 20 mM EDTA, 20 mM Tris, 100 mM MgCI2, 0,1% triton X-100). O tubo foi aquecido a 60 °C e deixado naquela temperatura por 3 min. Depois, o tubo foi aquecido a 80 °C por 2 min. c) 1 mL de um tampão de ligação (10% PEG 6000) foi adicionado à solução acima. d) Uma seringa de 3 mL embalada com algodão (seringa de algodão, como mostrado na Figura 1[a]) foi colocada para interagir com a solução, puxando o êmbolo da seringa para frente e para trás por cinco vezes. e) Depois, a seringa de algodão foi lavada especificamente com 3 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 100mM MgCL) puxando o êmbolo da seringa para frente e para trás por sete vezes. f) A seringa de algodão foi lavada com água (3X2 mL) puxando o êmbolo da seringa para frente e para trás com o líquido três vezes em cada lavagem. g) Os ácidos nucleicos foram eluídos em 200 μl de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCl, pH 9,8) a 95 °C puxando o êmbolo da seringa para frente e para trás com o líquido duas vezes. h) Os ácidos nucleicos presentes no sangue foram obtidos em forma pronta PCR e o protocolo completo levou cerca de 9 minutos.

Exemplo-15: Extração dos ácidos nucleicos peptídicos (PNA) a) 50 μl de PNA contendo solução padrão foram adicionados a 75 μl de tampão lisado (10 μl de 10 mg/mL proteinase K, 5,6 M cloridrato de guanidina, 100 mM EDTA, 20 mM Tris, 0,01% triton X-100, pH 9,5), colocado em vórtex por 7 min, sendo o sobrenadante transferido para um tubo. A solução resultante foi aquecida a 60 °C e deixada naquela temperatura por 3 min. Depois, a solução foi aquecida a 75 °C por 3 min. b) 150 μl de um tampão de ligação (água com 0,1 g/mL de PEG6000) foram adicionados à solução acima. c) 10 mg de algodão foram colocados para interagir com a solução acima. d) Depois, o algodão foi lavado especificamente com 3 mL de tampão de lavagem 1 (50% etanol contendo 100 mM MgCI2). e) O algodão foi então lavado com água (3 X 1mL). f) Os ácidos nucleicos proteicos foram eluídos em 100 uL de tampão de eluição (10 mM bicina, 10 mM KCl, pH 9,8) a 95 °C.

Exemplo-16 : Amplificação PCR As amostras de DNA/RNA purificadas pelo protocolo da presente revelação são submetidas a amplificação PCR seguida por eletroforese em gel. Os resultados são mostrados nas figuras 4, 5 6, e 7. A Figura 4 provê bandas comparativas de amostras de DNA isoladas e purificadas usando viscose, cotonetes de viscose comercial, algodão embalado em ponta de pipeta de 1 mL, coluna comercial de sílica e cotonete de algodão. De forma similar, a figura 5 provê bandas comparativas de amostras de DNA purificadas por diferentes protocolos, isto é, algodão embalado em ponta de pipeta de 1 mL, algodão embalado em seringa de 2 mL, coluna comercial de sílica, e marcador de peso molecular.

Também, a figura 6 provê bandas comparativas de amostras de DNA purificadas por diferentes protocolos, isto é, marcador de peso molecular, protocolo de sílica comercial, algodão embalado em ponta de pipeta de 1 mL, papel filtro Whatman N° 1 embalado em a ponta de pipeta e protocolo de cartão FTA.

Além disso, a figura 7 provê bandas comparativas de uma amostra RNA 30 ct amplificada por RT-PCR, que foram purificadas por diferentes protocolos. Os protocolos usaram diferentes fontes da matriz de algodão, a saber, algodão cirúrgico, algodão autoclavado, algodão lavado com hidróxido de sódio, algodão lavado com ácido clorídrico e algodão absorvente.

Apesar de vários aspectos e realizações terem sido revelados na presente, outros aspectos e realizações ficarão aparentes para os técnicos não assunto. Os vários aspectos e realizações revelados na presente são para finalidades de ilustração e não devem ser entendidos como limitadores, com o verdadeiro escopo e espírito sendo indicado pelas seguintes reivindicações.

Claims (28)

1. MÉTODO, para o isolamento de ácido nucleico de uma amostra, o referido método compreendendo as etapas de: (a) Adição de um tampão lisado com pH básico da amostra contendo ácido nucleico para obter uma solução lisada; ou (b) Adição de um tampão lisado com pH básico em combinação com um tampão de ligação da amostra para obter uma solução lisada (c) Adição de um tampão de ligação à solução obtida na etapa (a) para ligar o ácido nucleico a uma matriz de algodão ou ligação direta da solução da etapa (b) a uma matriz de algodão; caracterizado pelo pH de ligação ser de 8 a 11; e (d) lavagem com tampão de lavagem e eluição do ácido nucleico ligado à matriz do algodão com tampão de eluição para isolar e purificar o ácido nucleico, em que o tampão lisado compreende tiocianato de guanidina ou cloridrato de guanidina, EDTA, Tris, um detergente e, opcionalmente, ureia, um poliol, um sal monovalente contendo o cátion IA do grupo IA e / ou sal divalente contendo uma enzima de digestão proteica e cátion do grupo IIA.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o referido ácido nucleico é selecionado de um grupo consistindo de DNA, RNA e PNA.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a referida amostra é uma amostra biológica ou não biológica.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado em que a amostra biológica é selecionada de um grupo consistindo de sangue, catarro, soro, saliva ou extratos de tecidos sendo a amostra não biológica selecionada de um grupo compreendendo PNA quimicamente sintetizado.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a lise é feita em pH entre 8 a 11.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o referido EDTA tem uma concentração que varia entre 10 mM a 300 mM.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o referido tiocianato de guanidina ou o referido cloridrato de guanidina tem uma concentração que varia entre 0,1 M a 7 M.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a referida uréia tem uma concentração que varia entre 0,01 M a 7 M.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o referido Tris tem uma concentração que varia entre 0,01 mM a 100 mM.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o referido poliol tem uma concentração que varia entre 0,01% a 30% (v/v).

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o referido detergente é selecionado de um grupo consistindo de sódio lauril sulfato, sulfato dodecil sódio, Triton X-100, NP-40 e Tween 20 ou qualquer de suas combinações e em que a enzima digestora de proteínas é a proteinase K.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o referido tampão de ligação ser água, opcionalmente junto com polióis ou não polióis.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado em que o referido poliol compreende compostos polióis solúveis em água selecionados de um grupo que consiste de polietilenoglicol, glicerol, polipropilenoglicol, etilenoglicol e propilenoglicol.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado em que o referido não poliol compreende álcoois selecionados de um grupo que consistem de metanol, etanol, propanol ou qualquer líquido solúvel em água com um grupo funcional de ácido, amina, álcool, fenol, amida ou éster como um dos grupos funcionais; ou qualquer de suas combinações.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida lavagem compreender uma primeira lavagem com um tampão de lavagem compreendendo 1% a 99% (v/v) de álcool aquoso seguido por múltiplas lavagens com um tampão de lavagem compreendendo 100% de água.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo referido álcool aquoso ser selecionado de um grupo compreendendo etanol, metanol, n-propanol, 2-propanol, glicerol, PEG, PPG, etilenoglicol e propilenoglicol.

17. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 1 ou 15, caracterizado pela referida água ser selecionada de um grupo consistindo de água deionizada, água isenta de DNase, água isenta de RNase, água MilliQ, água filtrada, água de torneira e água do solo ou qualquer de suas combinações.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicações 1 ou 15, caracterizado pelo referido tampão de lavagem poder idealmente compreender sais selecionados de um grupo consistindo de MgCl2, CaCl2, NaCl e KCl, ou tampões selecionados de um grupo consistindo de bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina e piperidina, com pH variando entre 5 a 12.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido tampão de eluição compreender água quente com temperaturas variando entre 45oC a 99oC junto com tampão ou sal, tendo pH variando entre 8 a 11.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pela referida água ser selecionada de um grupo consistindo de água deionizada, água isenta de DNase, água isenta de RNase, água MilliQ, água filtrada, água de torneira e água do solo ou qualquer de suas combinações.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo referido tampão ser selecionado de um grupo consistindo de bicina, tricina, Tris, HEPES, CHAPS, fosfato, acetato, MES, piridina, piperazina, Bis-tris, PIPES, ACES, BES, TES, borato, TAPS, CHES, CAPS, etanolamina e piperidina, com pH variando entre 5 a 12.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo referido sal ser selecionado de um grupo consistindo de MgCl2, CaCl2, NaCl e KCl ou qualquer de suas combinações na concentração variando entre 0,01 mM a 100 mM.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o algodão é selecionado de um grupo consistindo de algodão natural, algodão cirúrgico, algodão clínico, algodão comercial, algodão tecido, algodão lavado com água, algodão lavado com ácido ou base, algodão autoclavado, algodão tratado com tampão com pH variando entre 1 a 14, algodão tratado com solução salina, algodão tratado com solvente orgânico, algodão prensado e algodão processado.

24. KIT, para isolamento do ácido nucleico de uma amostra, o referido kit caracterizado por compreender uma matriz de algodão, tampão lisado com pH básico, tampão de ligação em que o pH de ligação é de 8 a 11, tampão de lavagem e tampão de eluição, em que o tampão lisado compreende tiocianato de guanidina ou cloridrato de guanidina, EDTA, Tris, um detergente e opcionalmente ureia, um poliol, um sal monovalente contendo o cátion do grupo IA e/ou sal divalente contendo um cátion do grupo IIA e enzima de digestão de proteínas.

25. KIT, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo algodão ser selecionado de um grupo consistindo de algodão natural, algodão cirúrgico, algodão clínico, algodão comercial, algodão tecido, algodão lavado com água, algodão lavado com ácido ou base, algodão autoclavado, algodão tratado com tampão com pH variando entre 1 a 14, algodão tratado com solução salina, algodão tratado com solvente orgânico, algodão prensado e algodão processado.

26. KIT, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo referido tampão ser selecionado de um grupo consistindo de tampão lisado de acordo com as reivindicações 5 a 11, tampão de ligação de acordo com as reivindicações 12 a 14, tampão de lavagem de acordo com a reivindicações 15 e 19, e tampão de eluição de acordo com a reivindicações 15 e 20 a 23.

27. KIT, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pela referida amostra compreender amostras biológicas ou não biológicas.

28. KIT, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela amostra biológica ser selecionada de um grupo consistindo de sangue, catarro, soro, saliva ou extratos de tecidos e a amostra não biológica ser selecionada do grupo que consiste em PNA quimicamente sintetizado.

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